CN110592012A - 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用 - Google Patents

一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110592012A
CN110592012A CN201910933667.XA CN201910933667A CN110592012A CN 110592012 A CN110592012 A CN 110592012A CN 201910933667 A CN201910933667 A CN 201910933667A CN 110592012 A CN110592012 A CN 110592012A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
immune
immune cells
tumor
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN201910933667.XA
Other languages
English (en)
Inventor
王彦刈
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Dianzi University
Original Assignee
Hangzhou Dianzi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Dianzi University filed Critical Hangzhou Dianzi University
Priority to CN201910933667.XA priority Critical patent/CN110592012A/zh
Publication of CN110592012A publication Critical patent/CN110592012A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/45—Artificially induced pluripotent stem cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用。首先从血液中提取的全免疫细胞，将上述免疫细胞加入到70‑80％汇合的贴壁培养的诱导型多能干细胞中一起培养，培养12‑48小时，从共培养容器中分离出免疫细胞，该免疫细胞就是增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞。该方法制备的免疫细胞可以应用于体内杀伤肿瘤细胞以及体外抗肿瘤试验。

Description

一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用
背景技术
肿瘤细胞往往会分泌多种可溶性成分，这些成分能够抑制免疫细胞发挥抗肿瘤免疫，导致肿瘤细胞所谓的“逃避免疫监视”并形成肿瘤。目前大多采用细胞因子的激活法和采用基因工程的办法在免疫细胞特别是T细胞中转入识别肿瘤抗原的基因来提高免疫细胞对肿瘤细胞的识别和清除。但是细胞因子的激活法通过一阵临床应用后发现效果并不是很理想；而通过基因工程的方法提高免疫细胞的免疫功能虽然是非常有前途的治疗方法，比如利用TCR基因修饰的自体淋巴细胞来治疗已经转移的黑色素瘤【Hong等.ClinicalCancer Research October 2010,16:4892；Abad等.J Immunother.2008,31(1):1–6.Zhao等.J Immunol 2005,174:4415-4423】，但是该方法成本高技术性强，况且不同的肿瘤具有不同的肿瘤抗原，导致不同的肿瘤需要转入不同的识别肿瘤抗原的TCR基因，所以比较难做到广谱性及工业制备，给应用带来难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用，该方法比较方便，既有较好的效果，又具有广谱性，比较适合工业制备。
增强抗肿瘤活性的免疫细胞采用以下方法制备：
首先从血液中提取的全免疫细胞(即去除红细胞后的血液白细胞)，将上述免疫细胞加入到70-80％汇合的贴壁培养的诱导型多能干细胞(induced pluripotent stemcells，iPS cells)中一起培养，培养12-48小时(优选为24h)，从共培养容器中分离出免疫细胞，该免疫细胞就是增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞。
应用：
这些免疫细胞通过与诱导型多能干细胞共培养后，即获得了抵抗肿瘤细胞分泌物的抑制免疫的作用的能力，从而使免疫细胞碰到肿瘤细胞时能够正常发挥其识别、清除肿瘤细胞的作用。这些细胞可以被应用于非治疗目的的体外抗肿瘤试验(将上述增强了抗肿瘤活性的免疫细胞与肿瘤细胞体外共培养24-48小时，进行体外杀伤肿瘤细胞试验观察)，也可应用于体内杀伤肿瘤细胞(将上述增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞注射入荷瘤生物体的血液系统中，以让其实施体内杀灭肿瘤细胞的作用，起到抗癌作用)，比如杀伤实体瘤和血液肿瘤细胞等。
本发明的有益效果：
通过与肿瘤细胞的共培养，可以制备出抵抗肿瘤细胞分泌物的抑制免疫作用的能力的免疫细胞，从而使免疫细胞碰到肿瘤细胞时能够正常发挥其识别、清除肿瘤细胞的作用。
附图说明
图1是增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞与肿瘤细胞体外共培养后，其对肿瘤细胞的杀伤力比较图。其中＊P<0.05与对照相比；＊＊P<0.01与对照相比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1：诱导型多能干细胞的传代培养
取小鼠成体细胞经转入Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc四种基因诱导而成的多能干细胞，培养在gelatinized培养皿中的ES细胞培养液中【DMEM培养基(GIBCO，11965-084)+10ng/ml白血病抑制因子LIF+15％胎牛血清(GIBCO，16141-061)+2mM L-谷氨酰胺(Cellgro,25-005-CI)+0.1mM非必须氨基酸(StemCell Technologies Inc.)+0.1mMβ-mercaptoethanol(Sigma)】，培养环境为37℃、5％CO2的培养箱中。培养到70-80％细胞汇合后，用0.25％胰酶消化，用培养基重新悬浮细胞，按照1:5的比例进行传代培养。对照用小鼠成纤维细胞进行培养，操作与上述诱导型多能干细胞相同。
实施例2：免疫细胞的分离制备
采用基因型相同的C57BL/6J小鼠，颌下静脉采血，肝素抗凝，用溶血剂溶掉血中红细胞，PBS清洗白细胞，重悬于上述ES培养基中，此即为全免疫细胞。
实施例3：增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备
上述实施例1中的已经传代的小鼠诱导型多能干细胞和成纤维细胞，培养到70-80％细胞汇合后，便可加入上述实施例2中分离制备好的全免疫细胞，每个9厘米直径的培养皿加入1-5×107个免疫细胞，共培养24-48小时，倒出悬浮的免疫细胞，PBS清洗，此即为增强了抗肿瘤免疫活性的免疫细胞。
实施例4：体外杀伤肿瘤细胞应用效果评价
取小鼠肿瘤细胞S180，培养于培养皿中，培养基为RPMI-1640培养基+10％胎牛血清+2mM L-谷氨酰胺+100单位/毫升的青霉素+100微克/毫升的链霉素，在培养基中加入上述实施例3中已经过诱导型多能干细胞和成纤维细胞处理的免疫细胞，共培养，分别于24、48小时后用流式细胞法测定肿瘤杀伤效果(方法参见Wang YY,Zheng XX.A flowcytometry-based assay for quantitative analysis ofcellular proliferation andcytotoxicity in vitro.Journal of immunological methods.2002,268(2):179-188)。结果如附图1，与成纤维细胞处理的对照相比，经诱导型多能干细胞处理过的免疫细胞的杀伤肿瘤细胞的效果非常显著。
实施例5：体内抗肿瘤应用效果评价
取20只C57BL/6小鼠，颈背部皮下接种2×106个S180肿瘤细胞，待瘤体生长到肉眼可见(约黄豆大小)，上述实施例3中经过诱导型多能干细胞处理和成纤维细胞处理的免疫细胞分别注射进荷瘤小鼠的尾静脉中(分别称为处理组和对照组)，注射量是隔两天每个小鼠2×107个细胞。10天后断颈处死小鼠，剥离肿瘤，称重。结果处理组的瘤体平均重量为1.02±0.27克，而对照组的瘤体平均重量为1.37±0.36克，差异显著(P<0.05)。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法，其特征在于将血液中提取的全免疫细胞加入到贴壁培养的诱导型多能干细胞中培养12-24小时。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于免疫细胞与诱导型多能干细胞共培养时间为24小时。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于诱导型多能干细胞为70-80％贴壁培养状态。
4.如权利要求1或2或3所述方法得到的增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞在非治疗目的的体外抗肿瘤试验中的应用。
CN201910933667.XA 2019-09-29 2019-09-29 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用 Withdrawn CN110592012A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910933667.XA CN110592012A (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910933667.XA CN110592012A (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110592012A true CN110592012A (zh) 2019-12-20

Family

ID=68864923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910933667.XA Withdrawn CN110592012A (zh) 2019-09-29 2019-09-29 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110592012A (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1869206A (zh) * 2006-05-27 2006-11-29 大连理工大学 一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法
CN102471753A (zh) * 2009-12-08 2012-05-23 伊利诺伊大学理事会 干细胞免疫调节应用方法和设备
CN104911148A (zh) * 2015-07-14 2015-09-16 奥思达干细胞有限公司 一种人免疫活性细胞dc-cik细胞制剂及其有效制备方法
CN106459918A (zh) * 2014-04-24 2017-02-22 得克萨斯州大学系统董事会 施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品
CN109295155A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 庆云堂生物科技（北京）有限公司 利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法
WO2019028422A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Trutino Biosciences METHODS OF ACTIVATION OF IMMUNE CELLS
CN110152015A (zh) * 2018-02-11 2019-08-23 上海市第六人民医院东院 负载抗肿瘤药物的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1869206A (zh) * 2006-05-27 2006-11-29 大连理工大学 一种高效免疫活性细胞群制备及用于抗肿瘤的方法
CN102471753A (zh) * 2009-12-08 2012-05-23 伊利诺伊大学理事会 干细胞免疫调节应用方法和设备
CN106459918A (zh) * 2014-04-24 2017-02-22 得克萨斯州大学系统董事会 施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品
CN104911148A (zh) * 2015-07-14 2015-09-16 奥思达干细胞有限公司 一种人免疫活性细胞dc-cik细胞制剂及其有效制备方法
WO2019028422A1 (en) * 2017-08-04 2019-02-07 Trutino Biosciences METHODS OF ACTIVATION OF IMMUNE CELLS
CN110152015A (zh) * 2018-02-11 2019-08-23 上海市第六人民医院东院 负载抗肿瘤药物的人多能干细胞外泌体及其制备方法与用途
CN109295155A (zh) * 2018-09-04 2019-02-01 庆云堂生物科技（北京）有限公司 利用微流控细胞培养检测人免疫细胞抗肿瘤能力的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOMING OUYANG ET AL.: "Induced Pluripotent Stem Cell-Based Cancer Vaccines", 《FRONTIERS IN IMMUNOLOGY》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200131475A1 (en) Method of generating natural killer cells and dendritic cells from human embryonic stem cell-derived hemangioblasts
DK2918673T3 (en) Compositions for the preparation of mature dendritic cells
US11898166B2 (en) In vitro generation of thymic organoid from human pluripotent stem cells
EP1424387B1 (en) Method of extended culture for antigen-specific cytotoxic t lymphocytes
CN107418930B (zh) 一种纯化与扩增人骨髓间充质干细胞的制备方法
CN113195710A (zh) T细胞或nk细胞的制造方法、t细胞或nk细胞的培养用培养基、t细胞或nk细胞的培养方法、维持未分化t细胞的未分化状态的方法和t细胞或nk细胞的增殖促进剂
CN115896019B (zh) 一种诱导性多能干细胞诱导分化为nk细胞的方法
Donaldson et al. Human amniotic fluid stem cells do not differentiate into dopamine neurons in vitro or after transplantation in vivo
CN105343894B (zh) 高效分泌前列腺素e2（pge2）的重组间充质干细胞及其应用
US9598674B2 (en) Dendritic cells obtained from induced pluripotent stem cells (iPSCs)
US20190209610A1 (en) Induced pluripotent stem cells produced from dendritic cells
CN105316286B (zh) 一种制备重组间充质干细胞的方法及其得到的重组间充质干细胞
CN110592012A (zh) 一种增强抗肿瘤免疫活性的免疫细胞的制备方法及其应用
CN108220243A (zh) 一种多能干细胞及其分化的t细胞和应用
CN106701663B (zh) 一种人母乳干细胞的制备方法及其应用
US20200263136A1 (en) Methods of preparing hematopoietic progenitor cells in vitro
EP4101924A1 (en) Cytotoxic t cells derived from human t cell-derived ips cells
US20220160789A1 (en) DUAL ANTIGEN-RECOGNIZING iPS CELL-DERIVED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR-T-CELL THERAPY
KR20190087777A (ko) 골수 유래 단핵구 제조방법
US20160060599A1 (en) Dendritic cell tumor vaccine and method for preparing the same
Veselá et al. Leukaemia inhibitory factor inhibits cardiomyogenesis of mouse embryonic stem cells via STAT3 activation
CN115087732B (zh) 来自人T细胞来源的iPS细胞的细胞毒性T细胞
CN117050940B (zh) 一种制备自然杀伤细胞的方法
CN113980901B (zh) 一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方法及应用
CN118028231A (zh) Ipsc细胞诱导分化为nk细胞的培养方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20191220

WW01 Invention patent application withdrawn after publication