KR20120120988A - 줄기 세포를 이용한 면역 조정 방법 및 장치 - Google Patents
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Abstract
줄기 세포를 단핵구 세포 및/또는 림프구와 공동-배양하여, 이의 기능을 조정하는 방법 및 장치를 개시한다. 또한, 본 발명은 자가면역 질환 및 면역 장애 관련 질환, 예컨대 당뇨병을 치료하기 위한 기전으로서 자가반응성 면역 세포를 교육시키기 위한 줄기 세포의 용도를 개시한다. 본 발명의 일 측면에서, 림프구를 조정하여 자가반응성 T 세포를 억제하는 생물반응조를 제공한다. 이 생물반응조는 하나 이상의 양으로 하전된 및/또는 소수성 기질 표면을 가지고 있는 챔버, 상기 기질 표면에 부착된 줄기 세포 집단, 상기 챔버로 림프구를 도입하기 위한 유입관, 및 상기 줄기 세포와의 공동-배양 후 처리된(treated) 림프구를 추출하기 위한 배출관을 포함할 수 있다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2009년 12월 8일자 미국 가출원 61/283,782의 "줄기 세포 교육자 및 임상 적용"과 2009년 12월 8일자 미국 가출원 61/283,810의 "줄기 세포의 면역 조정 및 이의 분자 기전"에 대한 우선권을 주장하며, 이들 문헌의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 또한, 본 출원은 2008년 4월 7일자 미국 특허 출원 12/099,054의 "인간 제대혈 유래의 분리된 배아 유사 줄기 세포"에 대한 일부 계속 출원이며, 이 문헌의 내용도 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 일반적으로 자가면역 질환 및 면역 장애 관련 질환을 치료하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다.
인간 자가면역 질환 및 면역 장애 관련 질환, 예컨대 심혈관 질환, 당뇨병 및 신경 퇴행성 질환의 발병율 증가는 보다 효과적인 치료법 발굴에 동기가 된다. 배아 줄기 세포 및 성체 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 이용한 치료법은 재생 의학에 있어 합리적인 치료 도구이며, 현대 치료학에 대변혁을 일으킬만한 잠재력을 가지고 있다. 자가 재생력과 만능성 분화력의 높은 잠재성으로 인해, 배아 줄기(ES) 세포는 매우 활발하게 연구되는 분야가 되고 있다. 그러나, 윤리적인 문제가 이의 유용성과 실제 유효성에 제약이 되고 있다. 이러한 윤리적인 문제는 제쳐두더라도, ES 세포를 확보하기 위해 시험관내 수정(IVF)과 변성된 핵 치환술(ANT)을 이용하는 것도 필수 기술들의 복잡성으로 인해 문제가 된다.
최근, 조혈계와 그외 장기를 재구성하기 위한 줄기 세포의 소스로서 제대혈이 사용되고 있다. 제대혈은 간엽 줄기 세포와 단핵구-유래 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 확보하기 위한 풍족한 자원을 제공한다. 제대혈에서 조혈 세포를 제거(백혈구 공통 항원 CD45+ 세포들을 모두 제거함)하였을 때, ES 분자 마커를 발현하는 줄기 세포가 확인되었다. 그러나, 제대혈에서의 전술한 세포 집단의 제거는 이의 실무적 적용에 큰 제한이 된다.
배아 기원이 아닌 성체 기원으로부터 유래된 수종의 다른 배아 유사 줄기 세포도 개시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 7,045,148, 미국 특허 출원 번호 2005/0148034, 2005/0118715, 2004/0028660, 2003/0235909, 2002/0160510 및 2003/0180269, 및 국제 특허 WO 03/068937에서는 제대혈 또는 태반으로부터 추출한 배아 유사 줄기 세포를 개시하였다. 미국 특허 출원 번호 2006/0078993에서는 탯줄의 양막으로부터 유래된 배아 유사 줄기 세포를 개시하였다. 이들 특허 또는 특허 출원에 언급된 줄기 세포들은 CD45 마커를 발현하지 않는(CD45-) 간엽 기원의 줄기 세포들이다. 다른 예로, 미국 특허 출원 번호 2006/0147426에서는 인간 골수 유래 줄기 세포를 언급하였다. Zhao 및 Mazzone의 국제 특허 PCT/US06/38524에서는 줄기 세포 치료에 적합한 제대혈로부터 분리한 배아 유사 줄기 세포를 개시하였다. 또한, Zhao 및 Mazzone의 국제 특허 PCT/US07/22260에서는 줄기 세포 치료에 적합한 말초 혈액으로부터 분리한 배아 유사 줄기 세포를 개시하였다.
본 발명은 자가면역 질환을 치료하기 위한 기전으로서 자가반응성 면역 세포를 교육시키는 배아 유사 줄기 세포 특징을 가진 줄기 세포를 이용하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
본 발명은, 일 측면으로, 하나 이상의 양으로 하전된 및/또는 소수성 기질 표면을 가지고 있는 챔버, 상기 기질 표면에 부착되는 줄기 세포 집단, 상기 챔버로 림프구를 도입하기 위한 유입관, 및 줄기 세포와의 공동-배양 후 처리된(treated) 림프구를 추출하기 위한 배출관을 포함하는, 림프구를 조정(modulation)하여 자가반응성 T 세포를 억제하기 위한 생물반응조를 개시한다.
생물반응조의 기질 표면은 하나 이상의 시트 층으로서 형성될 수 있다. 다른 예로, 상기 기질 표면은 복수의 마이크로캐리어에 의해 형성될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 기질 표면은 투과성 막 층일 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 기질 표면은 줄기 세포가 쉽게 부착될 수 있는 폴리스티렌 등의 소수성 폴리머를 포함한다. 줄기 세포는 기질 표면에서 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 심지어 95% 이상의 컨플루언스(confluence)를 형성할 수 있다. 생물반응조는 바람직하게는 챔버 안에 106개 이상의 줄기 세포 집단을 수용한다. 어떤 경우에는, 줄기 세포는 챔버 안에서 림프구와 적어도 1:10의 비율로 존재한다.
생물반응조의 챔버는, 줄기 세포와 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 허용하도록, 또는 이러한 세포 대 세포 접촉을 방지하도록, 예컨대 처리된 림프구를 챔버에서 꺼낼 때 줄기 세포의 편승 효과(entrainment) 방지하도록, 구성될 수 있다. 아울러, 줄기 세포를 챔버내 복수의 기질 표면 층에서 배양할 수 있다.
줄기 세포는 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 수득할 수 있다. 줄기 세포는 림프구와 동종이계(allogenic)이거나 또는 림프구와 동종동계(autologous)일 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 개체로부터 혈액을 채혈하기 위한 유체 도관; 채혈한 혈액으로부터 림프구를 분리하기 위한 혈구 성분 채집 장치; 줄기 세포 집단을 기질 표면에 부착시킬 수 있는, 하나 이상의 양으로 하전된 및/또는 소수성 기질 표면을 구비한 챔버, 상기 챔버로 림프구를 도입하기 위한 유입관, 및 줄기 세포와의 공동-배양 후 처리된 림프구를 추출하기 위한 배출관을 포함하는 생물반응조; 및 상기 처리된 림프구를 개체로 복귀시키기 위한 유체 도관을 포함하는 시스템을 개시한다. 생물반응조는 전술한 요소들, 특징 또는 기능들 전체 또는 임의의 일부를 갖출 수 있다.
본 발명은, 다른 측면에서, 치료가 필요한 개체로부터 채혈하는 단계, 채혈한 혈액으로부터 림프구를 분리하는 단계, 조절성 T(Treg) 세포가 활성화되어 자가반응성 T 세포를 억제하도록 상기 림프구를 줄기 세포에 노출시키는 단계, 및 상기 처리된 림프구의 적어도 일부를 상기 개체로 복귀시키는 단계를 포함하는, 자가반응성 T 세포로 인한 자가면역성 장애를 치료하는 방법을 개시한다. 예를 들어, 상기 방법은 자가면역성 장애가 당뇨병인 경우에 수행할 수 있다.
상기 림프구를 줄기 세포에 노출시키는 단계는, 예컨대 줄기 세포를 순 양 전하(net positive charge)를 띄는 기질 표면에서 컨플루언스 상태에 도달하도록 배양함으로써 줄기 세포를 반응조에서 배양하는 단계, 및 개체의 림프구를 상기 반응조로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 방법은 개체의 림프구에 동종이계 또는 동종동계인 줄기 세포를 이용하여 수행할 수 있다. 줄기 세포는 제대혈 또는 말초 혈액, 예컨대 개체 자신의 말초 혈액으로부터 수득되는 자가 줄기 세포로부터 수득할 수 있다.
생물반응조에서 줄기 세포를 배양하는 단계는, 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 포함하는 말초 혈액을 수집하는 단계; PBMC가 배아 유사 줄기 세포로 회귀되도록, PBMC를 배양하는 단계; 상기 배아 유사 줄기 세포를 분리하는 단계; 및 상기 배아 유사 줄기 세포를 상기 반응조의 표면에 부착시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 방법은 줄기 세포의 예정된(programmed) 세포 사멸 리간드 1(PD-L1)의 발현을 통해 Treg 세포를 조정하는 단계를 포함할 수 있거나, 및/또는 이때 Treg 세포는 줄기 세포에 의한 질소 산화물(NO)의 분비에 의해 활성화된다. 본 방법은 줄기 세포와 세포 대 세포 접촉에 의한 및/또는 반응조내에서 줄기 세포에 의해 분비되는 가용성 인자에 의한 Treg 세포의 활성화를 포함할 수 있다. 조절성 T(Treg) 세포를 활성화하는 방법은, Treg 세포를, 카르복시펩티다제 M(CPM)를 발현하는 줄기 세포 또는 브래디키닌(bradykinin) B1 수용체를 발현하는 줄기 세포에 노출시키는 단계, 또는 Treg 세포를 자가면역 조절자(AIRE) 단백질을 발현하는 줄기 세포에 노출시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 조정된/활성화된 Treg 세포는 CD4, CD25, CD62L 및 CD69 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 것으로, 바람직하게는 이들 마커 모두를 발현하는 것으로 특정화될 수 있다.
일 구현예에서, 혈액을 채혈하는 단계와 처리된 림프구를 개체에게 복귀시키는 단계는 연속적인 방식으로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 개체의 혈액은 혈액 1 L 이상을 추출할 수 있는 충분한 기간 동안 계속적으로 가공 처리될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은, 배아 유사 줄기 세포를 포함하는 소스로부터 줄기 세포를 추출하는 단계; 상기 줄기 세포를 배양 배지에서 배양하여, 상기 줄기 세포를 배아 유사 줄기 세포로 복원시키는 단계; 및 상기 배아 유사 세포를 분리하는 단계를 포함하는, 개체로부터 배아 유사 줄기 세포를 회수(harvesting)하는 방법을 개시한다. 일부 구현예에서, 배양 배지는 혈청이 첨가 또는 무첨가된 배지를 포함할 수 있다. 세포는 시험관내에서 배양하기 위한 공급 세포층(feeder cell layer)을 필요로 하지 않으며, 생체내에서 생장시 기형종(teratomas)을 형성하지 않는다. 배양은, 폴리스티렌 또는 그외 적합한 플라스틱 물질 및 유리와 같은 소수성 표면에 줄기 세포를 접종하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예들에서, 배아 유사 줄기 세포는 옥타머-결합성 전사 인자 4 (Oct-4), 나노그 호메오박스 (Nanog), SRY (성 결정 영역 Y)-박스 2 (Sox-2), CD9, CD45, 카르복시펩티다제 M (CPM), 브래디키닌(bradykinin) B1 수용체 (B1R) 및 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1) 중 하나 이상을 발현한다. 다른 구현예에서, 배아 유사 줄기 세포는 유도성 질소 산화물 신타제(iNOS)를 발현한다. 또 다른 구현예에서, 상기 배아 유사 줄기 세포는 자가면역 조절자(AIRE)를 발현한다.
다른 측면에서, 본 발명은, 제1 배아 유사 줄기 세포 집단을 림프구를 포함하는 제2 세포 집단과 함께 공동-배양하는 단계, 상기 공동-배양 후 적어도 처리된 제2 세포 집단을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 개체에서 림프구 또는 림프구의 기능을 교육 및 조정하는 방법을 개시한다. 림프구(T 림프구 및 B 림프구 함유)는 인간 말초 혈액으로부터 유래된 동종이계 림프구 또는 자가 림프구일 수 있다. 림프구를 배아 유사 줄기 세포와 배양하여 림프구를 조정한다. 예를 들어, 조정은 자기-항원의 발현 변화를 포함할 수 있다. 다른 구현예로, 배아 유사 줄기 세포는 CD4+, CD62L+ T 림프구를 조정한다. 본 방법은 질소 산화물(NO) 생산의 상향 조절을 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 방법은 자가면역 조절자(AIRE)의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 본 방법을 이용하여, 1형 당뇨병의 증상을 치료 또는 완화시키거나 발병을 지연시킬 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은, 개체로부터 하나 이상의 자가면역성 림프구를 취하는 단계; 상기 림프구를 배아 유사 줄기 세포와 공동-배양하는 단계; 및 상기 림프구를 다시 상기 개체에게 투여하여 당뇨병을 치료하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 포유류 개체에서 당뇨병을 치료하는 방법을 개시한다. 일 구현예에서, 상기 림프구는 개체의 말초 혈액으로부터 수득한다. 개체는 림프구를 수득하기 위해 혈구 성분 채집 시술(cytopheresis)을 받을 수 있다. 다른 구현예에서, 림프구는 CD4+, CD62L+ T 림프구이다. 상기 투여 단계는, 임의의 적합한 방법으로, 예컨대 정맥내 또는 동맥내 주사를 통해 이루어질 수 있다. 세포는 개체 당 약 1 x 104 - 1 x 1013 개로 투여될 수 있다. 본 방법을 이용하여, 인슐린-의존형 당뇨병의 증상을 치료 또는 완화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 림프구는 혈구 성분 채집술을 통해 말초 혈액으로부터 수득한다.
다른 측면에서, 본 발명은 줄기 세포를 제2 세포 집단과 공동-배양하기 위한 장치를 기술한다. 이 장치는, 세포 및/또는 액체용 홀을 따라 한 층에서 다른 층으로 통과하여 흐르는, 줄기 세포로 구성된 층이 복수로 층을 이룬 다층 구조(multi-tiered)일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 장치는 폴리스티렌 또는 그외 적정 플라스틱 물질 및 유리와 같은 소수성 표면을 갖춘 표면을 구비한다. 다른 구현예에서, 줄기 세포는 본 장치의 표면에 부착한다. 본 장치는 유입구와 배출구를 추가로 구비할 수 있다. 제2 세포 집단은 유입구를 통해 장치 안으로 흘러 들어간다. 제2 세포 집단은 줄기 세포와 공동-배양된 다음, 장치의 배출구를 통해 외부로 흘러나오게 된다. 본 장치는 제2 세포 집단을 제공하는 계속적인 유입과 공동-배양된 세포를 배출하는 계속적인 배출이 직접 연결된, 폐쇄형(closed) 시스템일 수 있다. 계속적인 유입은 혈구 성분 채집기와 같은 소스로부터 제공될 수 있다. 다른 측면에서, 계속적인 배출은 혈구 성분 채집기와 같은 소스에 의해 이루어질 수 있다.
본 장치는 줄기 세포와 제2 세포 집단 사이에 막 분리기(membrane separator)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 막은 다공성 막일 수 있다. 상기 다공성 막은 줄기 세포가 막을 통과하지 못하도록 충분히 작은 구멍을 가진다. 다른 구현예에서, 상기 다공성 막은 인자(factor)들이 막의 한쪽 편에서 다른 편으로 통과할 수 있는 충분히 큰 구멍을 가진다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 상기 다공성 막의 한쪽 표면에 부착된다. 다른 구현예에서, 상기 구멍은 줄기 세포의 평균 크기의 약 절반 이하이다.
도 1은 혈액 세포 분리기 MCS+를 1회 바늘 시술로 이용하는 자가면역성 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 시스템을 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 시스템에 사용하기 위한 줄기 세포 생물반응조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 시스템에 사용하기 위한 줄기 세포 생물반응조의 다른 예를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4A는 면역원성은 낮으나 동종이계 림프구의 증식을 자극하지 않는 인간 제대혈 줄기 세포 CB-SC를 도시한 것이다.
도 4B는 CB-SC와의 시험관내 공동-배양한 후, CD4+CD25+ Treg, CD4+Foxp3+ Treg, 및 CD4+CD62L+ Treg의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 4C는 CB-SC와의 시험관내 공동-배양 후, CD4+CD62L+ Treg에서의 CD25 및 Foxp3의 발현을 유세포 분석한 결과이다.
도 4D는 세포내 사이토카인을 염색한 다음 CD4+CD62L+ Treg를 유세포 분석으로 분석한 결과이다. 이소형이 동일한 IgG를 대조군으로 사용한다.
도 5A는 CB-SC에 의해 조정된 CD4+CD62L+ Treg 세포 (mCD4CD62L Tregs)가 당뇨병 NOD 마우스의 고혈당증을 교정할 수 있음을 나타낸 것이다. 대조군으로는 정제된 대조군 CD4CD62L Treg을 사용한다(총 5,000,000개 세포/마우스, i.p., 청색선, n=5 마우스). 다른 대조군으로 PBS를 사용한다(검정선, n=5 마우스).
도 5B는 mCD4CD62L Treg를 1회 처리한 후 3주간의 복막내 포도당 부하 검사(IPGTT) 결과를 나타낸 것이다. 7주령 NOD 마우스를 정상 대조군으로 사용한다.
도 5C는 ELISA에 의한 혈당치 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5D는 치료에 따른 마우스 체중 효과를 나타낸 것이다.
도 5E는 췌장 β 세포 매스(mass)의 형태계측학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 췌장 β 세포 매스는 인슐린 양성의 섬 β 세포에 대한 포인트-카운팅 형태계측법으로 수행한 후, 기니아피그 항-인슐린 Ab (Dako)로 면역염색하고 헤마톡실린으로 대조-염색함으로써, 확인하였다.
도 5F는 Ki67과 인슐린 Ab로 2중 면역염색한 후, 췌장 섬 세포에서의 Ki67-양성 세포를 정량한 결과이다. 이소형이 일치되는 토끼 IgG를 토끼 항-Ki67 mAb에 대한 대조군으로 사용하였다.
도 6A는 mCD4CD62L Treg 처리가 당뇨병 NOD 마우스에서 췌도염 및 면역 기능부전을 회복시킬 수 있음을 나타낸 것이다. mCD4CD62L Treg을 이용한 치료는, 1형 현성 당뇨병 NOD 마우스의 췌도염을 치유한다.
도 6B는 여러가지 타입의 췌도염의 예를 사진으로 나타낸 것이다. 데이타는 mCD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 NOD 마우스로부터 수집하였다. 스케일, 막대, 50 ㎛;
도 6C는 6주령의 마우스를 대상으로 ELISA로 혈장 IFN-γ 수치를 측정한 결과이다.
도 6D는 ELISA에 의한 혈장 IL-4의 측정 결과이다.
도 6E는 ELISA로 측정한 혈장 IL-10의 측정 결과이다.
도 6F는 ELISA로 측정한 혈장 TGF-β1의 측정 결과이다.
도 7은 mCD4CD62L Treg를 이용한 치료시, 췌장 섬에서의 TGF-β1 발현 강화에 의한 췌장 섬에서의 침윤된 면역 세포의 세포자살 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 10 ㎍/ml PHA의 존재 또는 부재 하에, CB-SC와 림프구를 1:10 비율로 CB-SC와 공동-배양한 T1D 환자 유래의 림프구를 나타낸 것이다. 24시간 후, 부유하는 림프구를 유세포 분석기로 수집하였다(A 및 B).
도 8A는 세포내 사이토카인 염색 결과이다.
도 8B는 세포내 Foxp3 염색 결과이다.
도 8C는 세포 증식의 분석 결과이다. T1D 환자 유래의 GAD-특이 CD4+ T 세포 클론을 3일간 CB-SC와 항원 제시 세포(APC) 및 특이 GAD 펩타이드 또는 비-특이 대조군 프로인슐린 펩타이드의 존재 하에 공동-배양하였다.
도 9A는 CB-SC에서의 CPM, B1R 및 iNOS의 발현을 나타낸 것이다. 이소형이 동일한 IgG를 면역염색의 대조군으로 사용하였다. 배율, 400.
도 9B 및 9C는 NO 생성에 대한 실시간 분석 결과이다.
도 9D는 미토겐 PHA-자극화된 림프구를 CB-SC와 CPM 저해제 MGTA (10 μM) 및 B1R 길항제 DALKD (2 μM)의 존재 하에 공동-배양한 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 10A는 Aire 유전자를 실시간 PCR로 분석한 후 2% 아가로스 겔에서 전기영동한 결과이다.
도 10B는 전사 인자 Aire에 대한 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 이소형이 동일한 IgG(좌)를 AIRE 염색(우)에 대한 대조군으로 사용하였고, 배율은 200이다. 데이타는 8가지의 CB-SC 조제물의 결과이다.
도 11A는 웨스턴 블롯으로 확인한 Aire siRNA의 농도 반응 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군 siRNA (NC)는 40 nM의 농도로 대조군으로 사용하였다.
도 11B는 Aire-특이적인 siRNA(P1, P2 및 P3) 3쌍을 이용한 웨스턴 블롯 결과로서, AIRE, CPM 및 PD-LI의 단백질 발현 수준이 감소됨을 보여주며, 내부 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 11C는 Foxp 3 발현에 대한 유세포 분석 결과이다. 성체 말초혈에서 분리한 림프구를 CB-SC와 10:1의 비율로 50 nM Aire siRNA 및 음성 대조군 (NC) siRNA의 존재 하에 공동-배양하였다. 24시간 동안 PHA로 자극화한 후, 유세포 분석으로 세포를 수집하였다.
도 12는 본 발명에 따른 시스템에 사용할 수 있는 줄기 세포 생물반응조의 일예를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 시스템에 사용하기 위한 줄기 세포 생물반응조를 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 시스템에 사용하기 위한 줄기 세포 생물반응조의 다른 예를 개략적으로 도시한 것이다.
도 4A는 면역원성은 낮으나 동종이계 림프구의 증식을 자극하지 않는 인간 제대혈 줄기 세포 CB-SC를 도시한 것이다.
도 4B는 CB-SC와의 시험관내 공동-배양한 후, CD4+CD25+ Treg, CD4+Foxp3+ Treg, 및 CD4+CD62L+ Treg의 퍼센트를 나타낸 것이다.
도 4C는 CB-SC와의 시험관내 공동-배양 후, CD4+CD62L+ Treg에서의 CD25 및 Foxp3의 발현을 유세포 분석한 결과이다.
도 4D는 세포내 사이토카인을 염색한 다음 CD4+CD62L+ Treg를 유세포 분석으로 분석한 결과이다. 이소형이 동일한 IgG를 대조군으로 사용한다.
도 5A는 CB-SC에 의해 조정된 CD4+CD62L+ Treg 세포 (mCD4CD62L Tregs)가 당뇨병 NOD 마우스의 고혈당증을 교정할 수 있음을 나타낸 것이다. 대조군으로는 정제된 대조군 CD4CD62L Treg을 사용한다(총 5,000,000개 세포/마우스, i.p., 청색선, n=5 마우스). 다른 대조군으로 PBS를 사용한다(검정선, n=5 마우스).
도 5B는 mCD4CD62L Treg를 1회 처리한 후 3주간의 복막내 포도당 부하 검사(IPGTT) 결과를 나타낸 것이다. 7주령 NOD 마우스를 정상 대조군으로 사용한다.
도 5C는 ELISA에 의한 혈당치 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5D는 치료에 따른 마우스 체중 효과를 나타낸 것이다.
도 5E는 췌장 β 세포 매스(mass)의 형태계측학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 췌장 β 세포 매스는 인슐린 양성의 섬 β 세포에 대한 포인트-카운팅 형태계측법으로 수행한 후, 기니아피그 항-인슐린 Ab (Dako)로 면역염색하고 헤마톡실린으로 대조-염색함으로써, 확인하였다.
도 5F는 Ki67과 인슐린 Ab로 2중 면역염색한 후, 췌장 섬 세포에서의 Ki67-양성 세포를 정량한 결과이다. 이소형이 일치되는 토끼 IgG를 토끼 항-Ki67 mAb에 대한 대조군으로 사용하였다.
도 6A는 mCD4CD62L Treg 처리가 당뇨병 NOD 마우스에서 췌도염 및 면역 기능부전을 회복시킬 수 있음을 나타낸 것이다. mCD4CD62L Treg을 이용한 치료는, 1형 현성 당뇨병 NOD 마우스의 췌도염을 치유한다.
도 6B는 여러가지 타입의 췌도염의 예를 사진으로 나타낸 것이다. 데이타는 mCD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 NOD 마우스로부터 수집하였다. 스케일, 막대, 50 ㎛;
도 6C는 6주령의 마우스를 대상으로 ELISA로 혈장 IFN-γ 수치를 측정한 결과이다.
도 6D는 ELISA에 의한 혈장 IL-4의 측정 결과이다.
도 6E는 ELISA로 측정한 혈장 IL-10의 측정 결과이다.
도 6F는 ELISA로 측정한 혈장 TGF-β1의 측정 결과이다.
도 7은 mCD4CD62L Treg를 이용한 치료시, 췌장 섬에서의 TGF-β1 발현 강화에 의한 췌장 섬에서의 침윤된 면역 세포의 세포자살 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 10 ㎍/ml PHA의 존재 또는 부재 하에, CB-SC와 림프구를 1:10 비율로 CB-SC와 공동-배양한 T1D 환자 유래의 림프구를 나타낸 것이다. 24시간 후, 부유하는 림프구를 유세포 분석기로 수집하였다(A 및 B).
도 8A는 세포내 사이토카인 염색 결과이다.
도 8B는 세포내 Foxp3 염색 결과이다.
도 8C는 세포 증식의 분석 결과이다. T1D 환자 유래의 GAD-특이 CD4+ T 세포 클론을 3일간 CB-SC와 항원 제시 세포(APC) 및 특이 GAD 펩타이드 또는 비-특이 대조군 프로인슐린 펩타이드의 존재 하에 공동-배양하였다.
도 9A는 CB-SC에서의 CPM, B1R 및 iNOS의 발현을 나타낸 것이다. 이소형이 동일한 IgG를 면역염색의 대조군으로 사용하였다. 배율, 400.
도 9B 및 9C는 NO 생성에 대한 실시간 분석 결과이다.
도 9D는 미토겐 PHA-자극화된 림프구를 CB-SC와 CPM 저해제 MGTA (10 μM) 및 B1R 길항제 DALKD (2 μM)의 존재 하에 공동-배양한 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 10A는 Aire 유전자를 실시간 PCR로 분석한 후 2% 아가로스 겔에서 전기영동한 결과이다.
도 10B는 전사 인자 Aire에 대한 면역조직화학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 이소형이 동일한 IgG(좌)를 AIRE 염색(우)에 대한 대조군으로 사용하였고, 배율은 200이다. 데이타는 8가지의 CB-SC 조제물의 결과이다.
도 11A는 웨스턴 블롯으로 확인한 Aire siRNA의 농도 반응 결과를 나타낸 것이다. 음성 대조군 siRNA (NC)는 40 nM의 농도로 대조군으로 사용하였다.
도 11B는 Aire-특이적인 siRNA(P1, P2 및 P3) 3쌍을 이용한 웨스턴 블롯 결과로서, AIRE, CPM 및 PD-LI의 단백질 발현 수준이 감소됨을 보여주며, 내부 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.
도 11C는 Foxp 3 발현에 대한 유세포 분석 결과이다. 성체 말초혈에서 분리한 림프구를 CB-SC와 10:1의 비율로 50 nM Aire siRNA 및 음성 대조군 (NC) siRNA의 존재 하에 공동-배양하였다. 24시간 동안 PHA로 자극화한 후, 유세포 분석으로 세포를 수집하였다.
도 12는 본 발명에 따른 시스템에 사용할 수 있는 줄기 세포 생물반응조의 일예를 도시한 것이다.
본 발명은 줄기 세포의 새로운 이용 방법 및 이용 장치에 관한 것이다. 줄기 세포는 제대혈 또는 말초 혈액(및 간엽은 아님) 기원의 줄기 세포일 수 있다. 이들 세포는 단순한 기술로 분리하여 증식시킬 수 있다. 본 발명의 특히 유용한 측면은, 이들 세포를 자가 줄기 세포 치료를 위해 개체, 특히 성체의 말초혈로부터 분리하거나, 또는 이들 세포를 비-자가 줄기 세포 치료를 위해 다른 개체로부터 분리할 수 있다는 것이다. 본 발명은, 또한, 단핵구 세포, 예컨대 T 림프구, B 림프구, 단핵수, 수지상 세포(DC) 및 과립구의 기능을 조정하는데 있어 줄기 세포의 용도를 개시한다.
바람직한 구현예에서, 줄기 세포는, 비제한적으로, 줄기 세포 마커들, 즉 Oct-4, Nanog 및 Sox-2를, 다른 배아 줄기(ES) 세포 관련 유전자들, 예컨대 아연 핑거(Zinc finger) 및 SCAN 도메인 함유성 10 (ZNF206, ZSCAN10이라고도 함), Zic 패밀리 멤버 3 헤테로탁시(heterotaxy) 1 (ZIC3), Zic 패밀리 멤버 2 (ZIC2), 생장 관련 단백질 43 (GAP43), PR 도메인 함유성 14 (PRDM14), 단백질 티로신 포스파타제, 수용체 타입의 Z 폴리펩타이드 1 (PTPRZ1), 포도칼리신(Podocalyxin)-유사 (PODXL), 폴리호메오 상동체(Polyhomeotic homolog) 1 (PHC1), 아연 핑거 단백질 589 (ZNF589), 카르복시펩티다제 M (CPM), 브래디키닌 B1 수용체 (B1R)(서열번호 1) 및 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1)과 더불어 포함하는, 특징을 가진다. 다른 구현예에서, 배아 유사 줄기 세포는 유발성 질소 산화물 신타제 (iNOS)를 발현한다. 또 다른 구현예에서, 배아 유사 줄기 세포는 자가면역 조절자(AIRE)(서열번호 2)를 발현한다. Oct-4, Nanog 및 Sox-2의 서열들은 각각 유전자은행 등재 번호 NM_002701, Z11898 및 Q01860; 유전자은행 등재 번호 NM_024865 및 NP_079141; 및 유전자은행 등재 번호 Z31560 및 CAA83435에서 확인할 수 있다.
다른 구현예에서, 줄기 세포는 또한 백혈구 공통 항원 CD45의 발현이 특징적인 조혈세포(hemotopoietic) 특징들을 가질 수 있다. 추가적인 구현예로, 줄기 세포는 CD3, CD20 (B-림프구 세포 표면 항원 B1, 등재 번호 M27394), CD11c (인테그린, 알파 X, 등재 번호 NM_000887), CD11b/Mac-1 (보체 컴포넌트 3 수용체 3 서브유닛, 등재 번호 NM_000632) 및 CD14 (등재 번호 NM_001040021 및 P08571) 마커들은 발현하지 않는다. 보다 추가적인 구현예로, 줄기 세포는 CD34 마커 (조혈 전구 세포 항원 CD34, 등재 번호 P28906)는 발현하지 않는다.
또한, 본 발명은, 당뇨병(1형, 1.5형 및 2형 포함)과 같은 자가면역성 장애 및 질환의 발병을 예방 또는 지연 및/또는 회복 또는 치료하기 위한 줄기 세포의 용도를 개시한다. 실시예에서 확인되는 바와 같이, 줄기 세포와의 공동-배양 후, 다양한 T 림프구 집단들을 분리하고, 이를 개체에 투여하여, 당뇨병과 같은 자가면역성 장애 및 질환의 발병을 예방 또는 지연시키거나 및/또는 자가면역성 장애 및 질환을 회복 또는 치료할 수 있다. 예를 들어, CD62L 마커 (기억 림프구의 마커)에 양성인 T 세포를 분리할 수 있다. CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 세포는 위험군 개체에서 당뇨병 발병을 유의하게 지연시킬 수 있다. 예컨대, CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 세포의 투여가, 당뇨병성 NOD 마우스의 자가면역 반응의 초기 단계를 조정하여, 당뇨병 발병을 유의하게 지연시키는 것으로 입증되었다. CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 세포를 투여한 후, 당뇨병과 같은 자가면역성 장애 또는 질환은 회복되어 정상 혈당(euglycemia)이 될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 배아 유사 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포 기반의 치료법 및 치료 장치를 개시한다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 포유류 개체에서 당뇨병과 같은 자가면역 질환 및 면역 장애-관련 질환을 치료하는데 사용된다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 자가면역성 림프구를 면역조절하는 방법을 개시한다. 본 방법은 성인의 말초혈 샘플을 제공하는 단계; 상기 샘플에서 림프구를 추출하는 단계; 상기 림프구를 줄기 세포와 공동-배양하는 단계; 상기 공동-배양물로부터 림프구 세포를 회수하는 단계; 및 상기 림프구를 다시 개체로 투여하는 단계를 포함한다. 줄기 세포는 생물반응조의 표면에 부착할 수 있다. 아울러, 줄기 세포는 세포 공급자 층을 필요로 하지 않는다. 본 발명은 줄기 세포 기반의 공동-배양 치료법, 자가 및 비-자가 세포 치료법에 적합하다.
조절성 T 세포 (Treg)는, 자가반응성 작동자 T 세포에 대한 저해 효과를 통해, 예컨대 면역억제성 사이토카인 인터루킨-10 (IL-10)의 분비 및/또는 형질변환 성장 인자-β1(TGF-beta1)의 분비를 통해, 항상성과 자가-허용성을 유지하는데 중요한 역할을 한다. Treg는, 세포 수 또는 기능 측면에서의 비정상성이, 당뇨병과 같은 자가면역 질환의 발병 및 진행과 연관되어 있다는 증거들이 많아지고 있다. 자가면역 질환을 치료하기 위한 Treg의 조작은 새로운 접근 방법이다. 제한된 수의 연구들이 자가면역성 당뇨병에 대한 방어를 부여하기 위한 손상된 Treg의 기능 복원에 대해 집중적으로 이루어졌지만, Treg의 기능 조정에 대해서는 이루어지지 않았다. 본원에 기술된 줄기 세포는 Treg의 기능적인 결함을 교정할 수 있으며, 이로써 당뇨병과 같은 현성 자가면역 질환을 치료할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명의 줄기 세포를 T 림프구와 공동-배양하여, 당뇨병을 예방, 지연, 치료 및/또는 경감시킬 수 있는 다양한 T 세포 집단들의 생산을 강화할 수 있다. 일부 구현예들에서, 공동-배양한 림프구를 개체에게 투여하여, 당뇨병과 같은 자가면역성 장애를 경감 또는 완화시키거나 발병을 지연시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 공동-배양한 림프구는 하나 이상의 CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, CD62L 양성 및 CD69 또는 CD4 중 하나 이상이 양성인 T 세포를 투여하여, 당뇨병과 같은 자가면역성 장애의 한가지 이상의 증상을 경감시키거나 또는 개체에서 상기 장애를 완화시킬 수 있다. 예컨대, 공동-배양한 림프구를 개체에게 투여할 수 있으며, 이때 상기 개체의 포도당 수준은 상기 개체의 정상 범위의 수준으로 감소된다. 일부 구현예에서, 림프구 성장 인자를 이용함으로써 시험관내에서 증식시킬 수 있다. 비제한적인 성장 인자의 예를 사용하여, 공동-배양한 림프구의 집단 및/또는 공동-배양한 림프구의 특정 서브집단(예, CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 세포)을 증식시킬 수 있다.
I. 정의
본 발명에서 사용되는 용어는, 일반적으로, 분자 생물학 분야의 당업자들에게 일반적으로 용인되는 표준 정의에 따를 것으로 보인다. 아래에 열거된 몇가지 예외는 본 발명의 범위에서 추가로 정의된다.
본원에서, 용어 "배아 줄기 세포"는 만능성인 배반포의 내세포괴(inner cell mass)로부터 유래된 줄기 세포(예, 4일령 - 7일령의 인간 배아)를 지칭한다. 용어 "배아 유사 줄기 세포", "줄기 세포", "제대혈-줄기 세포 (CB-SC)" 및 "제대혈 유래 인슐린 생산 세포 (CB-IPC)", "말초혈-줄기 세포(PB-SC)", 및 "말초혈 유래 인슐린 생산 세포 (PB-IPC)"는 본원에서 상호 호환적으로 배반포의 내세포괴로부터 유래되지 않는 줄기 세포를 지칭한다. 배아 유사 줄기 세포는 만능성이다. 배아 유사 줄기 세포는 적어도 배아 줄기 세포(ES) 및 조혈 세포의 특징들 중 적어도 일부를 나타낸다. 용어 "줄기 세포"는 무한정으로 생장하여 조직 및 장기의 특수 세포를 형성할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기 세포는 분열하며, 분화적으로 만능성 또는 전능성인 세포이다. 줄기 세포는 2개의 딸 줄기 세포 또는 하나의 딸 줄기 세포를 만들 수 있으며, 한가지 전구체("트랜지트") 세포는 조직의 성숙한, 충분히 확립된 세포로 증식할 수 있다. 본원에서 사용되는 "줄기 세포"는 다르게 언급되지 않는 한 "전구 세포"를 포함한다.
본원에서, 용어 "만능적인", "분화 만능성" 또는 "만능성"은 세포가 비제한적으로 Oct-4, Nanog 및 Sox-2와 같은 만능성 마커들 중 하나 이상에 대해 양성을 나타내며, 세포가 적정 성장 인자들에 의해서와 같이 적정 자극시 포유류 신체의 약 260가지의 세포 타입의 서브세트로 적어도 분화될 수 있는 잠재성을 가지고 있는 것을 의미한다.
본원에서, 용어 "전능성 세포"는 완전한 배아(예, 배반포)를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다.
용어 "개체"는 면역 반응이 이루어지는 모든 살아있는 유기체를 지칭한다. 이 용어는 원치않거나 부적절한 미생물에 의한 병태를 치료할 필요가 있거나 또는 병태에 걸리기 쉬운, 예컨대 후술하는 원치않은 병원성 세포(pathogenic cell) 보유에 대한 특별한 치료가 필요한, 살아있는 동물 또는 인간을 지칭한다. 용어 개체는, 인간, 침팬지 및 그외 유인원 및 원숭이 종 등의 인간을 제외한 영장류; 농장 동물, 예, 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가축 포유류, 예컨대 개 및 고양이; 설치류를 비롯한 실험 동물, 예컨대 마우스, 랫 및 기니아 피그 등을 포함하나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 이 용어는 특정 성별 또는 연령을 지칭하는 것은 아니다. 따라서, 성체 및 신생아 개체, 뿐만 아니라 태아는 암컷 또는 수컷에 상관없이 포괄되는 것으로 의도된다. 바람직한 구현예에서, 개체는 인간 및 인간을 제외한 포유류 등의 포유류이다. 가장 바람직한 구현예에서, 개체는 인간이다.
용어 "미분화된"은 본원에서 보다 특수화된 세포 특징을 발현하지 않는 만능성 배아 줄기 세포를 지칭한다. 당해 기술 분야의 당업자라면 숙지하는 바와 같이, 용어 "미분화된" 및 "분화된"은 서로 상대적인 의미이다. "분화된" 줄기 세포는 보다 특수화된 세포의 특징을 가진다. 분화된 세포 및 미분화된 세포는 상대적인 크기와 형태, 핵 부피 대 세포질 부피의 비율과 같은 형태학적 특징; 및 공지된 분화 마커들의 검출가능한 존재 등의 발현 특징들을 비롯하여, 잘 확립된 몇가지 기준으로 서로 구분된다. 세포가 분화된 세포인지 미분화된 세포인지를 나타내는 분화 마커는 단백질, 탄수화물, 지질, 핵산, 기능적 특징 및/또는 분화된 세포에 특이적인 형태학적 특징을 포함한다.
본원에서, 세포에 적용할 때, 용어 "실질적으로 상동적인"은, 집단에 속하는 세포들의 약 70% 이상이, 바람직하게는 약 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상이 동일한 세포 타입인, 세포의 집단을 의미한다. 세포 타입의 예로는, 배아 유사 줄기 세포, β 세포 유사 인슐린 생산 세포, 신경 세포, 심근 세포, 거핵세포, 내피세포, 상피 세포, 적혈구 세포, 림프구, 단핵구, 대식세포, 과립구, 간세포, 신장 세포(nephrogenic cell), 지방세포(adipogenic cell), 골모 세포(osteoblast cell), 파골세포, 폐포세포(alveolar cell), 심장세포(cardiac cell), 장세포, 신장세포 등이 있으나, 이로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 용어 "실질적으로 상동적인"은 집단에 속하는 세포의 약 70% 이상이, 바람직하게는 약 80% 이상이, 보다 바람직하게는 90% 이상이 미분화된, 세포 집단을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 세포의 실질적으로 상동적인 집단은, 세포의 95% 이상이 미분화된 집단이다. 다른 구현예에서, 세포의 실질적으로 상동적인 집단은 세포의 99% 이상이 미분화된 집단이다. 세포의 집단은, 세포의 집단이 실질적으로 상동적인지를 확인하기 위해 하나 이상의 분화 마커를 분석할 수 있다.
배아 유사 줄기 세포 및/또는 분화된 세포 타입으로 구성된 실질적으로 상동적인 집단의 형성 및/또는 유지는, 미분화된 세포 및/또는 분화된 세포의 특정 마커들로 세포의 비율을 분석함으로써 측정할 수 있다. 예컨대, Oct4와 같은 미분화된 세포의 마커, 네스틴 및 Ngn-3과 같은 신경전구체 마커, 및 β-투불린 및 TPH2와 같인 성숙형 신경 마커의 마커들에 대한 전사 산물의 상대적인 비율을 정량적인 RT-PCR로 평가한다. 또한, 미분환된 세포에서의 마커의 생산과 위치는 면역조직화학법으로 분석할 수 있다.
미분화된 줄기 세포 및 분화된 세포의 마커들은, 특정 마커에 특이적인 항체를 이용하는 항체-기반의 검출 기법 등의 임의의 다양한 방법으로 분석한다. 항체 기반의 기법으로는 면역형광 및 면역블롯팅을 포함한다. 다른 분석법으로는, 특정 마커를 코딩하는 mRNA 검출법이 있다. 이러한 분석은 중합효소 연쇄 반응, 블롯 혼성화(또한 노던 블롯으로도 알려져 있음) 및 인 시츄 혼성화를 포함한다. 이러한 분석과 그외 분석에 대한 상세한 내용은 본원과 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 3rd ed., 2001; F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols; 5th ed., 2002; 및 E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 등의 표준 참조문헌에 기술되어 있다.
본원에서, 용어 "림프구" 및 "백혈구"는 상호 호환적으로 사용되며, 통상적으로, 백색 혈액 세포, T 세포 및 B 세포, T 림프구, 작동자 T 세포, Treg 세포, 미성숙 T 세포, B 림프구, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 조혈 항원 제시 세포, 기억 B 세포를 비제한적으로 포함하는, 조혈계 단핵구 세포를 지칭한다.
본원에서, 용어 "배양 배지"는 일반적으로 살아있는 세포를 배양하기 위해 사용하는 임의의 물질 또는 조제물을 지칭한다. "세포 배양물"은 시험관내 세포 증식을 지칭하며, 세포는 증식하더라도 조직 자체로 조직화되지 않는다.
본원에서, 용어 "치료한다", "치료하는", "치료" 등은 장애 및/또는 장애와 관련있는 증상을 경감 또는 완화시키는 것을 지칭한다. 불가능한 것은 아니지만, 장애 또는 병태의 치료는, 장애, 병태 또는 이와 관련있는 증상의 완전한 퇴치가 필수 조건은 아니다. 본원에서, 용어 "예방한다", "예방하는", "예방" 등은 장애 또는 병태를 앓고 있진 않지만 장애 또는 병태가 발병할 위험성이 있는 개체에서 장애 또는 병태의 발병 가능성을 낮추는 것을 의미한다.
용어 "투여", "투여하는"은 명세서 전체에서 본 발명에 따른 배아 유사 줄기 세포를 개체에게 전달되는 것을 기술하는데 이용된다. 배아 유사 줄기 세포는, 세포를 필요한 부위로 이동시킬 수 있는 경로들 중에서도, 비경구(정맥내, 동맥내 및 그외 적정 비경구 경로 포함), 척수강내(intrathecal), 실내(intraventricular), 실질조직내(intraparenchymal) (척추내, 뇌간내 또는 운동 피질내 포함), 낭내(intracisternal), 두개내(intracranial), 선조체내(intrastriatal) 및 흑질내(intranigral) 등의 다양한 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 유인제 처리 없이("무처리", 즉, 줄기 세포 샘플에서 세포의 분화를 촉진시키기 위한 추가적인 처리 없음) 또는 배아 유사 줄기 세포를 우호적인 표현형을 나타내는 세포로 분화되게 하는 유인제 또는 그외 제제를 처리한 후("처리됨") 사용할 수 있다. 투여는 치료할 질병 또는 병태에 따라 거의 결정될 것이며, 바람직하게는 비경구 경구, 예컨대 정맥내로 뇌척수액으로의 투여에 의해 또는 뇌나 다른 신체 부위내 질병에 걸린 조직으로의 직접 투여에 의해 이루어질 수 있다. 예컨대, 당뇨병의 경우, 바람직한 투여 경로는 췌장으로의 투여이나, 또는 순환계를 통한 회귀(transmigration)에 의해 질병에 걸린 부위로 "귀향"할 수 있는 정맥내 경로에 의한 투여일 것이다.
용어 "자가면역성 장애" 및 "자가면역 질환"은 명세서 전체에서 동의적으로 사용되며, 에디슨 질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 크론 질환, 당뇨병(1형), 그레이브 질환, 길리안-바레 증후군, 전신 홍반성 낭창(LSE), 홍반성 신염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 건선, 원발성 담증성 간경변, 류마티스 관절염, 포도막염, 천식, 죽상경화증, 1형 당뇨병, 건선 및 다양한 알레르기 등의 자가면역 증상들을 가지고 있는 질환을 기술한다.
용어 "면역 장애-관련 질환"은 명세서 전체에서 동의적으로 2형 당뇨병, 비만, 심혈관 질환, 고혈압, 고지질혈증, 만성 신장병, 원발성 사구체신염; 자반병성 신염, 홍반성 신염, 당뇨병성 신병증, 당뇨병성 족부 질환 및 당뇨병성 안 질환 등의, 질병의 병인에 기여하는 면역 장애를 가지고 있는 질환들을 기술한다.
용어 "이식하는(grafting 및 transplanting)" 및 이식("graft" 및 "transplantation")은 명세서 전체에서 동의적으로 사용되며, 배아 유사 줄기 세포 또는 본 발명에 따른 다른 세포가 자가면역 질환 치료 및 당뇨병 치료 등의 우호적인 효과를 나타내도록 의도된 부위로 전달되는 방식을 기술한다. 배아 유사 줄기 세포 또는 본 발명에 사용되는 다른 세포들 역시 이식을 수행하기 위해 체내 적정 부위로의 세포 이동에 따라, 전술한 임의의 투여 방식에 의해 신체의 원격 부위로 전달할 수 있다.
용어 "본질적으로"는 90% 이상 유효한, 바람직하게는 약 95% 이상 유효한, 보다 바람직하게는 98% 이상 유효한 방법 또는 세포의 집단을 설명하는데 사용된다. 즉, 해당 세포 집단을 "본질적으로" 제거하는 방법은, 타겟화된 세포 집단의 약 90% 이상, 가장 바람직하게는 세포 집단의 약 98% 이상을 제거하는 것이다. 배아 유사 줄기 세포는, 특정 구현예에서 본질적으로 조혈 세포(즉 조혈 줄기 세포 마커 CD34-임)가 결여, 본질적으로 림프구(즉, 림프구 마커들 CD3, CD20 및 CD90이 -임)가 결여, 본질적으로 단핵구/대식세포 항원 CD11b/Mac-1 및 CD14가 결여, 수지상 세포 항원 CD11c가 결여, 및 본질적으로 간엽 세포(CD45-)가 결여되어 있다.
용어 "비-종양원성(non-tumorigenic)"은 세포가 신생물 또는 종양을 형성하지 않는 것을 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 배아 유사 줄기 세포에는 일반적으로 신생물 및 암이 없다.
II. 줄기 세포의 분리 방법
본 발명은 배아 제대혈 또는 말초혈로부터 분리된 줄기 세포 집단의 이용에 관한 것이다. 줄기 세포는 본원에서 제대혈-줄기 세포(CB-SC) 또는 말초혈-줄기 세포(PB-SC)로 지칭된다. 본원에서, 용어 "제대혈(umbilical cord blood 및 cord blood)"은 상호 호환적으로 사용된다.
본 발명의 방법에 있어서, 줄기 세포는 림프구 집단과의 공동-배양 중에 부착되는 세포 집단을 의미한다. 림프구는 성체 인간 말초혈로부터 유래된다. 림프구는 또한 제대혈, 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 림프절, 지방 조직(adipocyte tissue) 및 간 세포일 수 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 림프구는 저농도의 혈청(예, 7% 소 태아 혈청), 무혈청성 세포 배양 배지 및 세포 공급자 첨가없이 고염기성 세포 배양 배지에서 공동-배양할 수 있다. 부착되는 줄기 세포 집단은 양으로 하전된 표면에 부착시킬 수 있다. 또한, 표면은 소수성 표면, 예컨대 폴리스티렌 및 유리일 수 있다.
본 발명에서 "분리된"이라는 의미는, 줄기 세포 또는 림프구가, 비제한적으로 기계적인 분리 또는 선택적인 배양과 같은 한가지 이상의 분리 방법을 통해, 제대혈 또는 말초혈에서 발견되는, 적혈구 및 기타 부착되지 않은 단핵구 세포 등의, 다른 세포들로부터 분리되는 것을 의미한다. 세포의 2차 집단에 존재할 수 있는 다른 세포 타입들은 공동-배양 과정 또는 회수 과정을 통해 제거될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 2차 집단은 단핵구가 50% 이상을 차지한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 2차 집단은 단핵구가 75% 이상을 차지한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 2차 집단은 단핵구가 90% 이상을 차지한다. 다른 구현예에서, 세포의 2차 집단은, 적혈구, 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 림프절, 지방 조직 및 간 세포가 제거된, 성체 인간 말초혈로부터 유래된 50% 이상의 단핵구이다.
III. 줄기 세포의 특정화
줄기 세포 기반의 치료에 적합한 줄기 세포에 대한 주요 특징들 중 한가지는 증식 역량이다. 본원에서, 용어 "증식 역량"은 세포가 비제한적인 예로서 Nanog 등의 하나 이상의 자기-재생 마커를 발현하며, 세포가 증식할 수 있다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 세포는 무한정 증식할 수 있다. 본원에서 사용되는 "증식한다"는 세포를 배양하였을 때 세포가 증식하며 수적 증가를 의미한다. 용어 "증식한다" 및 "확장한다"는 본원에서 상호 호환적으로 사용된다.
임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니나, 줄기 세포의 낮은 면역원성이 T 림프구와 같은 면역 세포를 조정하는 줄기 세포의 능력에 기여할 수 있다. 면역 세포와 줄기 세포를 공동-배양한 후, 면역 세포에서 생산되는 염증성 사이토카인의 생산은 예컨대 2-3배 이상 감소될 수 있으며, 다른 사이토카인의 생산은 증가될 수 있으며, 예컨대 TGF-β1은 2-3배 증가한다. 줄기 세포와의 공동-배양에 의해 감소될 수 있는 염증성 사이토카인의 예로는 TNF-α, IL-β, IL-γ, IL-15, IL-17, IL-18, IL1β, IL-21, IL22, IL-23, IL-4, IL-5 및 IL-6가 있다. 줄기 세포는, 면역 세포와의 공동 배양시, 다른 면역 세포, 예컨대 CD4/CD8의 비율은 정상화하면서, 자극받은 면역 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및 IL-2-자극 받은 CD4+CD25+ 조절성 T 세포의 비율은 감소시킬 수 있다. 활성화된 T 림프구에 대한 네거티브 조절자인 CD69 분자도, 줄기 세포와의 공동 배양 후, CD4+ 및 CD8+ T 림프구와 같은 면역 세포에서 증가될 수 있다. 아울러, 줄기 세포는 IL-2- 및/또는 PHA-자극받은 림프구 등의 자극받은 면역 세포의 증식을 저해할 수 있다.
줄기 세포와 림프구 간의 세포 대 세포 접촉은 저해 효과를 매개할 수 있다. 줄기 세포와 림프구 간의 직접 상호작용은 줄기 세포 및/또는 림프구 상의 세포 표면 수용체들을 통해 이루어진다. 이러한 수용체들은 카르복시펩티다제 M(CPM), 브래디키닌 B1 수용체 (B1R) 및 예정된 사멸 리간드 1 (PD-L1)을 포함할 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
질소 산화물(NO)과 같은 줄기 세포에 의해 분비되는 가용성 인자들도, 강력한 질소 산화물 신타제 저해제 (N-오메가-니트로-L-아르기닌, L-NNA)를 이용한 블록킹에 의해 입증된 바와 같이, 저해성 효과를 매개할 수 있다. 아울러, 기계론적 연구를 통해, CB-SC에서 생산된 질소 산화물 (NO)은 조절성 T 림프구에 대한 CB-SC에 의한 조정에 기여하는 것으로 확인되었다. CB-SC-유래 NO에 의한 DNA 메틸트랜스퍼라제 (DNMT) 활성에 대한 후생적(epigenetic) 조절은, 특이적인 유발성 질소 산화물 신타제 (iNOS) 저해제 1400W의 존재에 의해 유의하게 차단할 수 있다.
IV. 치료 방법
당뇨병은 건강에 가장 문제가 되는 질환이다. 인슐린 생산 세포의 결핍이 1형 및 2형 당뇨병 둘다에서 주된 요인이다. 줄기 세포 유래의 인슐린 생산 세포는 합리적인 치료 도구가 될 수 있다. 이러한 치료의 주된 성공 열쇠는, 임의의 윤리적인 문제와 면역 거부없이, 접근, 선택, 배양, 증식 및 분화가 용이한 세포를 동정할 수 있어야 한다는 것이다. 배아 줄기 세포와 성체 줄기 세포 둘다 임상적인 치료제로 가능한 자원으로 사용할 수 있다. 그러나, 면역 시스템은 동종이계 배아 줄기 세포의 적용시 인체의 면역 감시를 통해 외래 세포를 인지하여 공격할 것이다. 따라서, 자가 줄기 세포를 이용하는 것이 가능한 공격 전략이다. 인간 골수 및 말초혈이, CD34+ 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포 및 단핵구 유래 줄기 세포 등의, 자가 줄기 세포 입수에 유용한 근원을 제공한다는 증거들이 증가하고 있다.
본 발명은 포유류 개체에게 자가면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개시한다. 자가면역성 장애는 에디슨 질환, 자가면역성 용혈 빈혈, 자가면역성 갑상선염, 크론 질환, 당뇨병(1형), 그레이브 질환, 길리안-바레 증후군, 전신 홍반성 낭창 (SLE), 홍반성 신염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 건선, 원발성 담증성 간경변, 류마티스 관절염, 포도막염, 천식, 죽상경화증, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 건선 및 다양한 알레르기 중 임의의 한가지일 수 있다. 자가면역 질환의 예는 1형 당뇨병이다. 일 구현예에서, 단핵구 세포, 예컨대 림프구는 개체로부터 회수한다. 단핵구 세포는 또한 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 림프절, 지방 조직 및 간 세포일 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
임상적인 활용을 위해, 단핵구 세포를 개체의 말초혈로부터 수득할 수 있다. 또한, 단핵구 세포를 줄기 세포와 공동-배양함으로써 전술한 줄기 세포로 처리하여, 복수의 줄기 세포-처리된 단핵구 세포를 수득할 수 있다. 공동-배양 중에, 줄기 세포는 단핵구 세포와 직접 상호작용하여 단핵구 세포의 기능을 조정한다. 조정된 기능은, 비제한적으로, 휴지(quiescence) 또는 활성화에 대한 마커들의 세포 표면에서의 발현 변화(증가 또는 감소), 및 휴지기, 활성화 또는 세포 사멸과 관련있는 유전자의 발현 변화(증가 또는 감소)에 의해 분석할 수 있다. 단핵구 세포는 자기 항원에 대한 자가면역성이 감소되게 조정된다. 공동-배양한 후, 줄기 세포-처리된 단핵구 세포를 회수할 수 있다. 줄기 세포-처리된 단핵구 세포를 다시 개체에게 투여하여, 자가면역 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 바람직하게는, 줄기 세포-처리된 단핵구 세포는, 개체에게 투여하기 전에, 공동-배양물에서 회수한다. 다른 구현예에서, 줄기 세포-처리된 단핵구 세포는 이를 개체에게 투여함과 동시에 공동-배양물로부터 회수한다.
일 측면에서, 본 방법은, 하나 이상의 단핵구 세포를 포함하는 개체의 말초혈로부터 단핵구 세포를 취하는 공정, 상기 단핵구 세포를 줄기 세포와 공동-배양함으로써 하나 이상의 림프구를 줄기 세포와 공동-배양하는 공정, 하나 이상의 줄기 세포-처리된 림프구를 포함하는 상기 공동-배양된 단핵구 세포를 회수하는 공정 및 하나 이상의 줄기 세포-처리된 림프구를 포함하는 상기 공동-배양한 단핵구 세포를 개체에게로 다시 투여하는 공정을 포함하는, 연속적인 폐쇄형 시스템인, 포유류 개체에서 자가면역 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 개시한다. 단핵구 세포는, 비제한적인 예로서, 림프구, T 림프구, CD4+CD25+CD62L+CD69+ T 림프구, B 세포, 작동자 T 세포, Treg 세포, 미성숙 T 세포, B 림프구, 미성숙 B 세포, 성숙 B 세포, 기억 B 세포, 과립구, 단핵구, 수지상 세포 및 그외 항원 제시 세포일 수 있다.
상기 연속적인 폐쇄형 시스템은 개체로부터 말초혈을 채혈하고, 개체의 말초혈로부터 단핵구 세포와 림프구를 분리하는 혈구 성분 채집 기법을 활용할 수 있다. 단핵구 세포는 하나 이상의 림프구를 포함할 것이다. 개체의 말초혈을 취하여, 말초혈내 혈장 및 적혈구로부터 단핵구 세포를 분리한 다음, 혈장과 적혈구는 상기 개체로 다시 복귀시키면서 단핵구 세포는 줄기 세포와의 공동-배양을 위한 장치로 이동시킬 수 있다. 단핵구 세포를 함유한 용액을 줄기 세포 위로 이동시킴으로써 단핵구 세포를 줄기 세포와 공동-배양할 수 있다. 상기 공동-배양물로부터 단핵구 세포를 취하여, 중력 또는 펌핑에 의해 개체로 회귀시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 림프구를 면역조절하는 방법을 개시한다. 본 방법은 성체 인간 말초혈의 샘플을 제공하는 단계; 상기 샘플에서 적혈구를 제거하여 단핵구 세포를 수득하는 단계; 상기 단핵구 세포를 줄기 세포와 공동-배양하는 단계; 상기 공동 배양물로부터 단핵구 세포를 회수하고 이를 개체에게 다시 투여하는 단계를 포함한다. 본 방법은 줄기 세포-기반의 공동-배양 치료법, 자가 및 비-자가 세포 치료법에 적합하다.
줄기 세포와 단핵구 세포 및/또는 림프구와의 공동-배양으로, 상기 단핵구 세포 및/또는 림프구의 활성화가 유도될 수 있다. 활성화는, 비제한적으로 CD69, CD100, 림프구 증식 강화(potentiation) 인자, 흉선 세포-활성화 인자, CD223 등의 세포 활성화와 관련있는 특이적인 유전자의 합성을 유도할 수 있는, 단핵구 세포 및/또는 림프구의 형태적 및 기능적 변형이다. 또한, 활성화는 단핵구 세포 및/또는 림프구가 세포 주기에 참여하도록 유도할 수 있다. 활성화는 또한 단핵구 세포 및/또는 림프구가 증식되게 유도할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 줄기 세포는 단핵구 및/또는 림프구와의 공동-배양 전에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 컨플루언스 상태에 도달하도록 배양한다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:2의 비율로 공동-배양할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:5의 비율로 공동-배양할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:10의 비율로 공동-배양할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:20의 비율로 공동-배양할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:50의 비율로 공동-배양할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 단핵구 세포 및/또는 림프구와 적어도 1:100의 비율로 공동-배양할 수 있다.
V. 장치
도 1은, 혈구 성분 채집 장치(14)와 함께 개체(2)로부터 혈액을 채혈하기 위한 유체 도관(12), 줄기 세포 반응조(16) 및 유체 반송 도관(18)을 구비한, 자가면역성 장애를 치료하기 위한 본 발명에 따른 시스템(10)을 도시한다. 사용시, 예컨대 혈류역학 펌프가 구비된 유체 도관(12)을 통해 개체로부터 혈액을 채혈하고, 혈구 성분 채집기(14)에 의해 처리하여 혈액으로부터 림프구를 분리한다. 혈액은 유체 반송 도관(18)을 통해 환자에게로 다시 회귀시킬 수 있다. 분리된 림프구는 줄기 세포 반응조("줄기 세포 교육자")로 이송되며, 여기서 림프구 집단의 일부가 반응조(16)내 줄기 세포와의 상호작용에 의해 변형된다. 바람직한 일 구현예에서, 줄기 세포는 Treg 세포를 활성화하며, 이를 반응조(16)에서 회수하여, 예컨대 유체 반송 도관(18)을 통해 개체로 다시 회귀시킬 수 있다.
도 2는, 챔버(22), 유체 유입구(23), 줄기 세포(25)가 접종된 복수의 기질 표면 층(24)을 포함하는 본 발명에 따른 줄기 세포 반응조(20)를 개략적으로 도시한 것이다. 층 간의 연결통로(25)는 흐름 경로(27)를 따라서 유입구(23)에서 배출구(29)로 림프구가 흐르게 한다. 사용시, 청구항 1항의 혈구 성분 채집 장치로부터 나온 림프구를 조정/활성화가 이루어지는 챔버(22)로 공급한다. 적정 시간이 경과된 후, 활성화된 Treg 세포 (및/또는 존재하는 경우, 그외 조정된 림프구)를 반응조로부터 이동시켜 개체로 회귀시킬 수 있다.
도 3은 조절 중인 림프구가 줄기 세포(36)와의 직접 접촉으로부터 물리적으로 격리된, 줄기 세포 반응조(30)의 다른 구현예를 개략적으로 도시한 것이다. 반응조(30)는 배양한 줄기 세포를 보유하는(housing) 챔버(32)를 포함한다. 챔버는 줄기 세포의 영양 배지를 순환시키기 위한 유입구(34)와 배출구(35)를 구비할 수 있다. 챔버 내부에는 줄기 세포(36)와 림프구의 유동 경로를 분리시키는 막으로 규정된 하나 이상의 연결통로(37)가 존재하며, 줄기 세포는 림프구를 줄기 세포와의 직접 접촉으로부터 격리시키는 관상 막(37)의 바깥쪽 챔버안 도처에서 증식할 수 있다. 사용시, 림프구는 제1항의 혈구 성분 채집 장치로부터 유체 도관(31)을 통해 챔버(32)로 공급되며, 유체 도관(39)을 통해 배출된다. 챔버 안에서 특정 림프구의 조정/활성화가 이루어진다. 적정 시간이 경과된 후, 활성화된 Treg 세포 (및/또는 존재하는 경우 기타 조정된 림프구)를 반응조에서 취하여 개체로 회귀시킬 수 있다.
자가면역-유발성 1형 당뇨병(T1D)의 개시 및 진행에, 조절성 T 림프구(Treg)에 본질적인 결함이 존재한다는 것이 입증되었다. 즉, 림프구를 조작하는 것이 자가면역성 장애를 예방 및 치료하기 위한 성공적인 면역요법을 개발하는데 매력적인 연구 초점이 된다. CB-SC 또는 PB-SC와 같은 줄기 세포를 이용하여, 전체적인 유전자 발현 프로파일을 조절함으로써, 림프구의 기능적인 결함을 교정할 수 있으며, 이로써 명백한 자가면역성 장애를 치유할 수 있다. 특히, 림프구와 줄기 세포의 공동-배양을 이용한 치료는 자가면역성을 줄일 뿐만 아니라, 전체 과정이 단순하고, 안전하며, 비용 효율적일 수 있다. 이러한 방법과 장치에 대한 내용은 당뇨병 및 기타 자가면역성 질환에 임상적으로 영향을 미칠 수 있으며, 환자에서 질환을 치료하는 방향으로 줄기 세포-조정된 림프구의 새로운 치료법을 인도할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포-기반의 치료를 위한 장치를 추가로 개시한다. 일 구현예에서, 본 발명의 줄기 세포는 포유류 개체에서 당뇨병과 같은 자가면역 질환 및 면역 장애-관련 질환의 치료에 사용된다.
장치는, 자기반응성 림프구를 억제하기 위한 생물반응조일 수 있다. 상기 생물반응조는 하나 이상의 양으로 하전된 기질 표면을 구비한 챔버를 포함할 수 있다. 줄기 세포의 집단은 기질 표면에 부착할 수 있다. 상기 표면은 또한 시트형 층, 복수개의 마이크로캐리어 및 투과성 막 층의 형태일 수 있다. 또한, 기질 표면은 줄기 세포가 부착될 수 있는 폴리스티렌 또는 유리와 같은 소수성 기질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 챔버는 복수의 기질 층들을 가진다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 2층, 많게는 35층 또는 2 - 35 층 중 임의 갯수의 층을 구비할 수 있다.
또한, 챔버는 줄기 세포와 단핵구 세포/림프구 간의 상호작용을 허용할 수 있다. 상호작용은 세포 대 세포 접촉을 통해 이루어질 수 있다. 또한, 상호작용은 하나의 세포에서 다른 세포로 분비되는 가용성 인자들을 통한 것일 수 있다. 챔버는 또한 줄기 세포와 단핵구 세포/림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 방지할 수 있다. 다공성 막을 사용하여, 줄기 세포와 단핵구 세포/림프구 사이에, 가용성 인자는 막을 통과할 수 있지만 세포는 투과할 수 없는 경계를 제공할 수 있다. 상기 다공성 막은 세포, 줄기 세포, 공동 배양한 세포 집단, 림프구, T 세포가 막의 반대측으로 통과하지 못하도록 충분히 작은 구멍 크기를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 다공성 막은 줄기 세포에서 분비된 인자, 성장 인자, 사이토카인, iNOS가 막의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 구멍을 구비한다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 다공성 막의 한쪽 표면에 부착한다. 다른 구현예에서, 구멍은 줄기 세포의 평균 크기의 약 절반 크기 이하이다.
또한, 생물반응조는 챔버로 림프구를 도입하기 위한 유입관을 포함할 수 있다. 유입관은 세포 집단이 유입구를 통해 생물반응조로 흘러 들어가게 할 수 있다. 또한, 생물반응조는 처리된 공동-배양된 림프구를 챔버에서 추출하기 위한 배출관을 포함할 수 있다. 중력 및/또는 펌핑으로 세포 집단을 유입구에서 배출관으로 이동시킬 수 있다.
생물반응조는 줄기 세포가 구비된 챔버를 포함할 수 있다. 줄기 세포는 챔버내 기질 표면 상에 접종할 수 있다. 아울러, 줄기 세포는 적어도 107개의 세포 농도로 존재할 수 있다. 줄기 세포는 또한 적어도 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010개의 세포 농도로 접종할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 기질 표면 상에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 컨플루언스로 존재한다. 줄기 세포는 또한 생물반응조에서 증식하여 최적 컨플루언스에 도달할 수 있다. 다른 구현예에서, 줄기 세포는 기질 표면 상에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 컨플루언스로 증식한다.
또한, 줄기 세포는 복수의 소스로부터 수득할 수 있다. 줄기 세포는 추출되어진 단핵구 세포/림프구의 동종동계 세포일 수 있다. 다른 예로, 줄기 세포는 상기 단핵구 세포/림프구에 동종이계일 수 있다. 나아가, 줄기 세포는 말초혈, 제대혈, 골수 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 림프절, 지방 조직 및 간 세포로부터 유래될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 자가면역성 장애를 저해하기 위한 시스템을 개시한다. 이 시스템은 개체로부터 혈액을 채혈하기 위한 유체 도관과 처리한 림프구를 상기 개체에게 회송하기 위한 유체 도관을 포함할 수 있다. 또한, 상기 시스템은 채혈한 혈액에서 림프구를 분리하기 위한 혈구 성분 채집 장치를 포함할 수 있다. 이 혈구 성분 채집 장치는 림프구를 크기, 무게, 원심분리 등으로 분리할 수 있다. 또한, 혈구 성분 채집 장치는 단핵구 세포, 림프구, 혈장 및 적혈구 등을 선택적으로 분리할 수 있다. 상기 혈구 성분 채집 장치는 단일 니들 및 이중 니들 공정일 수 있다. 혈구 성분 채집 장치는 Baxter (UK) 사의 ALYX 시스템, Baxter (Deerfield, IL) 사의 CS3000plus, Haemonetics (Braintree, MA) 사의 MCS+9000 및 CaridianBCT (Lakewood, CO) 사의 Spectra ®와 같은 상용 장치일 수 있다.
자가면역성 장애를 저해하기 위한 시스템은, 또한, 자가반응성 림프구 억제용 생물반응조를 포함한다. 생물반응조는 하나 이상의 양으로 하전된 기질 표면이 구비된 챔버를 포함한다. 줄기 세포 집단은 상기 기질 표면에 부착할 수 있다. 상기 표면은 시트형 층, 복수의 마이크로캐리어 및 투과성 막 층의 형태일 수 있다. 기질 표면은 또한 줄기 세포가 부착할 수 있는 폴리스티렌 또는 유리와 같은 소수성 물질을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 챔버는 복수의 기질 층들을 가진다. 일 구현예에서, 챔버는 적어도 2층에서 많게는 35층 또는 2 - 35개의 층을 구비할 수 있다.
또한, 본 시스템은 줄기 세포와 림프구 간의 상호작용을 허용할 수 있는 챔버를 포함할 수 있다. 상호작용은 세포 대 세포 접촉을 통해 이루어질 수 있다. 또한, 상호작용은 하나의 세포에서 다른 세포로 분비되는 가용성 인자들을 통한 것일 수 있다. 챔버는 또한 줄기 세포와 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 방지할 수 있다. 다공성 막을 사용하여, 줄기 세포와 림프구 사이에, 가용성 인자는 막을 통과할 수 있지만 세포는 투과할 수 없는 경계를 제공할 수 있다. 상기 다공성 막은 세포, 줄기 세포, 공동 배양한 세포 집단, 림프구, T 세포가 막의 반대측으로 통과하지 못하도록 충분히 작은 구멍 크기를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 다공성 막은 줄기 세포에서 분비된 인자, 성장 인자, 사이토카인, iNOS가 막의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과할 수 있을 만큼 충분히 큰 구멍을 구비한다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 다공성 막의 한쪽 표면에 부착한다. 다른 구현예에서, 구멍은 줄기 세포의 평균 크기의 약 절반 크기 이하이다.
자가면역성 장애를 저해하기 위한 시스템은 림프구를 생물반응조로 도입하기 위한 유입관과 처리된 공동-배양한 림프구를 챔버에서 추출하기 위한 배출관을 구비한 생물반응조를 포함할 수 있다. 생물반응조는 또한 줄기 세포가 부착된 기질 표면을 포함할 수 있다. 줄기 세포는 적어도 107개의 세포 농도로 존재할 수 있다. 줄기 세포는 또한 적어도 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010개의 세포 농도로 접종할 수 있다. 일 구현예에서, 줄기 세포는 기질 표면 상에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 컨플루언스로 존재한다. 줄기 세포는 또한 생물반응조에서 증식하여 최적 컨플루언스에 도달할 수 있다. 다른 구현예에서, 줄기 세포는 기질 표면 상에 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95%의 컨플루언스로 증식한다.
또한, 본 시스템은 개체의 혈액의 연속적인 처리가 가능한 폐쇄된 시스템일 수 있다(도 12 참조). 개체에 정맥 바늘과 같은 유체 도관을 통해 혈구 성분 채집기를 연결시킬 수 있다. 그런 후, 혈구 성분 채집기에서는 개체로부터 추출한 말초혈에서 림프구를 분리한다. 림프구는 유입관을 통해 생물반응조로 줄기 세포를 도입될 수 있다. 림프구는 활성화되고, 자가반응성 T 세포와 같은 자가반응성 림프구를 억제할 수 있게 되며, 처리된 림프구는 배출관을 통해 생물반응조로부터 배출되고, 유체 도관을 통해 개체로 회귀된다.
개체로 회귀되는 줄기 세포-조정된 환자의 단핵구 세포(예, T 세포, Treg, B 세포, 단핵구, DC)는, 전신의 면역 균형의 조절, 조직, 예컨대 췌장 섬에서의 면역 관용성 유도, 침윤된 면역 세포의 세포자살 유도를 통한 염증 완화 및 췌장 섬 β 세포의 증식 등의 조직 세포의 신생형성 자극 후 췌장 섬 구조(architecture)의 전체적인 복원 등의 여러가지 치료학적 잠재력을 나타낼 수 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예를 들어 추가적으로 설명하며, 하기 실시예로 한정되는 것으로 해석되지 않는다. 아래 실험들을 수행하여, 본 발명의 다양한 측면들을 설명할 수 있다.
아래 실시예들에서의 통계적인 데이타 분석은 쌍을 이룬 스투던트의 t-검사로 수행하여 통계 유의성을 결정하였다. 값은 평균 ± SD (표준 편차)로 나타낸다.
실시예 1
방법 및 재료
5-6주령의 암컷 NOD/LtJ 마우스를 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)에서 구입하여, 시카고 일리노이 대학에서 무균 조건에서 사육하였다. 혈당 수치를 비-공복 조건에서 9 및 11 AM에 Ascensia ELITE glucometer (Bayer Corporation, Elkhart, IN)를 이용하여 체크하였다. 체중 감소, 다뇨증 및 적어도 2일 연속 비공복 혈당치 >250 mg/dL로 검증된, 자연적으로 발생된 자가면역 당뇨병을 앓고 있는 암컷 당뇨병 NOD/LtJ 마우스 (24 - 28 주령)를, 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 위원회(ACC)로부터 승인받은 프로토콜에 따른 처리에 사용하였다.
공동-배양
인간 제대혈 (60 - 120 ml/unit/bag)을 건강한 공여체로부터 유래된 것으로 Life-Source Blood Services (Glenview, IL)로부터 구입하였다. 본 연구에서 제대혈의 사용과 관련하여, 제대혈은 상업적으로 이용가능하므로, 대학의 윤리적 승인과 공여체로부터 어떠한 동의 서명이 필요하지 않았다. 인간 제대혈 유래 줄기 세포 (CB-SC)를 종래 기술된 바와 같이 준비하였다. 간략하게, 제대혈 단핵구 세포를 150 x 15 mm 페트리 디쉬 (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, 조직 배양 처리된 디쉬가 아님)에 7% 소태아 혈청 (Invitrogen, Carlsbad, CA)이 첨가된 RPMI 1640 배지 25 ml/dish에 1 x 106 cells/ml로 접종하여, 37℃ 및 8% CO2 조건에서 인큐베이션하였다. 2 - 3 주 경과 후, 80 - 90% 컨플루언스 상태에 도달하도록 배양된 CB-SC는, 부착되지 않은 제대혈 단핵구 세포를 모두 제거한 다음, 마우스 림프구와 공동-배양하였다. 공동-배양을 위해, 마우스 림프구를 6 - 8 주령의 NOD 마우스 비장으로부터 분리하여, 7% 소 태아 혈청 (Invitrogen)이 첨가된 25 ml RPMI 1640 배지가 들어있는 150 x 15 mm 페트리 디쉬에 CB-SC : 림프구 1:10의 비율로 CB-SC 위에 접종하고, 인큐베이터에서 37℃ 및 8% CO2 조건에서 인큐베이션하였다. 2 - 4일간 공동-배양한 후, 실험을 위해 CB-SC 오염이 최소화되게 부유성 림프구를 수집하였다 (부유 세포의 <1%가 CB-SC 마커 인간 백혈구 공통 항원 CD45에 양성임). CB-SC는 배양 디쉬에 딱 붙어있고 큰 원형 형태를 띄고 있기 때문에 림프구를 CB-SC와 구별하여 수집하기가 용이하다. 대조 실험으로, 림프구를 CB-SC 없이 동일한 배양 조건에서 배양하였다.
유세포 분석 및 분류
유세포 분석 및 세포 분류를 종래 개시된 바와 같이 수행하였다. 유세포 분석을 위해, 세포를 2.5% 말 혈청 (Vector Laboratories)이 함유된 배지에 희석한 랫 항-마우스 CD16 단일클론 항체 (eBioscience, San Diego, CA)와 함께 15분간 4℃에서 인큐베이션하여, Fc 수용체를 블록킹하여 비특이 염색을 방지하였다. 세포를, Alex Fluor® 647-접합된 CD3, FITC- 또는 피코에리트린(PE)-접합된 CD4, FITC-접합된 CD25, 및/또는 피코에리트린-Cy7 (PE-Cy7)-접합된 CD62L을 비롯하여, 랫 항-마우스 단일클론 항체 (eBioscience)와 함께 45분간 4℃에서 인큐베이션한 다음, 유세포 분석 전에 차가운 PBS로 헹구었다. 이소형이 동일한 랫 항-마우스 IgG 항체 (eBioscience)를 음성 대조군으로 사용하였다. 염색 후, 세포를 CyAn ADP (DakoCytomation)로 분석하였다. 세포내 사이토카인 염색을 위해, 세포를 먼저 세포 표면 항원(예, PE-접합된 CD4, FITC-접합된 CD25, 및 PE-Cy7-접합된 CD62L)으로 염색한 다음, BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization kit (BD Biosciences, San Jose, CA)를 이용하여 회수하였다. 그런 후, 세포를 FITC-접합된 IL-4, Alexa Fluor® 647-접합된 IL-10, Alexa Fluor® 647-접합된 IL-12, Pacific blue-접합된 IFN-γ (eBioscience), 바이오틴화된 항-TGF-β1 Ab (Catalog number BAF240, R & D Systems, Minneapolis, MN) 등의 항체들의 여러 조합으로 염색하였다. TGF-β1을 염색하기 위해, 세포를 스트렙아비딘-접합된 FITC (Vector Laboratories)로 다시 염색하였다. Alexa Fluor 647-접합된 항-Foxp3는 eBioscience 사에서 구입하였다. 여러가지 세포 집단을 분리하기 위한 세포 분류를 위해, CB-SC-공동-배양한 림프구, 대조군 마우스 림프구 또는 신선하게 분리한 마우스 비장 세포를 먼저 CD16 Ab와 인큐베이션하여, Fc 수용체의 결합성을 차단한 다음, FITC-접합된 CD4 및 PE-Cy7-접합된 CD62L와 같은 여러 항체 조합과 45분간 4℃에서 인큐베이션한 후, MoFlo (DakoCytomation)을 이용하여 세포 분류를 수행하였다. 집단의 순도 (>98%)를 검증한 후, CD4+CD62L+ Treg를 수집하여, 여러가지 시험관내 실험과 생체내 실험에 사용하였다.
정량적인 실시간 PCR
정량적인 실시간 PCR로 여러가지 mRNA의 발현을 분석하였다. 총 RNA를 Qiagen kit (Valencia, CA)로 추출하였다. 총 RNA로부터 QuantiTect 역전사 키트를 제조사의 설명서 (Qiangen, Valencia, CA)에 따라 사용하여 제1 cDNA 가닥을 합성하였다. 실시간 PCR은 각 유전자에 대해 검증된 유전자 특이 RT2 PCR 프라이머 세트 (SuperArray, Frederick, MD)를 사용하여 ABI Prism 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, CA)에서 다음과 같은 조건으로 각 샘플에 대해 3세트로 수행하였다: 95℃, 15분 -> 40회 사이클 (95℃, 15초 -> 60℃, 60초). 내부 대조군 β-액틴을 기준으로 각 유전자의 발현 수준을 측정하였다. 실시간 PCR 분석을 위해, 마우스 Th1-Th2-Th3 PCR 어레이 키트를 제조사의 지침서에 따라 사용하였다. 데이타는 제조사 (SuperArray)가 제공하는 웹 기반의 PCR 분석 데이타 분석법을 이용하여 분석하였다.
생체내 처리
확립된 당뇨병 NOD 마우스를 치료하기 위해, 6-8주령의 암컷 NOD 마우스로부터 분리한 비장 림프구를 전술한 바와 같이 CB-SC와 공동-배양하였다. 2-4일간 공동-배양한 후, 부유성 림프구를 전술한 바와 같이 세포 분류를 위해 수집하였다. 정제된 CD4+CD62L+ Treg (mCD4CD62L Treg, 3 x 106 세포)를 현성 당뇨병 NOD 마우스에 1차 투여로 100 ㎕ PBS/mouse (복막내, 췌장 근처) 중의 용액으로 복막내 투여한 다음, 1주일 후 100 ㎕ PBS/mouse (복막내, 췌장 근처) 중의 용액으로 세포 2,000,000개를 2차 투여로 복막내 투여하였다. 동일 부피의 PBS를 주사한 당뇨병 마우스를 대조군으로 사용하였다. CB-SC 없이 시험관내에서 배양한 후에는 림프구의 생존성이 급격하게 감소하기 때문에, CB-SC와 공동-배양하지 않고 신선하게 분리한 마우스 비장 림프구로부터 분류한 CD4+CD62L+ Treg (대조군 CD4CD62L Treg)를 추가적인 대조군으로 사용하였다. 실험이 종결될 때까지, 혈당치와 체중을 매주 2번 모니터링하였다. 치료 개시 후 3주간, 포도당 부하 검사를 후술된 바와 같이 행하였다(각 그룹 별 n=3). 치료 개시 후 7주째에, 대조군 마우스는 심각한 고혈당 (>600 mg/dL)과 체중 감소 (>20%)로 인한 병리적 이상으로 희생시켰다. 당뇨병을 앓고 있지 않은 마우스도 mCD4CD62L Treg로 처리한 후 조직학적 검사를 위해 희생시켰다. 인슐린을 측정하기 위해, 혈액 샘플을 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다. 혈중 인슐린 수치를 초민감 마우스 인슐린 효소-연결된 면역흡착 분석(EIA) 키트 (Alpco Diagnostics, NH)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 측정하였다. 분석 민감도는 0.019 ng/ml이다.
복막내 포도당 부하 검사
마우스를 밤새 (12 h) 금식시키고, 체중을 측정한 다음, 포도당 볼루스 (2 mg/g(체중))를 복막내 주사하였다. 그런 후, 당 주사 후 0, 10, 20, 30, 45, 60, 90 및 120분째에, 꼬리 정맥으로부터 혈액을 채혈하였다. 포도당 수치를 전술한 바와 같이 전체 꼬리 정맥 혈액에서 측정하였다.
면역조직화학적 방법
췌장을 10% 포름알데하이드로 고정하고, 가공한 다음, 파라핀으로 포매하였다. 단편을 연속적으로 5 ㎛ 두께로 절단하였다. 일부 수정을 가하여 기존 방식에 따라 면역염색을 수행하였다. 비특이 염색을 막기 위해, 단편들을 2.5% 말 혈청 (Vector Laboratories)이 포함된 완충액에 20분간 실온에서 인큐베이션하였다. 1차 항체는 기니아피그 다클론 항-인슐린 Ab (DakoCytomation, Carpinteria, CA), 마우스 항-글루카곤 mAb (Sigma), 마우스 항-TGF-β1 mAb (Catalog number MAB240, TGF-β1의 휴지기 상태에 대한 교차 반응성 25%, TGF-β2에 대한 교차 반응성 없음, TGF-β3 및 TGF-β5에 대한 교반 반응성 <2%, R & D Systems), 마우스 항-SMAD4 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), 토끼 항-Ki67 mAb 및 랫 항-대식세포 마커 F4/80 mAb (Novus Biologicals, Littleton, CO), 및 햄스터 항-마우스 수지상 세포 마커 CD11c (BD Pharmingen)를 포함한다. 2차 Ab는, Texas red-접합된 AffiniPure 당나귀 항-기니아 피그 IgG, 로다민-접합된 AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG, AMCA AffiniPure 당나귀 항-토끼 IgG, FITC-접합된 AffiniPure 당나귀 항-마우스 IgG, 및 Cy5-접합된 AffiniPure 당나귀 항-마우스 IgG, AMCA AffiniPure 당나귀 항-아르메니아 햄스터(armenian hamster) IgG, 및 Cy5-접합된 AffiniPure 당나귀 항-랫 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)를 포함한다. 비-형광 염색으로, 1차 항체와 인큐베이션한 후, 세포를 ABC 키트 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 염색하였다. 바이오틴화된 말 항-토끼 Ab 및 바이오틴화된 염소 항-기니아 Ab는 Vector Laboratories (Burlingame, CA) 사로부터 구입하였다. 이소형이 동일한 대조군으로, 마우스 IgG1을 BD Biosciences 사에서 구입하였고, 기니아 피그 혈청과 토끼 IgG를 Santa Cruz Biotechnology 사에서 구입하였다. 췌장 슬라이드에 대해, 면역염색 후 헤마톡실린 (Sigma)으로 대조염색을 수행하였다. 각 실험에서, 이소형이 동일한 항체를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 Zeiss Axioskop Histology/Digital 형광 현미경과 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경을 이용하여 HRP-면역염색 이미지를 Zeiss Axiocam 컬러 카메라로 사진을 촬영하였다.
인슐린 Ab로 면역염색한 후 전체 β-세포 매스(mass)를 비교하기 위해, β-세포 매스를 측정하여, Image J 소프트웨어를 이용한 포인트 카운팅 외형 측정 분석에 의해 계산하였다.
췌도염에 점수를 매기기 위해, 각 실험군들로부터 수득한 췌장 단편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다 (H&E 염색, Sigma). 각 췌장의 200개의 일련의 단편들로부터 유래된 50개 이상의 랑게르한스 섬 조직을 검사하여, 백혈구 침윤 정도를 평가하였다. 췌도염을 백혈구의 랑게르한스 섬 침윤 수준을 기준으로 5개의 카테고리로 등급을 나누었다: 췌도염 없음(침윤 없음), 경미한 췌도염(침윤 수준 <25%), 중도 수준의 췌도염(침윤 수준 25%~50%), 중증 췌도염(침윤 수준 50%~75%) 및 infiltrations), 매우 심각한 수준의 췌도염(침윤 수준 >75%).
침윤된 백혈구의 세포자살을 확인하기 위해, 인 시츄 세포 사멸 검출 키트 (fluorescein) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 사용하여, 제조사의 권고 프로토콜에 따라 수행하였다. mCD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 마우스와 대조군 유래의 냉동 췌장의 동결단편 (두께 8 ㎛ thickness)을 Microtome Cryostat HM 500 OM (Microm International GmbH)을 사용하여 준비하였다. 어떤 세포 타입이 세포자살성이 되는지를 확인하기 위해, CD4+ T 세포에 대해 PE-접합된 CD4 mAb를, CD8+ T 세포에 대해 PE-접합된 CD8 mAb를, B 세포에 대해 PE-접합된 B220 mAb를, 그리고 대식세포에 대해 랫 항-마우스 F4/80 mAb 등의 여러가지 마커들을 TUNEL 염색과 조합하여 사용하였다. CD4, CD8 및 B220에 대한 mAb는 eBioscience에서 구입하였다. 동결단편은 먼저 인 시츄 세포 사멸 검출 키트 (Roche)를 이용하여 검출한 다음, 여러가지 단일클론 항체로 면역염색하고 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경으로 이미지를 획득하였다. 2중 염색 후, 양성 세포를 공초점 현미경 및/또는 이미지에서 직접 정량하였다. 음성 대조군으로는, TUNEL 반응 혼합물 및/또는 이소형이 동일한 IgG를 사용하지 않고 표지 용액과 동결단편을 인큐베이션한 것을 사용하였다.
사이토카인 분석
마우스 혈장내 사이토카인 수준을 상업적인 ELISa 키트를 제조사의 지침서에 따라 사용하여 정량하였다. 마우스 IFN-γ ELISA 키트는 Biolegend Inc.(San Diego, CA)에서 구입하였고, 마우스 IL-4와 IL-10 ELISA 키트는 Assay Designs (Ann Arbor, MI)에서 구입하였고, TGF-β1 ELISA 키트는 Promega (Madison, WI)에서 구입하였다.
실시예 2
마우스 조절성 T 림프구의 조절
T1D에서 Treg의 치료학적 잠재성을 조사하기 위해, 실험적인 비-비만 당뇨병(NOD) 마우스 모델을 사용하였다. 먼저, CB-SC와 NOD 마우스 비장-유래 림프구의 공동-배양물을 테스트하였고, 그 결과 CB-SC와 인간 림프구의 공동-배양과 유사하게, 여러가지 CB-SC : 림프구 비율(1:5, 1:10 및 1:20) (도 4A, 각각 p=0.25, p=0.15, p=0.16)로의 CB-SC와의 공동-배양시, 마우스 림프구의 증식을 유의하게 자극하지 않는 것으로 확인되었다. 데이타는 4번의 독립적인 실험 결과의 평균 ± s.d.로 나타낸다.
다음으로, 통상적인 CD4+CD25+ Treg과 CD4+Foxp3+ Treg, 및 CD4+CD62L+ Treg 등의 Treg 존재에 대해, CB-SC와 마우스 림프구의 공동-배양물을 분석하였다. 그 결과, CB-SC를 첨가하여 배양하거나 또는 단독으로 배양한 마우스 비장 총 림프구에서, CD4+CD25+ Treg 및 CD4+Foxp3+ Treg에 유의한 차이는 확인되지 않았다. 반면, CD4+CD62L+ Treg의 퍼센트는 CB-SC와 공동-배양한 군에서 약 5배 증가하였다(도 4B). 추가적인 유세포 측정을 통해, 이들 CD4+CD62L+ Treg 중 극소수 비율만 CD4+CD25+CD62L+Foxp3+ 양성(도 4C)이고, 이 비율은 CB-SC와 공동 배양하거나 공동 배양하지 않은 림프구들 간에 차이가 없다(0.11 ± 0.04% vs 0.10 ± 0.03%, P=0.44)는 것을 확인하였다. 이후, CB-SC와의 공동-배양에 의해 주로 영향을 받는 CD4+CD62L+ Treg에 집중하였다(CB-SC-조정된 CD4+CD62L+ Treg, mCD4CD62L Treg라 칭함). B - C의 데이타는 3회 내지 5회 실험한 결과를 나타낸다.
시험관내 공동-배양 후 CB-SC에 의한 CD4+CD62L+ Treg의 조정을 입증하기 위해, 헬퍼 T(Th)1 및 Th2 면역 반응과 관련있는 세포내 사이토카인을 유세포 분석으로 측정하였다 (도 4D). 그 결과, 대조군 CD4CD62L Treg에 비해 mCD4CD62L Treg에서, IL-4 수준은 크게 하향 조정되었고 (p=0.004), IL-10, IL-12 및 TGF-β1 수준은 상향 조절되었다 (각각 p=0.001, p=0.0001, 및 p=0.006). 반면에, IFN-γ 발현은 CB-SC와의 공동-배양 후 변화가 없었다 (도 4D, p=0.5). 다음으로, CB-SC와의 공동-배양 후 정제한 CD4+CD62L+ Treg에 대해, 정량적인 실시간 PCR 어레이를 이용하여, Th1-Th2-Th3 세포 관련 유전자의 발현을 조사하였다. 그 결과, mCD4CD62L Treg에서는 복수의 사이토카인 및 이의 수용체, 케모카인 및 이의 수용체, 세포 표면 분자들을 비롯하여 Th 세포 관련 유전자가, 신호전달 경로 분자 및 전사 인자들과 더불어, 현저하게 하향-조절되는 것으로 나타났다. 이러한 데이타는, CB-SC와의 시험관내 공동-배양이 마우스 CD4+CD62L+ Treg에서의 유전자, 특히 기능 관련 사이토카인과 케모카인 유전자의 발현에 실질적인 변형을 유발시킨다는 것을, 명확하게 보여준다.
CB-SC-조정된 CD4
+
CD62L
+
Treg는 마우스에서 고혈당증을 교정한다.
다음으로, 현성 당뇨병 NOD 마우스 (암컷, 24 - 28주령)에, T1D를 진단한 후 5 - 20일간, mCD4CD62L Treg (총 5,000,000 세포/마우스, i.p., n=마우스 8마리)를 처리하여, 이의 치료학적 잠재성을 확인하였다. 동일 세포 수(i.p., n=마우스 5마리)의 대조군 CD4CD62L Treg와 비히클 PBS(총 200 ㎕/마우스, i.p., n=마우스 5마리)를 대조군으로 사용하였다. 특히, 현성 당뇨병 마우스에서는 mCD4CD62L Treg 처리시 정상 혈당으로 회복되는 것이 확인되었다(마우스 8마리 중 6마리) (도 5A). 그러나, 대조군 CD4CD62L Treg 또는 PBS를 처리한 경우, 당뇨병 마우스에서의 고혈당은 완화되지 않았다(각각 마우스 5/5, 5/5) (도 5B). mCD4CD62L Treg로 치료한 후 정상 혈당으로 회복된 당뇨병 마우스에서는, 또한, 7주째에서 비-당뇨병 NOD 마우스에서와 비슷하게, 포도당 부하 검사(IPGTT) 결과가 개선되었다 (도 5B). 그러나, PBS 또는 대조군 CD4CD62L Treg로 처리된 당뇨병 마우스에서는 높은 혈당치가 유지되었고 (>500 mg/dL), 어떠한 관찰가능한 하향-조절은 없었다 (도 5B). 아울러, mCD4CD62L Treg로 처리한 후 6주간 혈중 인슐린 수치를 모니터링하였다. 그 결과, PBS 또는 대조군 CD4CD62L Treg로 처리된 당뇨병 마우스의 경우, 인슐린은 ELISA (ELISA 키트의 민감도 0.019 ng/ml, 도 5C) 키트로 검출할 수 없었다. 이들 마우스는 중증 고혈당 (BG>600 mg/dL)과 체중 감소 (>20%)로 인해 동물 관리 위원회에서 승인받은 프로토콜에 따라 희생시켜야 했다 (도 5D). 이와는 대조적으로, mCD4CD62L Treg로 처리된 당뇨병 NOD 마우스에서는 혈중 인슐린 수치가 현저하게 증가하였다 (도 5D, p=0.0025).
처리 후 45일째에, 췌장을 조직 분석하고, 총 β-세포 매스를 평가한 다음, 췌장의 일련의 단편을 인슐린 Ab로 면역염색하였다. 외형 측정 분석을 통해, mCD4CD62L Treg 처리가 총 β-세포 매스를 유의하게 증가시킨다는 것이 확인되었다(도 5E, p=0.0026). 반면에, PBS 또는 대조군 CD4CD62L Treg를 처리한 후에는, β-세포 매스는 크게 감소되었다 (도 5E). 총 β-세포 매스의 증가 기전을 이해하기 위해, 췌장 섬 세포에서의 세포 증식 핵 마커인 Ki67의 발현을 확인하였다. 인슐린 항체 및 Ki67 Ab를 이용한 2중 면역 염색시, mCD4CD62L Treg-처리된 마우스의 췌장섬(pancreatic islet)에서 20 ± 8 β 세포/섬이 Ki67을 발현하는 것으로 확인되었으며 (도 5F), 대조군 CD4CD62L Treg 처리한 마우스의 췌장섬 보다 훨씬 높은 수치였다(1 ± 0.4) (p=0.0014). 이는, β 세포의 신규 증식이 총 β 세포 매스의 현저한 증가의 원인임을 시사해준다. 아울러, β-세포-마커 인슐린 및 α 세포-마커 글루카곤으로 2중 면역염색시, mCD4CD62L Treg로 처리된 당뇨병 마우스의 췌장섬은, 비-당뇨병 NOD 마우스의 정상 섬에서 확인되는 바와 동일한 α 및 β-세포 분포 패턴을 나타내는 것으로 확인되었다. 그러나, 대조군 CD4CD62L Treg으로 처리된 당뇨병 마우스에서는 섬의 구조(islet architecture)가 완전히 파괴되었고, β 세포가 거의 완전히 소실되었다. 따라서, mCD4CD62L Treg로 치료하여, 섬 세포 구조의 재건 및 β-세포 재생을 촉진시킴으로써 T1D의 고혈당증을 교정할 수 있다.
NOD 마우스에서의 췌도염 및 자가면역 기능부전의 회복
mCD4CD62L Treg가 자가반응성 작동자 T 세포에 대해 면역억제 영향을 나타내는지를 확인하기 위해, 췌장 조직 분석을 수행하였고, 치료 후 45일째에 췌도염의 등급을 매겼다. 조직학적 평가에서, 당뇨병 NOD 마우스의 경우 치료 전에는 섬 β 세포의 약 80%(매우 심각한 췌도염)가 파괴된 것을 확인하였다. 치료 후, 6주간, mCD4CD62L Treg를 투여받은 당뇨병 마우스의 경우, 췌장섬의 36%에서 염증 세포의 침윤 신호가 거의 또는 전혀 나타나지 않았고, 20%는 경미한 췌도염을, 15%는 중도의 췌도염을, 18%는 중증 췌도염을, 11%만 매우 심각한 췌도염이 나타났다 (도 6A 및 6B). 췌도염이 나타나지 않은 섬은 크기가 매우 작았으며, 증식 마커 Ki67에 대해 양성이었는데(데이타 미기재), 이는 이들 섬이 신규 재생된 것일 가능성을 시사한다. 반면에, 대조군 CD4CD62L Treg를 투여받은 당뇨병 마우스의 경우, 췌장섬 모두에서 대규모 염증 세포의 침윤과 중증 췌장 구조의 파괴가 확인되었으며 (도 6B), 인슐린-양성 세포는 거의 또는 전혀 존재하지 않았다. 마찬가지로, 췌장 조직 검경에서, mCD4CD62L Treg 치료에 저항성을 보였던 마우스 2마리(8마리 중 2마리)는 또한 관찰 45일 후 매우 심각한 췌도염을 나타내었다(데이타 미개재). 예시된 데이타는 mCD4CD62L Treg 치료에 민감한 정상 혈당의 당뇨병 마우스 6마리(8마리 중 6마리)에서 입수한 것이다. 췌장섬을 인슐린 면역염색 및 헤마톡실린 대조염색하여 단핵구 세포 침윤 퍼센트로 등급을 매겼다.
췌도염 완화의 기본적인 분자 기전을 이해하기 위해, ELISA로 혈장 Th1/Th2 사이토카인 수준을 측정하였다. 대조군 CD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 마우스와 비교하여, mCD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 마우스의 혈장에서, Th1 사이토카인 IFN-γ와 Th2 사이토카인 IL-4의 현저한 감소가 확인되었다(각각 P=0.017, 도 6C, P=0.018, 도 6D). 또한, mCD4CD62L Treg를 투여받은 당뇨병 마우스에서는, 대조군 CD4CD62L Treg (P=0.016) 및 비-당뇨병 NOD 6주령 마우스 (P=0.014) 실험군과 비교하여, 혈장 IL-10 수준의 현저한 증가가 확인되었다. 데이타는 3번 실험에서 입수한 마우스 혈장 사이토카인 수준의 평균 ± s.d.로 나타낸다. 추가적으로, 혈장 TGF-β1 수준은 대조군 CD4CD62L Treg-처리한 당뇨병 마우스 (P=0.041)와 비교하여 mCD4CD62L Treg-처리한 당뇨병 마우스에서 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는, IL-10과 TGF-β1 둘다, mCD4CD62L Treg로의 치료로, 면역 관용성을 유도하는데 기여할 수 있음을 시사한다. 이러한 데이타는, CB-SC에 노출됨으로써 유발되는 mCD4CD62L Treg에서의 현저한 변화가, "정상" 섬 구조와 β-세포 기능이 복원되는 것을 도와, 당뇨병을 억제한다는 것을 입증해준다.
TGF-β1은 면역 억제 유도 및 자기-관용성 유지에 기여하는 가장 잘 특정화된 사이토카인이다. mCD4CD62L Treg로 치료한 후, 섬 β 세포를 보호하는 새로운 기저 분자 기전을 밝히기 위해, 혈장 TGF-β1 측정과 더불어 면역조직화학법에 의해 췌장섬에서의 TGF-β1의 발현을 측정하였다. 그 결과, TGF-β1은 대조군 CD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 마우스에 비해 mCD4CD62L Treg-처리된 당뇨병 마우스의 췌장섬에서 고수준으로 존재하는 것으로 나타났다. TGF-β1 양성 세포의 염색에서 2가지 패턴이 나타났다: 한가지 패턴은 섬 β 세포에 분포된 패턴이고, 다른 패턴은 섬 β 세포 주위에 위치된 패턴이다. 중요하게도, TGF-β1 양성 세포로 둘러싼 패턴(대식세포 마커 F4/8에 음성이나, 수지상 세포 마커 CD11c에는 양성임, 데이타 미기재)과 여기에서 매트릭스로의 TGF-β1의 분비(희미하게 염색)로, 췌장섬을 둘러싼 고리가 형성된다는 것을 확인하게 되었다. 이 고리는, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 말단 표지(TUNEL) 염색으로 확인된 바와 같이, 자가-공격성의 작동자 림프구에 세포자살을 유도함으로써, 신생 섬 세포들을 공격으로부터 보호할 수 있다 (58 ± 23 TUNEL+ mCD4CD62L Treg-처리군에서의 백혈구 침윤 vs. 9 ± 3 TUNEL+ 대조군 CD4CD62L Treg-처리균에서의 백혈구 침윤, p=0.02). 어떤 세포 타입이 세포자살로 진행되는지를 명확하게 하기 위해, 각각 CD4+ T 세포에 대한 CD4, CD8+ T 세포에 대한 CD8, B 세포에 대한 B220 및 대식세포에 대한 F4/80 등의 여러가지 세포 마커들을, TUNEL 염색과 조합하여 2중 염색을 수행하였다. mCD4CD62L Treg로 치료시, 침윤된 T 세포, B 세포 및 대식 세포에서의 세포자살이, 대조군 CD4CD62L Treg 치료군에 비해 증가한 것으로 나타났다 (각각 p=0.0034, p=0.024, p=0.041, 및 p=0.032). 그러나, 다른 3가지 세포 타입들과 비교하면, CD4+ T 세포에서 세포자살율이 훨씬 더 높게 나타났다 (도 7). 즉, 이러한 데이타는, mCD4CD62L Treg로 치료하면, 신생 췌장 섬을 자가반응성 면역 세포에 의한 파괴로부터 국소 보호하는데 기여할 수 있는, 췌장섬에서의 TGF-β1의 발현이 강화됨을 시사한다. 데이타는 5번의 실험 결과의 평균 ± s.d.로 나타낸다.
실시예 3
시험관내 면역 조정
CB-SC는 CD4+CD62L+ Treg의 기능을 조정하여, NOD 마우스 모델에서 현성 자가면역-유발성 1형 당뇨병(T1D)의 예방 및 회복을 유도할 수 있다. 본 발명자들은 미토겐 PHA의 존재 하에 T1D 환자의 CD4+CD62L+ Treg에 대한 CB-SC의 면역 조정을 확인하였다 (도 8A 및 도 8B). 세포내 사이토카인을 염색한 결과, CB-SC와의 공동-배양 후, CD4+CD62L+ Treg에서 IL-5 수준은 유의하게 하향-조절되었고(p = 0.007), IL-10과 TGF-1은 PHA 처리 대조군과 비교하여, 상향-조절되었는데(각각 p = 0.0018 및 p = 0.019), 이는 NOD 마우스 CD4+CD62L+ Treg에서의 결과와 일치되었다. 이와는 반대로, CB-SC와의 공동-배양 후 IL-4, IL-12 및 IFN-발현에는 변화가 없었다 (도 8A). 추가적으로, Treg의 특이 마커인 전사 인자 Foxp3는, 대조군 PHA 처리군과 비교하여, PHA + CB-SC로 처리한 후 2.7배 상향-조절되었다 (도 8B). 따라서, 이러한 결과는 CB-SC가 T1D 환자의 CD4+CD62L+ Treg를 조정할 수 있음을 의미한다.
T1D에서 CB-SC의 치료학적 잠재성을 확인하기 위해, T1D 환자로부터 수득한 섬-세포 GAD-특이 CD4+ T 세포 클론에 대한 CB-SC의 직접 조정을 조사하였다. 그 결과, 항원 제시 세포(APC) 및 다양한 용량의 GAD 펩타이드로 자극된 T 세포 클론의 증식이, CB-SC의 부재시의 대조군과 비교하여, CB-SC의 존재하는 경우에 현저하고 특이적으로 감소되었다 (도 8C). 즉, CB-SC가 병인성 T 세포를 제거할 잠재성을 가지고 있는 것으로 시사되었다. 데이타는 3번의 독립적인 실험의 결과를 평균 ± 표준 편차로 나타낸다.
카르복시펩티다제 M (CPM) 및 브랜디키닌 B1 수용체
CB-SC가 막 카르복시펩티다제 M (CPM), 브랜디키닌 B1 수용체 및 유발성 질소 산화물 신타제(iNOS)를 발현함을 확인하였다 (도 9A). iNOS에 대한 카르복시펩티다제 M-매개의 아르기닌 기질 제조가 대식세포 및 내피세포에서 NO 생산을 강화시키는 것은 입증되었다. 그 결과, NO 생산은 B1R 활성자 des-Arg 10-브래디키닌(DAKD)의 존재시 증가되었지만, iNOS 특이적인 저해제 1400W 또는 선택적인 B1 수용체 길항제[Des-Arg10, Leu9] kallidin (DALKD)과 조합시 저해되는 것으로 확인되었다 (도 9B 및 도 9C). 특이적인 B-타입 카르복시펩티다제 저해제를 이용한 블록킹으로, 2-머캅토메틸-3-구아니디노에틸티오프로판산(MGTA)은 CB-SC에서 NO의 생산을 차단할 수 있었으며, iNOS 저해제 1400W를 이용한 경우와 마찬가지로 동종이계 림프구에 대한 CB-SC의 억제를 반전시킬 수 있었다.
세포 대 세포 접촉 효과와 인간 Treg에 대한 CB-SC의 면역 조정에 대한 CPM 및 B1R 기여를 조사하기 위해, CPM 특이적인 저해제 MGTA 및 B1R 특이적인 저해제 DALKD의 존재 하에 공동-배양 실험을 수행하였다. 트랜스-웰에 접종한 림프구를 대조군으로 사용하였다. 그 결과, CPM 및/또는 B1R을 차단하여 CD4+CD25+CD62L+CD69+ Treg의 양성 퍼센트를 낮출 수 있는 것으로 나타났다 (도 9D). 데이타는 5번의 실험의 결과이다.
CB-SC에서 자가면역 조절자(Aire)의 발현
Aire는 말초 자기-항원의 이소성 발현과 자가반응성 T 세포의 제거를 매개함으로써 면역 관용성에 중요한 역할을 수행한다. CB-SC가 면역을 조정하는데 있어 기본적인 분자 기전을 조사하기 위해, 본 발명자들은 CB-SC에서 Aire이 유전자 수준(도 10A) 및 단백질 수준 (도 10B)에서 발현된다는 것을 확인하였다. CB-SC에서 Aire이 면역 조정에 기여할 수 있음을 시사한다. 데이타는 3가지 CB-SC 조제물들로 실험한 결과이다.
CB-SC에서의 Aire의 역할을 조사하기 위해, Aire-특이적인 isRNA 3쌍을 리포펙타민 RNAiMAX (Invitrogen)을 이용하여 투여하여, Aire 유전자 발현을 낫다운시켰다 (도11A). 데이타는 5가지 CB-SC 조제물들로 실험한 결과이다. 웨스턴 블롯에서, 50 nM aire siRNA의 존재시, 음성 대조군 siRNA와 비교하여, Aire 단백질을 70%로 낫다운시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 11B). 특히, 웨스턴 블롯팅에서, CPM과 PD-L1 단백질 역시 aire siRNA의 존재시 하향-조절되는 것으로 나타났다. 또한, 웨스턴 블롯에서, CPM과 PD-L1 단백질의 하향-조절이 확인되었다 (도 11B). 이는, Aire이 이의 유전자 발현을 전사 수준에서 조절할 수 있음을 암시한다. 데이타는 3번의 실험의 결과이다.
Aire가 면역 조정에 기여하는지를 추가로 조사하기 위해, Aire siRNA 및 음성 대조군 siRNA의 존재 하에 인간 Treg 마커 Foxp3을 테스트하였다. 유세포 분석으로, Foxp3의 발현이 대조군 siRNA에 비해 Aire siRNA의 존재시 크게 감소되는 것으로 확인되었다 (p = 0.028, 도 11C). 따라서, 이들 데이타는 CB-SC에서의 Aire 발현이 면역 조정에 기여한다는 것을 의미한다. 데이타는 3회 실험 결과의 평균 ± SD로 나타낸다.
본 발명은 특정 방법과 조성물 측면에서 기술되어 있지만, 본 발명을 고려하여 당해 기술 분야의 당업자라면 변형과 수정을 가할 수 있을 것으로 생각된다. 당해 기술 분야의 당업자라면 일상적인 것에 불과한 실험을 수행하여, 전술한 구현예들에 기초한 본 발명의 다른 특징들과 이점을 이해하거나 또는 알아낼 수 있을 것이다. 본 발명은, 달리 언급되어 있지 않은 한, 당해 기술 분야의 기술에 속하는, 통상적인 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 미생물학, 유전자공학 및 면역학 기법들을 이용 및 병합하여 수행될 것이다. 본 발명은 현재 가장 실용적이며 바람직한 구현예인 것으로 생각되는 예를 들어 설명되어 있지만, 본 발명은 기술된 구현예로만 한정되지 않으며, 특허청구범위의 사상 및 범위에 포함되는 다양한 변형과 등가의 조합을 포괄하는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명에 대한 수정과 변형은 청구항에 의해 규정되는 본 발명의 새로운 측면들로부터 벗어나지 않는 범위내에서 이루어질 수 있다. 즉, 본 발명은 구체적으로 나타내고 설명된 사항으로 한정되지 않는다. 모든 공개문헌과 참조문헌들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 명확하게 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> Zhao, Yong
<120> Stem Cell Immune Modulation Methods of Use and Apparatus
<130> 107973-23
<150> 61/283,782
<151> 2009-12-08
<150> 61/283,810
<151> 2009-12-08
<150> 12/099,054
<151> 2008-04-07
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1307
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aagagaaaac tcctccaaaa gcagctctca ctatcagaaa acccaactac agttgtgaac 60
gccttcattt tctgcctgag gtctcagtcc gtcggcccag actgaagtgc agtggcacaa 120
tcatagctcg ctgcagcctc gaccttccag gcttaaacga ttctcccacc tcagcctctc 180
gagttgctgg gaccacaggt cactgtgcat ggcatcatcc tggccccctc tagagctcca 240
atcctccaac cagagccagc tcttccctca aaatgctacg gcctgtgaca atgctccaga 300
agcctgggac ctgctgcaca gagtgctgcc aacatttatc atctccatct gtttcttcgg 360
cctcctaggg aacctttttg tcctgttggt cttcctcctg ccccggcggc aactgaacgt 420
ggcagaaatc tacctggcca acctggcagc ctctgatctg gtgtttgtct tgggcttgcc 480
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tgtcatcaac ggggtcatca aggccaattt gttcatcagc atcttcctgg tggtggccat 600
cagccaggac cgctaccgcg tgctggtgca ccctatggcc agccggaggc agcagcggcg 660
gaggcaggcc cgggtcacct gcgtgctcat ctgggttgtg gggggcctct tgagcatccc 720
cacattcctg ctgcgatcca tccaagccgt cccagatctg aacatcaccg cctgcatcct 780
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gcgggaggag gtcagcagga caaggtgcgg gggccgcaag gatagcaaga ccacagcgct 960
gatcctcacg ctcgtggttg ccttcctggt ctgctgggcc ccttaccact tctttgcctt 1020
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Claims (54)
- 림프구를 조정(modulation)하여 자가반응성(autoreactive) T 세포를 억제하기 위한 생물반응조로서,
하나 이상의 양으로 하전된 기질 표면을 구비한 챔버;
상기 기질 표면에 부착되는 줄기 세포 집단;
림프구를 상기 챔버로 도입하기 위한 유입관; 및
줄기 세포와의 공동-배양 후 처리된(treated) 림프구를 추출하기 위한 배출관
을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응조. - 제1항에 있어서, 상기 기질 표면은 하나 이상의 시트 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 기질 표면은 복수의 마이크로캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 기질 표면은 하나 이상의 투과성 막 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제 1항에 있어서, 상기 기질 표면은 소수성 폴리스티렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 50% 이상의 컨플루언스(confluence)를 형성하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 80% 이상의 컨플루언스를 형성하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 90% 이상의 컨플루언스를 형성하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 챔버는 상기 줄기 세포와 상기 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 허용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 챔버는 상기 줄기 세포와 상기 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 방지하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 제대혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 말초혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 림프구와 동종이계(allogenic)인 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 림프구와 동종동계(autologous)인 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 챔버 안에 106개 이상의 상기 줄기 세포 집단이 존재하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 챔버 안에 상기 림프구와 적어도 1:10의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 제1항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 챔버 안에서 복수의 기질 표면 층에서 배양되는 것을 특징으로 하는 생물반응조.
- 자가면역성 장애 치료용 시스템으로서,
개체로부터 혈액을 채혈하기 위한 유체 도관;
채혈한 혈액으로부터 림프구를 분리하기 위한 혈구 성분 채집 장치(apheresis apparatus);
줄기 세포 집단을 기질 표면에 부착시킬 수 있는, 하나 이상의 양으로 하전된 기질 표면을 구비한 챔버, 상기 챔버로 상기 림프구를 도입하기 위한 유입관, 및 상기 줄기 세포와의 공동-배양 후 처리된 림프구를 추출하기 위한 배출관을 포함하는 생물반응조; 및
상기 처리된 림프구를 상기 개체로 복귀시키기 위한 유체 도관
을 포함하는 것을 특징으로 하는 자가면역성 장애 치료용 시스템. - 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 기질 표면은 하나 이상의 시트 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 기질 표면은 복수의 마이크로캐리어를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 기질 표면은 하나 이상의 투과성 막 층을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 기질 표면은 소수성 폴리스티렌을 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 50% 이상의 컨플루언스를 형성하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 80% 이상의 컨플루언스를 형성하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 기질 표면 상에서 90% 이상의 컨플루언스를 형성하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 챔버는 상기 줄기 세포와 상기 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 허용하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 생물반응조의 상기 챔버는 상기 줄기 세포와 상기 림프구 간의 세포 대 세포 접촉을 방지하도록 구성되어 있는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 제대혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 말초혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 림프구와 동종이계(allogenic)인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 림프구와 동종동계(autologous)인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포 집단은 상기 챔버 안에 106개 이상으로 존재하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 기질 표면에 부착되는 상기 줄기 세포는 상기 챔버 안에 상기 림프구와 적어도 1:10의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 챔버 안에서 복수의 기질 표면 층에서 배양되는 것을 특징으로 하는 시스템.
- 제18항에 있어서, 상기 시스템은 폐쇄형 루프 시스템(closed-loop system)인 것을 특징으로 하는 시스템.
- 자가반응성 T 세포로 인한 자가면역성 장애를 치료하는 방법으로서,
치료가 필요한 개체로부터 혈액을 채혈하는 단계;
채혈한 혈액으로부터 림프구를 분리하는 단계;
조절성 T(Treg) 세포가 활성화되어 자가반응성 T 세포를 억제하도록, 상기 림프구를 줄기 세포에 노출시키는 단계; 및
상기 처리된 림프구의 적어도 일부를 상기 개체로 복귀시키는 단계
를 포함하는, 자가반응성 T 세포로 인한 자가면역성 장애를 치료하는 방법. - 제36항에 있어서, 상기 자가면역성 장애는 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 림프구를 줄기 세포에 노출시키는 단계는,
상기 줄기 세포를 반응조에서 배양하는 단계, 및
상기 개체의 림프구를 상기 반응조로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제38항에 있어서, 상기 줄기 세포는 상기 림프구와 동종이계의 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 줄기 세포는 제대혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 상기 줄기 세포는 말초혈로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 줄기 세포는 개체 본인의 말초혈로부터 수득되는 자가 줄기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 줄기 세포를 반응조에서 배양하는 단계는
말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 포함하는 말초혈을 수집하는 단계;
상기 PBMC가 배아 유사 줄기 세포(embryonic-like stem cell)로 복원되도록, 상기 PBMC를 배양하는 단계;
상기 배아 유사 줄기 세포를 분리하는 단계; 및
상기 배아 유사 줄기 세포를 상기 반응조의 표면에 부착시키는 단계
를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제43항에 있어서, 상기 반응조의 표면은 순 양 전하(net positive charge)를 띄는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 Treg 세포는 상기 줄기 세포에서의 예정된 사멸 리간드 1(PD-L1: programmed death ligand 1)의 발현에 의해 조정되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 Treg 세포는 상기 줄기 세포에서의 질소 산화물(NO)의 분비에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 Treg 세포는 상기 줄기 세포와의 세포 대 세포 접촉에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 Treg 세포는 상기 반응조 안에서 상기 줄기 세포에 의해 분비되는 가용성 인자(soluble factor)에 의해 활성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 Treg 세포는 CD4, CD25, CD62L 및 CD69 마커의 발현이 특징적인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제36항에 있어서, 상기 혈액을 채혈하는 단계와 처리된 림프구를 상기 개체로 복귀시키는 단계는 연속적인 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제50항에 있어서, 상기 개체의 혈액은 혈액 1 L 이상을 추출할 수 있는 충분한 기간 동안 계속적으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- Treg 세포를 카르복시펩티다제 M (CPM)을 발현하는 줄기 세포에 노출시킴으로써, 조절성 T (Treg) 세포를 활성화하는 방법.
- Treg 세포를 브래디키닌(bradykinin) B1 수용체를 발현하는 줄기 세포에 노출시킴으로써, 조절성 T (Treg) 세포를 활성화하는 방법.
- Treg 세포를 자가면역 조절자(AIRE) 단백질을 발현하는 줄기 세포에 노출시킴으로써, 조절성 T (Treg) 세포를 활성화하는 방법.
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