CN107849523A - 用于调理用于细胞疗法的细胞群体的方法和装置 - Google Patents

用于调理用于细胞疗法的细胞群体的方法和装置 Download PDF

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Abstract

提供了一种用于调理多能细胞或细胞培养基的生物反应器系统。在另外的方面，提供了经调理的多能细胞和用于制备此类细胞的方法。

Description

用于调理用于细胞疗法的细胞群体的方法和装置
本申请要求2015年6月23日提交的美国临时专利申请号62/183,273的权益，其全部以引用方式并入本文。
发明背景
发明领域
本发明的实施方案涉及用于调理细胞群体来改善特性以用作治疗剂的方法和装置。更具体地，本发明的实施方案涉及通过对沿着其中布置干细胞的流动室的边界布置的干细胞施加受控性剪切应力来调理干细胞的装置和方法。
相关领域的背景
已经考虑将谱系特异性分化的细胞群体用于患有疾病或病症的患者的细胞替代疗法中。已经考虑将保留分化成特化细胞类型(干细胞)和/或分泌某些因子的能力的细胞群体用于患有多种疾病或病症的患者的基于细胞的疗法中。
据推测涉及干细胞的定向分化的研究和技术发展为许多疾病和病症提供治疗。然而，仍然需要获得足够的供体细胞群体的能力，所述供体细胞群体被可靠地调理以使得在其治疗活性方面是可预测的。本发明的方法和装置为这些问题提供了解决方案，因此有利于细胞用作细胞治疗剂或用作可溶性因子的来源。
生物反应器是在其中生物材料的成分诸如含干细胞流体可以通过操纵影响材料的因素进行调理的设备。含干细胞流体的状态受多种因素影响，包括pH、废物含量、营养物质含量以及溶解气体的类型和浓度(例如像氧气)。这些因素通常可以被称为影响含干细胞流体中干细胞的状态的化学因素。
生物反应器可以使得能够通过控制非化学因素来操纵含干细胞流体的状态。调理用于常规细胞疗法的细胞群体的常规装置和方法不能精确控制对待调理细胞的机械剪切。因此需要用于对能够大规模生产细胞的生物反应器流动室内的待调理细胞可控制地施加剪切应力的装置和方法。
发明概述
本发明的实施方案包括装置，所述装置能够控制影响含干细胞流体的状态的至少一个机械因素。更具体地，本发明的实施方案包括能够控制施加到含有干细胞的流体内的干细胞的剪切应力速率的装置。本发明的实施方案可以用于使培养基流体流过一个或多个流动室，所述一个或多个流动室被成形为提供非常高的流动边界层周长与横截面流动面积之比，从而最大化机械力(剪切)对粘附至室的干细胞的调理作用。
对于给定的流动通道，针对对应的横截面流动面积的非常大的边界层周长计算为流动室的周长除以横截面流动面积。例如，圆形流动通道提供了针对对应的横截面流动面积的最小可实现的流动边界层周长，其计算为：2πr÷πr2＝2/r。注意，在所有其它因素(湍流或层流状态、表面粗糙度等)一样的情况下，具有最小周长与横截面流动面积之比的流动通道通常使得在流体流过流动通道时传递至流体的剪切应力最小。
针对对应的横截面流动面积的最大流动边界层周长通过例如无限宽且极薄的通道来提供，针对对应的横截面流动面积可实现的流动边界层周长理论上接近∞。当然，无限宽且极窄的通道是不实际的，因为它会对流动施加无限大阻力，但是通过提供宽而薄的流动通道来实现针对相应的横截面流动面积的非常大的流动边界层周长以促进沿流动边界层周长将剪切施加至移动通过其中的含干细胞流体。
本发明装置的一个实施方案提供一种装置，所述装置包括第一盖，其具有第一端部、第二端部、位于两者间的壁、在第一端部近侧的入口流体连接器、在第一端部近侧的立管孔、和供给通道，所述供给通道从入口流体连接器延伸到立管孔以将立管孔设置成与入口流体连接器流体连通；第二盖，其具有第一端部、第二端部、位于两者间的壁、在第二端部近侧的出口流体连接器、在第二端部近侧的立管孔、和排放通道，所述排放通道从立管孔延伸到出口流体连接器以将立管孔设置成与出口流体连接器流体连通；以及至少一个中间模块，其被设置在第一盖的壁与第二盖的壁的中间，并且在将装置组装时与第一盖和第二盖中的每一个可密封地接合，每个中间模块包括框架，所述框架具有第一端部、第二端部、位于其间的阻挡件，所述阻挡件具有朝向第一盖的壁设置的第一侧和朝向第二盖的壁设置的第二侧，所述阻挡件被设置在框架内并且位于第一端部与第二端部之间，以在第一盖的密封面与中间模块的第一侧的密封面可密封地接合时在第一盖的壁与中间模块的阻挡件之间形成第一流动室，并且也在第二盖的密封面与中间模块的第二侧的密封面、第二盖的密封面与中间模块可密封地接合时在第二盖的壁与中间模块的阻挡件之间形成第二流动室；在框架中的模块供给孔，所述模块供给孔在中间模块的第一端部的近侧以在将装置组装时可密封地接合第一盖的立管孔；在框架中的分配通道，所述分配通道在中间模块的第一端部的近侧并且与模块供给孔流体连通以将接收的流体流从模块供给孔分配到分配通道中；多个流动室供给口，所述供给口被设置在中间模块的第一端部的近侧并且与分配通道流体连通以用于将接收的流体流引入到第一流动室和第二流动室中；多个流动室排放口，所述排放口被设置在中间模块的第二端部的近侧并且与第一流动室和第二流动室流体连通；聚集通道，所述聚集通道沿着中间模块的第二端部设置并且通过流动室排放口与第一流动室和第二流动室流体连通；模块排放孔，所述模块排放孔在中间模块的第二端部的近侧并与采集通道流体连通并且用于在将装置组装时可密封地接合第二盖的立管孔，其中在将装置组装之后，一个或多个中间模块设置在第一盖与第二盖中间以将一个或多个中间模块上的第一侧密封面与第一盖上的密封面密封地结合并且也将一个或多个中间模块上的第二侧密封面与第二盖上的密封面密封地接合，使第一盖的入口流体连接器与第二盖上的出口流体连接器设置成可密封地接合以提供分支流体路径，所述分支流体路径包括第一流动室和第二流动室，所述第一流动室设置在多个流动室供给口中的至少一些与多个流动室排放口中的至少一些中间并且设置在至少一个中间模块第一侧与第一盖中间，所述第二流动室设置在多个流动室供给口中的至少一些与多个流动室排放口中的至少一些之间并且设置在至少一个中间模块第二侧与第二盖中间，其中在跨装置的入口流体连接器和出口流体连接器提供流体压力差时，沿着分配通道分布的多个流动室供给口和沿着中间模块的聚集通道分布的多个流动室排放口提供流动室内的更均匀的局部流体速率，其中第一流动室的周长与第一流动室的横截面流动面积之比突出。
本发明的某些实施方案涉及产生经调理组合物的方法。如本文所用，经调理组合物是指已经受到机械力的调理作用的组合物。例如，机械力可以是以足够产生经调理组合物的力施加受控性剪切应力。在一些方面，经调理组合物包含经调理的多能细胞(例如MSC)的群体。因此，某些方面涉及分离经调理的多能细胞的群体。在另外的方面，经调理组合物是包含来自已经受受控性剪切应力的多能细胞的分泌因子的培养基(例如无细胞培养基)。
实施方案的方面涉及在基底上培养干细胞以实现细胞粘附。在一些情况下，基底是支持干细胞单层生长的表面。例如，在一些方面，表面是塑料或玻璃表面，诸如已用细胞外基质材料(例如，胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和/或玻连蛋白)涂布的表面。在另外的方面，基底可以被改性以结合具有增加的或降低的表面能的表面(或表面涂层)。可以用作表面或表面涂层的低能材料的实例包括但不限于烃聚合物，诸如聚乙烯或聚丙烯和氮化物。例如，表面或表面涂层可以包括聚六氟丙烯、聚四氟乙烯、聚(偏二氟乙烯)、聚(三氟氯乙烯)、聚乙烯、聚丙烯、聚(甲基丙烯酸甲酯)-PMMA、聚苯乙烯、聚酰胺、尼龙-6,6、聚(氯乙烯)、聚(偏二氯乙烯)、聚(对苯二甲酸乙二醇酯)、环氧树脂(例如橡胶韧化或胺固化的)、酚-间苯二酚树脂、脲醛树脂、苯乙烯-丁二烯橡胶、丙烯腈-丁二烯橡胶和/或碳纤维增强塑料。可以用作表面或表面涂层的高能材料的实例包括但不限于金属和氧化物。例如，表面或表面涂层可以包括氧化铝、氧化铍(Berylium oxide)、铜、石墨、氧化铁(Fe 2O 3)、铅、汞、云母、镍、铂、二氧化硅-硅石和/或银。
实施方案的另外方面涉及以足够产生经调理组合物的力施加受控性剪切应力。在某些方面，剪切应力以流体层流剪切应力的形式施加。例如，剪切应力的力为至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10达因/平方厘米。在某些情况下，剪切应力的力至少为5、10或15达因/平方厘米，诸如在约5-20、5-15、10-20或10-15达因/平方厘米之间。在一些方面，受控性剪切应力施加约1分钟至2天的时间段。例如，受控性剪切应力可以施加5分钟至24小时、10分钟至24小时、0.5小时至24小时或1小时至8小时的时间段。在另外的方面，将实施方案的细胞暴露于升高的压力。
在还另外的方面，对来自实施方案的培养物的细胞或培养基进行周期性地测试，以确定调理水平。例如，可以约每10分钟、15分钟、30分钟或每小时从培养物中获取包含细胞或培养基的样品。可以测试此类样品，例如以确定抗炎因子诸如转录因子或细胞因子的表达水平。在特定的方面，细胞或培养基可以从定位于较低流体压力的位置处，包括在例如被配置来引导流体通过装置的泵的入口附近的采样口获取。
在某些方面中，获得干细胞的起始群体。例如，起始干细胞群体可以包括诱导多能干(iPS)细胞或间充质干细胞(MSC)。在一些方面，MSC从组织中分离。例如，在一些方面，组织包括骨髓、脐带血、外周血、输卵管、胎肝、肺、牙髓、胎盘、脂肪组织或羊水。在另外方面，细胞是人细胞。例如，细胞可以是自体干细胞。在一些方面，干细胞是转基因细胞。
在实施方案的另外方面，生产经调理组合物的方法包括因施加受控性剪切应力而使流体流经干细胞。例如，流经干细胞的流体可以是细胞生长培养基。在一些方面，生长培养基至少包含第一外源性细胞因子、生长因子、TLR激动剂或炎症刺激剂。例如，生长培养基可以包含IL1B、TNF-α、IFNγ、Poly I:C、脂多糖(LPS)、豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)和/或前列腺素。在某些具体方面，前列腺素是16,16'-二甲基前列腺素E2(dmPGE2)。
在某些方面，与干细胞的起始群体相比，实施方案的经调理干细胞具有高至少2-、3-、4-、5-或6-倍的抗炎基因表达。例如，抗炎基因可以是TSG-6、PGE-2、COX-2、IL1Ra、HMOX-1、LIF和/或KLF2。
在另外的实施方案中，经调理组合物包含条件培养基的组合物。因此，某些方面涉及在施加剪切应力之后分离条件培养基。在一些情况下，条件培养基是基本不含细胞的。
实施方案的另外方面涉及在生物反应器(例如像在此详述的生物反应器)中施加剪切应力。在某些方面，生物反应器系统包括入口流体供给板、基板以及定位在入口流体供给板与基板之间的多个中间板。例如，中间板包括第一端部、第二端部、第一侧和第二侧；在第一端部近侧的分配通道；以及在第二端部近侧的聚集通道。在另外的方面，分配通道在中间板的第一侧与第二侧之间延伸。在某些方面，聚集通道在中间板的第一侧与第二侧之间延伸。在一些情况下，生物反应器系统还包括贮存器、第一导管和第二导管。在某些方面，入口流体供给板包括第一流体入口、第一流体出口、第二流体入口和第二流体出口。例如，贮存器通过第一导管联接到第一流体入口并且通过第二导管联接到第二流体出口。
在实施方案的另外方面中，生物反应器系统包括联接到入口流体供给板的第一流体出口和第二流体入口的泵。在某些方面，泵被配置来通过第一流体入口和第一流体出口从贮存器抽取流体，并且将流体引导通过第二流体入口、穿过多个中间板、从第二入口出来并返回至贮存器。在一些方面，流体通过第二流体入口的速率通过泵的滚动元件的旋转速度来控制。在某些方面，生物反应器系统提供高流动边界层周长与横截面流动面积之比。在一些方面，生物反应器系统能够大规模生产细胞。例如，产生经调理组合物的方法是自动化的。
实施方案的某些方面提供了治疗有效量的经调理干细胞的组合物。一些方面提供了治疗需要这种治疗的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的经调理干细胞。例如，细胞可以包括通过根据实施方案的方法获得的经调理组合物(例如，细胞组合物或条件培养基)。如本文所证实的，在一些方面，此类经调理组合物在受试者中提供增强的干细胞移入。例如，在一些方面，受试者患有慢性或急性炎症、移植物抗宿主病、神经损伤(例如，缺血性损伤诸如中风或外伤性脑损伤)、肌肉骨骼外伤或自身免疫性病症。在一些方面，经调理干细胞与一种或多种另外的治疗剂组合施用。
在还另一实施方案中，提供增加患者骨髓中的CD105+细胞的方法，所述方法包括向患者施用有效量的干细胞(例如间充质干细胞)。例如，细胞可以包括通过根据实施方案的方法获得的经调理组合物(例如，细胞组合物或条件培养基)。在一些方面，患者具有神经损伤，诸如缺血性损伤(例如来自中风)或外伤性脑损伤。在某些方面，患者在施用细胞之前不到24、18、12或6小时已经罹患神经损伤。
某些方面，实施方案涉及对细胞和/或经调理组合物的施用。在一些方面，施用可以是局部的，诸如施用在患病或受损组织内或附近。在另外的方面，施用是全身性的。例如，施用可以通过注射组合物，诸如静脉内注射进行。
通过以下详细描述，本发明的其它目的、特征和优势将变得显而易见。然而，应当理解，尽管指示本发明的某些实施方案，但是详细描述和特定实施方案仅通过说明的方式给出，因为从此详细描述中，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
附图简述
本发明的方法、系统和装置的目的和优点在结合下面的详细描述和以举例的方式图解本系统和方法的优选实施方案的附图时将更好地理解和更容易明白。
图1是根据本公开的生物反应器壳体的供给盖的平面图。
图2是图1的供给盖的侧正视图。
图3是图1和2的供给盖的截面正视图，穿过立管孔所截取。
图4是图1-3的供给盖的端视图。
图5是根据本公开的生物反应器壳体的中间模块的平面图。
图6是图5的中间模块的侧正视图。
图7是图6的中间模块的侧正视图的第二端部处的流体通道的放大图。
图8是图5-7的中间模块的第二端部的端视图。
图9是本发明的生物反应器壳体的排放盖的平面图。
图10是图10的排放盖的侧正视图。
图11是图10和11的排放盖的截面正视图，穿过立管孔所截取。
图12是图10-12的排放盖的端视图。
图13是本公开的组装的生物反应器壳体的截面正视图，其具有可连接到容器(未示出)的分支流体路径，所述容器含有待使用生物反应器进行调理的流体并且可连接到收集容器(未示出)以从生物反应器接收流体。
图14是图13的生物反应器壳体的侧正视图。
图15是图13的生物反应器壳体的透视图。
图16是根据本公开的细胞制备系统的一个实施方案的分解图。
图17是图16的细胞制备系统的透视组装视图。
图18是包括多个模块化细胞制备装置的细胞制备系统的第一透视图。
图19是图18的细胞制备系统的第二透视图。
图20图表证明在受流体剪切应力的人MSC中对于COX2、TSG6、HMOX1和IL1RN的转录诱导是稳健的。hBM MSC，人骨髓MSC(每个图表中的前四个条)；hAF MSC，羊水MSC(每个图表中倒数第二个条)；hAD MSC，脂肪来源的MSC(每个图表中的最后一个条)。P值通过配对t检验、等方差计算。
图21示出代表性蛋白质印迹，其显示细胞内COX2蛋白增加，所述COX2蛋白通过NF-kB拮抗剂BAY11-7085(10μM)降低。
图22示出突出MSC免疫调节的功能增强的TNF-α细胞因子抑制测定。将通过机械力(15达因/cm2剪切应力，持续3小时)预调理的人MSC与脂多糖(LPS)或植物血球凝集素(PHA)激活的脾细胞(包括巨噬细胞、嗜中性粒细胞、NK细胞、B细胞和T细胞)一起置于静态共培养中。测定的结果显示，当MSC用剪切应力进行短暂调理时，脾细胞的TNF-α分泌减少10％-50％。较低的值对应于较大的抗炎效力。hBM MSC，人骨髓MSC；hAF MSC，羊水MSC(图表中用“*”指示)；hAD MSC，脂肪来源的MSC(图表中用“^”指示)。P值通过配对t检验、等方差计算。
图23示出对COX2的抑制(吲哚美辛，10μM；NS-398，10μM)并且NF-kB(BAY11-7085，10μM)消除剪切应力的正面效应，而异位dmPGE2(10μM)模拟了MSC抑制。星号指示p<0.001，与静态媒介物相比。n＝6指示显示的数据中包括六种不同的MSC供体细胞系。
图24示出引发剂补充剪切诱导的抗炎信号传导。变暗的条代表处理组合，其指示由剪切应力和细胞因子(IFN-γ，20ng/ml；TNF-α，50ng/ml)对通路的实质诱导。在这种低性能人羊膜MSC系中，TSG6仅由剪切应力诱导。IDO仅由IFN-γ诱导。hAF MSC，人羊水MSC。
图25A-D说明在大鼠中由外伤性脑损伤引起的骨髓细胞成分的破坏通过静脉内施用WSS-预调理的人MSC而消除。(A)通过CCI进行外伤性脑损伤后24小时在骨髓中对内源性大鼠MSC的免疫检测揭示对CD105+群体(复染剂来源于核固红)的耗尽。(B)在CCI后骨髓中存在更少的CD105+MSC。(C)在损伤后72小时检测到CD105(苏木精复染)。(D)在CCI后72小时对CD105MSC频率的定量揭示当在CCI后24小时静脉内施用MSC疗法时通过MSC疗法保护了骨髓细胞成分。对CD105+MSC群体的保护作用通过对治疗上使用的MSC进行WSS预调理得以增强(单因素方差分析，***p<0.001)。
详述
当处理多能干细胞，诸如间充质干细胞(MSC)时，控制分化的结果是开发细胞疗法中的关键步骤。生成一致的结果需要精确控制细胞环境，其包括许多参数。这些参数包括化学因素，诸如营养素、废产物、pH和溶解气体。许多现有技术的生物反应器已经被设计和制造以控制和监测这些化学参数。
然而，机械环境也在干细胞的结果中起着显著作用。机械环境取决于两个主要因素：基底和周围培养基的动态。可以通过仔细选择表面处理或涂层来控制基底刚度，其可以影响细胞对基底的粘附性以及分化结果。
在细胞群体附着到基底之后，使它们经受由细胞所浸入的培养基施加的机械力。在传统的细胞培养中，这些力基本上为零，因为不存在培养基的总体流动。现有的生物反应器系统具有恒定或可变的流体流动(培养基)，但是缺乏对流动模式(层流单向或双向对湍流)或对与细胞相互作用的剪切力的程度的设计控制。移动流体对细胞施加与流体速率和粘度成正比的剪切应力。大多数机械力传导研究已经在层流状态下进行，其中剪切应力行为是众所周知的，并且由简单的方程表征。层流的特征在于流动通道横截面上的不均匀速率分布。边界(例如壁)处的流体速率可以假定为零，这称为“无滑移条件”或“边界条件”。描述层流中牛顿流体的剪切应力(τ)的直接方程为τ＝-μ(du/dy)，其中μ是粘度，u是流体在通道中特定深度处的速率。已知培养基粘度和流体速率，可以计算出施加的剪切应力。
保留分化成多种细胞类型的能力的细胞群体(例如，干细胞)已被证明可用于开发大量谱系特异性分化的细胞群体。间充质干细胞(MSC)是这样一种类型的干细胞，并且已知是多能性和自我更新性的。因此MSC已显现为候选的细胞治疗剂，并且可以潜在地提供持续的生物活性免疫调节分子来源。然而，目前限制使用MSC的临床效力的障碍之一是MSC功能的诱导严重依赖于由激活的免疫细胞产生的细胞因子和信号的存在，所述细胞因子和信号进而引发MSC的免疫调节活性。在本发明方法之前，例如，这种可变性已经转化为干细胞组合物的不可预测的治疗活性。
在一些方面，本文所述的生物反应器系统提供增加数量的干细胞(例如，MSC)，所述干细胞也已经在体外关于免疫调节功能进行可预测且可靠的调理。由此获得的干细胞提供了关于免疫调节功能进行可靠且一致的调理的治疗有效数量的MSC。在其它实施方案中，所述系统提供可以分离和纯化以用作治疗剂的分泌因子来源。
在一些实施方案中，此类方法可提供经调理的细胞(诸如MSC)以用于疗法中并且例如用于抑制与损伤(例如，神经损伤)相关的慢性或急性炎症、移植物抗宿主病和自身免疫。这种经调理组合物在本文中已经被证明在施用后提供增强的细胞移入潜力，这可以显著增强治疗方法的效力。
某些实施方案包括用于产生增加数量的治疗上可预测地经调理细胞的系统，所述细胞诸如但不限于用于基于细胞的疗法的MSC。在一些实施方案中，所描述的系统可以尤其用于调理MSC以表现出抗炎性和免疫调节特性，从而当例如在损伤位点处注射此类经调理细胞或其产生的因子时治疗多种类型的肌肉骨骼外伤和炎性病状。
在一些实施方案中，所述系统包括模块化生物反应器系统，其集成了对流体动力学微环境的控制以指导对细胞(诸如但不限于MSC)的基于机械的调理。
根据本发明使用生物反应器壳体来调理培养基流体流内的细胞(例如，使培养基流经粘附细胞以提供所施加的剪切力)。在下面讨论的附图中示出生物反应器壳体的一个实施方案。
图1是生物反应器壳体的一个实施方案的供给盖12的平面图。供给盖12包括第一端部15和第二端部18以及位于两者间的壁13。供给盖12还包括供给通道16(以虚线示出)，其在第一端部15的近侧并且始于入口流体连接器11处并终止于立管孔17处，所述立管孔17所述从供给通道16朝向图1的观察者延伸。在图1供给盖12的实施方案中，供给通道16的短部分19垂直于供给通道16转向以连接到立管孔17。供给盖12包括围绕壁13的密封面14。应当注意的是，在位置50处在供给盖12上不存在第二立管孔。对于注意这种不存在的原因将在考虑到下面的公开内容之后变得清晰。
图2是图1的供给盖12的侧正视图，其揭示了在入口流体连接器11内部的密封件16，用以密封地接合连接到加压流体源的流体导管(未示出)。箭头指示在供给盖12的第一端部15的立管孔17的位置。供给盖12的壁13在图2和3中示出为在供给盖12的顶侧，与其相对的是，供给盖12的外部20示出为在供给盖12的底侧。应当理解，本发明装置的实施方案的盖和模块可在不损害功能的情况下以其它方式取向。
图3是图1和2的供给盖12的截面图，穿过在供给盖12的第一端部15近侧的立管孔17所截取。立管孔17从供给通道16接收流体并且将流体流递送到一个或多个中间模块(图3中未示出)，其中至少一个中间模块抵靠密封面14被可密封地接收。
图4是图1-3的供给盖12的端视图。图4示出入口流体连接器11在供给盖12的第一端部15的近侧的位置、供给通道16从入口流体连接器11延伸到立管孔17。应当注意的是，供给盖12的入口流体连接器11、供给通道16和立管孔17设置在供给盖12的第一端部15的近侧，并且没有对应的流体通道被设置在供给盖12的第二端部18的近侧。
图5是本发明的生物反应器壳体的中间模块30的平面图，其适于密封且可操作地接合供给盖12。中间模块30包括第一侧31和第二侧32(图5中未示出)，每个侧具有密封面44以接合供给盖12的密封面14。中间模块30还包括穿过中间模块30并且在中间模块30的第一端部47的近侧的第一模块孔34。模块孔34被定位成在中间模块30的第一侧31的密封面44与供给盖12的对应密封面14可密封地接合时与图1-4的供给盖12的立管孔17相接并重合。中间模块30还包括在中间模块30的第二端部48的近侧并且处于一定位置以重合于且接合第二供给盖12的第二模块孔134(第二供给盖12可以与第一供给盖12相同，但围绕图1的轴线60旋转180度。应当理解，第二供给盖12将接合中间模块30的第二侧32上的密封面44，并且第一供给盖12将接合中间模块30的第一侧31的密封面44。应当进一步理解的是，在供给盖12的第二端部18的近侧不存在第二立管孔17能够使供给盖12的密封面14封闭中间模块30的(在中间模块30的第二端部48的近侧)第二模块孔134。在本发明的装置的一个实施方案中，供给盖12可以因此构造成在供给盖12接合中间模块30的第一侧31的第一模式下用于接收流体流并将所述流递送至中间模块30的第一端部47，并且在第二供给盖12接合中间模块30的第一侧32的反向第二模式下用于从多个流体室接收流体流，所述流体室包括在第一供给盖12的密封面14与反向第二供给盖112的密封面44接合之后形成在第一供给盖12的壁13与中间模块30的阻挡件39之间的至少第一流体室38A，和在第二供给盖112的密封面14与反向第二供给盖112的密封面114接合之后形成在反向第二供给盖112的壁113与中间模块30的阻挡件38之间的第二流体室38B。结合图9-12进一步讨论第二供给盖112的结构。
图5的中间模块30还包括扩散器供给通道35，其在中间模块30的第一端部47的近侧并且始于模块孔34处并终止于分配通道36处。扩散器供给通道35大致在中间模块30的第一端部47近侧的第一模块孔34的远侧延伸到分配通道36。中间模块30的分配通道36从扩散器供给通道35接收流体流并且从扩散器通道35朝向中间模块30的第一边缘57延伸并且还从扩散器通道35朝向中间模块30的第二边缘58延伸。类似地，图5的中间模块30还包括注入器排放通道135，其在中间模块30的第二端部48的近侧并且始于注入器133处并终止于聚集通道136处。注入器排放通道135大致在中间模块30的第二端部48近侧的第二模块孔134的近侧延伸到聚集通道136。中间模块30的聚集通道136从注入器133接收流体流，并通过输液器排放通道135将流体流引导至第二模块孔134。
图6是图5的中间模块30的侧正视图，其揭示布置在第一流体室38A内的多个流体扩散器33、设置在第二流体室38B内的多个流体扩散器33、设置在第一流体室38A内的多个流体注入器133和设置在第二流体室38B内的多个流体注入器133的定位，多个流体扩散器33在中间模块30的第一端部47的近侧并且多个流体注入器133在中间模块30的第二端部48的近侧。应当理解，本文使用的术语“扩散器”是指用于降低流体速率并增加流体静压的设备。应当理解，本文使用的术语“注入器”是指用于接收低速、高压流并将其转换成高速、低压流的设备。
图7是图6的中间模块30的侧正视图的第二端部48处的多个连接流体通道和注入器133的放大图。应当理解，在附图中示出的本发明装置的实施方案中的流体通道的布置可以不同的方式布置，而不会实质上改变它们的功能。图7揭示具有穿过其中的第二模块孔34的中间模块30。第二模块孔134是通过注入器排放通道135流体连接到聚集通道136。如图7的观察者所看到的那样，聚集通道136与页面相交地延伸，以通过对应的多个口通道137与多个扩散器133流体连接。流体进入彼此由阻挡件39分隔的第一流体室38A和第二流体室38B，至注入器133、至口通道137、聚集通道136、注入器排放通道135、至第二模块孔134。将会注意到，图7示出多个口通道137的延伸到第一流体室38A和第二流体室38B中的部分40。
图8是图5-7的中间模块的截面端视图，其揭示从第一流动室38A和第二流动室38B接收流体的注入器133的位置。应当理解，图8也可以被视为中间模块30的截面端视图，其揭示将流引入第一流动室38A和第二流动室38B的扩散器33的位置。图8示出注入器133(在中间模块30的第二端部48处)的间距和扩散器33(在中间模块30的第一端部47处)的间距。
图9是本发明的生物反应器壳体的实施方案的排放盖112的平面图。排放盖112包括第一端部115和第二端部118以及位于两者间的壁113。排放盖112还包括排放通道116(以虚线示出)，其在第一端部115的近侧并且起始于立管孔117处并终止于出口流体连接器111处。立管孔117从排放通道116朝向图9的观看者延伸。在图9排放盖112的实施方案中，排放通道116的短部分119垂直于排放通道116转向以连接到立管孔117。排放盖112包括围绕壁113的密封面114。
图10是图9的排放盖112的侧正视图，其揭示了在出口流体连接器111内部的密封件116，用以密封地接合连接到用于从生物反应器10接收经调理流体的收集器的流体导管(未示出)。箭头指示立管孔117的位置。排放盖112的壁113示出为在排放盖112的顶侧，与其相对的是，排放盖112的外部120示出为在排放盖112的底侧。应当理解，本发明装置的实施方案的盖和模块可在不损害功能的情况下以其它方式取向。
图11是图9和10的排放盖112的截面侧视图，穿过立管孔117所截取。立管孔117经由中间模块30的第二模块孔134(参见图5-8)从第一流体室38A和第二流体室38B接收流体，并且将所述流递送到排放盖112，所述排放盖112具有密封面114，所述密封面114抵靠中间模块30的第一侧31的密封面44被可密封地接收。
图12是图9-11的排放盖112的截面端视图。图12示出出口流体连接器111在排放盖112的第一端部115的近侧的位置并且排放通道116从出口流体连接器111延伸到立管孔117。应当注意的是，进料盖112的出口流体连接器111、排放通道116和立管孔117设置在排放盖112的第一端部115的近侧，并且没有对应的流体通道被设置在第二端部118的近侧。
图13是本发明的组装生物反应器壳体10的透视图，其中从图13中分别省略了供给盖12和排放盖112的入口流体连接器11和出口流体连接器111，以更好地揭示供给盖12的立管孔17、排放盖112的立管孔117的定位，第一模块孔可连接到含有待用于调理布置在生物反应器10的流室38A和38B内的干细胞的流体的容器(未示出)并且出口流体连接器111(未示出)可连接到用于从生物反应器接收经调理流体的容器。
应当理解，图13中示出的组装生物反应器壳体10包括供给盖12、排放盖112和位于其间的中间模块30。应当进一步理解，通过生物反应器壳体10的流体的流量和流向取决于压力差(流体入口连接器11处的压力与流体出口连接器111处的压力之间的差异)、流体流过生物反应器10的阻力、流体的粘度和其它因素。供给盖12、中间模块30和排放盖112可以各种方式固定在图13的生物反应器壳体10的组装构造中，所述方式包括使用夹具、索线、系带等等。
可替代地，供给盖12、中间模块30和排放盖112可通过以下方式固定在图13的生物反应器壳体10的组装构造中：提供具有因相互吸引而进行取向的嵌入或连接磁性构件的供给盖12、排放盖112和中间模块30。图14和图15示出了生物反应器壳体10的实施方案，所述生物反应器壳体10具有嵌入在沿着供给盖12的周边的多个位置处的多个稀土磁体49，并且对应的多个稀土磁体可以嵌入在沿着排放盖112的周边的对齐位置中。
现参照图16和17，生物反应器壳体200的另一个实施方案分别以透视图和分解图示出。为了清楚起见，在每个附图中并不是所有的元件都用附图编号标记。生物反应器壳体200包括入口流体供给板212、多个中间模块板232和基部模块板234。每个中间模块板232包括第一端部233、第二端部235、第一侧273和第二侧275。此外，中间模块板232垂直堆叠在入口流体供给板212与基部模块板234之间。
如图18和19所示，生物反应器200可被组装为在模块化细胞制备装置300中的部件。在图18和19中所示的实施方案中，多个模块化细胞制备装置300被组装成细胞制备系统400中的部件。细胞制备系统400包括被配置来支撑多个模块化细胞制备装置300的基座450。在所示的实施方案中，每个细胞制备系统包括生物反应器壳体200、贮存器220、第一外壳271、第二外壳272和泵250。贮存器220通过供应导管215和回流导管225与生物反应器壳体200流体连通。
现具体参照图16和17，生物反应器壳体200包括具有中心通道217的入口流体供给板212，所述中心通道217具有第一流体入口211和第一流体出口221。入口流体供给板212还包括第二流体入口231和第二流体出口241。如图18和19所示，第一流体入口211和第二流体出口241可以联接到贮存器220，而第一流体出口221和第二流体入口231可以联接到泵250。在某些实施方案中，泵250可以被配置为滚子(例如蠕动)泵。泵250包括滚动元件252和可压缩导管254。在运行期间，滚动元件252通过电动机260旋转。来自贮存器220的流体通过导管215抽取到第一流体入口211、通过中央通道217和第一流体出口221进入可压缩导管254。然后流体被引导至第二流体入口231并且到达与中间模块板232流体连通的分配口238。
中间模块板232各自包括与分配口238流体连通的入口237。每个中间模块板232还包括与入口237流体连通的分配通道253。每个分配通道253和入口237在中间模块板232的第一端部233的近侧。每个分配通道253横跨培养板239延伸并在培养板239上分配流体。在流过培养板239之后，通过聚集通道263来收集流体，所述聚集通道263与每个中间模块板232中的返回口261流体连通。聚集通道263和返回口261在中间模块板232的第二端部235。因此，流体必须流过培养板239以进入聚集通道263。返回口261进一步与第二流体出口241流体连通，所述第二流体出口241通过返回导管225与贮存器220流体连通。
流体培养板239的流从分配通道253流至聚集通道263使培养板239上的受试者细胞经受剪切应力。通过泵250将流体从贮存器220再循环至生物反应器壳体200(包括多个中间模块板232和培养板239)的能力使得剪切应力的施加持续延长(理论上无限制)的时间段。
在示例性实施方案中，希望将施加到培养板239上的细胞的剪切应力的量控制在均匀的水平下，并且最小化在培养板239上的不同位置处施加的剪切应力的差异。对细胞维持均匀施加的剪切应力的一个因素是流体培养基相对于细胞和培养板239的速率。减少流体速率的变化可以帮助维持更均匀施加的剪切应力。如图16所示，分配通道253和聚集通道263在基本上延伸跨过中间模块板232的表面的宽度W(例如，中间模块板232的第一侧273与第二侧275之间的尺寸)。在某些实施方案中，分配通道253和聚集通道263的长度L(例如，平行于中间模块板232的尺寸W测量的通道的每个端部之间的距离)延伸跨过中间模块板232的宽度W的大部分。在特定实施方案中，长度L为宽度W的至少70％、75％、80％、85％、90％或95％。例如，与不延伸跨过大部分培养板239的入口和出口相比，此构造可以提供更均匀速率的流体培养基穿过培养板239。粘附在培养板239上的细胞进而受到更均匀的剪切应力。
施加至细胞的剪切应力的水平还可以通过调节各种运行参数来控制。例如，通过调节滚动元件252压缩可压缩导管254的量可以改变通过泵250施加至流体的压力。流过培养板239的流体的体积和速率也可以通过改变电动机260的速度来调节，这又将改变滚动元件252的旋转速度。额外的控制可以通过选择部件的特定尺寸和几何形状，包括但不限于表面光洁度(例如粗糙度)、培养板239的长度和宽度，以及中间模块板232之间的距离来完成。
此外，以垂直叠堆使用具有培养板239的多个中间模块板232使得待经受剪切应力的细胞数量增加。此外，在细胞制备系统400中使用并行操作的多个模块化细胞制备装置300可以进一步增加受到剪切应力的细胞数量以备进一步处理或分析。
在某些实施方案中，模块化细胞制备装置300(单独操作或作为细胞制备系统400的部件)可被操作来控制流体动力学微环境以便以受控性方式引导对细胞(包括但不限于MSC)的机械力传导调理。以举例的方式，本文提供的研究证实，所述方法和装置通过以下方式调理细胞群体(包括例如MSC)：使所述细胞群体按需经受均匀且可控剪切应力来调理此类细胞以表达特定活性，包括但不限于免疫调节因子的诱导和释放。
以下实施例中提供的研究展示了使人细胞培养物(例如MSC)受到类型类似于由本发明设备提供的类型的剪切应力的方法，但是使用了不太灵活的系统、使用了在其施加剪切应力的能力级别上相当有限和制备性较少的设备。然而，这些研究说明剪切应力可用于调理细胞表达特定活性，诸如但不限于免疫调节因子的诱导和释放。
本文呈现的结果证实功能性MSC可以直接调理以表达和产生抗炎性和免疫调节因子。在细胞疗法的情况下，这种技术有望为受与损伤或疾病相关的炎症影响或处于患所述炎症的风险下的患者提供缓解。这表明使用由本发明系统提供的类型的剪切应力来调理MSC实质上增加了它们在预先存在的炎症环境中抑制炎性细胞的能力，并且可以有助于预防和消退炎症。
此外，与使用诱导MSC细胞免疫调节活性，包括例如产生抗炎性分子的替代性可用技术的情况相比，通过使用本文所述的系统，可更快速、均匀且可靠地完成调理。所描述的调理细胞的系统在将受试者自身(自体)细胞用作治疗剂和需要细胞扩增和调理的方法时可能是特别有利的。
在不存在调理时，初始MSC几乎不或没有表达免疫抑制的关键调节剂，诸如多官能抗炎蛋白TNF-α刺激的蛋白6(TSG-6)、前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂(IL1RN)。如以下实施例中详述的，来源于三种人组织来源即骨髓、脂肪和羊水的MSC均被发现对这种基于剪切应力的调理系统具响应性，使得免疫调节信号的激活可以在不同程度上检测到。具体地，在编码TSG-6、COX-2、IL1Ra、HMOX-1，LIF和KLF2的MSC基因的转录中对经调理人骨髓来源的MSC进行评价，使用由本系统提供的类型的层流式剪切应力刺激了基因表达的深度上调，其中增加了6-至120-倍。
示例性实施方案包括用于提供经调理细胞群体的方法，所述方法包括：获得细胞群体并且使细胞经受受控性剪切应力。某些实施方案包括用于提供经调理细胞群体的方法，所述方法包括：获得细胞群体；将所述细胞在细胞培养基中培养；并且使细胞经受足够力的可控剪切应力以调理细胞。在一些实施方案中，细胞最初从哺乳动物获得。在一些实施方案中，细胞最初从伴侣动物获得。在优选的实施方案中，细胞最初从人获得。在一些实施方案中，细胞最初从骨髓获得。在一些实施方案中，细胞最初从羊水获得，而在其它实施方案中。而在一些实施方案中，细胞最初从脂肪组织获得。在一些实施方案中，经受受控性剪切应力的细胞是MSC。
在另外的实施方案中，是获得治疗有效数量的经调理细胞的方法。在一些实施方案中，是获得使用本文所述的装置和方法调理的治疗有效数量的细胞的方法。在一些实施方案中，是获得使用下述方法调理的治疗有效数量的细胞的方法，所述方法包括：获得细胞群体；施加足够力的受控性剪切应力以调理此类细胞从而按需要起作用。在一些其它实施方案中，是获得使用下述方法调理的治疗有效数量的细胞的方法，所述方法包括：获得细胞群体；施加足够力的受控性剪切应力以调理此类细胞从而按需要起作用。在一些实施方案中，是获得使用下述方法调理的治疗有效数量的细胞的方法，所述方法包括：获得细胞群体；将细胞在细胞培养基中的第一培养表面上培养，使得细胞粘附至第一培养表面；并且施加足够力的受控性剪切应力以调理此类细胞从而按需要起作用。在一些实施方案中，是获得使用下述方法调理的治疗有效数量的细胞的方法，所述方法包括：获得细胞群体；将细胞在细胞培养基中的培养表面上培养，使得细胞粘附至阻挡件上；并且施加足够力的受控性剪切应力以调理此类细胞从而按需要起作用。
在类似的实施方案中，是用于提供经调理细胞群体的方法，所述方法包括：获得细胞群体；将细胞在细胞培养基中的培养系统中培养，使得细胞粘附至阻挡件；使细胞培养基流经所述细胞以提供足够力的受控性流体层流式剪切应力来调理所述细胞。在一些实施方案中，经调理细胞表达抗炎活性。在一些实施方案中，抗炎活性包括基因表达的增加，所述基因选自包括编码TSG-6、COX-2、IL1RN、HMOX-1、LIF或KLF2的那些基因的组。在一些实施方案中，所述活性包括经调理细胞对COX2蛋白的表达增加。
另外的实施方案包括组合物，其包含已在根据权利要求1-10中描述的装置中使用受控性剪切应力调理的细胞。一些实施方案包括组合物，其包含已使用下述方法调理的细胞，所述方法包括：获得细胞群体；将所述细胞在细胞培养基中的培养系统中培养，使得细胞粘附至阻挡件；并且施加足够力的流体层流式剪切应力以调理所述细胞。在类似的实施方案中，是包含已使用用于提供经调理细胞群体的方法调理的细胞的组合物，所述方法包括：获得细胞群体；将细胞在细胞培养基中的培养系统中培养，使得细胞粘附至阻挡件；使所述细胞培养基流经所述细胞以提供足够力的流体层流式剪切应力来调理所述细胞。在一些实施方案中，组合物包含表达抗炎活性的经调理细胞。在一些实施方案中，抗炎活性包括基因表达的增加，所述基因选自包括编码TSG-6、COX-2、IL1RN、HMOX-1、LIF或KLF2的那些基因的组。在一些实施方案中，组合物包含表达水平增加的COX2蛋白的经调理细胞。在另外的实施方案中，所述的设备和方法可以用于刺激抗炎因子的表达和释放，所述抗炎因子可以从培养基中分离出来并用作治疗剂。
在另外的实施方案中，是用通过所述方法调理的细胞治疗需要这种治疗的受试者的方法。在替代性实施方案中，治疗需要这种治疗的受试者的方法可以包括由使用所述方法调理的细胞释放因子。
在一些实施方案中，治疗受试者的方法包括但不限于，获得根据所述系统产生的经调理细胞群体并且向需要治疗的受试者施用细胞。在一些实施方案中，受试者需要抗炎疗法，并且细胞群体是其抗炎活性已使用所述系统诱导的人MSC。在一些实施方案中，此类细胞的治疗剂量可以包含至少1x102、1x103、1x104、1x105或1x106个引入到需要疗法的受试者中的细胞。在一些实施方案中，经调理细胞群体的抗炎活性可以用于治疗急性病症，诸如但不限于肌肉骨骼损伤，诸如矫形外科或脊髓损伤或外伤性脑损伤。
细胞培养调理系统在本文中的各种实施方案中有所描述并且应当理解用于细胞培养和维持的另外方法，如对于技术人员将已知的，可与本实施方案一起使用。在某些实施方案中，对于培养，可以使用各种基质成分来培养、维持或分化人干细胞。除了以下实例中所述的那些之外，例如，胶原蛋白IV、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白的组合可用于涂覆培养表面以作为为多能细胞生长提供固体支持物的手段。MatrigelTM也可用于提供用于人多能干细胞的细胞培养和维持的基底。MatrigelTM是由小鼠肿瘤细胞分泌的凝胶状蛋白质混合物，并且可从BD Biosciences(New Jersey,USA)商购获得。这种混合物类似于在许多组织中发现的复杂细胞外环境，并被细胞生物学家用作细胞培养的基底。
在细胞培养的一些实施方案中，一旦培养容器是满的(例如，汇合)，则通过适合于分离的任何方法将集落分裂成聚集细胞或甚至单细胞，然后将所述细胞放入新的培养容器进行传代。细胞传代或分裂是使细胞在培养条件下存活和生长延长的时间段的技术。当细胞汇合约70％-100％时，则细胞通常将进行传代。
在某些方面，用于本发明调理系统的起始细胞可以包括至少或约104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013个细胞或其中可引出的任何范围。起始细胞群体可以具有至少或约10、101、102、103、104、105、106、107、108个细胞/mL或其中可引出的任何范围的接种密度。
作为基础培养基，除了下面实施例所述的，一系列培养基是可用的，包括确定成分培养基，诸如Eagle氏基础培养基(BME)、BGJb、CMRL 1066、Glasgow MEM、改良的MEM ZincOption、Iscove氏改良的Dulbecco氏培养基(IMDM)、培养基199、Eagle MEM、αMEM、DMEM、Ham、RPMI 1640和Fischer氏培养基。可根据实施方案使用的培养基的其它实例包括但不限于Lonza Therapeak(化学成分确定的)培养基、Irvine Scientific Prime-XV(SFM或XSFM)、PromoCell MSC生长培养基(DXF)、StemCell Technologies Mesencult(ACF)或富含人血小板或血小板裂解液的培养基。
在另外的实施方案中，培养基也可包含补充剂，诸如B-27补充剂、胰岛素、转铁蛋白和硒(ITS)补充剂、L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2补充剂(5μg/mL胰岛素、100μg/mL转铁蛋白、20nM孕酮、30nM硒、100μM腐胺和β-巯基乙醇(β-ME)。可以设想，可能或可能不添加附加因子，包括但不限于纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸。
可以向培养基添加附加因子以与剪切应力结合用于产生经调理组合物，诸如经调理细胞群体。因此，在一些实施方案中，可以在生物力学刺激之前、期间或之后施用至少一种造血作用化学调节剂。可以向培养基添加的附加成分的实例包括但不限于阿替洛尔、地高辛、多沙唑嗪(Doxazosin)、强力霉素、芬地林、肼屈嗪、13-羟基十八碳二烯酸(13(s)-HODE)、毛花洋地黄甙C、NG-单甲基-L-精氨酸(L-NMMA)、美托洛尔、黄花夹竹桃次苷B(Nerifolin)、尼卡地平、硝苯地平、一氧化氮(NO)或NO信号通路激动剂、1H-[1,2,4]噁二唑并-[4,3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ)、黄花夹竹桃次苷A(Peruvoside)、吲哚洛尔、丙奈洛尔、突触蛋白(SNAP)、硝普钠、毒毛旋花甙元(Strophanthidin)、托屈嗪(Todralazine)、1,5-戊撑四唑、前列腺素E 2(PGE2)、PGE2甲酯、PGE2丝氨醇酰胺、11-脱氧-16,16-二甲基PGE2、15(R)-15-甲基PGE 2、15(S)-15-甲基PGE 2、6,16-二甲基PGE2，16,16-二甲基PGE2p-(对乙酰氨基苯甲酰氨基)苯基酯、16-苯基四去甲PGE2、19(R)-羟基PGE2、前列腺素B2、前列环素(PGI2，依前列醇)、4-氨基吡啶、8-溴代-cAMP、9-脱氧-9-亚甲基PGE2、9-脱氧-9-亚甲基-16,16-二甲基PGE2、PGE2受体激动剂、Bapta-AM、苯磷硫胺、荷包牡丹硷(Bicuclline)、(2'Z,3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟(BIO)、缓激肽、布他前列素、Cay1O397、氯烯雌醚、氯磺丙脲、二氮嗪、二十碳三烯酸、环氧二十碳三烯酸、氟氢缩松、毛喉素、加波沙朵、加拉明、茚基氧乙酸94(IAA94)、丙咪嗪、犬尿喹啉酸、L-精氨酸、亚油酸、LY171883、蜜糖酸、美贝维林、12甲氧基十二碳烯酸、N-甲酰基-Met-Leu-Phe、前列腺素E2受体EP2选择性激动剂(ONO-AEl-259)、黄夹次苷、匹莫齐特、吲哚洛尔、硝普钠、钒酸钠、毒毛旋花甙元、硫前列酮、噻苯咪唑、Vesamicol、1,2-二癸酰-甘油(10:0)、11,12环氧二十碳三烯酸、1-十六烷基-2-花生四烯酰-甘油、5-羟基癸酸酯、6-甲酰基吲哚并[3,2-B]咔唑、花生四烯酸乙醇胺(20:3，n-6)、卡巴环素、氨甲酰基-血小板-激活因子(C-PAF)或S-法呢基-L-半胱氨酸甲酯。
在另外的方面，培养基可以包含一种或多种生长因子，诸如表皮生长因子家族的成员(例如EGF)、成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员(包括FGF2和/或FGF8)、血小板衍生生长因子家族(PDGF)的成员、转化生长因子(TGF)/骨形态发生蛋白(BMP)/生长和分化因子(GDF)因子家族拮抗剂，包括但不限于头蛋白(noggin)、卵泡抑素、脊索发生素(chordin)、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropinamnionless、TGF、BMP，并且GDF拮抗剂也可以TGF、BMP和GDF受体-Fc嵌合体的形式添加。可以或可以不添加的其它因子包括可以通过Notch受体家族激活或灭活信号传导的分子，包括但不限于δ样和Jagged家族的蛋白以及γ分泌酶抑制剂和Notch加工或裂解的其它抑制剂诸如DAPT。附加生长因子可包括胰岛素样生长因子家族(IGF)、无翅基因相关(WNT)因子家族和刺猬因子家族的成员。
在还另外的方面，培养基可以包含一种或多种引发剂，诸如炎性细胞因子、LPS、PHA、Poly I:C和/或ConA。可以根据实施方案使用的另外的引发剂包括Wagner等,2009详述的那些，所述文献以引用的方式并入本文。可在进一步分化培养基中特别添加附加因子以促进细胞祖细胞增殖和存活以及自我更新和分化，所述附加因子包括但不限于二甲基-前列腺素E2，伊洛前列素和花生四烯酸代谢的其它类似产物。
培养基可以是含血清或无血清的培养基。无血清培养基可以是指不具有未经处理或未经纯化的血清的培养基，并且因此可以包括具有纯化的血液源性成分或动物组织源性成分(诸如生长因子)的培养基。从防止异源动物源性成分污染的方面考虑，血清可以来源于与细胞动物相同的动物。
培养基可以含有或可以不含有任何血清替代品。血清替代品可以包括适当含有以下各项的物质：白蛋白(诸如富含脂质的白蛋白、白蛋白替代物诸如重组白蛋白、植物淀粉、葡聚糖和蛋白质水解产物)、转铁蛋白(或其它铁转运蛋白)、脂肪酸、胰岛素、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇甘油或其等价物。血清替代品可以通过例如国际公布号WO98/30679中公开的方法制备。可替代地，可以使用任何可商购的材料以获得更多便利。可商购获得的材料包括敲除血清替代物(KSR)、化学成分确定的脂质浓缩物(Gibco)和Glutamax(Gibco)。
培养基还可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(诸如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧化剂物质、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂和无机盐。2-巯基乙醇的浓度可以是例如约0.05至1.0mM，并且具体地是约0.1至0.5，或0.01、0.02、0.03、0.04，0.05、0.1、0.2、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、5、7.5、10mM或任何中间值，但浓度并不特别限制于此，只要其适合用于培养干细胞。
细胞可以在至少或约0.005、0.010、0.015、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、800、1000、1500mL或其中可引出的任何范围的体积中培养，这取决于培养的需要。生物反应器可以具有至少或约2、4、5、6、8、10、15、20、25、50、75、100、150、200、500升、1、2、4、6、8、10、15立方米或其中可引出的任何范围的体积。
当组装装置时，供给盖12的壁13与中间模块30的阻挡件39之间形成的培养表面和室可根据用途而制备有或不制备有细胞粘合剂。细胞粘合剂培养容器可以涂覆有适合细胞粘附的基底(例如细胞外基质[ECM])以改善血管表面与细胞的粘附性。用于细胞粘附的基底可以是任何旨在附着干细胞或饲养细胞(如果使用的话)的材料。用于细胞粘附的非限制性基底包括胶原、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、聚-D-鸟氨酸、层粘连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白及其混合物，例如，来自Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤细胞的蛋白质混合物(诸如MatrigelTM或Geltrex)和裂解的细胞膜制备物。在具体的实施方案中，培养物包括含有聚-L-赖氨酸(或聚-D-赖氨酸)和层粘连蛋白的基质。
其它培养条件可以适当地限定。例如，培养温度可以是约30℃至40℃，例如至少或约31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃，但是并不特别地限于它们。CO2浓度可以是约1％至10％，例如约2％至7％，或其中可引出的任何范围。氧张力可以是至少或约1％、5％、8％、10％、20％或其中可引出的任何范围。
基本上不含“外部添加的”成分是指不具有或基本上没有来自除培养基中的细胞以外的来源的指定成分的培养基。“基本上不含”外部添加的生长因子或多肽(诸如FGF或EGF等)可意指最少量或不可检测量的外部添加的成分。例如，基本上不含FGF或EGF多肽的培养基或环境可以含有小于1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.01、0.001ng/mL或其中可引出的任何范围。
在一些实施方案中，使用所述系统调理的细胞具有多种治疗用途。具体地，如果细胞是人MSC，则可以在治疗上使用此类经调理细胞的疾病或病症，或者使用从培养细胞(包括但不限于经受用所述系统进行的调理的MSC)产生和分离的因子的疗法所针对的那些疾病或病症包括但不限于自身免疫性病症(包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE))、移植物抗宿主病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、炎症性肠病、神经退行性病症、神经元功能障碍、脑病症、中枢神经系统病症、外周神经系统病症、神经性病状、记忆和学习的病症、心律失常、帕金森氏病(Parkinson's disease)、眼部病症、脊髓损伤、需要神经治愈和再生的病症、多发性硬化(MS)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、帕金森氏病、中风、慢性或急性损伤、骨修复、外伤性脑损伤、矫形和脊柱病状、软骨骨骼或肌肉病症、骨关节炎、骨坏死、心血管疾病、与心脏病发作相关的血管损伤或诸如严重肢体缺血的疾病、外周动脉疾病、动脉粥样硬化以及受益于新血管形成的那些疾病、伤口、烧伤和溃疡。
在某些实施方案中，本发明公开的系统可以被应用来调理细胞并改善其免疫调节特性。在某些实施方案中，此类组合物可以与一种或多种附加化合物或药剂(“附加活性药剂”)组合施用以尤其用于治疗、管理和/或预防自身免疫性疾病和病症。此类疗法可以治疗有效剂量施用于患者以尤其治疗或改善免疫调节性疾病或病症。
可通过标准药学程序、使用例如细胞培养物或实验动物例如测定LD50(群体的50％致死剂量)和ED50(群体的50％治疗有效剂量)来确定此类经调理细胞或因子组合物的毒性和治疗效力。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数，表示为比率LD50/ED50。优选展现大治疗指数的组合物。在某些实施方案中可以使用表现毒副作用的化合物，然而，通常应小心设计使此类组合物优先靶向受影响组织的位点的递送系统，以便使对未受影响的细胞的潜在损害减到最小，并由此降低副作用。
可在配制用于人的剂量范围中使用由细胞培养试验和动物研究获得的数据。此类组合物的剂量优选处于包括ED50同时具有极小或无毒性的循环浓度的范围内。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于任何组合物，可由细胞培养试验来初始地评估治疗有效剂量。可在动物模型中配制剂量来实现包括如在细胞培养中测定的IC50(即，实现症状的半数最大抑制的测试组合物的浓度)的循环血浆浓度范围。所述信息可用于更准确地测定人中的有用剂量。可以通过(例如)高效液相色谱法测量血浆水平。
当设想尤其治疗性治疗自身免疫性病症时，还可以使用动物研究测定每千克测试受试者体重的生物活性剂的最大耐受剂量或MTD来确定适当的剂量。一般来讲，测试的至少一种动物种类是哺乳动物。本领域技术人员有规律地外推剂量以获得效力和避免对包括人的其它物种的毒性。在进行人效力研究之前，I期临床研究将有助于建立安全剂量。
另外，生物活性剂可以与多种已得到确认的组合物或结构偶合或络合，所述组合物或结构例如增强生物活性剂的稳定性，或以其它方式提高其药理学特性(例如，增加体内半衰期、减少毒性等)。
使用本发明系统调理的细胞或从此类细胞释放的因子和其它此类治疗剂可以通过本领域的普通技术人员已知的任意种方法施用，所述方法包括但不限于手术期间进行的细胞嵌入、静脉内(IV)、腹膜内(IP)、肌内(IM)或鞘内注射、吸入、皮下(sub-q)或局部施用(经皮、膏剂、霜剂、药膏、滴眼剂等)。
下面的实施例章节提供了关于各种实施方案的实例的进一步细节。本领域技术人员应理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的作用良好的技术和/或组合物。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。这些实施例是本文所述方法和系统的例示，并且不意图限制本发明的范围。其非限制性实例包括但不限于下文呈现的那些。
如本文所用并且除非另外指明，否则术语“治疗(treat/treating/treatment)”和“疗法”涵盖在患者罹患疾病或病症时发生的降低这种疾病或病症的一种或多种症状或影响的严重性的行动。在上下文允许的情况下，术语“治疗”也是指为确保处于增加的患疾病或病症风险下的个体能够在疾病或病症发作之前接受适当的手术和/或其它医疗干预而采取的行动。如本文所用并且除非另外指明，否则术语“预防(prevent/preventing/prevention)”涵盖在患者开始罹患疾病或病症之前发生的延迟疾病或病症发作和/或抑制或降低疾病或病症的严重性的行动。
如本文所用并且除非另外指明，否则术语“控制(manage/managing/management)”涵盖在已患有疾病、病症或病状的患者中防止、延缓或减少这种疾病或病症复发的严重性。术语涵盖调节疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间或改变患者响应疾病或病症的方式。
如本文所用并且除非另有说明，否则细胞、因子或化合物的“治疗有效量”是足以提供治疗或控制疾病或病症的任何治疗益处，或延迟或最小化与疾病或病症相关的一种或多种症状的量。治疗有效量意指细胞、因子或化合物单独地或与一种或多种其它疗法和/或治疗剂组合在治疗或控制疾病或病症中提供任何治疗益处的量。术语“治疗有效量”可以涵盖缓解疾病或病症、改善或减轻疾病或病症、改善总体疗法或增强另一种治疗剂的治疗效力的量。
如本文所用并且除非另有说明，细胞、因子或化合物的“预防有效量”是足以预防或延迟疾病或病症或与疾病或病症相关的一种或多种症状的发作，或预防或延迟其复发的量。细胞、因子或化合物的预防有效量意指细胞、因子或化合物单独地或与一种或多种其它治疗和/或预防剂组合在预防疾病或病症中提供预防益处的量。术语“预防有效量”可以涵盖细胞、因子或化合物的预防疾病或病症、改善总体预防或增强另一种预防剂的预防效力的量。“预防有效量”可以在例如疾病或病症之前开药方。
如本文所用，“患者”或“受试者”包括哺乳动物有机体，其能够患有如本文所述的疾病或病症，诸如人和非人哺乳动物，例如但不限于，啮齿动物、小鼠、大鼠、非人灵长类动物、伴侣动物诸如狗和猫以及家畜例如绵羊、牛、马等。
如本文所用，“MSC”是间充质干细胞，此类细胞也被称为骨髓间充质干细胞。
如本文所用，“受控性剪切应力”是指通过调整培养基在表面上的流速来设定施加于细胞的剪切应力的量的能力。应力均匀地施加在板的整个表面区域上。
如本文所用，“经调理细胞”是指因暴露于剪切应力导致表达附加功能性的细胞。
随附权利要求书中的所有装置的相应结构、材料、动作以及等效物或步骤加功能要素意图包括用于执行所述功能的任何结构、材料或动作与具体要求保护的其它要求保护要素的组合。出于说明和描述的目的已经呈现了对本发明的描述，但并不意图为详尽的或将本公开限制于呈所公开形式的本发明。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，许多修改和变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。选择并且描述实施方案以便最好地解释本发明的原理和实际应用，并且使得其它本领域普通技术人员了解各种实施方案以及各种修改适合于所涵盖的具体用途。
在不进一步详细描述下，据信本领域技术人员可使用本文描述在本方法的最大程度上利用本方法。本文所述的实施方案应解释为说明性的，而无论如何都不以任何方式限制本公开的其余部分。虽然已展示及描述优选实施方案，但可以由本领域的技术人员在不偏离本发明所公开的方法的精神和教示的情况下对其做出许多变型和修改。
因此，保护范围不受上文陈述的描述限制，而是仅由权利要求书，包括所述权利要求书的主题的所有等效物，限制。本文所引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容在与本文所述的本公开一致的程度上以引用的方式并入本文。
实施例
包括以下实施例以示范本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解以下实施例中公开的技术表示由本发明人发现的，在本发明实践中发挥良好作用的技术，并且因此可以被认为构成本发明实践的优选模式。然而，根据本公开，本领域技术人员应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以在已公开并仍获得类似或相似结果的特定实施方案中做出许多改变。
实施例1
进行了一项试验研究，以提供下述原理的证明：流体剪切应力可用于调理干细胞、改变基因表达和增强功能活性。为了举例说明由本发明系统提供的类型的剪切应力的调理活性，而是在更小的分析规模上，使用从IBIDI,LLC.(Verona,WI,USA)获得的定制的载玻片或小规模微流体通道载玻片施加力(剪切应力)。从骨髓(BM)、羊水(AF)或脂肪(AD)组织收获人样品、对其进行处理以分离和扩增hMSC，并冷冻保存。将冷冻的hMSC解冻并接种到具有50ml最低必需培养基(MEM-α)(20％FBS、5％青霉素/链霉素、5％谷氨酰胺)的T225细胞培养瓶中。将培养基每3-4天更换一次。将hMSC维持在培养物中，直到其几乎100％汇合。细胞具有成纤维细胞表型。在将细胞接种到设备(微流体通道载玻片或定制载玻片)之前，所述设备提供类似于本发明系统提供的流体层流式剪切应力的流体层流式剪切应力，但是在比本发明系统提供的规模局限得多的规模上，将培养表面在37℃下用于PBS中的100ug/ml纤连蛋白预包覆30-45min，并且在接种细胞之前用PBS洗涤2次，并且使细胞在培养箱中静置30-45分钟，同时使细胞准备用于接种。通过使用真空和玻璃巴氏吸管从T225烧瓶除去培养基来制备培养的hMSC，将细胞用室温PBS洗涤1次，通过抽吸将所述PBS除去。加入3ml的0.25％胰蛋白酶溶液，并且在37℃下将烧瓶孵育5min。在该孵育之后，将烧瓶从培养箱中取出并剧烈敲打以使细胞脱离。在解剖显微镜下检查烧瓶，以确保所有的细胞已经脱离并且自由漂浮。此时，将9ml MEM-α加入烧瓶，并且取出总体积(12ml)并置于15ml锥形管中。将管置于离心机中并在室温下以300RCF旋转5分钟。吸出上清液，在细胞沉淀物上方留下少量培养基，加入3ml MEM-α，并且将细胞沉淀物重悬于该培养基中。使用台盼蓝染料排除测定存在的活细胞的数量。在血细胞计数器上测定活细胞计数并且将细胞重新悬浮以获得每种测定所需的浓度(参见表1)。利用IBIDI通道来提供与本发明系统提供的类型类似但不太好控制的流体层流式剪切应力。使细胞静置30-45分钟，然后每孔填充60ul培养基(如果经过过多时间，则培养基将开始从通道中蒸发)。使细胞孵育12-18小时。然后将管件附接于具有干净的三通旋塞阀的安全柜中的载玻片(全部先前都高压灭菌或EtO灭菌，与蠕动泵一起使用所需的三个止动管可以是EtO或UV灭菌的)，然后转移到培养箱中。IBIDI通道实验再循环总体积为6ml，并且大的制造载玻片实验再循环总体积为50ml。蠕动泵或Harvard注射泵被编程为以15达因/cm2将培养基推动流过培养表面。将流体剪切应力施加3、6或8小时。
表1：
由于流体层流式剪切应力导致的免疫调节变化
初始MSC不表达免疫抑制的关键调节剂，诸如多官能抗炎蛋白诸如TNF-α刺激的蛋白6(TSG-6)、前列腺素E2(PGE2)和白细胞介素(IL)-1受体拮抗剂(IL1RN)。来源于三种人组织来源即骨髓、脂肪和羊水的MSC都被发现对剪切应力具有不同程度的响应性。例如，以15达因/cm2的力施加的剪切应力激活了从多种人体组织收集的MSC中的免疫调节信号传导。在编码TSG-6、COX-2、IL1RN、HMOX-1、LIF和KLF2的MSC基因的转录中对骨髓来源的MSC进行评价，层流式剪切应力刺激了深度上调，增加了6-至120-倍。参见例如(图20)。
类似地，利用可商购获得的ELISA确定已经经受流体剪切应力的来自人MSC培养物的培养基也包含免疫调节蛋白，诸如前列腺素E2。此外，蛋白质印迹确认COX2、TSG6和IL1RN的蛋白水平(翻译)升高。使用恒定的肌动蛋白表达水平作为基线蛋白表达的对照。在本研究中，确定在将人MSC(来源于hBM，人骨髓MSC；hAF MSC，羊水MSC；hAD MSC，脂肪来源的MSC)暴露于流体剪切应力8小时之后，与从未经受流体剪切应力的MSC获得的培养基相比，COX2蛋白的表达显著增加。还确定的是，通过加入10uM的NF-κB拮抗剂BAY11-7085可以消除该诱导(图21)。此外，通过利用商业上可获得的ELISA，确定了来自已经受流体剪切应力仅仅3小时的人MSC培养物的培养基具有免疫抑制活性，如通过当将处理的hMSC与来自脾脏的激活免疫细胞共培养时TNF-α减少10％-50％所证实的(图22)。还使用细胞因子抑制测定确定的是，施加COX或NF-κB抑制剂消除了剪切处理的MSC抑制TNF-α产生的能力；而加入稳定的合成形式的PGE2(dmPGE2)使TNF-α降低至在经剪切MSC存在时产生的水平(图23)。另外的证据进一步表明经剪切MSC可能比未经受流体剪切应力的MSC对其它引发剂更具响应性，因为在加入IFN-γ的情况下发生更大的COX2和HMOX1诱导(图24)。因此，表明当存在于例如组合疗法中时，经受流体剪切应力的人MSC可能与细胞因子协同作用。
进一步确定的是，暴露于剪切应力的初始MSC(没有炎性细胞因子的预调理)能够阻断脂多糖(LPS)激活的小鼠脾细胞的TNF-α分泌(范围为完全抑制至低于静态条件下培养的MSC的2倍减少，取决于MSC供体和来源变异性)。
神经保护能力：
进行研究以建立细胞诸如暴露于受控性剪切应力的MSC可以在例如外伤性脑损伤(TBI)之后提供神经保护。要做到这一点，利用大鼠模型来评价功能结果。大鼠中受控性皮质撞击损伤(CCI)呈现类似于人头部外伤的形态学和脑血管损伤应答。因此，对加强神经损伤和炎症的细胞和分子改变的表征提供了测量MSC预调理的潜在临床效力的有力工具。
预测十二(12)只大鼠每种条件需要以0.05的α误差水平(SAS预测分析软件)实现80％功率。待施用用于细胞疗法的细胞是骨髓来源的MSC。将MSC暴露于静态条件下或暴露于在15达因/cm2的强度下的剪切应力3小时，流体流速和持续时间被证实产生对COX2、TSG6、IL1RN和HMOX1的强力诱导并抑制激活免疫细胞中的细胞因子产生。在由大容量侧流系统施加力后，立即将10x106个细胞/kgMSC通过尾静脉注射(每只大鼠大约剂量为2.5x106个MSC)转移至受体大鼠。
使用用于检查跨过脉管系统的渗漏的标准方法(利用如本文所述的在悬浮液中的葡聚糖珠)测定血-脑屏障(BBB)的渗透性。通过CCI设备(Leica Impactor 1)在雄性大鼠(225-250克)中引入右顶叶联合皮质处的损伤。平行地，对照大鼠仅用CCI处理或只是麻醉(假手术对照)。损伤后四十八(48)小时，施用MSC。注射MSC后二十四(24)小时，将荧光缀合的Alexa 680-葡聚糖珠(10kDa，0.5ml的1mg/ml)通过尾静脉递送。注射这种染料后三十(30)分钟，使动物安乐死并且用4％多聚甲醛灌注。将固定的脑以1mm厚度沿冠状面切片。通过脑切片在使用700和800nm通道(800nm信号用于背景扣除)的LI-COROdyssey CLx红外激光扫描仪中的荧光强度测量血管渗漏。对某些免疫和神经细胞类型的频率的组织学分析已知在对神经炎症的应答中迅速改变，并且是预后的重要指示物。在以后的研究中，在大鼠的独立群组中，
使用检测小胶质细胞(Iba1，ED1或CD63)、浸润嗜中性粒细胞(RP-3)、星形神经胶质(GFAP)和神经元(NeuN)的抗体以及细胞死亡指示物(裂解的半胱天冬酶3)通过免疫组织化学对8至50um之间的脑切片分析CNS中的炎性表型。脑切片的染色将使用标准的自由浮动染色方案或载玻片冷冻切片进行。
处理的和对照的大鼠的认知恢复可以通过经典的海马体依赖性空间学习任务Morris水迷宫进行评估，其中大鼠基于额外迷宫线索找出水下平台。对于这些研究，在损伤两(2)周后，通过速度、在每个象限中的花费时间以及寻找平台的路径距离来衡量学习。在损伤后4周通过迷宫中的相同措施测试相同个体的记忆功能。预期的结果是递送经剪切MSC将相对于初始静态培养的MSC降低了BBB渗透性和脑中的炎症细胞表型，并且还将导致改善的认知恢复。
实施例2-损伤改变了骨髓中MSC的频率
外伤性脑损伤的慢性炎症因先天性免疫系统和适应性免疫系统中的单核细胞和淋巴细胞而持续。据报道MSC从骨髓移动到损伤和炎症位点，但是仍缺乏对在此背景下自骨髓的MSC运输的详细分析。为了监测由于损伤引起的MSC频率的变化，建立了外伤性脑损伤的大鼠模型，其呈现类似于人头部外伤的形态学和脑血管损伤应答。简而言之，将受控性皮质撞击损伤(CCI)递送至与中线骨缝相邻的暴露的右顶叶联合皮质。平行地，将假手术对照麻醉并且产生切口但没有损伤。在骨髓内检查CD105+MSC的频率，并且发现损伤后24小时CD105+MSC的绝对数量显著减少(图25A和25B)。这些数据表明MSC通过从骨髓中排出来对损伤作出响应，可能如通过造血干细胞或祖细胞所观察到的一样，因此增加了MSC直接暴露于存在于血流内和血管壁上的血液动力学力的可能性。重要的是，在CCI后24小时施用时，静脉内施用经3小时15达因/cm2WSS预调理的人MSC显著升高受损伤的大鼠骨髓中的CD105+MSC频率(图25C和25D)。当施用静态培养的MSC或WSS暴露的MSC时，CCI后72小时，CD105+细胞频率均显著更高，并且当用WSS预调理MSC时对骨髓的保护作用显著更大。
材料和方法
细胞培养-骨髓MSC来源于来自独立人供体的全骨髓(AllCells)。简而言之，通过Ficoll-Paque中的相分离将单核细胞富集在全骨髓的血沉棕黄层中。将细胞冷冻保存或重新悬浮以在完全培养基中立即扩增，所述完全培养基由MEM-α(Thermo Scientific)、20％胎牛血清(Atlanta Biologicals)、100单位/ml青霉素(Gibco)、100μg/ml链霉素(Gibco)和2mM L-谷氨酰胺(Gibco)组成。在2天后除去未粘附细胞。将粘附的集落进一步扩增并作为第1代进行冷冻。解冻的MSC以1x105个细胞/ml铺板，并且每三天更换一次培养基。在80％汇合时，将细胞以3x106个细胞/ml的密度传代到IBIDI通道(μ-Slide VI 0.4)中用于qRTPCR、免疫印迹和大鼠CCI实验，并且以5x105个细胞/ml用于ELISA和免疫荧光实验。在附着到培养表面后，将注射泵(PhDULTRA可编程的，Harvard Apparatus)或蠕动泵(REGLO模拟MS4/12，Ismatec)用于产生15达因/cm2的层流式剪切应力。
受控性皮质撞击损伤(CCI)-将CCI设备(Leica IMPACT ONETM)用于以6m/s将3.1mm压缩的单次撞击递送在右顶叶联合皮质处(邻近前卤点与人字点之间的中线骨缝)，在雄性大鼠(225-250克)的暴露脑上使用了6mm撞击器尖端。平行地，对照大鼠仅用CCI处理或只是麻醉(假手术对照)。在细胞疗法实验中，将低传代(P2-5)的MSC在静态条件或15达因/cm2的剪切应力下培养3小时。在剪切暴露2小时内使受体大鼠通过尾静脉接受MSC(10x106个细胞/kg)。处死时，用4％多聚甲醛灌注大鼠，并且收集后进一步固定组织。所有实验均按照得克萨斯大学健康科学中心机构动物护理和使用委员会(University of Texas HealthScience Center Institutional Animal Care andUse Committee)的指导方针进行。
大鼠组织的组织学处理-收获大鼠胫骨并且小心除去骨周围的肌肉。将骨进一步固定在4％多聚甲醛中，并且使用10％EDTA进行脱钙。一旦脱钙，就将骨转移到UT医学院的组织学中心进行大体积标本处理(grossing)、石蜡包埋和切片。
骨髓的免疫染色-将石蜡包埋的切片在60℃下烘烤20min，并且在二甲苯和不同等级的乙醇中连续再水合。使用DAKO靶抗原修复液(pH 6.1)进行热诱导表位修复。用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶。将载玻片用2.5％BSA封闭1小时，并且与在2.5％BSA中的抗-CD105抗体(1:200，SN6，Ab11414)孵育过夜。根据制造商说明书使用Vector ABC试剂盒和DAKO DAB试剂盒(EliteABC试剂盒；PK-6102，Dako DAB试剂盒；K3468)进行免疫过氧化物酶检测，并且用核固红或CAT苏木精(Vector Labs；H-3403，BiocareMedical；012215)复染。为了确保最佳的细胞对比度，将发蓝试剂与苏木精(Statlab，SL203)一起使用。将载玻片空气干燥并且用BiocareEcomount(EM897L)盖住盖玻片。
图像采集和分析-使用Olympus BX51P偏光显微镜(DP71彩色照相机)和DP控制器软件(Olympus，3.3.1.292版本)采集免疫组织化学的显微照相图。使用Image J(NIH)定量分析图像。通过对治疗组和样品鉴定不知情的研究者对CD105+MSC进行计数。使用随机数值生成器来选择8个随机图像集，随后将其进行统计分析。
统计分析-用12.5软件分析所有数据的统计显著性并且报告为平均值±SEM。使用单因素方差分析和用于多重比较的Holm-Sidak方法来评价组织学测量值的差异。P<0.001的显著性水平在图中用三个星号***表示。示出了来自至少三个独立的生物重复品的代表性结果，除非另有说明。(参见图25B和25D)
***
根据本公开，本文公开的并且要求保护的所有方法可在无需过度实验的情况下进行和实施。尽管本发明的组合物和方法已经根据优选实施方案加以描述，但对本领域技术人员显而易见的是可使本文所述的方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序发生变化，而不偏离本发明的概念、精神和范围。更具体说来，显而易见的是在化学上和生理学上相关的某些试剂可取代本文所述的试剂，同时达到相同或相似结果。对本领域技术人员来说显而易见的所有此类相似的替代和修改被认为是在如由随附权利要求限定的本发明的精神、范围和概念内。
本文所用的章节标题仅出于组织目的，并且不应解释为限制所述主题。本申请中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于专利、专利申请、文章、书籍和论文，均出于任何目的特此明确地以引用的方式整体并入本文。在并入的参考文献和类似材料中的一个或多个以与本申请中术语的定义相冲突的方式限定所述术语的情况下，以本申请为准。
参考文献
以下参考文献以引用方式特别并入本文，在某种程度上，它们提供示例性程序或对本文所阐述的那些进行补充的其它细节。
国际公布号WO98/30679
Wagner等,Optimizing mesenchymal stem cell-based therapeutics.CurrOpin Biotechnol 20(5):531-536,2009。

Claims (91)

1.一种装置，其包括：
入口流体供给板；
基板；以及
定位在所述入口流体供给板与所述基板之间的多个中间板，其中所述多个中间板中的每一个包括：
第一端部、第二端部、第一侧和第二侧；
在所述第一端部近侧的分配通道；以及
在所述第二端部近侧的聚集通道，其中：
所述分配通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸；并且
所述聚集通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸。
2.如权利要求1所述的装置，其中：
每个中间板的所述分配通道具有第一长度；
每个中间板的所述聚集通道具有第二长度；
所述中间板中的每一个具有在第一侧与第二侧之间的宽度；
所述分配通道的所述第一长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的大部分；并且
所述聚集通道的所述第二长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的大部分。
3.如权利要求1所述的装置，其中：
每个中间板的所述分配通道具有第一长度；
每个中间板的所述聚集通道具有第二长度；
所述中间板中的每一个具有在第一侧与第二侧之间的宽度；
所述分配通道的所述第一长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的至少70％；并且
所述聚集通道的所述第二长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的至少70％。
4.如权利要求1所述的装置，其还包括：
贮存器；
第一导管；以及
第二导管，其中：
所述入口流体供给板包括第一流体入口、第一流体出口、第二流体入口和第二流体出口；
所述贮存器通过所述第一导管联接到所述第一流体入口；
所述贮存器通过所述第二导管联接到所述第二流体出口；
5.如权利要求4所述的装置，其还包括联接到所述入口流体供给板的所述第一流体出口和所述第二流体入口的泵。
6.如权利要求5所述的装置，其中所述泵包括：
滚动元件；以及
柔性导管，其中所述柔性导管联接到所述入口流体供给板的所述第一流体出口和所述第二流体入口。
7.如权利要求5所述的装置，其还包括联接到所述滚动元件的电动机。
8.如权利要求5所述的装置，其中在使用期间，所述泵被配置来：
通过第一流体入口和所述第一流体出口从所述贮存器抽取流体；
将所述流体引导通过所述第二流体入口、穿过所述多个中间板、从所述第二出口出来并返回至所述贮存器。
9.如权利要求8所述的装置，其中所述流体通过所述第二流体入口的速率通过所述泵的所述滚动元件的旋转速度来控制。
10.如权利要求1所述的装置，其中所述多个中间板包括至少三个中间板。
11.一种细胞制备系统，其包括：
基部；
联接到所述基部的多个模块化细胞制备装置，其中每个模块化细胞制备装置包括：
入口流体供给板；
基板；以及
定位在所述入口流体供给板与所述基板之间的多个中间板；
贮存器；以及
泵。
12.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中所述多个模块化细胞制备装置包括至少三个模块化细胞制备装置。
13.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中在使用期间所述多个模块化细胞制备装置被配置来并行操作以制备细胞。
14.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中所述多个中间板包括至少三个中间板。
15.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中所述多个中间板中的每一个所述中间板包括：
第一端部、第二端部、第一侧和第二侧；
在所述第一端部近侧的分配通道；以及
在所述第二端部近侧的聚集通道，其中：
所述分配通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸；并且
所述聚集通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸。
16.如权利要求15所述的细胞制备系统，其中：
每个中间板的所述分配通道具有第一长度；
每个中间板的所述聚集通道具有第二长度；
所述中间板中的每一个具有在第一侧与第二侧之间的宽度；
所述分配通道的所述第一长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的大部分；并且
所述聚集通道的所述第二长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的大部分。
17.如权利要求15所述的细胞制备系统，其中：
每个中间板的所述分配通道具有第一长度；
每个中间板的所述聚集通道具有第二长度；
所述中间板中的每一个具有在第一侧与第二侧之间的宽度；
所述分配通道的所述第一长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的至少70％；并且
所述聚集通道的所述第二长度延伸跨过所述中间板的所述宽度的至少70％。
18.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中每个模块化细胞制备装置还包括：
第一导管；以及
第二导管，其中：
所述入口流体供给板包括第一流体入口、第一流体出口、第二流体入口和第二流体出口；
所述贮存器通过所述第一导管联接到所述第一流体入口；并且
所述贮存器通过所述第二导管联接到所述第二流体出口；
19.如权利要求18所述的细胞制备系统，其中每个模块化细胞制备装置的所述泵联接到所述入口流体供给板的所述第一流体出口和所述第二流体入口。
20.如权利要求11所述的细胞制备系统，其中所述泵包括：
滚动元件；以及
柔性导管，其中所述柔性导管联接到所述入口流体供给板的所述第一流体出口和所述第二流体入口。
21.如权利要求20所述的细胞制备系统，其还包括联接到所述滚动元件的电动机。
22.如权利要求21所述的装置，其中所述流体通过所述第二流体入口的速率通过所述泵的所述滚动元件的旋转速度来控制。
23.如权利要求20所述的细胞制备系统，其中在使用期间，所述泵被配置来：
通过第一流体入口和所述第一流体出口从所述贮存器抽取流体；
将所述流体引导通过所述第二流体入口、穿过所述多个中间板、从所述第二出口出来并返回至所述贮存器。
24.一种装置，其包括：
第一盖，其具有第一端部、第二端部、位于两者间的壁、在所述第一端部近侧的入口流体连接器、在所述第一端部近侧的立管孔，和供给通道，所述供给通道从所述入口流体连接器延伸到所述立管孔以将所述立管孔设置成与所述入口流体连接器流体连通；
第二盖，其具有第一端部、第二端部、位于两者间的壁、在所述第二端部近侧的出口流体连接器、在所述第一端部近侧的立管孔，和排放通道，所述排放通道从立管孔延伸到所述出口流体连接器以将所述立管孔设置成与所述出口流体连接器流体连通；以及
至少一个中间模块，其被设置在所述第一盖的所述壁与所述第二盖的所述壁的中间，并且在将所述装置组装时与所述第一盖和所述第二盖中的每一个可密封地接合，每个中间模块包括：
框架，所述框架具有第一端部、第二端部、位于其间的阻挡件，所述阻挡件具有朝向所述第一盖的所述壁设置的第一侧、朝向所述第二盖的所述壁设置的第二侧，所述阻挡件被设置在所述框架内并且位于所述第一端部与所述第二端部之间，以在所述第一盖的密封面与所述中间模块的第一侧的密封面可密封地接合时在所述第一盖的所述壁与所述中间模块的所述阻挡件的所述第一侧之间形成第一流动室，并且在所述第二盖的密封面与所述中间模块的第二侧的密封面、所述第二盖的密封面与所述中间模块可密封地接合时在所述第二盖的所述壁与所述中间模块的所述阻挡件的所述第二侧之间形成第二流动室；
在所述框架中的入口流动口，所述入口流动口在所述中间模块的所述第一端部的近侧以在将所述装置组装时可密封地接合所述第一盖的所述立管孔；
在所述框架中的分配通道，所述分配通道在所述中间模块的所述第一端部的近侧并且与所述入口流动口流体连通以将接收的流体流从所述入口流动口分配到所述分配通道中；
多个流动室供给口，所述多个流动室供给口被设置在所述中间模块的所述第一端部的近侧并且与所述分配通道流体连通以用于将接收的流体流引入到所述第一流动室和所述第二流动室中；
多个流动室排放口，所述多个流动室排放口被设置在所述中间模块的所述第二端部的近侧并且与所述第一流动室和所述第二流动室流体连通；
聚集通道，所述聚集通道沿着所述中间模块的所述第二端部设置并且与所述第一流动室和所述第二流动室流体连通；
立管孔，所述立管孔在所述中间模块的所述第一端部的近侧并与所述采集通道流体连通并且用于在将所述装置组装时可密封地接合所述第二盖的所述立管孔；
其中在将所述装置组装之后，所述一个或多个中间模块设置在所述第一盖与所述第二盖中间以将所述一个或多个中间模块上的所述第一侧密封面与所述第一盖上的所述密封面可密封地接合并且将所述一个或多个中间模块上的所述第二侧密封面与所述第二盖上的所述密封面可密封地接合，使所述第一盖上的所述入口与所述第二盖上的所述出口设置成可密封地接合以提供流体回路，所述流体回路包括所述第一流动室和第二流动室，所述第一流动室设置在所述多个流动室供给口中的至少一些与所述多个流动室排放口中的至少一些中间并且设置在所述至少一个中间模块第一侧与所述第一盖中间，所述第二流动室设置在所述多个流动室排放口中的至少一些与所述多个流动室排放口中的至少一些中间并且设置在所述至少一个中间模块第二侧与所述第二盖中间；
其中在跨所述装置的所述入口和所述出口提供流体压力差时，沿着所述分配通道分布的所述多个流动室供给口和沿着所述中间模块的所述聚集通道分布的所述多个流动室排放口提供所述流动室内的更均匀的局部流体速率。
25.如权利要求24所述的装置，其还包括：
多个稀土磁体，其嵌入在所述第一盖中；以及
对应的多个稀土磁体，其嵌入在所述第二盖中；
其中所述第二盖中的所述稀土磁体被设置成处于与嵌入在所述第一盖中的所述稀土磁体重合的模式，从而使所述第二盖与所述第一盖对准，并且促进所述第一盖中的所述多个稀土磁体中的每一个与所述第二盖中的所述多个稀土磁体中对应的一个之间的磁性吸引，并且从而在所述第一盖的所述密封面与所述一个或多个中间模块的所述第一侧密封面之间的界面上以及也在所述第二盖的所述密封面与所述一个或多个中间模块的所述第二侧密封面之间的界面上施加密封力。
26.如权利要求24所述的装置，其中流动室的数量等于所述一个或多个中间模块的数量加一。
27.如权利要求24所述的装置，其中至少所述第一盖和所述第二盖包含聚苯乙烯。
28.如权利要求24所述的装置，其还包括：
夹具，其用于促使所述第一端部朝向所述第二端部以在所述第一盖的所述密封面与所述一个或多个中间模块的所述第一侧密封面之间的界面上以及也在所述第二盖的所述密封面与所述一个或多个中间模块的所述第二侧密封面之间的界面上施加密封力。
29.如权利要求28所述的装置，其中所述夹具是松紧带。
30.如权利要求28所述的装置，其中所述夹具包括拉伸构件和具有用于调整夹具张力的螺纹构件的机械紧固件。
31.如权利要求24所述的装置，其中所述第一盖还包括围绕所述密封面延伸的突出唇缘和凹槽中的至少一个；并且
其中所述一个或多个中间模块的所述第一侧密封面还包括突出唇缘和凹槽中的另一个以接合所述第一盖的所述突出唇缘和凹槽中的一个。
32.如权利要求31所述的装置，其中所述第二盖还包括围绕所述密封面延伸的突出唇缘和凹槽中的至少一个；并且
其中所述一个或多个中间模块的所述第二侧密封面还包括突出唇缘和凹槽中的另一个以接合所述第二盖的所述突出唇缘和凹槽中的一个。
33.如权利要求24所述的装置，其中所述第一盖、所述第二盖和所述一个或多个中间模块各自呈矩形形状。
34.一种产生经调理组合物的方法，其包括：
(a)获得干细胞的起始群体；
(b)在基底上培养所述干细胞以实现细胞粘附；以及
(c)以足够产生经调理组合物的力向所述干细胞施加受控性剪切应力。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述经调理组合物为经调理干细胞的群体。
36.如权利要求35所述的方法，其还包括(d)分离经调理干细胞的群体。
37.如权利要求34所述的方法，其中所述经调理组合物为经调理培养基组合物。
38.如权利要求37所述的方法，其还包括(d)分离所述经调理培养基。
39.如权利要求37所述的方法，其中所述经调理培养基基本上不含细胞。
40.如权利要求34所述的方法，其中所述方法为自动化的。
41.如权利要求34所述的方法，其中步骤(c)包括使流体流经所述干细胞.
42.如权利要求41所述的方法，其中所述流体为生长培养基。
43.如权利要求34所述的方法，其中所述基底是支持所述干细胞单层生长的表面。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述生长培养基包含至少第一外源性细胞因子或生长因子。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述生长培养基包含IL1B、TNF-α、IFNγ和/或前列腺素。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述前列腺素为16,16'-二甲基前列腺素E2(dmPGE2)。
47.如权利要求43所述的方法，其中所述生长培养基包含至少第一TLR激动剂或炎症刺激剂。
48.如权利要求43所述的方法，其中所述生长培养基包含PolyI:C、脂多糖(LPS)或豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)。
49.如权利要求34所述的方法，其中所述剪切应力为流体层流式剪切应力。
50.如权利要求34所述的方法，其中所述剪切应力为至少5达因/平方厘米。
51.如权利要求34所述的方法，其中所述剪切应力为至少10或15达因/平方厘米。
52.如权利要求34所述的方法，其中步骤(c)还包括将所述细胞暴露于升高的压力。
53.如权利要求34所述的方法，其中向所述干细胞施加受控性剪切应力持续约1分钟与两天之间的时间段。
54.如权利要求53所述的方法，其中向所述干细胞施加受控性剪切应力持续约5分钟至24小时、10分钟至24小时、0.5小时至24小时或1小时至8小时之间的时间段。
55.如权利要求34所述的方法，其中所述干细胞是人细胞。
56.如权利要求34所述的方法，其中所述干细胞是诱导多能干(iPS)细胞。
57.如权利要求34所述的方法，其中所述干细胞是转基因细胞。
58.如权利要求34所述的方法，其中所述干细胞是自体干细胞。
59.如权利要求34所述的方法，其中所述干细胞是间充质干细胞(MSC)。
60.如权利要求59所述的方法，其还包括从组织中分离所述MSC。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述组织为骨髓、脐带血、外周血、输卵管、胎肝、肺、牙髓、胎盘、脂肪组织或羊水。
62.如权利要求34所述的方法，其中与所述干细胞的起始群体相比，所述经调理干细胞具有高至少6倍的抗炎基因表达。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述抗炎基因编码TSG-6、PGE-2、COX-2、IL1Ra、HMOX-1、LIF和/或KLF2。
64.如权利要求34所述的方法，其中所述剪切应力在生物反应器系统中施加。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述生物反应器系统包括入口流体供给板、基板以及定位在所述入口流体供给板与所述基板之间的多个中间板。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述中间板包括第一端部、第二端部、第一侧和第二侧；在所述第一端部近侧的分配通道；以及在所述第二端部近侧的聚集通道。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述分配通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸。
68.如权利要求66所述的方法，其中所述聚集通道在所述中间板的所述第一侧与所述第二侧之间延伸。
69.如权利要求64所述的方法，其中所述生物反应器系统还包括贮存器、第一导管和第二导管。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述入口流体供给板包括第一流体入口、第一流体出口、第二流体入口和第二流体出口。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述贮存器通过所述第一导管联接到所述第一流体入口并且通过所述第二导管联接到所述第二流体出口。
72.如权利要求69所述的方法，其中生物反应器系统还包括联接到所述入口流体供给板的所述第一流体出口和所述第二流体入口的泵。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述泵被配置来通过第一流体入口和所述第一流体出口从所述贮存器抽取流体，并且将所述流体引导通过所述第二流体入口、穿过多个中间板、从所述第二入口出来并返回至所述贮存器。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述流体通过所述第二流体入口的速率通过所述泵的所述滚动元件的旋转速度来控制。
75.如权利要求64所述的方法，其中所述生物反应器系统提供高流动边界层周长与横截面流动面积之比。
76.如权利要求64所述的方法，其中所述生物反应器系统能够大规模生产细胞。
77.一种通过如权利要求34所述的方法获得的治疗有效量的经调理干细胞的组合物。
78.一种治疗需要这种治疗的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的已通过暴露于剪切应力进行调理的经调理干细胞。
79.如权利要求78所述的方法，其中所述经调理干细胞包括经调理间充质干细胞。
80.如权利要求78所述的方法，其中所述经调理干细胞包括通过根据权利要求34-76中任一项所述的方法获得的组合物。
81.如权利要求78所述的方法，其中所述受试者患有慢性或急性炎症、移植物抗宿主病、肌肉骨骼外伤、神经损伤或自身免疫性病症。
82.如权利要求78所述的方法，其中所述神经损伤为外伤性脑损伤。
83.如权利要求78所述的方法，其中所述经调理干细胞与一种或多种另外的治疗剂组合施用。
84.一种增加患者骨髓中的CD105+细胞的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的间充质干细胞。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述间充质干细胞包括已通过暴露于剪切应力进行调理的细胞。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述间充质干细胞包括通过根据权利要求34-76中任一项所述的方法产生的经调理组合物。
87.如权利要求84所述的方法，其中所述患者患有神经损伤。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述神经损伤为外伤性脑损伤。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述患者在所述施用之前不到24小时罹患所述神经损伤。
90.如权利要求84所述的方法，其中所述间充质干细胞是全身性施用的。
91.如权利要求84所述的方法，其中所述间充质干细胞是静脉内施用的。
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