CN113980901B - 一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备高纯度、成熟人树突状细胞的方法及应用，具体地，本发明通过单核细胞诱导分化为高纯度的非成熟树突状细胞、非成熟树突状细胞摄取加工抗原、非成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞几个环节，使得制备的树突状细胞具有高纯度、高得率，可有效摄取加工抗原，诱导活化抗原特异性的CTL杀伤肿瘤细胞。

Description

一种制备高纯度的成熟人树突状细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和细胞治疗领域，具体地，本发明涉及一种高纯度的成熟人树突状细胞的制备方法及应用。

背景技术

树突状细胞(Dendritic cells，DC)是1973年由美国Steinman首先发现的，因其成熟时伸出许多树突状或伪足样突起而得名。DC是目前所知抗原提呈功能最强的APC，最大的特点是能够刺激初始T细胞(naïve T cell)活化和增殖，而Mφ、B细胞等仅能刺激已活化的T细胞或记忆T细胞，因此，DC是特异性免疫应答的始动者，在免疫系统中占有独特地位。

DC可由骨髓中髓样干细胞和淋巴样干细胞分化而来，分别称为髓系DC(myeloidDC,MDC)、淋巴系DC(lymphoid DC，LDC)，大多数DC来源于骨髓，由骨髓进入外周血，再分布到全身组织。DC广泛分布于脑以外的全身各器官，数量少，仅占外周血单个核细胞的1%以下，占小鼠脾细胞的0.2%-0.5%。根据DC的成熟状态，可将DC分为DC前体、未成熟DC、迁移期DC和成熟DC。DC前体细胞经血循环或淋巴循环进入多种实体器官及非淋巴组织的上皮部位，在某些细胞因子作用下分化、发育为未成熟DC(immature DC, iDC)。正常情况下，体内绝大多数DC处于未成熟状态，它们仅表达低水平的MHCⅡ类分子、共刺激分子和粘附分子，在体外激发MLR能力较弱；但表达较多的FcR和病原体受体，具有极强的摄取和加工处理抗原的能力。iDC在摄取抗原或受到某些刺激(主要是炎性信号如LPS、IL1β、TNFα)后，未成熟DC即开始分化成熟。成熟的DC(mature DC，mDC)表达大量MHCⅡ类分子和共刺激分子(CD80、CD40、CD86等)，能有效地将加工、处理后的抗原以抗原肽-MHCⅡ类分子复合物的形式提呈给初始T细胞，并使之激活。

全球范围的DC肿瘤疫苗研究持续了近20年，目前，全球已经有4种DC肿瘤疫苗已经获得上市批准：Hybricell(Genoa Biotecnologia,巴西)、CreaVaX RCC(CreaGene,韩国)、Sipuleucel-T(Dendreon,美国)、APCEDEN(APAC Biotech,印度)。截止2020年4月，在美国国立卫生研究院管理的“Clinical trail”临床数据登记平台显示，以“Dendritic cells”为关键词共有1024项DC细胞治疗临床试验登记，包括62项临床Ⅲ-Ⅳ产品试验登记。美国、中国、欧盟是开发DC细胞治疗的主要国家和地区，在美国开展的临床试验有503项，中国为103项，中国已经成为仅次于美国的DC研发热地。在适应症方面，DC细胞治疗的主要适应症为黑色素瘤、肾癌、乳腺癌、脑癌、前列腺癌、白血病和HIV感染等，在肿瘤治疗领域，全球处于临床Ⅲ期的正在进行DC产品有13个。

获得高纯度、成熟的、可活化抗原特异性T淋巴细胞的DC是临床研究的关键。常规的制备DC的方法存在纯度低、成熟度不够的情况，容易导致细胞功能缺失，批间差异太大的问题，导致临床应用中效果不佳或出现免疫耐受情况。

因此，有必要对DC的培养方法进行进一步完善，以有效提高DC疫苗在临床应用中的疗效。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的制备高纯度、成熟人树突状细胞的方法；本发明制备的人树突状细胞，纯度达到80%，得率达到8%，CD83和CCR7的阳性细胞比例达到80%以上，可有效诱导抗原特异性的CTL，分泌IFN-γ和穿孔素，杀伤肿瘤细胞。

本发明的第一方面，提供了一种诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法，包括步骤：

(a) 提供一经终浓度为1-10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶；

(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml-400ng/ml的rhGM-CSF的第一基础培养基的培养体系中，培养单个核细胞1-4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；

(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；和

(d) 在添加了血清替代品或AB型血清、rhGM-CSF、和rhIL-4的第二基础培养基中，并在培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3-5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞。

在另一优选例中，在步骤(a)中，将用于培养单个核细胞的培养瓶预先经终浓度为1-10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被处理，从而获得经包被的培养瓶。

在另一优选例中，在步骤(b)中，将分离的PBMC作为单个核细胞接种于所述的培养体系。

在另一优选例中，在步骤(b)中，将单个核细胞以4×10⁶-10×10⁶/ml接种于所述含100ng/ml-400ng/mlrhGM-CSF的第一基础培养基。

在另一优选例中，在步骤(c)中，用第一基础培养基进行洗涤，洗涤次数为1-4次。

在另一优选例中，所述的步骤(d)中，AB型血清浓度为2-10体积%，rhGM-CSF浓度为100ng/ml-400ng/ml，rhIL-4浓度为100ng/ml-1000ng/ml。

在另一优选例中，所述的步骤(d)中，还包括对培养体系的培养基进行换液处理，并且对换下的培养基中悬浮的树突状细胞进行离心收集后，用新鲜的第二培养基重悬后传回原培养瓶中继续培养。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(e)用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞。

在另一优选例中，所述的感兴趣的抗原包括肿瘤相关抗原、病毒抗原、或其组合。

在另一优选例中，所述的肿瘤相关抗原包括肿瘤特异性抗原。

在另一优选例中，所述的病毒抗原包括：HIV病毒抗原、HPV病毒抗原、或其组合。

在另一优选例中，将在步骤(d)后获得的非成熟树突状细胞与感兴趣的抗原共孵育4-36小时（较佳地12-24小时），从而获得经抗原致敏的非成熟树突状细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：

(f)将步骤(e)获得的经抗原致敏的非成熟树突状细胞，进行成熟培养，从而获得成熟的树突状细胞。

在另一优选例中，在步骤(f)中，将所述经抗原致敏的非成熟树突状细胞，在添加了5-15μg/ml PGE2，500-1500IU/ml TNFα，和1-10μg/ml CD40L的第三基础培养基中，并在合适的培养条件下，培养16-60小时后，从而获得悬浮的成熟树突状细胞。

在另一优选例中，步骤(f)中获得的悬浮的成熟树突状细胞的纯度大于80%。

在另一优选例中，步骤(f)中获得的悬浮的成熟树突状细胞的数量为步骤(b)中单个核细胞接种数量的6-20％。

在另一优选例中，第一基础培养基包括RMPI 1640、X-ViVo、LymGro、CellGenixGMP DC或其他培养基。

在另一优选例中，第二基础培养基包括RMPI 1640、X-ViVo、LymGro、CellGenixGMP DC或其他培养基。

在另一优选例中，第三基础培养基包括RMPI 1640、X-ViVo、LymGro、CellGenixGMP DC或其他培养基。

在另一优选例中，所述的第一基础培养基、第二基础培养基和第三基础培养基是相同或不同的。

在另一优选例中，所述的第一基础培养基、第二基础培养基和第三基础培养基均为RPMI 1640培养基。

本发明的第二方面，提供了一种诱导单核细胞分化为成熟树突状细胞的方法，包括步骤：

(a) 培养单个核细胞的培养瓶经终浓度为1-10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段Retronectin处理包被，从而获得经包被的培养瓶；

(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml-400ng/ml的rhGM-CSF的RMPI 1640培养基的培养体系中，培养单个核细胞1-4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；

(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；

(d) 在添加了AB型血清、rhGM-CSF、和rhIL-4的RMPI 1640培养基中，并在合适的培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3-5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞；

(e)用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞；和

(f)将步骤(e)获得的经抗原致敏的非成熟树突状细胞，在添加了5-15μg/mlPGE2，500-1500IU/ml TNFα，和1-10μg/ml CD40L的RMPI 1640培养基中，并在合适的培养条件下，培养16-60小时后，从而获得悬浮的成熟树突状细胞。

在另一优选例中，步骤(a)所述的重组人纤维连接蛋白片段Retronectin为市售的GMP级别，Takara品牌的商品化试剂。

在另一优选例中，步骤(a)所述的重组人纤维连接蛋白片段Retronectin的工作浓度为1-10ug/mL，较佳地，4-6ug/mL。

在另一优选例中，步骤(a)所述的重组人纤维连接蛋白片段Retronectin处理包被的时间为12-24小时，较佳地，16-24小时。

在另一优选例中，步骤(a)所述的重组人纤维连接蛋白片段Retronectin处理包被的温度为2-8℃。

在另一优选例中，步骤(b)所述的培养时间为1-4小时，较佳地2-3小时。

在另一优选例中，步骤(b)所述的单个核细胞，初始培养密度为4×10⁶-10×10⁶/ml，较佳地，5×10⁶-6×10⁶/ml。

在另一优选例中，步骤(b)所述的rhGM-CSF浓度为100ng/ml-400ng/ml，较佳地150ng/ml-200ng/ml。

在另一优选例中，步骤(b)所述的单个核细胞来源于人外周血收集的单个核细胞。

在另一优选例中，步骤(c)所述的“将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离”，具体操作为收集上层的悬浮细胞后，用RPMI 1640培养基洗涤贴壁的单核细胞1-4次，较佳地，用RPMI 1640培养基洗涤贴壁的单核细胞3次。

在另一优选例中，步骤(d)所述的培养时间为3-5天，较佳地，为4天。

在另一优选例中，所述的步骤(d)所述的AB型血清浓度为2%-10%（v/v），较佳地，4%-6%（v/v）。

在另一优选例中，所述的步骤(d)中，所述的rhGM-CSF浓度为100ng/ml-400ng/ml，较佳地，150ng/ml-200ng/ml。

在另一优选例中，所述的步骤(d)中，所述的rhIL-4浓度为100-1000ng/ml，较佳地250-500ng/ml。

在另一优选例中，所述的步骤(d)中，收获的非成熟树突状细胞，为半贴壁细胞，换液后需传回原培养瓶中培养。

在另一优选例中，所述的步骤(e)中，所述的感兴趣的抗原包括肿瘤相关抗原、病毒抗原、或其组合。

在另一优选例中，所述的肿瘤相关抗原包括肿瘤特异性抗原。

在另一优选例中，所述的病毒抗原包括：HIV病毒抗原、HPV病毒抗原、或其组合。

在另一优选例中，所述的步骤(e)中，若添加的抗原为肿瘤抗原蛋白质与GM-CSF制备的融合蛋白，则步骤(d)中，根据融合蛋白中GM-CSF的生物学活性及抗原的使用量，rhGM-CSF的浓度可下调至0 ng/ml。

在另一优选例中，所述的步骤(e)中，将在步骤(d)后获得的非成熟树突状细胞与感兴趣的抗原共孵育4-36小时（较佳地12-24小时），从而获得经抗原致敏的非成熟树突状细胞。

在另一优选例中，步骤(f)所述的培养时间为16-60小时，较佳地24-48小时。

在另一优选例中，步骤(f)所述的PGE2浓度为5-15μg/ml，较佳地，5-10μg/ml。

在另一优选例中，步骤(f)所述的TNFα浓度为500-1500IU/ml，较佳地，750-1000IU/ml。

在另一优选例中，步骤(f)所述的CD40L浓度为1-10μg/ml，较佳地，5-10μg/ml。

本发明的第三方面，提供了一种树突状细胞，所述的树突状细胞是用本发明第一方面或第二方面所述方法制备的。

在另一优选例中，所述树突状细胞具有选自下组的一个或多个特征：

(a)纯度大于80%；

(b)获得的成熟树突状细胞的得率高，数量为接种的初始单个核细胞接种数量的6-20％；

(c)获得的成熟树突状细胞高表达CD83和CCR7，CD83和CCR7阳性细胞比例均达到80%以上；和

(d)经抗原致敏后的成熟树突状细胞体外可诱导抗原特异性CTL，进而杀伤肿瘤细胞。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第三方面所述的树突状细胞和药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为肿瘤疫苗组合物。

本发明的第五方面，提供了一种本发明第三方面所述的树突状细胞或本发明第四方面所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的疾病选自下组：肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤、HIV感染。

本发明的第六方面，提供了一种治疗和/或预防疾病的方法，包括向需要的对象施用治疗有效量的本发明第三方面所述的树突状细胞或本发明第四方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的疾病选自下组：肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤、HIV感染。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各计数特征和下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可相互组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不一一累述。

附图说明

图1显示了本发明实施例1和对比例1所制备的DC细胞形态图；其中a显示了在本发明实施例1中制备的成熟人树突状细胞的形态图，b显示了对比例1中按照常规方法制备的成熟人树突状细胞的形态图。

图2显示了本发明所述方法和常规方法制备的成熟人树突状细胞的纯度和得率图。

图3显示了在本发明一个实施例中，不同刺激因子组合培养的树突状细胞表型结果。

图4显示了在本发明一个实施例制备的负载肿瘤抗原的成熟人树突状细胞，可诱导产生抗原特异性的CTL，该CTL可显著杀伤肿瘤细胞。

图5显示了在分离单核细胞过程中添加高浓度的rhGM-CSF对树突状细胞得率的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，培养瓶中事先包被重组人纤维连接蛋白片段RetroNectin，铺板培养基RPMI 1640中添加高浓度的rhGM-CSF可使单个核细胞中单核细胞的贴壁能力特异性地显著增强，从而使得单核细胞优先贴壁而其他细胞几乎不贴壁（即仍保持悬浮状态）。培养一段时间后，除去悬浮细胞，并用RPMI 1640洗涤后，即获得高纯度的单核细胞。单核细胞在含AB型血清、和高浓度rhGM-CSF和IL-4条件下培养诱导为非成熟树突状细胞。非成熟树突状细胞为半悬浮细胞，仍旧有大量处于贴壁状态，收获换液后的非成熟树突状细胞优选传回原瓶继续培养。非成熟树突状细胞可摄取加工肿瘤抗原，后经PGE2、TNFα、CD40L刺激因子作用后，可获得高纯度、高分化、高得率的悬浮状态负载肿瘤抗原的成熟树突状细胞，可有效诱导抗原特异性的CTL，分泌IFN-γ和穿孔素，杀伤肿瘤细胞。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的技术人员通常理解相同。

如本文所用，术语“重组人纤维连接蛋白片段”、“重组人纤连蛋白片段”、“RetroNectin”是指RetroNectin—Recombinant Human Fibronectin Fragment。RetroNectin是重组人纤维连接蛋白片段，包括细胞结合域，肝磷脂结合域和CS1位点三个功能区域。它由574个氨基酸组成，分子量63kDa。

如本文所用，术语“培养瓶”是指适合本发明的单核细胞和树突状细胞贴壁生长的培养容器，包括培养瓶、培养皿以及培养平板中的培养孔，但不包括培养袋。

如本文所用，术语“单个核细胞”是指外周血单个核细胞（PBMC），其包括包括淋巴细胞和单核细胞。

如本文所用，术语“贴壁单核细胞”是指在经重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶中，在含高浓度(100ng/ml-400ng/ml)rhGM-CSF的RPMI 1640培养基的培养体系中，培养接种于所述培养体系中的单个核细胞，使其中的单核细胞贴壁于所述培养瓶上所得到的细胞。

如本文所用，术语“非成熟树突状细胞”是将“贴壁单核细胞”在含人AB型血清、rhGM-CSF、和IL-4的培养条件下，培养3-5天后获得的细胞，其在接受肿瘤抗原致敏以及刺激因子刺激的成熟培养后，可生成“成熟的树突状细胞”。

如本文所用，术语“成熟的树突状细胞”、“成熟人树突状细胞”、“成熟人DC”可互换使用，均指使用本发明的方法制备的，经抗原致敏的成熟的树突状细胞。

诱导单核细胞分化为树突状细胞(DC)的方法

本发明提供了诱导单核细胞分化为树突状细胞的方法，主要包括将外周血单个核细胞中的单核细胞诱导为非成熟树突状细胞，以及将所述非成熟树突状细胞诱导为成熟的树突状细胞。

本发明提供了将外周血单个核细胞中的单核细胞诱导为非成熟树突状细胞的方法，包括以下步骤：

(a) 提供一经终浓度为1-10ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶；

(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml-400ng/ml的rhGM-CSF的第一基础培养基的培养体系中，培养单个核细胞1-4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；

(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；和

(d) 在添加了血清替代品或AB型血清、rhGM-CSF、和rhIL-4的第二基础培养基中，并在培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3-5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞。

本发明还提供了将所述非成熟树突状细胞诱导为成熟的树突状细胞的方法，包括以下步骤：

(e)用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞。

(f) 将上一步骤获得的经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞，进行成熟培养，从而获得成熟的树突状细胞。

在另一优选例中，在步骤(f)中，将所述经抗原致敏的非成熟树突状细胞在5-15μg/ml PGE2，500-1500IU/ml TNFα，和1-10μg/ml CD40L的培养条件下，培养16-60小时后，获得悬浮的高纯度成熟树突状细胞。

组合物和用途

本发明还提供了一种药物组合物或免疫组合物。在所述组合物中，含有药学上可接受的载体(包括稀释剂、赋形剂等)以及有效量的使用本发明所述方法制备的树突状细胞。所述的树突状细胞的数量通常为1万-100000万个细胞/剂，较佳地为100万-10000万个细胞/剂。

本文所用的术语“有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量，临床医师是能够判断出来的。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如肿瘤抗原)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Pub. Co.，N.J. 1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。此外，免疫组合物中还可以含有免疫佐剂。

通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。

本发明的含树突状细胞的治疗或预防性药物组合物(包括疫苗)，可以经皮下、皮内、腔内、瘤内或病变部位、淋巴结、静脉注射或埋植等方式应用。治疗剂量方案可以是单剂方案或多剂方案。

本发明的新型的肿瘤疫苗(即本发明的树突状细胞)可用于治疗和预防疾病（尤其是肿瘤）发生，对已发生的肿瘤具有治疗作用。代表性的例子包括(但并不限于)：各种肿瘤如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、胰腺癌、结直肠癌、黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、白血病、宫颈癌、卵巢癌、鼻咽癌、口腔癌、骨肉瘤、脑胶质瘤、膀胱癌、多发性骨髓瘤等的预防及治疗。

本发明的药物组合物还可以与本领域已知的其他用于疾病（尤其是肿瘤）治疗和/或预防的药物制剂组合使用。

本发明的主要优点在于：

(1) 本发明的方法使用包被重组人纤维连接蛋白片段RetroNectin的培养瓶以及添加高浓度的rhGM-CSF的培养体系，可增强单个核细胞中单核细胞的贴壁能力，提高后续诱导产生的树突状细胞的产率。

(2) 本发明的方法在含AB型血清、和高浓度rhGM-CSF和IL-4条件下培养诱导贴壁的单核细胞为非成熟树突状细胞，非成熟树突状细胞的纯度相对于使用传统方法制备的非成熟树突状细胞纯度更高。

(3) 本发明的方法使用肿瘤抗原致敏，并且在PGE2、TNFα、CD40L刺激因子作用下诱导非成熟树突状细胞生成成熟的树突状细胞，所获得的成熟的树突状细胞相对于传统方法，纯度更高、分化程度更高、得率更高。

(4) 通过本发明的方法制备得到的成熟的树突状细胞可有效诱导抗原特异性的CTL，分泌IFN-γ和穿孔素，杀伤肿瘤细胞。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

下列实施例仅是举例说明而不是限制。

细胞培养通用条件

培养温度：37±1℃。

CO₂浓度：约5%

实施例1：成熟人DC制备方法

本发明所述成熟DC培养方法如下：

(1)T75培养瓶经8-12ml含终浓度为5ug/mL的重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)生理盐水2-8度过夜包被处理。

(2)采集健康人的外周血200ml，用生理盐水稀释1倍后，按体积比1:1延管壁轻轻加到淋巴细胞分离液的上层。水平转子离心，转速600g，时间30min，离心时关刹车。

(3)离心完成后收集白膜层，用生理盐水洗涤，离心：400g，10分钟，室温，升速设置10，降速设置10，去掉上清。

(4)用生理盐水洗涤白膜层，离心：400g，5分钟，室温，升速设置10，降速设置10，去掉上清，重复洗涤3遍，去除血小板，即为单个核细胞。

(5)收集单个核细胞，用血球计数板计数，单个核细胞总数为3.2×10⁸，取其中一半(1.6×10⁸)的单个核细胞用含200ng/ml rhGM-CSF的RPMI 1640重悬至浓度为4×10⁶/ml，体积为40ml。另一半的单个核细胞用于以下对比例1中。

(6)取出提前隔夜包被重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)的T75培养瓶，弃去上清，并用生理盐水洗涤3次，去除游离的重组人纤维连接蛋白片段。

(7)将步骤（5）中重悬后的单个核细胞传入重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)处理的2个T75培养瓶中，使每个培养体积为20ml，在CO₂培养箱培养2-4小时。

(8)从培养瓶中倒出培养液，用RPMI 1640洗涤培养瓶3遍，尽量去除未贴壁的悬浮细胞，从而获得含贴壁细胞（贴壁细胞为单核细胞）的培养瓶。对于回收的悬浮的细胞(位于培养液中)，可用于其他用途（如冻存用于培养CIK或药效学实验）

(9)往两个T75培养瓶中各加入20ml含5% AB型人血清、200ng/ml rhGM-CSF、和500ng/ml IL-4的RPMI 1640培养基，CO₂培养箱培养5天，将单核细胞诱导为非成熟的树突状细胞。

(10)第5天，离心收集悬浮的非成熟树突状细胞，用血球计数板计数，数量为2×10⁷，弃去原培养基，离心后的细胞沉淀用新鲜的含5% AB型人血清、200ng/ml rhGM-CSF、500ng/ml IL-4的RPMI 1640培养基重悬至密度5×10⁵/ml，体积共40ml，传回原培养瓶，每瓶20ml，继续培养。

(11)第6天，往步骤（10）的培养瓶中添加终浓度为1000IU/ml的TNFα、10μg/ml的PGE2、5μg/ml的CD40L，放入CO₂培养箱继续培养48小时，即获得成熟人树突状细胞。显微镜下观察细胞形态，血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞表型。

实施例2：优化成熟方法以产生成熟树突状细胞

按照实施例1中所述至步骤(9)获得非成熟树突状细胞以后，分别按不同的刺激因子组合诱导树突状细胞成熟，组别分别为：

(1)组别1:10μg/ml PGE2

(2)组别2: 1000IU/ml TNFα；

(3)组别3：5μg/mlCD40L

(4)组别:4：1000IU/ml TNFα+10μg/ml PGE2；

(5)组别5：10μg/ml PGE2+5μg/mlCD40L。

(6)组别6：1000IU/ml TNFα+10μg/ml PGE2+5μg/ml CD40L。

各组流式细胞仪表型检测结果如表1所示，DC得率如表2所示，DC培养上清中IL-12(p70)和IL10的比值如表3所示。其中，CCR7是DC迁移能力的重要指标；CD83是DC成熟度的重要标志之一；IL-12(p70)是促进Th1细胞极化和NK细胞激活的重要细胞因子，IL-10是Th2细胞因子，可负调节Th1的分化，IL-12(p70)和IL10的比值常用于衡量DC生物学活性。

结果显示：PGE2可上调CCR7的表达，促进DC迁移至发挥抗肿瘤免疫效应的淋巴结；CD40L的添加可有效刺激DC细胞分泌IL-12(p70)，显著提高IL-12(p70)和IL-10浓度比值。TNFα和Poly I:C可诱导DC表达CD83，促进树突状细胞成熟。TNFα+PGE2+CD40L刺激因子组合条件下，CD83和CCR7阳性细胞比例（见图3），DC得率，IL-12(p70)和IL10的比值均显著优于其他组别。

表1：不同刺激因子条件下，DC表型对比（n=3）

表2：不同刺激因子条件下，DC得率对比（n=3）

表3：不同刺激因子条件下，DC分泌细胞因子IL-12p70/IL-10浓度对比（n=3）

实施例3：制备的成熟人树突状细胞活性验证

重复实施例1，不同点在于，步骤（10）采用以下条件：

(10)收集悬浮的非成熟树突状细胞，用含5% AB型人血清、200ng/ml rhGM-CSF、500ng/ml IL-4、5-100μg/ml的肿瘤抗原（包括肿瘤抗原多肽、蛋白质、肿瘤裂解物等）的RPMI 1640培养基将非成熟树突状细胞重悬重悬至密度5×10⁵/ml，体积共40ml，传回原培养瓶，每瓶20ml，继续培养。

本实施例中采用的肿瘤抗原为前列腺酸性磷酸酶/粒-巨噬细胞集落刺激（PAP-GM-CSF，按照申请号201810073775X所述方法制备），工作浓度为10μg/ml，由于本身PAP-GM-CSF具有GM-CSF生物学活性，抗原添加后培养体系中可以不额外添加rhGM-CSF。

(11)第6天，往步骤（10）的培养瓶中添加终浓度为1000IU/ml的TNFα、10μg/ml的PGE2、5μg/ml的CD40L，放入CO₂培养箱继续培养48小时，即获得抗原致敏的成熟人树突状细胞。

采用如上制备的抗原致敏的成熟人树突状细胞，体外冲击自体淋巴细胞三轮。三轮冲击后的淋巴细胞与人前列腺癌细胞LNCaP分别按照效靶比30:1、10:1、5:1共培养5小时后，采用LDH检测试剂盒(Promega，货号：G1781)，测定淋巴细胞杀伤靶细胞的杀伤率。

LDH检测结果表明(图4)：负载肿瘤抗原的成熟人树突状细胞可诱导活化肿瘤抗原特异性的CTL，体外杀伤肿瘤细胞。

对比例1：采用传统方法制备成熟人DC

(1)取实施例1的步骤（5）中分离的单个核细胞1.6×10⁸，直接用RPMI 1640培养至重悬至密度至浓度为4×10⁶/ml，体积为40ml。重悬后的单个核细胞直接传入2个未经处理的T75细胞培养瓶中，20ml/瓶，培养2小时。

(2)用RPMI 1640洗涤培养瓶3遍，尽量去除未贴壁的悬浮细胞。

(3)往培养瓶中加入20ml含10ng/ml rhGM-CSF、和50ng/ml IL-4的CellGenix GMPDC基础培养基，CO₂培养箱培养5天，将单核细胞诱导为非成熟的树突状细胞。

(4)第5天，离心收集悬浮的非成熟树突状细胞，用血球计数板计数，数量为8×10⁶，弃去原培养基，离心后的细胞沉淀用用新鲜的含10ng/ml rhGM-CSF、和50ng/ml IL-4的CellGenix GMP DC基础培养基重悬至密度5×10⁵/ml，体积共16ml,传回一个原T75培养瓶继续培养。

(5)第6天，往步骤（4）的培养瓶中添加终浓度为10ng/ml rhIL-1β、rh100ng/mlIL-6和500IU/ml rhTNFα刺激因子，放入CO₂培养箱继续培养48小时，即获得成熟的人树突状细胞。

实施例1和对比例1中共采用了来源于6名不同健康人捐赠的外周血制备树突状细胞。

实施例1和对比例1所制备的DC细胞用常规方法进行观察和检测，结果如图1和图2所示。

显微镜观察可见，本发明所述的方法制备的成熟人树突状细胞(图1中a所示)具有明显的伪足样突触，视野内淋巴细胞很少，收获的成熟人树突状细胞纯度高。传统方法制备的成熟人树突状细胞(图1中b所示)部分细胞具有明显的伪足样突触，视野内淋巴细胞很多，收获的成熟人树突状细胞纯度低。

显微镜计数结果表明(图2)，采用本发明所述制备的成熟人树突状细胞和传统方法制备的人树突状细胞对比细胞得率和纯度统计如图2(n=6)，按本发明所述制备的成熟人DC细胞纯度平均可达80%，而传统方法仅约45%，同时得率也平均可达8%，显著高于传统方法的平均得率4%。

流式细胞仪检测结果表明：本发明所述的方法获得的树突状细胞高表达CD83和CCR7，CD83和CCR7阳性细胞比例均大于80%，而传统方法制备的树突状细胞CD83和CCR7阳性细胞比例在约60%。

对比例2：RetroNectin包被对制备树突状细胞的影响

在本对比例中，重复实施例1（包括接种细胞的来源均相同），不同点在于：在步骤（1）中，采用的培养瓶是未经RetroNectin包被的T75培养瓶。

结果显示，最终收获的树突状细胞纯度平均纯度为60%，得率为6.5%，CD83和CCR7阳性细胞比例均大于80%。结果表明，RetroNectin预先包被培养瓶对最终收获的树突状细胞纯度和得率有显著影响，对细胞的表型无影响。

对比例3：分离过程中添加高浓度的rhGM-CSF对制备树突状细胞的影响

在本对比例中，将三个不同供者来源的PBMC平均分为两份，其中一半PBMC完全采用实施例1方案分离、诱导和培养（即RetroNectin包被+GM-CSF组）；另一半PBMC除步骤（5）中采用的为不含rhGM-CSF的培养基外，其余完全按照实施事例1的方案进行分离、诱导和培养（仅RetroNectin包被组）。

最终DC的得率分别为仅RetroNectin包被组：6.9%；RetroNectin包被+GM-CSF组：9.2%。RetroNectin包被+GM-CSF组的得率显著高于仅RetroNectin包被组（P<0.05，n=3）（图5）。

讨论

本发明人对目前常规的单核细胞培养诱导为成熟人树突状细胞的工艺进行了改良，首次意外地发现，用重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)包被的培养瓶培养单个核细胞，经贴壁洗涤后去除悬浮细胞后，获得纯度显著提高的单核细胞。发明人发现，在高浓度rhGM-CSF（100ng/ml-400ng/ml）条件下，单核细胞可有利地贴合在重组人纤维连接蛋白片段(RetroNectin)处理后的培养瓶壁上。

另一方面，本发明优化了单核细胞诱导为非成熟树突状细胞的培养体系和非成熟树突状细胞诱导为成熟树突状细胞的培养体系，最终获得高纯度、高得率、可有效摄取、加工肿瘤抗原的成熟人树突状细胞，本发明所述制备的成熟人树突状细胞，可活化、诱导杀伤肿瘤细胞的特异性CTL，具有临床实用性，可应用于多种抗肿瘤细胞免疫治疗。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种诱导单核细胞分化为树突状细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a) 提供一经终浓度为1-10μg/mL的重组人纤维连接蛋白片段试剂包被的培养瓶，所述重组人纤维连接蛋白片段试剂为重组人纤维连接蛋白片段Retronectin；

(b) 在所述经包被的培养瓶中，在含100ng/ml-400ng/ml的rhGM-CSF的第一基础培养基的培养体系中，培养单个核细胞1-4小时，从而使得单个核细胞中的单核细胞贴壁于所述培养瓶；

(c) 将所述培养体系中贴壁的单核细胞与悬浮的细胞进行分离，并对所述培养瓶贴壁的单核细胞进行洗涤，从而去除残留的悬浮细胞，获得经分离的贴壁单核细胞；

(d) 在添加了血清替代品或AB型血清、rhGM-CSF和rhIL-4的第二基础培养基中，并在合适的培养条件下，对上一步骤获得的经分离的贴壁单核细胞进行培养3-5天后，从而获得纯度大于80%的非成熟树突状细胞；

(e) 用感兴趣的抗原对所述非成熟树突状细胞进行致敏处理，从而获得经所述抗原致敏的非成熟树突状细胞；和

(f) 将步骤(e)获得的经抗原致敏的非成熟树突状细胞，在添加了5-15μg/ml PGE2，500-1500IU/ml TNFα和1-10μg/ml CD40L的第三基础培养基中，并在合适的培养条件下，培养16-60小时后，从而获得悬浮的成熟树突状细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，将分离的PBMC作为单个核细胞接种于所述的培养体系。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(d)中，AB型血清的体积浓度为2-10%，rhGM-CSF浓度为100ng/ml-400ng/ml，rhIL-4浓度为100ng/ml-1000ng/ml。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(d)中，还包括对培养体系的培养基进行换液处理，并且对换下的培养基中悬浮的树突状细胞进行离心收集后，用新鲜的第二培养基重悬后传回原培养瓶中继续培养。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)中，所述的感兴趣的抗原包括肿瘤相关抗原、病毒抗原或其组合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(f)中获得的悬浮的成熟树突状细胞的纯度大于80%。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一基础培养基、第二基础培养基和第三基础培养基均为RPMI 1640培养基。

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