CN108690830A - 一种高效扩增nkt细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞培养技术领域，本发明的培养方法培养的NKT细胞纯度较高，数量大。本发明主要通过联合使用α‑半乳糖神经酰胺(glycolipid α‑galactosylceramide，α‑GalCer)、利拉鲁肽(GLP‑1)、IL‑2、CD3单抗、CS1单抗及IL‑21来实现NKT的大量扩增。本发明对具体的培养方法也进行描述，包含抗体的包被、NKT细胞的活化及NKT的扩增。本发明简化了流程，最大程度的避免了污染；同时培养的NKT细胞纯度高，周期短，并且获得的NKT具有较高的杀伤活性。

Description

一种高效扩增NKT细胞的方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种NKT细胞培养组合物及其培养方法。
背景技术
自然杀伤T细胞(Nature KillerT，NKT)，是继T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞之外的第四类淋巴细胞。NKT细胞发现于1986年，NKT细胞具有T细胞和NK细胞两重性质，既能表达Va14/Ja281特定的T细胞受体又能由CD1介导识别脂质抗原。
研究显示NKT细胞在人体内发挥着细胞毒作用，NKT细胞活化后具有NK细胞样细胞毒活性，可溶解NK细胞敏感的靶细胞，主要效应分子为穿孔素，Fas配体以及IFN-γ。同时NKT在人体内还发挥着免疫调节的作用。NKT细胞受到刺激后，可以分泌大量的IL-4，IFN-γ，GM-CSF，IL-13和其它细胞因子和趋化因子，发挥免疫调节作用，它是联系固有免疫和获得性免疫的桥梁之一。研究显示它可以通过调节Th1/Th2型T淋巴细胞间的平衡而发挥免疫调节作用，NKT细胞的减少是这些免疫系统疾病的主要致病原因。因此NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞在抗感染、肿瘤免疫、器官免疫排斥和抑制自身免疫性疾病发生中均具有重要功能。
近年来，研究发现NKT细胞在对抗肥胖和代谢综合征(肥胖的一个严重后果)方面具有保护性的作用。它可以协助脂肪细胞表达成纤维细胞生长因子-21，FGF-21可以触发人体进行代谢，将白色脂肪转化为更加健康的棕色脂肪。在这个白色脂肪棕色化的过程中消耗大量能量，从而导致增加的代谢率和体重减轻。由此可见，NKT在加强体重减轻的事件中发挥着关键性作用。
过继免疫治疗已经成为肿瘤免疫治疗的主要方式之一，它主要包括特异性的TIL、TCR、CAR-T、CAR-NK和非特异性的CIK、DC、NK、NKT等。正是由于以上NKT其独特的特点，其在肿瘤免疫治疗中的应用越来越受到重视。同时NKT在免疫调节及对抗肥胖方面的功能也越来越得到重视。NKT细胞不仅广泛用于癌症病人治疗，还可应用于亚健康人群。因此，如何获得大量的NKT细胞成为目前亟待解决的问题。
目前，NKT细胞的大量获得仍然主要是通过采用磁珠分选或流式分选后进行扩增培养的。但是磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高。因此，研发一种低风险，低成本的NKT细胞培养方法称为一个亟待解决的问题。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种无需通过流式分选或磁珠分选，就可以获得纯度较高的NKT细胞，简化了操作流程且大大降低了成本。
本发明所采用的技术方案是：
对从外周血中分离PBMC细胞进行活化，活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：
(1)抗体包被
用PBS稀释CD3及CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，CD3、CS1单抗包被浓度分别为0.1-0.5μg/mL、10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。
(2)PBMC分离及自体血清制备
使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。
(3)NKT细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、α-GalCer、GLP-1它们的终浓度约为500-800IU/mL、60-120ng及10-30ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。
(4)NKT细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-21的X-VIVO培养基，IL-2及IL-21的终浓度分别为300-600IU/mL和10-80ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NKT细胞。
作为优选，本发明所述步骤(1)中CD3单抗、CS1单抗分别为FDA批准的药物：muromonab、elotuzumab。
并且，本发明所述步骤(1)中CD3单抗、CS1单抗浓度为0.2μg/mL 35μg/mL。
并且，本发明所述步骤(1)中抗体的孵育条件即可以是4℃孵育过夜，也可以是37℃孵育2h。在操作时，两者选其一。
并且，本发明步骤(2)中的外周血为人的外周血。并且，本发明步骤(3)中的IL-2、α-GalCer、GLP-1的终浓度约为500IU/mL、100ng及15ng/mL。
并且，本发明步骤(3)中的自体血清的浓度为10％。
并且，本发明步骤(4)中的克隆团较大是指在10X的显微镜下观察细胞团的直径大约1cm。
并且，本发明步骤(4)中的新培养瓶是指未曾包被过的培养瓶
并且，本发明步骤(4)中的IL-2及IL-21的终浓度分别为300IU/mL和15ng/mL。
与现代技术相比，本发明的有益结果是：
(1)本发明NKT活化及扩增所采用的CD3单抗(muromonab)及CS1单抗(Elotuzumab)均为美国FDA认证的可用于临床的药物，研究表明其可以活化NKT细胞。而利拉鲁肽(GLP-1)、IL-2及IL-15均是临床药物。采用临床药物进行NKT培养安全性高，原料来源广泛。
(2)本发明采用单抗配合临床用药对NKT进行活化后，然后进行扩增就可以获得高纯度的NKT细胞。避免了磁珠筛选及流式分选等步骤。大大降低了成本，并且简化了培养流程，使得培养操作简单易行。
(3)本发明所得到的NKT细胞在第14天时，NKT细胞的扩增倍数高达1000倍，且NKT细胞的纯度高达55％以上。培养的NKT对K562细胞有较高的杀伤能力。
综上所述，本发明优化了NKT细胞的培养方法，为以后的NKT细胞在保健、肿瘤治疗及预防等中的应用奠定了基础。
附图说明
图1为采用本发明培养的PBMC细胞生长示意图。
图2为培养第14天时细胞生长状态观察图
图3为人外周血PBMC细胞经培养14天后的流式检测结果
图4NKT细胞对K562及肿瘤细胞杀伤活性分析
具体实施方式
下面结合实施例及对发明进一步说明：下述实施例是说明性的，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的保护范围。本领域技术人员可以通过借鉴本文内容，适当改进工艺参数设置。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明。
本发明所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法；本发明中的试剂，如无特殊说明，均为本领域的常规试剂。
实施例
本实施例中从人外周血中分离培养NKT细胞的细胞培养方法具体步骤如下：
(1)抗体包被
用PBS稀释CD3及CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，CD3、CS1单抗包被浓度分别为0.2μg/mL、35μg/mL.然后置于4℃孵育过夜。
(2)PBMC分离及自体血清制备
使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清并于4℃储存备用。
(3)NKT细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入含有IL-2、α-GalCer、GLP-1的培养基。其中，IL-2、α-GalCer、GLP-1的终浓度约为500IU/mL、100ng、15ng/mL。同时加入10％的自体血清。
(4)NKT细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-21的X-VIVO培养基，IL-2及IL-21的终浓度分别为300IU/mL和15ng/mL。随后根据细胞生长情况进行补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NKT细胞。
为了更好的说明，在实施例中我们设置了实验组及对照组。对照组是使用同型对照人IgG取代CS1及CD3单抗进行包被，其他培养条件一致。我们对这两组细胞进行观察及检测。检测结果如下：
1.在培养的第0，10，14，21天对实验组和对照组细胞进行计数。结果显示：实验组细胞扩增倍数远远大于对照组：在培养14天时，实验组的细胞总数就达到1.59X109(见图1)，细胞总数扩增62倍；在培养第21天时，实验组的细胞总数就达到3.23X109(见图1)，细胞总数扩增126倍。同时，我们对14天及21天的细胞进行了细胞观察，实验组细胞成团成长，而对照组细胞较散(见图2)。结果表明：使用我们的方法，所获得的细胞数目多、增殖快，可以满足临床需求。
2.为了检测细胞的纯度，我们在细胞培养第14天时，对实验组及对照组培养的细胞进行细胞免疫表型测定分析检测。我们使用CD3及CD56的流式抗体与PBS洗好的实验组及对照组细胞进行孵育，孵育条件为：4℃，30min。然后使用PBS进行清洗2次。将处理好的细胞进行上机检测。检测结果显示：实验组中在第14天的NKT纯度为57.39％，NK和NKT共计68.15％；而对照组中对应时间的NKT纯度只有为14.57％，NK和NKT共计28.61％(见图3)。结果表明实验组的NKT纯度要远高于对照组。
3.为了进一步检测使用本发明培养的NKT的杀伤活力，我们进行了实验组及对照组的NKT细胞杀伤实验，检测了其对K562的杀伤活力。我们将K562细胞浓度调整为1X104，然后进行铺板，在96孔板中每孔加入100μL。然后按照效应细胞与靶细胞的比为5∶1的比例加入效应细胞，即培养第14天的NKT细胞。在本实验室中设置对照组，对照组有2组：一组只加靶细胞，另一组只加效应细胞。加完效应细胞后，将96孔板置于37℃，5％CO2的培养箱中进行培养，在培养12h后加入CCK8。然后再次置于培养箱中培养，培养2h后，置于酶标仪测定其在450nm及600nm的吸光度。其中600nm为参比波长。进行吸光度检测。那么NKT的杀伤活性＝【1-(实验组OD-效应细胞对照组OD)/靶细胞对照组OD】X100％。检测结果显示：对照组NKT细胞对K562的杀伤率为68.90％.而实验组NKT细胞对K562的杀伤率高达89.81％(见图4)。结果表明使用本发明培养的NKT具有较高的杀伤活性。
我们采用CS1单抗来活化NKT是基于已有的报道。研究显示CS1单抗可以参与人体免疫调节。通过对细胞的增殖，纯度及杀伤活性的测定，实验组NKT细胞增殖快，纯度高，杀伤活性高。
此外使用本发明所培养的NKT细胞扩增倍数高，仅需要25mL外周血就可以培养出近1亿个细胞。而且NKT细胞纯度高，对肿瘤细胞具有较高的杀伤活性。满足了临床上NKT细胞数量大，纯度高的要求。而且本发明避免了磁珠筛选或流式分选等工作简化了NKT培养工作。该培养方法培养的NKT优于常规的培养方法，为以后NKT的免疫治疗等临床上的应用奠定了基础。

Claims (11)

1.一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于首先使用α-GalCer、利拉鲁肽(GLP-1)、CD3及CS1对NKT进行活化。活化后再进行扩增培养。主要包括以下几个步骤：
(1)抗体包被
用PBS稀释CD3及CS1单抗，并用稀释好的单抗包被T75培养瓶，CD3、CS1单抗包被浓度分别为0.1-0.5μg/mL、10-60μg/mL.然后置于4℃孵育过夜或者37℃培养箱中孵育2h。
(2)PBMC分离及自体血清制备
使用Ficoll分离外周血中的PBMC，并使用X-VIVO培养基将PBMC的浓度调整至约1×106个/mL。同时将分离得到的血浆于56℃进行灭活30min。然后离心后取上清，于4℃储存备用。
(3)NKT细胞活化培养
将分离后的细胞转移至包被并用PBS清洗过的培养瓶中。然后加入IL-2、α-GalCer、GLP-1它们的终浓度约为500-800IU/mL、60-120ng及10-30ng/mL。最后加入7-10％的自体血清。
(4)NKT细胞的扩增培养
观察细胞状态，当观察到细胞的克隆团较多且较大时，将其转入新的培养瓶中，并补加已经添加IL-2及IL-21的X-VIVO培养基，IL-2及IL-21的终浓度分别为300-600IU/mL和10-80ng/mL。随后进行隔天补液。使细胞浓度维持在1X106。在培养第14天后，收集的细胞即为NKT细胞。
2.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的CD3及CS1单抗为CD3单抗、CS1单抗分别为FDA批准的药物：muromonab、elotuzumab。
3.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(1)中的CD3及CS1单抗的浓度分别为0.2μg/mL 35μg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(2)中外周血为人的外周血。
5.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中L-2、α-GalCer、GLP-1的终浓度分别约为500-800IU/mL、60-120ng及10-30ng/mL。
6.根据权利要求5所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中L-2、α-GalCer、GLP-1，它们的终浓度约为500IU/mL、100ng及15ng/mL。
7.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(3)中自体血清量为10％。
8.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中的克隆团较大是指在10X的显微镜下观察细胞团的直径大约1cm。
9.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中的新培养瓶是指未曾包被过的培养瓶。
10.根据权利要求1所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中L-2及IL-21的终浓度分别为300-600IU/mL和10-80ng/mL。
11.根据权利要求10所述的一种NKT细胞培养组合物及其培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中L-2及IL-21的终浓度分别为300IU/mL和15ng/mL。
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