CN106701680A - 一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于细胞生物学领域，公开了一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法。本发明所述组合因子包括CD40L和MPLA用本发明所述组合因子刺激树突状细胞，高效活化其自体T细胞，诱导树突状细胞充分成熟。本发明所述培养树突状细胞的方法为用所述促进树突状细胞成熟的组合因子刺激未成熟树突状细胞。本发明所述方法能够诱导树突状细胞充分成熟并具有高效活化自体T细胞的能力，操作方法简单，成本低，培养得到的成熟DC细胞可广泛用于制备肿瘤免疫治疗药物或疫苗，在肿瘤免疫治疗的领域发挥重要作用。

Description

一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的 方法

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法。

背景技术

1973年，Steinman和Cohn在体外培养小鼠脾细胞时发现了一群形态呈树枝状的细胞，因此命名为树突状细胞(dendritic cells，DCs)。此后，Steinman在对其功能的研究中发现DCs是混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)最有力的刺激因素，并推断DCs是激活T、B淋巴细胞活化的“辅助”细胞。这一推断在后来的研究中得到了充分的证实。目前认为，DCs是体内抗原提呈能力最强的专职抗原提呈细胞，也是唯一能够激活初始T淋巴细胞反应的细胞。

DCs起源于骨髓髓样干细胞和淋巴样干细胞，以未成熟DCs(immature dendriticcells，imDCs)状态广泛分布于除脑组织外的全身各组织器官。imDCs高表达吞噬相关受体，具有强大的抗原摄取能力，摄取抗原后，向淋巴结归巢并逐渐成熟。成熟DCs(maturedendritic cells,mDCs)丧失抗原摄取能力，高表达MHC I/Ⅱ类分子，以及CD40、CD80、CD86等共刺激分子和黏附分子，具有强大的抗原提呈能力，在淋巴结将抗原提呈给T细胞，并分泌细胞因子，激活初始T细胞产生免疫应答。研究表明，imDCs体外激发MLR的能力弱，而mDCs激发MLR的能力强；imDCs诱导免疫耐受，而mDCs激活免疫反应。基于imDCs与mDCs在功能上的差异，诱导DCs成熟是DCs疫苗制备中的重要环节。吞噬肿瘤抗原却未能分化成熟的DCs疫苗具有诱发机体免疫耐受，进而促进肿瘤进展的潜在风险。

现有的DCs培养技术未能足够重视DCs促成熟过程，同时考虑成本因素，国内大多采用TNF-α因子。实验研究表明干扰素a促成熟DC细胞成熟度不足，表面标记表达低，活化免疫功能差，很大程度上限制了DC疫苗临床应用工作的开展。因此，有必要对现有DC细胞培养方案进行进一步完善，以有效提高DC疫苗抗炎或抗肿瘤作用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，提供了一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法，用本发明所述组合因子刺激树突状细胞能够促进树突状细胞成熟，并高效活化其自体T细胞。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种促进树突状细胞成熟的组合因子，包括CD40L和MPLA。

作为优选，所述组合因子中CD40L与MPLA的质量比为50:1。

本发明还提供了一种培养树突状细胞的方法，用所述促进树突状细胞成熟的组合因子刺激未成熟树突状细胞。

作为优选，所述方法具体包括以下步骤：

1)用培养液悬浮单核细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养4-5天后加入CEA蛋白抗原负载24小时；

2)加入CD40L和MPLA，37℃、5％CO₂培养箱继续培养24小时后收获成熟的树突状细胞。

其中，作为优选，步骤2)所述CD40L的用量为2μg/ml，所述MPLA的用量为40ng/ml。

作为优选，步骤1)所述培养液为含有GM-CSF和IL-4的无血清培养液。

作为优选，所述无血清培养液中GM-CSF的含量为800U/ml，所述IL-4的含量为1000U/ml。

作为优选，步骤1)所述单核细胞为外周血单核细胞。

作为优选，步骤1)所述单核细胞的细胞密度为5×10⁵-2×10⁶/ml，

作为优选，步骤1)所述CEA抗原的工作浓度为5μg/ml。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种促进树突状细胞成熟的组合因子及培养树突状细胞的方法。本发明所述组合因子包括CD40L和MPLA用本发明所述组合因子刺激树突状细胞，高效活化其自体T细胞，诱导树突状细胞充分成熟。本发明所述培养树突状细胞的方法为用所述促进树突状细胞成熟的组合因子刺激未成熟树突状细胞。具体包括以下步骤：1)用培养液悬浮单核细胞，在37℃、5％CO2培养箱中培养4-5天后加入CEA蛋白抗原负载24小时；2)加入CD40L和MPLA，37℃、5％CO2培养箱继续培养24小时后收获成熟的树突状细胞。本发明所述方法能够诱导树突状细胞充分成熟并具有高效活化自体T细胞的能力，操作方法简单，成本低，培养得到的成熟DC细胞可广泛用于制备肿瘤免疫治疗药物或疫苗，在肿瘤免疫治疗的领域发挥重要作用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1培养第7天DC细胞形态图，其中图A、B为两位不同志愿者外周血单核细胞培养后的DC细胞形态图；

图2为对比例1不同方案培养DC细胞后IL-12分泌量比较图；

图3为成熟DCs表面分子表达图，其中灰色虚线表示阴性对照组，黑色表示实验组，数值表示阳性百分含量；

图4为成熟DCs细胞因子分泌的统计图；

图5为成熟DCs诱导自体T细胞IFNγ水平的统计图，其中图A为DC-PBMC组、B为PBMC组。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

为了实现本发明的目的，本发明提供的技术方案是：

本发明提供了一种促进树突状细胞成熟的组合因子，包括CD40L和MPLA。

优选的，所述组合因子中CD40L与MPLA的质量比为50:1。

实验表明采用CD40L联合MPLA共同刺激DC得到的成熟DC细胞具有很高成熟度，并高水平表达细胞表面分子，进而能更有效地活化自体T细胞。

在一些实施方案中，所述组合因子的用量为在每毫升树突状细胞培养液中，添加CD40L 2μg、MPLA 40ng。

本发明还提供了一种培养树突状细胞的方法，用所述促进树突状细胞成熟的组合因子刺激未成熟树突状细胞。

在一些实施方案中，本发明所述的方法中所述的未成熟树突状细胞是采用单核细胞在无血清培养液中进行常规培养4-5后收集的悬浮生长的未成熟树突状细胞。

在一些实施方案中，所述培养树突状细胞的方法具体包括以下步骤：

1)用培养液悬浮单核细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养4-5天后加入CEA蛋白抗原负载24小时；

2)加入CD40L和MPLA，37℃、5％CO₂培养箱继续培养24小时后收获成熟的树突状细胞。

本发明所述方法中，所述培养液是无血清细胞培养液，例如，常用Lonza公司的无血清细胞培养液X-VIVO。其他常用于树突状细胞的必需培养基液也可用于本发明。

进一步的，本发明所述的方法中所述的培养液中优选含有GM-CSF和IL-4的。

在一些实施方案中，所述无血清培养液中GM-CSF的含量为800U/ml，所述IL-4的含量为1000U/ml。

优选的，所述单核细胞为外周血单核细胞。

进一步的，所述单核细胞的细胞密度为5×10⁵-2×10⁶/ml。

为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明进行详细阐述，如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1：培养DCs细胞

1、志愿者2名，签署知情同意书，分别抽取外周静脉血30ml。淋巴细胞分离液(天津灏洋、TBD)分离PBMC后，用新鲜的无血清树突状细胞培养液(Lonza公司的X-VIVO)悬浮，细胞密度在5×10⁵-2×10⁶/ml，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2、培养4-5天后加CEA抗原至终浓度为5μg/ml，负载24小时，加入CD40L至终浓度2μg/ml，MPLA至终浓度40ng/ml，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时后收获成熟的树突状细胞。在第7天观察细胞形态，如图1。

从图1可以看出，两位志愿者的细胞均表现为半贴壁状态，表面有细小轴突，少数聚集成簇，即呈现DCs典型形态。

对比例1、不同培养方法培养DC细胞后IL-12分泌量比较

1、志愿者1名，签署知情同意书，分别抽取外周静脉血30ml。淋巴细胞分离液(天津灏洋、TBD)分离PBMC后，用新鲜的无血清树突状细胞培养液(Lonza公司的X-VIVO)悬浮，细胞密度在5×10⁵-2×10⁶/ml，37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2、培养4-5天后加CEA抗原至终浓度为5μg/ml，负载24小时后，分为四组：组一不加任何试剂做为负对照；组二加入MPLA至终浓度40ng/ml；组三加入CD40L至终浓度2μg/ml；组四加入CD40L至终浓度2μg/ml，MPLA至终浓度40ng/ml。在37℃，5％CO2培养箱中培养48小时后收集树突状细胞上清，进行ELISA检测(ELISA试剂盒购自ebioscience，货号88-7126-88，88-7106-88)。检测上清中促炎性因子IL-12的分泌情况，结果见图2。结果显示，组四CD40L与MPLA联合应用IL-12表达水平最高，显示CD40L，MPLA具有协同作用。

试验例1、效果试验

1、DCs表面marker的表达

收集实施例1中培养第7天的成熟的树突状细胞，用BD流式细胞仪检测CD83和CD86的表达。结果见图3。

结果显示，促成熟后DC的表面markerCD83和CD86分子显著上调。表明CD40L和MPLA的组合能有效促进DC成熟和表面marker高表达。

2、DCs细胞因子分泌检测

收集实施例1中培养第8天的成熟的树突状细胞上清，进行ELISA检测(ELISA试剂盒购自ebioscience，88-7126-88，88-7106-88)。检测上清中促炎性因子IL-12和抑制型因子IL-10的分泌情况，结果见图4。

结果显示，两个志愿者IL-12表达均远远高于各自IL-10，表明促成熟DCs具有分泌高水平促炎因子IL-12和低水平抑制型因子IL-10的能力。

3、检验DCs功能

DCs是否有效活化自体T淋巴细胞是检验DCs功能的关键问题，活化的T细胞会高水平分泌IFNg，因此通过IFNg的表达来研究CD8+T细胞的活化。

收集实施例1中培养第7天的成熟的树突状细胞与自体T细胞(来源于志愿者自体PBMC)以细胞数1:10(树突状细胞与自体T细胞细胞数比为1:10)的比率于37℃、5％CO₂培养箱中共培养。在共培养后的3-5天后，在各孔中加入0.6μg/ml可溶性的anti-CD3和anti-CD28(均购自R&D，MAB100，MAB342)抗体刺激剂以及10μg/ml brefeldin A(布雷非德菌素ABFA)(购自ebioscience，00-4506)蛋白转运抑制剂，37℃、5％CO₂培养箱中刺激培养5h后收集共培养细胞进行IFNg/CD8(购自BD，554702，347314)抗体染色，用流式细胞仪gate出CD8阳性T淋巴细胞群进行分析，结果如图5。

结果显示DC-PBMC(成熟的树突状细胞与自体T细胞共培养)组IFNg的表达高于PBMC组。表明抗原负载并促成熟DC能有效诱导自体T细胞分泌高水平IFNg，即能有效活化自体T淋巴细胞。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种促进树突状细胞成熟的组合因子，包括CD40L和MPLA。

2.根据权利要求1所述组合因子，其特征在于，所述CD40L与MPLA的质量比为50:1。

3.一种培养树突状细胞的方法，其特征在于，用权利要求1所述促进树突状细胞成熟的组合因子刺激未成熟树突状细胞。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：

1)用培养液悬浮单核细胞，在37℃、5％CO₂培养箱中培养4-5天后加入CEA蛋白抗原负载24小时；

2)加入CD40L和MPLA，37℃、5％CO₂培养箱继续培养24小时后收获成熟的树突状细胞。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤2)所述CD40L的用量为2μg/ml，MPLA的用量为40ng/ml。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述培养液为含有GM-CSF和IL-4的无血清培养液。

7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述无血清培养液中GM-CSF的含量为800U/ml，所述IL-4的含量为1000U/ml。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述单核细胞为外周血单核细胞。

9.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述单核细胞的细胞密度为5×10⁵-2×10⁶/ml。

10.根据权利要求4所述方法，其特征在于，步骤1)所述CEA抗原的工作浓度为5μg/ml。