CN1918287A

CN1918287A - 从脐带血分离和培养专能祖/干细胞的方法及诱导其分化的方法

Info

Publication number: CN1918287A
Application number: CNA2005800032834A
Authority: CN
Inventors: 李明雨; 金映真; 崔祯恩; 梁末淑; 文荣俊; 金仙庆; 金孝哲; 朴峻成; 张寅根
Original assignee: Lifecord Inc
Current assignee: Jin Yingzhen
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-31
Publication date: 2007-02-21
Also published as: KR20050077746A; KR100677054B1

Abstract

因为根据本发明的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞能够分化为几种类型的细胞，包括神经元、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、肝细胞和树突细胞，所以它们可以有效地用于细胞疗法、细胞替代疗法、器官修复技术或器官生产。

Description

从脐带血分离和培养专能祖/干细胞的方法及诱导其分化的方法

技术领域

本发明涉及从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的方法以及诱导所述专能祖/干细胞分化产生多种类型细胞的方法。

背景技术

干细胞具有通过特异性分化诱导刺激分化为多种组织的细胞的多重分化潜能，以及在未分化阶段的自我更新能力。根据它们的分化潜能和产生时间，干细胞被分为胚胎干细胞(ES细胞)和成体干细胞。ES细胞分离自胚泡阶段胚胎的内细胞团(ICM)。ES细胞包括三种类型的胚层，即，内胚层、中胚层和外胚层，并且ES细胞是几乎能分化为生物体内发现的每种类型细胞的多潜能细胞。然而，在如何控制其分化潜能和伦理问题上仍然存在困难。

相比较而言，成体干细胞出现在胚胎发育期间的器官形成阶段或成体阶段。成体干细胞是器官特异性的和专能性的，即，它们通常限于产生构成特定器官的细胞。这些成体干细胞保留在大多数成体器官内并且对连续补充正常或病理发生的细胞丢失起关键作用。

代表性的成体干细胞包括存在于骨髓中的造血干细胞(HSC)和间充质干细胞(MSC)。HSC产生多种血细胞，例如红细胞、白细胞和凝血细胞；MSC产生中胚层组织的细胞，例如成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞。

由于已经有成功分离人类胚胎干细胞或成体干细胞的报道，干细胞的临床应用已经引起越来越多的兴趣。最值得注意的干细胞的潜在用途是作为细胞替代疗法的细胞供应源。难治性疾病，例如，神经退行性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病、由脊髓损伤导致的四肢麻痹、白血病、中风、青少年糖尿病、心肌梗塞、肝硬化和其它慢性病，是由构成某种器官的细胞破坏和永久性功能障碍引起的。从外部补充细胞丢失的细胞替代疗法已经被提出作为它们的有希望的治疗方法。

ES干细胞可以从骨髓中获得，并且已经报道，HSC、MSC和专能成体祖细胞(MAPC)在骨髓中存在。一些报道已经证明了来源于骨髓的MAPC可以分化为其它组织的细胞，例如神经细胞、内皮细胞和肝细胞以及分化为类似于MSC的成骨细胞、成软骨细胞和脂肪细胞(Reyes M，et al.，Blood 98：2615-2625，2001；Reyes M，et al.，J.Clin.Invest.109：337-346，2002)。然而，尽管使用骨髓来源干细胞的细胞替代疗法预期有显著效果，其临床应用存在很多限制。例如，从骨髓分离干细胞的传统方法具有需要几个复杂操作步骤的问题，这可能对供体产生精神和身体上的压力。进一步，很难找到与受体抗原表型一致的骨髓移植供体。

自从Friedenstein发现了骨髓中存在MSC(Friedenstein AJ，Int.Rev.Cytol.47：327-345，1976)，已经有许多对其分化潜能和用作细胞治疗剂的研究。尤其是，MSC治疗软骨病的临床使用已经在审批过程中，包含MSC用于治疗骨细胞相关疾病的治疗剂将要进入临床阶段。然而，由于其受限制的分化和增殖潜能，骨髓中MSC的可适用靶标有限，而且它们仍然不能脱离以前报道的在获得来源于骨髓的干细胞上的问题。进一步，来源于骨髓的MAPC在分化潜能方面显示了广泛的应用范围，但是除了由骨髓起源引起的局限性外，它们也在如何重复性分离和培养上存在问题。

同时，因为已经报道脐带血包含大量干细胞并且是HSC的来源，已经做了一些尝试，用脐带血移植临床治疗血液病。进一步，脐带血移植比骨髓移植引发的移植物-宿主排斥反应程度小很多，并且已经对其临床使用进行了广泛研究。

然而，分离和培养脐带血中MSC仍然存在问题(Erices A，et al.，Br.J.Haematol.109：235-242，2000；Lee OK，et al.，Blood 103：1669-1675，2004；Wexler SA，et al.，Br.J.Haematol.121：368-74，2003)。也没有报道从脐带血中分离和培养能分化为多种类型细胞的干细胞的可靠方法，所述多种类型的细胞例如神经元、成骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞等。

本发明人致力于开发用于获得专能祖/干细胞的方法，所述细胞能有效地用于细胞疗法、细胞替代疗法、器官修复技术或器官生产，并且已经建立了有效的方法，用于从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞，和将所述专能祖/干细胞分化为多种类型的细胞，例如神经元、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、肝细胞和树突细胞。

发明内容

因此，本发明的目的是提供，从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的方法，和诱导所述专能祖/干细胞分化为多种类型细胞的方法。

根据本发明的一个方面，提供从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的方法，其包括依次在下列培养基中培养来源于脐带血的单个核细胞：

1)第一动物细胞培养基，其包含胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，还有无机盐、维生素、氨基酸和/或补加元素；

2)第二动物细胞培养基，除了缺少GM-CSF其与第一动物细胞培养基相同；和

3)第三动物细胞培养基，除了用干细胞因子(SCF)和内皮细胞生长因子(EGF)代替了GM-CSF，其与第一动物细胞培养基相同。

根据本发明的另一个方面，提供将通过上述方法分离和培养的专能祖/干细胞分化为多种类型细胞的方法及其中使用的培养基组合物。

根据本发明的进一步的方面，提供用于细胞疗法的细胞组合物，其包含通过上述方法分离和培养的专能祖/干细胞作为有效成分。

附图说明

结合附图，从本发明的以下说明中本发明的上述和其他目的和特征将是显而易见的。附图分别为：

图1：从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞的光学显微照片；

A：×100， B：×200

图2：从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞的免疫表型谱；

图3：根据培养的时间过程比较专能祖/干细胞的免疫表型的结果；

图4：图表显示了根据培养的时间过程专能祖/干细胞的存活率；

图5：从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞的细胞周期谱；

图6：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的神经元的光学显微照片；

A：分化诱导前，

B：分化诱导后3天，

C：分化诱导后7天，

D：分化诱导后14天

图7：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的神经元的荧光染色(G到I)或免疫细胞化学染色(A到C)结果；

A：MAP-1B染色， B：NF-L染色，

C：NSE染色， D：核染色，

E：核染色， F：核染色，

G：MAP-1B染色， H：NF-L染色，

I：NSE染色， J：D和G重叠，

K：E和H重叠， L：F和I重叠，

M：使用IMR32(神经元母细胞瘤细胞系，阳性对照)染色MAP-1B，

N：使用IMR32(阳性对照)染色NF-L，

O：使用IMR32(阳性对照)染色NSE

图8：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的神经元的Western印迹结果；

C(0)：分化诱导前，

3：分化诱导后3天，

7：分化诱导后7天，

14：分化诱导后14天，

P：IMR32(阳性对照)

图9：通过免疫细胞化学染色和Western印迹法分析神经元的细胞类型的结果，所述神经元由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化形成；

A：未分化的(阳性对照)，

B：TH染色(多巴胺能神经元)，

C：AchE染色(胆碱能神经元)，

D：GAD染色(γ-氨基丁酸能神经元)，

E：Western印迹，

C(0)：分化诱导前，

I：分化诱导后14天

图10：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的神经胶质细胞的荧光染色(C和D)或免疫细胞化学染色(G和H)结果；

A：核染色， B：核染色，

C：GFAP染色， D：髓鞘/少突胶质细胞染色，

E：A和C重叠， F：B和D重叠，

G：GFAP染色， H：髓鞘/少突胶质细胞染色

图11：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的成骨细胞的显微镜观察(A)和碱性磷酸酶(ALP)染色(B)结果；

图12：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的成骨细胞的RT-PCR结果；

M：分子量标志物，

1：由来源于骨髓的间充质干细胞分化的成骨细胞(阳性对照)，

2：分化诱导前，

3：分化诱导后

图13：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的成肌细胞的RT-PCR结果；

M：分子量标志物，

1：分化诱导后1周，

2：分化诱导后2周，

3：分化诱导后3周，

4：分化诱导后4周，

5：分化诱导后5周

图14：由来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的成肌细胞的荧光免疫细胞化学染色结果；

A：成肌蛋白染色， B：核染色，

C：A和B重叠

图15：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的内皮细胞的免疫表型谱；

图16：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的内皮细胞的RT-PCR结果；

M：分子量标志物，

1：分化诱导前，

2：分化诱导后3天，

3：分化诱导后7天，

4：分化诱导后14天，

5：HUVEC(人脐静脉内皮细胞，阳性对照)

图17：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的内皮细胞的Western印迹结果；

7：分化诱导后7天，

14：分化诱导后14天

HUVEC：阳性对照

图18：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的内皮细胞的荧光免疫细胞化学染色结果；

A：vWF染色， B：核染色，

C：A和B重叠， D：UEA-1染色，

E：Ac-LDL吸收， F：D和E重叠

图19：检查内皮细胞的管形成活性的结果，所述内皮细胞从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化形成；

A：分化诱导前，

C：用HUVEC形成管(阳性对照)

图20：检查内皮细胞的VEGF(血管内皮生长因子)分泌活性的结果，所述内皮细胞从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化形成；

图21：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的肝细胞的RT-PCR结果；

M：分子量标志物，

1：HepG2(肝癌细胞系)，

2：未分化的专能祖/干细胞，

3：由专能祖/干细胞分化的肝细胞，

4：阴性对照

图22：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的肝细胞的免疫细胞化学染色结果；

A：未分化的专能祖/干细胞中的CK-8，

B：由专能祖/干细胞分化的肝细胞中的CK-8，

C：未分化的专能祖/干细胞中的白蛋白，

D：由专能祖/干细胞分化的肝细胞中的白蛋白

图23：检查未成熟的树突细胞的葡聚糖-FITC吸收速率的结果，所述树突细胞从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化形成；

图24：从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的成熟树突细胞的免疫表型分析结果；和

图25：检查成熟的树突细胞诱导T淋巴细胞增殖的作用的结果，所述树突细胞从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化形成。

具体实施方式

在此使用的术语“动物细胞培养基”指的是，包含无机盐、氨基酸、维生素和/或补加元素的培养基，其常规用于培养动物细胞。用于动物细胞培养的代表性的商品培养基包括，但不限于，DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、MEM(Minimum Essential Medium)、IMDM(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、α-MEM、RPMI 1640等。

在此使用的术语“高葡萄糖培养基”指的是，进一步包含3,500-5,500mg/ml范围的D-葡萄糖和50-200mg/ml范围的丙酮酸钠的动物细胞培养基。代表性的商品高葡萄糖培养基包括，但不限于，HG(high glucose)-DMEM、IMDM等。

在此使用的术语“第一动物细胞培养基”指的是，用在从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的初始阶段的动物细胞培养基，其只诱导脐带血中几种类型干细胞中的专能祖/干细胞形成多层细胞集落。优选地，第一动物细胞培养基是进一步包含胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的高葡萄糖培养基。

在此使用的术语“第二动物细胞培养基”指的是，用于将在上述第一培养基中形成的多层细胞集落变形为单层细胞集落的动物细胞培养基。除了缺少GM-CSF以外，第二动物细胞培养基与第一动物细胞培养基相同。第二动物细胞培养基优选地是包含另外的FBS和L-谷氨酰胺的高葡萄糖培养基。

在此使用的术语“第三动物细胞培养基”指的是，用于诱导在第二动物细胞培养基中培养的形成单层细胞集落的细胞增殖的动物细胞培养基。除了用干细胞因子(SCF)和内皮细胞生长因子(EGF)代替GM-CSF以外，第三动物细胞培养基与第一动物细胞培养基相同。第三动物细胞培养基优选地是包含另外的FBS、L-谷氨酰胺、SCF和EGF的高葡萄糖培养基。

本发明提供了使用一系列动物细胞培养基从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的方法。

为了从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞，优选的依次在下列动物细胞培养基中培养来源于脐带血的单个核细胞：

1)第一动物细胞培养基，其是进一步包含FBS、L-谷氨酰胺和GM-CSF的动物细胞培养基；

2)第二动物细胞培养基，除了缺少GM-CSF，其与第一动物细胞培养基相同；和

3)第三动物细胞培养基，除了用SCF和EGF代替了GM-CSF，其与第一动物细胞培养基相同。

脐带血是回收自脐带的静脉的血液，脐带在哺乳动物包括人类中连接胎儿和胎盘，并在娩出婴儿后胎盘与子宫分离之前收集。本发明中优选使用从人脐带血分离的脐带血。

为了从脐带血分离单个核细胞，可以使用本领域公知的方法例如Ficoll-Hypaque密度梯度法。

简而言之，如此分离的脐带血通过与磷酸盐缓冲液(PBS)混合来稀释，稀释的脐带血覆盖在等体积的Ficoll-Hypaque溶液(密度：1.077g/ml)上。此时，Ficoll-Hypaque溶液在使用前在室温下预温，并优选地，稀释的脐带血体积保持在低于Ficoll-Hypaque溶液的3倍水平。得到的混合物经过离心分离红细胞层、单个核细胞层和血清层。用巴斯德移液管只将单个核细胞层转移到新管中并用PBS洗涤以去除污染，如Ficoll-Hypaque溶液和血小板。

如此分离的单个核细胞可以直接应用于分离和培养专能祖/干细胞或储存在深度冷冻器中直到使用。

为了从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞，在由第一、第二和第三培养基按顺序组成的一系列动物细胞培养基中培养单个核细胞。用于本发明的动物细胞培养基是本领域使用的常规动物细胞培养基，根据培养的具体目的其可以进一步包含另外的成分和/或抗体。代表性的商品动物细胞培养基包括，但不限于，RPMI1640、MEM、α-MEM、IMDM或DMEM，优选DMEM。优选地，所述动物细胞培养基是进一步包含3,500-5,500mg/ml范围D-葡萄糖和50-200mg/ml范围丙酮酸钠的高葡萄糖培养基，并可以根据培养的具体目的包含另外的成分和/或抗体。在本发明的优选实施方案中，包含另外的4,500mg/ml D-葡萄糖和110mg/ml丙酮酸钠的HG-DMEM(Gibco Cat.No.12800-017)作为高葡萄糖培养基使用。

首先，新鲜的单个核细胞，从脐带血新鲜分离的或解冻的单个核细胞，以1×10⁵-1×10⁶细胞/cm²浓度接种到第一动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-2周。优选地，用新鲜的培养基每隔5-10天更换培养基。此时，第一动物细胞培养基是进一步包含10-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺和10-100ng/ml GM-CSF的高葡萄糖培养基。在第一动物细胞培养基中培养是从脐带血中多种干细胞混合物中只分离专能祖/干细胞的步骤，并且它诱导专能祖/干细胞形成多层细胞集落，附着在培养瓶的底部生长。第一动物细胞培养基中的GM-CSF起诱导专能祖/干细胞生长成多层细胞集落集落的作用。

当形成多层细胞集落时，用第二动物细胞培养基代替第一动物细胞培养基，除了缺少GM-CSF以外，第二动物细胞培养基与第一动物细胞培养基相同。也就是说，第二动物细胞培养基是进一步包含10-20％FBS和1-2mM L-谷氨酰胺的高葡萄糖培养基。在第二动物细胞培养基中的培养通过在37℃和5％CO₂的环境下保温1-2周进行。此时，用新鲜培养基每隔5-10天更换培养基。这个步骤用于去除未附着的细胞并诱导由圆形细胞组成的多层细胞集落变形为显示成纤维细胞样形态的单层细胞集落。

第二次培养之后，当形成单层细胞集落的细胞生长到80-90％附着时，除去培养基，用PBS洗涤细胞并用胰酶/EDTA处理，以回收细胞。细胞以2×10⁴-8×10⁴细胞/cm²浓度接种到第三动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-2周，以诱导细胞生长和增殖为专能祖/干细胞。优选地，用新鲜培养基每隔3-5天更换培养基。在第三动物细胞培养基中的培养维持第二动物细胞培养基中培养的细胞的未分化状态，并诱导其增殖。此时，除了用SCF和EGF代替了GM-CSF以外，第三动物细胞培养基与第一动物细胞培养基相同。优选地，第三动物细胞培养基是进一步包含10-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、10-100mg/ml SCF和5-50mg/ml EGF的高葡萄糖培养基。SCF和EGF诱导干细胞的增殖，尤其SCF在维持专能祖/干细胞中起作用。

如此从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞显示成纤维细胞样细胞的形态特征，具有纺锤形细胞体(见图1)。根据流式细胞仪的免疫表型分析，所述专能祖/干细胞显示对造血抗原如CD14、CD31和CD45的抗体的阳性反应；对干细胞抗原如CD34和CD133的抗体的阴性反应；对细胞粘附相关抗原如CD54和CD166的抗体的阳性和部分阳性反应；对MSC抗原如CD73(SH3、SH4)和CD105(SH2)的抗体的阴性和部分阴性反应；对整合素蛋白抗原如CD49a和CD104的抗体的阴性和部分阳性反应；对CD44抗体的阳性反应；对CD62E和CD90(Thy-1)抗体的阴性反应(见图2)。进一步，在间隔4周的12周监控时间内，它们的免疫表型谱几乎没有发生改变(见图3)。这些结果提示，根据本发明的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞，属于造血细胞家族，但是不同于以前报道的造血干细胞或间充质干细胞。

培养的专能祖/干细胞显示约5-7天的倍增时间并连续增殖超过12周，产生大量细胞(见图4)。进一步，专能祖/干细胞的细胞周期分析显示，全部细胞的约20％活跃分裂并参与细胞增殖(见图5)。这些结果提示，根据本发明的专能祖/干细胞可以连续增殖而不丧失作为祖/干细胞的独特特征，即使长时间培养以产生大量相同细胞也是如此。

进一步，本发明提供诱导专能祖/干细胞分化为多种类型细胞的方法以及其中使用的培养基组合物。

根据本发明的方法，通过在具有特定组成的动物细胞培养基中并根据待分化成的目标细胞在特异性条件下培养，可以诱导专能祖/干细胞分化为多种类型细胞，包括神经元、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、肝细胞和树突细胞。

为了诱导专能祖/干细胞分化为神经元，优选的在进一步包含FBS、L-谷氨酰胺、视黄酸、folskolin、神经生长因子(NGF)、补充元素混合物和β-巯基乙醇的动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞。所述动物细胞培养基可以进一步包含至少一种抗生素，所述抗生素选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B。在此使用的补充元素混合物表示本领域中常规用于动物细胞培养基的成分的混合物，其包含10-500μg/ml胰岛素、1-20mg/ml转铁蛋白、0.1-2μg/ml孕酮、1-5mg/ml putrascine和/或0.1-5μg/ml的亚硒酸盐。代表性的商品补充元素混合物包括，但不限于，N2Suppliment、B27 Supplement等。

在本发明的一个优选实施方案中，用于诱导专能祖/干细胞分化为神经元的动物细胞培养基是补加0.1-2％ FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、1-25μM视黄酸、1-20μMfolskolin、10-100ng/ml NGF、1×N2 Supplement(500μg/ml胰岛素、10mg/ml转铁蛋白、0.63μg/ml孕酮、1.6mg/ml putrascine和/或0.52μg/ml亚硒酸盐)和1.0×10^-6-1.0×10^-5％β-巯基乙醇的HG-DMEM。将专能祖/干细胞以2×10⁴-8×10⁴细胞/cm²浓度接种到培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-2周。

如此分化的细胞显示神经元的典型特性，具有良好铺展的树突(见图6)。荧光染色或免疫细胞化学染色、Western印迹和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析显示，分化的细胞表现出神经元特异性标志物的阳性信号，例如神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经纤丝-L(NFL)和微管相关蛋白1B(MAP-1B)(见图7和8)。使用功能性神经元的特异性标志物检查分化细胞的细胞类型的分析揭示，分化的细胞显示抗酪氨酸羟化酶(TH)、乙酰胆碱酯酶(AchE)和谷氨酸脱羧酶(GAD)的阳性反应(见图9)，这提示了所述专能祖/干细胞可分化为多巴胺能神经元、胆碱能神经元和γ-氨基丁酸能神经元。由此已经证实了，根据本发明的方法，专能祖/干细胞成功地分化为神经元。进一步，在分化细胞的荧光染色或免疫细胞化学染色中检测到神经胶质细胞特异性标志物例如胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达(见图10)，这提示了根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为神经胶质细胞。

进一步，为了诱导专能祖/干细胞分化为成骨细胞，优选的在另外包含FBS、地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸和β-甘油磷酸酯的动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞。所述动物细胞培养基可以进一步包含至少一种选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B的抗生素。

优选地，诱导分化为成骨细胞的动物细胞培养基是补加5-20％FBS、0.1-1μM地塞米松、10-100μM抗坏血酸-2-磷酸和5-20mM β-甘油磷酸酯的HG-DMEM。专能祖/干细胞以5×10⁴-2×10⁵细胞/cm²浓度接种到分化诱导培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-3周，在此期间每隔3-4天更换新鲜培养基。

碱性磷酸化酶(ALP)染色和RT-PCR显示，根据本发明在分化的细胞中ALP被强染色并且检测到成骨细胞特异性标志物例如ALP和I型前胶原基因的表达(见图11和12)，这证明了根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为成骨细胞。

进一步，为了诱导专能祖/干细胞分化为成肌细胞，优选地在另外包含牛血清白蛋白(BSA)和5-氮胞苷的动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞。所述动物细胞培养基可以进一步包含至少一种选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B的抗生素。

优选地，诱导分化为成肌细胞的动物细胞培养基是补加5-10％BSA和10-20μM5-氮胞苷的HG-DMEM。专能祖/干细胞以1×10⁵-5×10⁵细胞/孔的浓度接种到分化诱导培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养5-6周，在此期间每隔3-4天更换新鲜培养基。

RT-PCR和荧光免疫细胞化学染色显示，在分化的细胞中检测到成肌细胞转录标志物例如MyoD、成肌蛋白、肌球蛋白重链基因的表达(见图13和14)，这证明了根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为成肌细胞。

进一步，为了诱导专能祖/干细胞分化为内皮祖细胞(EPCs)，优选地在另外包含FBS和血管内皮生长因子(VEGF)的动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞。所述动物细胞培养基可以进一步包含至少一种选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B的抗生素。

优选地，诱导分化为内皮细胞的动物细胞培养基是补加0.1-2％FBS和10-100ng/ml VEGF的HG-DMEM。专能祖/干细胞以1×10⁵-4×10⁵细胞/cm²浓度接种到分化诱导培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-3周，在此期间每隔3-4天更换新鲜培养基。

根据免疫表型分析，分化的细胞显示，抗EPC相关抗原例如CD14、CD31、CD45和CD105的阳性反应(见图15)。进一步，分化的细胞表达EPC特异性标志物例如VEGF受体-1(Flt-1/VEGFR-1)、VEGF受体-2(KDR/VEGFR-2)、血管内皮细胞钙粘蛋白(VE-钙粘蛋白)、内皮细胞一氧化氮合酶(ecNOS)和von Willebrand因子(vWF)以及ecNOS蛋白(见图16和17)。进一步，在荧光免疫细胞化学染色和ac-LDL吸收分析中已经观察到，大多数分化的细胞能够在摄入ac-LDL的同时表达vWF和UEA-1蛋白。也已经发现，分化的细胞显示内皮细胞的独特特性例如形成管和分泌细胞因子(见图18-20)。由此，这些结果证明了，根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为内皮祖细胞。

进一步，为了诱导专能祖/干细胞分化为肝细胞，优选地在另外包含肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M和L-谷氨酰胺的动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞。所述动物细胞培养基可以进一步包含至少一种选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B的抗生素。

优选地，诱导分化为肝细胞的动物细胞培养基是补加10-100ng/ml HGF、5-50ng/ml制瘤素M和1-2mM L-谷氨酰胺的HG-DMEM。专能祖/干细胞以5×10⁴-2×10⁵细胞/cm²浓度被接种到分化诱导培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-4周，在此期间每隔3-7天更换新鲜培养基。

分化的细胞表达肝细胞特异性标志物例如肝细胞核因子-1α(HNF-1α)、细胞角蛋白-8(CK-8)和白蛋白以及CK-8和白蛋白蛋白质(见图21和22)，这提示了根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为肝细胞。

进一步，为了诱导专能祖/干细胞分化为树突细胞，优选地依次在两种动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，一种用于诱导未成熟分化，另一种用于诱导成熟分化。用于诱导未成熟分化的动物细胞培养基是另外包含FBS、L-谷氨酰胺、GM-CSF和白细胞介素-4(IL-4)的高葡萄糖培养基，优选地是补加1-2％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、10-1,000ng/ml GM-CSF和10-100ng/ml IL-4的HG-DMEM。进一步，除了用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6和前列腺素E2替换GM-CSF和IL-4以外，诱导成熟分化的动物细胞培养基与前者相同，优选地是补加1-2％FBS、1-2mML-谷氨酰胺、1-100ng/ml TNF-α、1-100ng/ml IL-1β、100-10,000U/ml IL-6和0.1-10μg/ml前列腺素E2的HG-DMEM。所述未成熟和成熟分化的动物细胞培养基可以进一步包含至少一种选自青霉素、链霉素、卡那霉素、氨苄青霉素和两性霉素B的抗生素。

将诱导未成熟分化的动物细胞培养基分配到6孔培养板的每个孔之后，将专能祖/干细胞以1×10⁵-1×10⁷细胞/孔的浓度接种到孔中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-4周，在此期间每隔2-3天更换新鲜培养基。将如此培养的细胞转移到诱导成熟分化的动物培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-7天。

分化的细胞表现出葡聚糖-FITC摄入活性，这是未成熟树突细胞的独特特性(见图23)，也表现出这样的免疫表型谱：抗以下抗原的抗体的阳性反应：树突细胞抗原CD1a，同时刺激抗原如CD40、CD80和CD86，成熟树突细胞抗原CD83，粘附相关抗原CD11c和2型主要组织相容性复合物HLA-DR；和抗T细胞抗原CD8的抗体的阴性反应(见图24)。进一步，分化的细胞在混合的淋巴细胞反应(MLR)中能诱导与抗T淋巴细胞的刺激剂量成比例的增殖反应(见图25)，这证明根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为树突细胞。

进一步，本发明提供了用于细胞治疗的细胞组合物，其包含根据本发明的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞作为有效成分。

由于本发明的专能祖/干细胞能够分化为几种类型的细胞，包括神经元、成骨细胞、成肌细胞、内皮细胞、肝细胞和树突细胞，它们可以有效地用于细胞治疗、细胞替代治疗、器官修复技术或器官生产。

具体而言，包含本发明的专能祖/干细胞作为有效成分的细胞组合物能够用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病、由脊髓损伤导致的四肢麻痹、白血病、中风、脑瘤(cncephalophyma)、青少年糖尿病、心肌梗塞、肝硬化、肌肉病、心肌病、肝病、血液病、成骨细胞和软骨细胞的破坏和永久性功能障碍。

本发明的细胞组合物亚可以根据任何一种常规方法在药学上配制。在准备该制剂时，优选地使用载体、赋形剂或稀释剂混合或稀释有效成分。合适的载体、赋形剂或稀释剂的实例是乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇、淀粉、阿拉伯树胶、海藻酸、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。所述制剂可以另外地包含填充剂、抗凝聚剂、润滑剂、润湿剂、香味剂、乳化剂、防腐剂等。通过使用本领域任何一种公知的方法配制本发明的组合物以在给予患者后提供快速、持续或延迟释放有效成分。

本发明细胞组合物的施用可以通过注射(例如肌肉、静脉、腹腔、皮下)，或通过其它方法例如输液，以确保其以有效形式进入血流。所述细胞组合物也可以通过肿瘤内、肿瘤周围、损伤内或损伤周围的途径施用，以发挥局部和系统性治疗效果。优选局部或静脉注射。

专能祖/干细胞作为有效成分的的典型日剂量范围可以是约5×10⁵-2×10⁷细胞/kg体重，优选1×10⁶-1×10⁷细胞/kg体重，并且可以单一剂量或多个剂量施用。然而，应该了解，有效成分的实际施用量可以根据多种相关因素确定，包括待治疗疾病；选择的给药途径；个体患者的年龄、性别和体重；和患者症状的严重性。因此，上述剂量无论如何不意味着限制本发明的范围。

下列实施例用于进一步举例说明本发明但不限制其范围。

实施例1：从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞

<1-1>制备来源于脐带血的单个核细胞

在分娩之后胎盘从子宫分离之前，使用含23ml抗凝血剂CPDA-1的脐带血取样袋(容量：175ml)或含5ml肝素的50ml注射器，从脐带静脉取出60-150ml脐带血。所有用于脐带血取样的器械在使用前经过无菌处理，并且用酒精或betadin灭菌取样部位。

为了从脐带血分离单个核细胞，在取样后24小时之内将15ml脐带血样品分配到50ml锥形管中。向管中加入15ml磷酸盐缓冲液(Dulbecco’s PBS；Hyclone，SH300028.03)并与脐带血混合。轻轻地将15ml Ficoll-Hypaque溶液(Sigma，H8887，密度：1.077g/ml)覆盖到锥形管底部，管子在2,000rpm、室温下离心30分钟，使之分级成，底部的红细胞层，顶部的血清层和中间的单个核细胞层。使用巴斯德吸管从中分离单个核细胞层并转移到新管。向管中加入20ml PBS并与单个核细胞层混合。管子在2,000rpm、室温下离心10分钟洗涤。将上清液移出试管后，将单个核细胞沉淀物悬浮在40ml PBS中，测量悬液中单个核细胞存活率和数量，随后将悬液在2,000rpm、室温下离心10分钟。

如此得到的单个核细胞沉淀立即悬浮在基础培养基中并用于分离和培养专能祖/干细胞，或保存在深度冷冻器中。

对于低温保存，将单个核细胞沉淀悬浮在含10％DMSO(二甲基亚砜)的供体自己的血清中并以4×10⁷-6×10⁷细胞/ml的浓度分装到1.8ml的冻存管中。密封不含杂质的冻存管后，将管子在-100℃冷冻在程控冰箱中并保存在充满液氮的低温冷冻罐中。

当使用冷冻的单个核细胞时，装有单个核细胞的冻存管在37℃水浴中迅速解冻。将解冻的单个核细胞转移到锥形管并用10倍体积量的含10％BSA的基础培养基处理。管子在2,000rpm、室温下离心10分钟除去上清液，如此得到的细胞沉淀用于随后的专能祖/干细胞的分离和培养程序中。

<1-2>从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞

向T25细胞培养瓶中加入6ml第一动物细胞培养基，在实施例<1-1>中制备的来源于脐带血的单个核细胞以1×10⁵-1×10⁶细胞/cm²的浓度被接种到培养基中。此时，第一动物细胞培养基是补加10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100ng/ml GM-CSF和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM(Gibco，Cat.No.12800-017，下同)。培养瓶在37℃和5％CO₂的环境下培养2周。每天监测细胞是否形成粘附生长在培养瓶底部的多层细胞集落。当观察到形成多层细胞集落时，用在第一动物细胞培养基中缺少GM-CSF的第二动物细胞培养基替换第一动物细胞培养基，细胞进一步培养2周，其中第二动物细胞培养基是补加10％FBS、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。通过在第二动物培养基中的这种培养，除去未贴壁的细胞，同时多层细胞集落变形为显示成纤维细胞样细胞形态的单层细胞集落。一旦形成单层细胞集落的细胞生长到80-90％粘附，弃掉第二动物细胞培养基，用PBS洗涤细胞，然后用0.25％胰酶/EDTA处理。为了保持细胞的未分化状态并诱导其增殖，如此得到的细胞以2×10⁴-8×10⁴细胞/cm²的浓度接种到含第三动物细胞培养基的新T25培养烧瓶中，并在37℃和5％CO₂的环境下培养1周，其中第三动物细胞培养基是补加10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10ng/ml SCF、10ng/ml EGF和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。

使用光学显微镜观察根据上述方法培养的细胞，显示了培养细胞具有成纤维细胞样细胞的独特特征，即纺锤形细胞体(图1)。

实施例2：表征分离和培养自来源于脐带血的单个核细胞专能祖/干细胞

为了对实施例1中从来源于脐带血的单个核细胞制备的专能祖/干细胞进行免疫表型分析，将培养细胞用0.05％胰酶溶液处理使得细胞从培养瓶脱离，并用PBS洗涤两次分离细胞。细胞以5×10⁵细胞/200μl的浓度悬于PBS中，向其中加入10μl各种抗体，培养瓶放置在暗室中15分钟。随后为了流式细胞分析(Becton Dickinson)将细胞用PBS洗涤两次，与500μl同样的PBS混合，并用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)进行免疫表型分析。此时，使用偶联PE或FITC的CD14、CD31、CD34、CD44、CD45、CD49a、CD54、CD62E、CD73、CD90、CD104(上面提到的，BD Sciences)，CD105(Ancell Co.)、CD133(Miltenyi Biotec)和CD166(AncellCo.)抗体用于FACS。

根据本发明的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞实际上显示了这样的免疫表型谱：抗CD14、CD31、CD44、CD45和CD54抗原的抗体的阳性反应；抗CD34、CD49a、CD62E、CD73、CD90和CD133抗原的抗体的阴性反应；和抗CD104、CD105和CD166抗原的抗体的部分阳性反应(图2)。

进一步，为了监测免疫表型谱根据培养专能祖/干细胞的时间过程的变化，将细胞培养12周并根据上述相同方法在培养期间每隔4周进行免疫表型分析。结果显示，抗原例如CD105的表达稍微下降，但是在培养期间它们显示了恒定的免疫表型谱(图3a和3b)。

为了分析实施例1中制备的专能祖/干细胞的增殖速率和细胞周期，用0.05％胰酶溶液处理使得细胞从培养瓶脱离，脱离的细胞用PBS洗涤两次，随后根据台盼蓝排斥方法进行细胞计数。随后，用70％乙醇在4℃处理1小时固定细胞。固定的细胞用CycleTEST PLUS DNA(BD Science)试剂处理以便用125μg/ml碘化丙锭标记细胞，并用流式细胞仪(FACScan，Becton Dickinson)测量它们的DNA含量以确定细胞周期。

已经发现，根据本发明的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞连续增殖长达12周，这导致了细胞量比初始量增加了约25-30倍，并且全部细胞的约20％(S期+G2/M期)活跃分裂(图4和5)。

实施例3：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为神经元

<3-1>诱导分化为神经元

为了确认实施例1中得到的专能祖/干细胞是否能够分化为多种类型的细胞，如下对它们进行诱导分化为神经元的处理。专能祖/干细胞以4×10⁴细胞/cm²的浓度被接种到诱导分化为神经元的动物细胞培养基中，并培养1-2周，其中分化诱导培养基是补加1％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10μM视黄酸、10μM folskolin、100ng/ml NGF、1×N2 supplement(Gibco BRL)、0.00001％β-巯基乙醇和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。

<3-2>确认分化为神经元

用光学显微镜观察根据实施例<3-1>的方法脐带血来源的专能祖/干细胞是否分化为神经元，结果发现，分化细胞显示具有树突的神经元的典型形态特征，这证明了随着根据本发明的分化诱导时间过程专能祖/干细胞成功地分化为神经元。

进一步，为了检查分化的细胞是否表达神经元特异性标志物，对细胞进行荧光或免疫细胞化学染色和Western印迹分析。对于免疫细胞化学染色，生长在载玻片上的分化细胞用4％多聚甲醛(pH7.4)固定10分钟并用PBS洗涤三次(每次洗涤5分钟)。洗涤之后，将约30-50μl封闭溶液滴到细胞的染色表面，载玻片保持在37℃约1小时以便封闭非特异性反应。细胞与第一抗体在37℃反应约1-2小时并用PBS洗涤三次(每次洗涤约5分钟)。洗涤之后，细胞与第二抗体在37℃反应约1-2小时并用PBS洗涤三次(每次洗涤约5分钟)。抗体反应完成之后，细胞随后经浓度梯度方式(低→高)的乙醇处理以诱导细胞内脱水，用二甲苯染色，使用poly-mount溶液进行封固，随后用光学显微镜(？)观察。对于荧光免疫细胞化学染色，在抗体反应完成后使用90％甘油进行封固，用荧光显微镜观察。

对于Western印迹，从培养瓶中除去培养基之后，洗涤细胞，与约30μl RIPA缓冲液混合，并用刮子破碎细胞。破碎的细胞在4℃、13,000rpm下离心约10分钟，分离上清液。对上清液进行蛋白质定量并用于Western印迹。约30-80μg/孔的蛋白质用微型凝胶电泳仪在凝胶上进行电泳，将凝胶上分离的蛋白质转移到PVDF膜(Amersham Bioscience)上以获得印迹。将印迹膜浸在含5％BSA的Tris盐缓冲液(TBS)中1小时以便封闭非特异性反应并用TBS洗涤。洗涤之后，用第一抗体在4℃处理印迹膜约12小时并用TBS洗涤三次(每次洗涤约10分钟)。印迹与第二抗体在室温反应约1小时并用TBS洗涤三次约10分钟。抗体反应完成之后，将印迹膜浸在ECL溶液中以诱导显色反应，在暗室中暴露以使X光片敏化来检查蛋白质表达。

对于荧光或免疫细胞化学染色和Western印迹，使用抗-NSE(Santa CruzBiotechnology)、MAP-1B(Santa Cruz Biotechnology)、NF-L(Santa CruzBiotechnology)、TH(Santa Cruz Biotechnology)、AchE(Chemicon International)、GAD(Santa Cruz Biotechnology)、GFAP(Santa Cruz Biotechnology)、或MBP(Chemicon International)抗体作为第一抗体，使用偶联过氧化物酶的抗山羊、抗小鼠或抗兔抗体(Santa Cruz Biotechnology)作为第二抗体。

发现从来源于脐带血的单个核细胞的专能祖/干细胞分化的细胞强烈地表达神经元特异性标志物例如MAP-1B、NF-L和NSE(图7和8)，这提示了根据本发明的方法成功地诱导专能祖/干细胞分化为神经元。而且，专能祖/干细胞分化为几种类型的神经元，包括显示TH阳性反应的多巴胺能神经元、显示AchE阳性反应的胆碱能神经元和显示GAD阳性反应的γ-氨基丁酸能神经元(图9)。分化的细胞显示对星形细胞标志物GFAP和少突胶质细胞标志物MBP的阳性反应(图10)，这证明了根据本发明的方法在诱导神经元分化的条件下专能祖/干细胞能够分化为神经胶质细胞。

实施例4：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为成骨细胞

<4-1>诱导分化为成骨细胞

用0.05％胰酶溶液处理实施例1中制备的专能祖/干细胞，使得细胞从培养瓶脱离，将脱离的细胞悬在用于诱导分化为成骨细胞的动物细胞培养基中，其中所述动物细胞培养基是补加10％BSA(Gibco)、0.1μM地塞米松、100μM抗坏血酸-2-磷酸、10mM β-磷酸甘油和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。将细胞悬液以4×10⁵细胞/孔的浓度分配到6孔培养板上之后一周，向孔内加入所述动物细胞培养基，板子在37℃和5％CO₂环境下培养2周。每隔3-4天更换新鲜培养基。

<4-2>确认分化为成骨细胞

为了确认专能祖/干细胞分化为成骨细胞，如下将分化细胞用选择性地染色成骨细胞的碱性磷酸化酶(ALP)染料染色。首先，从培养板除去培养基并用ALP缓冲液洗涤细胞。向每个孔加入1ml ALP染料(1mg/ml萘酚AS-TR磷酸盐和2mg/mlFast red violet LB以10∶1比率的混合物)，培养板在37℃和5％CO₂的环境下保持30分钟。染色完成以后，从培养板除去ALP染料并用PBS洗涤培养板三次。向每个孔加入1ml 100％的冷酒精，培养板在冷室保持30分钟以固定细胞。从中除去酒精之后用蒸馏水洗涤培养板两次，在空气中干燥培养板并用荧光显微镜观察。发现ALP只染色来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的细胞(图11)，这提示了根据本发明的方法成功地诱导了专能祖/干细胞分化为成骨细胞。

也通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检查了专能祖/干细胞是否可以分化为成骨细胞。诱导分化为成骨细胞之后，用1ml Trizol(Invitrogen Inc.)处理1×10⁶-1×10⁷细胞5分钟以诱导细胞裂解，随后用200μl氯仿处理。得到的混合物在15,000rpm下离心15分钟以得到含RNA的上清液。将上清液转移到新管中并向其中加入每1mlTrizol 500μl异丙醇来沉淀RNA。如此得到的RNA沉淀用75％冷乙醇洗涤，在空气中干燥，溶解在含适当浓度DEPC的三蒸水中，并用作RT-PCR的模板。

如此得到的RNA在65℃保持5分钟以除去二级结构。混合5μl 6×RT-PCR缓冲液、2μl 2.5mM dNTP、1μl寡聚d(T)引物(500ng/μl)、0.5μl RNA酶抑制剂、2μg模板RNA和1μl逆转录酶(200U/μl；Promega)，并用含DEPC的三蒸水调节最终体积为30μl，从而制备RT-PCR反应混合物。在42℃下90分钟的初始反应以合成用作随后PCR模板的cDNA之后，在94℃处理5分钟以灭活反向转录酶，在此条件下进行RT-PCR。

使用下列寡核苷酸引物进行PCR，引物设计成具有与成骨细胞特异性基因互补的序列：对ALP基因特异性的SEQ ID No：1和2引物对；对I型前胶原基因特异性的SEQ ID No：3和4引物对。通过混合1μl每种引物(10pmol)、2μl 2.5mM dNTP混合物、2.5μl 10×Taq DNA聚合酶缓冲液(含氯化钠)、2μl模板cDNA和0.1μl TaqDNA聚合酶(5U/ml，Bioquest)，并用三蒸水调节最终体积为25μl，来制备PCR反应混合物。PCR反应条件是，使用DNA热循环仪(Perkin-Elmer)，初始变性(94℃保持4分钟)以后35个循环的94℃保持60秒、每个引物对在退火温度保持60秒、和72℃保持60秒。其中，引物退火温度对ALP是46℃，对I型前胶原是49℃。

发现成骨细胞特异性标志物如ALP和I型前胶原在根据本发明从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的细胞内表达(图12)。

实施例5：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为成肌细胞

<5-1>诱导分化为成肌细胞

用0.05％胰酶溶液处理实施例1中制备的专能祖/干细胞，使得细胞从培养瓶脱离，将脱离的细胞悬于用于诱导分化为成肌细胞的动物细胞培养基中，其中所述动物细胞培养基是补加10％BSA(Gibco)、10μM 5-氮胞苷和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。将细胞以5×10⁵细胞/孔的浓度分配到6孔培养板中之后一周，向孔内加入所述培养基，并将培养板在37℃和5％CO₂的环境下培养6周。每隔3-4天更换新鲜培养基。

<5-2>确认分化为成肌细胞

根据与实施例4中相同方法通过RT-PCR检查专能祖/干细胞向成肌细胞的分化。使用下列寡核苷酸引物进行PCR，所述引物设计成具有与成肌细胞特异性基因互补的序列：对myoD基因特异性的SEQ ID No：5和6引物对；对成肌蛋白基因特异性的SEQ ID No：7和8引物对；和对肌球蛋白重链基因特异性的SEQ ID No：9和10引物对。引物退火温度对myoD是48℃，对成肌蛋白是48℃，对肌球蛋白重链是56℃。

发现成肌细胞转录因子如myoD和成肌蛋白，和肌球蛋白功能调节因子如肌球蛋白重链基因在根据本发明从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的细胞内表达(图13)。

进一步，根据与实施例3中相同方法的荧光免疫细胞化学染色的结果显示，myoD和成肌蛋白染色由专能祖/干细胞分化的细胞(图14)，这提示根据本发明的方法专能祖/干细胞成功地分化为成肌细胞。

实施例6：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为内皮细胞

<6-1>诱导分化为内皮细胞

从实施例1中培养的专能祖/干细胞中只取出漂浮细胞，将细胞悬于用于诱导分化为内皮细胞的动物细胞培养基中，所述动物细胞培养基是补加1％FBS、10ng/mlVEGF和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。将细胞悬液以4×10⁵细胞/孔的浓度分配到6孔培养板中，将培养板在37℃和5％CO₂的环境下培养2周。每隔3-4天更换新鲜培养基。

<6-2>确认分化为内皮细胞

在实施例<6-1>中培养的细胞的免疫表型分析，根据与实施例2中相同的方法通过流式细胞仪进行。如图15所示，细胞表现出这样的免疫表型谱：对CD31、CD34、CD105、CD14和CD45抗原的抗体的阳性反应和对CD133抗原的抗体的阴性反应。

进一步，根据与实施例4中相同的方法进行RT-PCR以便检查向内皮细胞的分化。使用下列寡核苷酸引物进行PCR，所述引物设计成具有与内皮细胞特异性基因互补的序列：对Flt-1/VEFGR-1基因特异性的SEQ ID No：11和12引物对；对KDR(激酶插入结构域受体)/VEGFR-2基因特异性的SEQ ID No：13和14引物对；对ecNOS基因特异性的SEQ ID No：15和16引物对；对VE-钙粘蛋白基因特异性的SEQ ID No：17和18引物对；对vWF基因特异性的SEQ ID No：19和20引物对；和对β-肌动蛋白基因特异性的SEQ ID No：21和22引物对。上述所有基因的引物退火温度是56℃。

结果是，内皮细胞特异性标志物如Flt-1/VEFGR-1、KDR/VEGFR-2、ecNOS、VE-钙粘蛋白和vWF基因，在根据本发明从来源于脐带血的专能祖/干细胞分化的细胞中检测到(图16)。

为了确认专能祖/干细胞分化为内皮细胞，根据与实施例3中相同的方法通过Western印迹分析ecNOS的表达，结果显示，ecNOS在专能祖/干细胞分化的细胞中表达(图17)。

进一步，根据与实施例3中相同的方法通过荧光免疫细胞化学染色来分析vWF和UEA-1蛋白在分化细胞中的表达，并如下检查它们的ac-LDL吸收活性。用ac-LDL以50ng/ml的浓度处理分化的细胞并在37℃和5％CO₂的环境下保持4小时。除去试剂之后，用PBS洗涤细胞三次。用4％福尔马林处理细胞30分钟以固定细胞并通过荧光显微镜观察。结果是，已经发现ac-LDL掺入分化的细胞中并且在其中强烈地检测到vWF和UEA-1(图18)。

为了确认分化的细胞是否如内皮细胞一样发挥功能，检查了它们的管形成活性。首先，向每个孔中加入200μl matrigel，并将培养板在37℃和5％CO₂的环境下保持30分钟以固化。分化的细胞以2×10⁵细胞/孔的浓度接种到培养板中并监测其管形成24小时。结果是，已经发现全部细胞的约50-60％参与管形成(图19)。

另外，根据制造商说明书通过使用ELISA试剂盒(Quantikine，R&D system)检查分化的细胞是否分泌VEGF。结果是，分化的细胞分泌900pg或更多VEGF(图20)，这提示根据本发明专能祖/干细胞成功地分化为内皮细胞。

实施例7：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为肝细胞

<7-1>诱导分化为肝细胞

在实施例1中培养的专能祖/干细胞以1×10⁵细胞/cm²的浓度接种到用于诱导分化为肝细胞的动物细胞培养基中并培养2-4周，其中所述动物细胞培养基是补加25ng/ml肝细胞生长因子(HGF)、20ng/ml制瘤素M(OSM)、2mM L-谷氨酰胺和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM，并使用matrigel包被培养板。

<7-2>确认诱导分化为肝细胞

根据与实施例4中相同的方法通过RT-PCR分析专能祖/干细胞分化为肝细胞。使用下列寡核苷酸引物进行PCR，所述引物设计成具有与肝细胞特异性基因互补的序列：对HNF1-α基因特异性的SEQ ID No：23和24引物对；对细胞角蛋白-8基因特异性的SEQ ID No：25和26引物对；和对白蛋白基因特异性的SEQ ID No：27和28引物对。引物退火温度对HNF1-α和CK-8是58℃，对白蛋白是62℃。

图21显示，分化的细胞表达肝细胞特异性标志物例如HNF1-α、CK-8和白蛋白基因。

而且，免疫细胞化学染色显示，CK-8和白蛋白在分化的细胞中被染色(图22)，这证明根据本发明的方法来源于脐带血的专能祖/干细胞成功地分化为肝细胞。

实施例8：来源于脐带血的专能祖/干细胞分化为树突细胞

<8-1>诱导分化为树突细胞

用0.05％胰酶/EDTA溶液处理实施例1中制备的专能祖/干细胞，使得细胞从培养瓶脱离，将细胞以5×10⁵细胞/孔的浓度分配到6孔培养板中。向每个孔内加入诱导未成熟分化为树突细胞的动物细胞培养基，并将培养板在37℃和5％CO₂的环境下培养5天，其中所述培养基是补加10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100ng/mlGM-CSF、20ng/ml IL-4和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。每隔2-3天更换新鲜培养基。将细胞转移到诱导成熟分化为树突细胞的动物细胞培养基中并进一步在37℃和5％CO₂的环境下培养2天，其中所述动物细胞培养基是补加10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、10ng/ml TNF-α、10ng/ml IL-1β、1,000U/ml IL-6、1μg/ml前列腺素E2和100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素的HG-DMEM。

<8-2>确认分化为树突细胞

为了确认专能祖/干细胞分化为树突细胞，如下测量分化的细胞对葡聚糖-FITC吸收的活性。从培养瓶中回收漂浮细胞并用PBS洗涤两次。将细胞以2×10⁵细胞/200μl的浓度悬于无FBS的培养基中并向其中加入10μl葡聚糖-FITC(Sigma)。其中，对照组在4℃、测试组在37℃在暗室中反应2小时。暗反应完成后，为了用于流式细胞仪(Becton Dickinson)用PBS洗涤细胞两次，与500μl相同缓冲液混合，随后用流式细胞仪(FACSan，Becton Dickinson)分析。结果是，根据本发明的分化细胞吸收大部分葡聚糖-FITC(图23)。

进一步，根据与实施例2中相同的方法通过流式细胞仪对分化的细胞进行免疫表型分析。对于免疫表型分析，使用抗如下抗原的抗体：单个核细胞抗原如CD14；树突细胞和朗格汉斯细胞抗原如CD1a；细胞粘附相关抗原如CD11c；T细胞相关抗原如CD8；共刺激抗原如CD80、CD86和CD40；成熟树突细胞相关抗原如CD83；和MHC 2类HLA-DR(上面提到的，BD Sciences)。

如图24所示，分化的细胞表现出这样的免疫表型谱：具有抗CD1a、CD11c、CD40、CD80、CD86、CD83和HLA-DR抗原的抗体的阳性反应，和抗CD8抗原的抗体的阴性反应。

进一步，为了检查分化的细胞对诱导T淋巴细胞增殖的影响，使用CD3磁性颗粒溶液(Miltenyl Biotech，Bergisch Glandbac，Germany)从血样分离CD3+T淋巴细胞。5×10⁴细胞/100μl T淋巴细胞与1×10²-1×10⁴细胞/100μl的成熟树突细胞混合，以调整树突细胞与T淋巴细胞的混合比率(刺激因子：应答因子)分别为1∶5、1∶10、1∶50、1∶100和1∶500，将细胞混合物分配到96孔培养板中。培养板在37℃和5％CO₂的环境下培养4天。在第5天，向每个孔中加入10μl BrdU(5-溴-2’-脱氧尿苷)溶液(Roche)，培养板在37℃和5％CO₂的环境下进一步培养24小时。通过使用ELISA阅读仪测量T淋巴细胞增殖。结果是，已经发现从专能祖/干细胞分化的成熟树突细胞能与刺激剂量成比例地诱导T淋巴细胞增殖(图25)。

由于已经结合上述具体实施方案描述了本发明，应该认识到，本领域的技术人员可以对本发明进行多种改进和改变，这些都落入附加的权利要求所定义的本发明范围内。

序列表

110>生命科得公司等

<120>从脐带血分离和培养专能祖/干细胞的方法及诱导其分化的方法

<130>PCA50101-LCI

<150>KR2004-6088

<151>2004-01-30

<150>KR2005-6595

<151>2005-01-25

<160>28

<170>KopatentIn 1.71

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>碱性磷酸酶特异性正向引物

<400>1

acgtggctaa gaatgtcatc 20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>碱性磷酸酶特异性反向引物

<400>2

ctggtaggcg atgtcctta 19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I型前胶原特异性正向引物

<400>3

tgacgagacc aagaactg 18

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>I型前胶原特异性反向引物

<400>4

cgatccaaac cactgaaacc 20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>myoD特异性正向引物

<400>5

aatgtagcag gtgtaaccgt 20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>myoD特异性反向引物

<400>6

gcctttattt tgatcacctg 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>成肌蛋白特异性正向引物

<400>7

cactacttct gtagcagggg 20

<210>8

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>成肌蛋白特异性反向引物

<400>8

tctctcaaac cgtttcactt 20

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肌球蛋白重链特异性正向引物

<400>9

tgtgaatgcc aaatgtgctt 20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>肌球蛋白重链特异性反向引物

<400>10

gtggagctgg gtatccttga 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Flt-1/VEGFR-1特异性正向引物

<400>11

ggtcttacgg agtattgctg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>Flt-1/VEGFR-1特异性反向引物

<400>12

ctttcttttg ggtctctgtg 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>KDR/VEGFR-2特异性正向引物

<400>13

ggacctggcg gcacgaaata 20

<210>14

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>KDR/VEGFR-2特异性反向引物

<400>14

aggccggctc tttcgcttac 20

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ecNOS特异性正向引物

<400>15

aagacatttt cgggctcacg ctgcgcaccc 30

<210>16

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>ecNOS特异性反向引物

<400>16

tggggtaggc actttagtag ttctcctaac 30

<210>17

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VF-钙粘蛋白特异性正向引物

<400>17

gatgcagagg ctcatgatg 19

<210>18

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>VE-钙粘蛋白特异性反向引物

<400>18

cttgcgactc acgcttgact 20

<210>19

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>vWF特异性正向引物

<400>19

caccgtttgc ccacccttcg 20

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>vWF特异性反向引物

<400>20

gcccactggg agccgacact 20

<210>21

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>β-肌动蛋白特异性正向引物

<400>21

tgaaccaggc ttcagcatc 19

<210>22

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>β-肌动蛋白特异性反向引物

<400>22

ggacttcgag caagatatgg 20

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HNF1-α特异性正向引物

<400>23

ttctaagctc agccagctgc agacg 25

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>HNF1-α特异性反向引物

<400>24

gctgaggttc tccggctctt tcaga 25

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>细胞角蛋白-8特异性正向引物

<400>25

caatgccaag ctggaggatc 20

<210>26

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>细胞角蛋白-8特异性反向引物

<400>26

acctcaggct ggcaatgact 20

<210>27

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>白蛋白特异性正向引物

<400>27

tgcttgaatg tgctgatgac aggg 24

<210>28

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>白蛋白特异性反向引物

<400>28

aaggcaagtc agcaggcatc tcatc 25

Claims

1.从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的方法，其包括依次在下列培养基中培养来源于脐带血的单个核细胞：

1)第一动物细胞培养基，其包含胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以及无机盐、维生素、氨基酸和/或补充元素；

3)第三动物细胞培养基，除了用干细胞因子(SCF)和内皮细胞生长因子(EGF)代替GM-CSF，其与第一动物细胞培养基相同。

2.权利要求1的方法，其中所述动物细胞培养基进一步包含3,500-5,500mg/ml的D-葡萄糖和50-200mg/ml的丙酮酸钠。

3.权利要求1的方法，其中所述第一动物细胞培养基包含10-20％FBS、1-2mML-谷氨酰胺、10-100ng/ml GM-CSF；所述第二动物细胞培养基包含10-20％FBS和1-2mML-谷氨酰胺；和所述第三动物细胞培养基包含10-20％FBS、1-2mML-谷氨酰胺、10-100mg/ml SCF和10-50mg/mlEGF。

4.权利要求1的方法，其中在第一动物细胞培养基中培养如此进行：将单个核细胞以1×10⁵-1×10⁶细胞/cm²的浓度接种到第一动物细胞培养基中，并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-2周；在第二动物细胞培养基中培养如此进行：确认形成多层细胞集落之后将第一动物细胞培养基替换为第二动物细胞培养基，并在37℃和5％CO₂的环境下进一步培养1-2周；和在第三动物细胞培养基中培养如此进行：观察到多层细胞集落变形为单层细胞集落之后将在第二动物细胞培养基中培养的细胞以2×10⁴-8×10⁴细胞/cm²的浓度接种到第三动物细胞培养基中，并在37℃和5％CO₂的环境下进一步培养1-2周。

5.根据权利要求1的方法从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养的专能祖/干细胞。

6.专能祖/干细胞，其具有这样的免疫表型谱：显示抗CD14、CD31、CD44和CD45抗原的抗体的阳性反应；抗CD34、CD62E、CD90(Thy-1)和CD133抗原的抗体的阴性反应；抗CD54和CD166抗原的抗体的阳性和部分阳性反应；抗CD73(SH3、SH4)和CD105(SH2)抗原的抗体的阴性和部分阴性反应；抗CD49a和CD104抗原的抗体的阴性和部分阳性反应。

7.用于从来源于脐带血的单个核细胞分离和培养专能祖/干细胞的动物细胞培养基组合物，其选自：

动物细胞培养基组合物，包含10-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺和10-100ng/mlGM-CSF；

动物细胞培养基组合物，包含10-20％FBS和1-2mM L-谷氨酰胺；和

动物细胞培养基组合物亚，包含10-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、10-100mg/mlSCF和10-50mg/mlEGF。

其中每种动物细胞培养基进一步含有无机盐、氨基酸、维生素和/或补充因子。

8.权利要求7的动物细胞培养基组合物，其中所述动物细胞培养基进一步含有3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

9.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为神经元的方法，其包括在动物细胞培养基中培养所述专能祖/干细胞，所述动物细胞培养基包含FBS、L-谷氨酰胺、视黄酸、folskolin、神经生长因子(NGF)、补充元素混合物和β-巯基乙醇，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

10.权利要求9的方法，其中所述动物细胞培养基含有0.1-2％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、1-25μM视黄酸、1-20μM folskolin、10-100ng/ml NGF、1x补充元素混合物和1×10^-6-1×10^-5％β-巯基乙醇。

11.权利要求9的方法，其中所述专能祖/干细胞以2×10⁴-8×10⁴细胞/cm²浓度接种到动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-2周。

12.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为神经元的动物细胞培养基组合物，其包含0.1-2％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、1-25μM视黄酸、1-20μM folskolin、10-100ng/ml NGF、1x补充元素混合物和1×10^-1×10^-5％β-巯基乙醇，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

13.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为成骨细胞的方法，其包括在动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，所述动物细胞培养基包含FBS、地塞米松、抗坏血酸-2-磷酸和β-磷酸甘油，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

14.权利要求13的方法，其中所述动物细胞培养基含有5-20％FBS、0.1-1μM地塞米松、10-100μM抗坏血酸-2-磷酸和5-20mMβ-磷酸甘油。

15.权利要求13的方法，其中专能祖/干细胞以5×10⁴-2×10⁵细胞/cm²浓度接种到动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-3周。

16.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为成骨细胞的动物细胞培养基组合物，其包含5-20％FBS、0.1-1μM地塞米松、10-100μM抗坏血酸-2-磷酸和5-20mMβ-磷酸甘油，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

17.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为内皮细胞的方法，其包括在动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，所述动物细胞培养基包含FBS和血管内皮细胞生长因子(VEGF)，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

18.权利要求17的方法，其中所述动物细胞培养基含有0.1-2％FBS和10-100ng/mlVEGF。

19.权利要求17的方法，其中专能祖/干细胞以1×10⁵-4×10⁵细胞/cm²浓度接种到动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-3周。

20.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为内皮细胞的动物细胞培养基组合物，其包含0.1-2％FBS和10-100ng/mlVEGF，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

21.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为成肌细胞的方法，其包括在动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，所述动物细胞培养基包含牛血清白蛋白(BSA)和5-氮胞苷，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

22.权利要求21的方法，其中所述动物细胞培养基含有5-10％BSA和10-20μM5-氮胞苷。

23.权利要求21的方法，其中专能祖/干细胞以1×10⁵-5×10⁵细胞/cm²浓度接种到动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养5-6周。

24.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为成肌细胞的动物细胞培养基组合物，其包含5-10％BSA和10-20μM5-氮胞苷，还有3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

25.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为肝细胞的方法，其包括在动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，所述动物细胞培养基包含肝细胞生长因子(HGF)、制瘤素M和L-谷氨酰胺，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

26.权利要求25的方法，其中所述动物细胞培养基含有10-100ng/mlHGF、5-50ng/ml制瘤素M和1-2mM L-谷氨酰胺。

27.权利要求25的方法，其中专能祖/干细胞以5×10⁴-5×10⁵细胞/cm²浓度接种到动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养2-4周。

28.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为肝细胞的动物细胞培养基组合物，其包含10-100ng/ml HGF、5-50ng/ml制瘤素M和1-2mML-谷氨酰胺，以及3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

29.将权利要求5的专能祖/干细胞分化为树突细胞的方法，其包括下列步骤：在诱导未成熟分化的第一动物细胞培养基中培养专能祖/干细胞，所述第一动物细胞培养基包含FBS、L-谷氨酰胺、GM-CSF和白细胞介素-4(IL-4)；将未成熟分化的细胞转移到第二动物细胞培养基中，所述第二动物细胞培养基包含FBS、L-谷氨酰胺、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β、IL-6和前列腺素E2；并培养上述细胞以诱导成熟分化，其中每种动物细胞培养基进一步含有3,500-5,500mg/mlD-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

30.权利要求29的方法，其中所述第一动物细胞培养基含有1-2％FBS、1-2mML-谷氨酰胺、10-1,000ng/mlGM-CSF和10-100ng/ml IL-4，所述第二动物细胞培养基含有1-2％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、1-100ng/ml TNF-α、1-2ng/ml IL-1β、100-1,000U/ml IL-6和0.1-10μg/ml前列腺素E2。

31.权利要求29的方法，其中专能祖/干细胞以1×10⁵-1×10⁷细胞/cm²浓度接种到第一动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养3-15天，未成熟分化的细胞在第二动物细胞培养基中并在37℃和5％CO₂的环境下培养1-7天。

32.用于将权利要求5的专能祖/干细胞分化为树突细胞的动物细胞培养基组合物，其选自：

用于诱导未成熟分化的动物细胞培养基组合物，其包含1-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、10-1,000ng/ml GM-CSF和10-100ng/ml IL-4；和

用于诱导成熟分化的动物细胞培养基组合物，其包含1-20％FBS、1-2mM L-谷氨酰胺、1-100ng/ml TNF-α、1-100ng/ml IL-1β、100-10,000U/ml IL-6和0.1-10μg/ml前列腺素E2，

其中每种动物细胞培养基进一步含有3,500-5,500mg/ml D-葡萄糖和50-200mg/ml丙酮酸钠。

33.用于细胞治疗的细胞组合物，其包含权利要求5的专能祖/干细胞。

34.权利要求33的细胞组合物，其用于治疗帕金森病、阿尔茨海默病、由脊髓损伤导致的四肢麻痹、白血病、中风、脑瘤(encephalophyma)、青少年糖尿病、心肌梗塞、肝硬化、肌肉病、心肌病、肝病、血液病、成骨细胞和软骨细胞破坏和永久性功能障碍。