CN102676455A

CN102676455A - 脐带血来源的树突状细胞及树突状细胞疫苗的制备方法

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Publication number: CN102676455A
Application number: CN 201210150716
Authority: CN
Inventors: 吴明远; 史高娜; 裴雪涛; 李会; 刘大庆; 南雪; 陈琳; 习佳飞
Original assignee: Beijing Heze Purui Biological Technology Co ltd; Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Current assignee: Beijing Heze Purui Biological Technology Co ltd; Institute of Field Blood Transfusion Chinese Academy of Military Medical Sciences
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102676455B

Abstract

本发明公开了脐带血来源的树突状细胞（DC）以及树突状细胞（DC）疫苗的制备方法，涉及一种细胞疫苗的制备方法。该方法采用多种细胞因子诱导脐带血分离得到的DC，继而用肿瘤特异性抗原刺激DC，从而提高DC的特异性抗原递呈能力；在细胞培养基中加入干细胞生长因子和Flt3-L可以有效促进脐带血中的造血细胞向免疫细胞诱导和增殖。该方法制备出的DC疫苗具有特异性抗原递呈能力，作为肿瘤免疫治疗产品，可结合CIK细胞共同治疗恶性肿瘤，作为继手术、放化疗后的重要辅助治疗；并可有效预防手术后的转移复发，降低患者因放化疗引起的毒副作用，从而提高治疗效果。

Description

脐带血来源的树突状细胞及树突状细胞疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及细胞免疫领域，具体地说是一种DC疫苗的制备方法，即从脐带血中分离得到的DC用于肿瘤生物免疫治疗，最终制备成肿瘤疫苗治疗产品，用于临床治疗前列腺癌，乳腺癌等多种恶性肿瘤。

背景技术

树突状细胞（Dendritic cells，DC）是体内功能最强的抗原递呈细胞（Antigen presenting cell，APC），能够刺激初始的T细胞增殖，启动免疫应答；还能够呈递抗原给MHC-I类限制性CD8⁺和MHC-II类限制性CD4⁺T淋巴细胞，诱导特异性免疫反应，被称为“天然免疫佐剂”，因此在诱导免疫应答中具有独特的地位。近年来，以DC为基础的免疫治疗在临床应用中得到越来越广泛的关注，是国内外研究的热点。

以前的DC制备方法中大多采用病人的外周血单个核细胞，存在细胞数目少，抗原递呈能力差等缺点。本方法采用脐带血来源的DC，通过多种细胞因因子以及肿瘤相关抗原刺激为成熟的DC，并制备成DC疫苗，用于多种恶性肿瘤的辅助治疗。

发明内容

本发明通过细胞来源的选择、培养方案的优化、肿瘤特异性抗原提取和选择等方面的改进，解决了外周血来源的DC数目少、抗原递呈能力差的问题。

本发明提供了一种DC制备方法，其特征在于将脐带血单个核细胞用含有脐带血分离的上层血浆的培养基贴壁培养2h后，去除未贴壁细胞，向贴壁细胞中加入rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L，继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF-α，再继续培养1-4天，即可获得成熟的DC。

在一个特定的实施方案中，所分离的脐带血单个核细胞是采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血得到的。

在一个特定的实施方案中，使用的培养基为GT-T551淋巴细胞培养基；脐带血分离的上层血浆为自体脐带血血浆，并且其在培养基中的含量为0.6-10％，优选1％；加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、SCF、Flt3-L和rhTNF-α的终浓度分别为1000U/mL、500U/mL、50 ng/mL、30 ng/mL和50U/mL；肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白，其终浓度为20μg/mL。

在最优选的实施方案中，所述DC制备方法包括下列步骤：

（1）将分离得到的单个核细胞贴壁2h，去除未贴壁细胞；

（2）向贴壁细胞中加入含1%自体脐带血血浆的GT-T551淋巴细胞培养基5mL，并加入rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL、SCF 50 ng/mL和Flt3-L 30 ng/mL，置37℃ 5％CO₂孵箱中继续培养；

（3）隔天半量换液，并补加rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L以保持培养基中其浓度不变；

（4）于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白20μg/mL刺激，第6天加入rhTNF-α 50U/mL，继续培养1-4天即可获得成熟的DC。

通过形态学特征、免疫表型以及混合淋巴细胞反应证明本方法所得到的DC纯度高，抗原递呈能力强，并可促进T淋巴细胞的增殖。

附图说明

图1A～图1C 不同培养时间细胞的形态，图1A～图1C分别为培养第1、7、9天细胞在倒置显微镜下的形态，放大倍率均为20×。

图2A～图2C不同培养时间细胞的流式细胞分析结果，图2A～图2C分别为培养第1、7、9天的DC。

图3 不同培养时间细胞中CD1α、HLA-DR、CD80、CD83、CD86阳性细胞的比例。

具体实施方式

实施例1 脐带血来源的DC的制备

自体脐带血血浆的制备：

1. 无菌采集足月顺产胎儿断脐后的脐带血一份，枸橼酸抗凝，置离心管内离心15分钟。

2. 吸取上清大约30mL，放入离心管内，继续离心15分钟，收集上清血浆。

3. 将收集到的血浆放入56℃水浴30分钟，灭活补体。

4. 离心除去管中絮状沉淀物，将上清移至新的离心管中分装冻存备用。

脐带血单个核细胞的分离：

1. 将分离完上层血浆的脐带血，按照1:1的比例与生理盐水混匀，再按4:1的比例与6.0％(w/v)的羟乙基淀粉（HESpan）混匀，室温静置30分钟，待红细胞自然沉降至界限分明，沉降红细胞。

2. 吸出上清，置50mL离心管中，25℃、1800rpm离心5分钟。

3. 在15mL的离心管中加入5mL Ficoll人淋巴细胞分离液，再缓缓沿管壁加入5mL细胞悬液，25℃、1800rpm离心25分钟，分离出单个核细胞。

4. 收集界面单个核细胞，用PBS洗涤。

5. 用PBS悬浮细胞计数，备用。

DC的体外诱导：

1. 将分离得到的单个核细胞接种到T25细胞培养瓶中，置37℃ CO₂孵箱中贴壁2h，扔掉悬浮细胞。

2. 向贴壁的细胞中加入含1%自体脐带血血浆的GT-T551淋巴细胞培养基（日本TAKARA原装进口无血清培养基，由宝日医生物技术有限公司提供）5mL，并加入rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL、50 ng/mL SCF和30 ng/mL Flt3-L，置37℃ 5％CO₂孵箱中继续培养。

3. 隔天半量换液，补加含rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L的完全培养基，使细胞因子的浓度保持不变。

4. 于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白20μg/mL刺激，第6天加入rhTNF-α 50U/mL，继续培养1-4天。

倒置显微镜下观察细胞形态：

分别取培养第1、7、9天的细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态，如图1所示。随着培养过程的进行，细胞由典型的球形单个核细胞形态转变为DC形态。

实施例2 培养细胞的免疫表型检测

分别取培养第1、7、9天的细胞，用无钙镁PBS洗2次后，各取1×10⁵/ mL，分别加入相应的FCM管中。加入待检测单克隆抗体包括CD1α、HLA-DR、CD80、CD83、CD86抗体各5 μl，4 ℃避光孵育30分钟，每10分钟摇晃1次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400 μl的PBS中，采用流式细胞仪FASCSCalibur（BD Biosciences）检测，结果见图2、表1、图3。

表1 不同培养时间DC的免疫表型

培养时间	第1天	第7天	第9天
				CD1α+	0.84±0.566%	23.33±2.17%	13.46±1.97%
CD83+	27.37±2.11%	38.57±1.99%	40.88±2.60%
				HLA-DR+	76.21±3.09%	82.63±1.62%	89.01±2.59%
CD80+	8.01±2.01%	46.51±3.68%	55.47±3.35%
				CD86+	35.47±3.21%	80.49±1.70%	95.75±3.25%

上述表面抗原中，CD1α 和CD80是DC细胞的表面标志，CD83和CD86是DC细胞的共刺激分子，HLA-DR是DC细胞的免疫刺激分子。由表1的实验结果可以看出，随着培养的进行，DC所占比率不断升高，本发明的方法所得到的DC纯度高。

实施例3 混合淋巴细胞反应（MLR）

1. 取培养第9天的DC，用AIM-V淋巴细胞培养基悬浮，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml，先用丝裂霉素25 μg/ml处理45分钟，PBS洗3遍以上。

2. 调整DC浓度为1×10⁵个/ml，与相应培养时间的T淋巴细胞按（DC：淋巴细胞）1:10、1:20、1:50、1:100的比例混合培养，阴性孔不加DC，每组设3个复孔，培养72小时。

3. CCK-8法检测细胞活性：加人CCK-8，培养4小时，用酶联免疫检测仪于450 nm处，测OD值并记录结果，结果用3孔均值统计T淋巴细胞增殖率。并计算其增殖指数SI。SI=试验孔OD值/对照孔OD值。试验结果如表2所示。

表2 脐带血来源的DC刺激T淋巴细胞增殖的能力(X±S，n=3)

*与1:50组相比P＜0.01；#与1:20组相比P＜0.05

由表2的试验结果可以看出，本方法所得到的DC抗原递呈能力强，可有效促进T淋巴细胞的增殖。

Claims

1.一种树突状细胞（DC）制备方法，其特征在于将脐带血单个核细胞用含有脐带血分离的上层血浆的培养基贴壁培养2h后，去除未贴壁细胞，向贴壁细胞中加入rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L，继续培养；隔天半量换液，并补加rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L以保持培养基中其浓度不变；于培养的第5天加入肿瘤特异性抗原刺激，第6天加入rhTNF-α，再继续培养1-4天，即可获得成熟的DC。

2.权利要求1所述的DC制备方法，其中，所述培养基为GT-T551淋巴细胞培养基。

3.权利要求1所述的DC制备方法，其中，所述培养基中含有0.6-10％脐带血分离的上层血浆。

4.权利要求3所述的DC制备方法，其中，所述培养基中含有1％脐带血分离的上层血浆。

5.权利要求1所述的DC制备方法，其中，所述脐带血分离的上层血浆为自体脐带血血浆。

6.权利要求1所述的DC制备方法，其中，所述肿瘤特异性抗原为乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白。

7.权利要求1所述的DC制备方法，其中，加入的细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4、SCF、Flt3-L和rhTNF-α的终浓度分别为1000U/mL、500U/mL、50 ng/mL、30 ng/mL和50U/mL，肿瘤特异性抗原的终浓度为20μg/mL。

8.权利要求1所述的DC制备方法，包括下列步骤：

将分离得到的单个核细胞贴壁2h，去除未贴壁细胞；

向贴壁细胞中加入含1%自体脐带血血浆的GT-T551淋巴细胞培养基5mL，并加入rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL、SCF 50 ng/mL和Flt3-L 30 ng/mL，置37℃ 5％CO₂孵箱中继续培养；

隔天半量换液，并补加rhGM-CSF、rhIL-4、SCF和Flt3-L以保持培养基中其浓度不变；

于培养的第5天加入乳腺癌细胞系ZR-751提取的抗原蛋白20μg/mL刺激，第6天加入rhTNF-α 50U/mL，再继续培养1-4天即可获得成熟的DC。

9.权利要求1-8任一项所述的DC制备方法，其中，所分离的脐带血单个核细胞是采用密度梯度离心法，用Ficoll人淋巴细胞分离液分离新鲜人脐带血得到的。