KR102169589B1

KR102169589B1 - 세포 배양 및 분화를 위한 나노섬유의 제조방법 및 이에 따라 제조된 나노섬유

Info

Publication number: KR102169589B1
Application number: KR1020190048033A
Authority: KR
Inventors: 유혁상; 손영주
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2019-03-18
Filing date: 2019-04-24
Publication date: 2020-10-23
Also published as: KR20200111082A

Abstract

일 양상은 세포로부터 배양 및 분화에 이용될 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법 및 이로부터 제조된 친수성 나노섬유를 제공한다.

Description

세포 배양 및 분화를 위한 나노섬유의 제조방법 및 이에 따라 제조된 나노섬유{A process for the preparation of nanofiber for cell culture and differentiation and nanofiber using the same}

세포 배양 및 분화에 이용될 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법 및 이에 따라 제조된 나노섬유에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 세포 배양 및 분화에 이용될 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법 및 이로부터 제조된 나노섬유에 관한 것이다.

전기방사를 이용한 나노섬유는 그 구조적 특성이 물조직의 세포외기질 구조를 모방하기 때문에 조직공학용 지지체로 활용도가 높다. 종래에는 나노섬유를 제조함에 있어서, 전기방사의 용이성으로 인해 주로 소수성 고분자들을 사용하여 왔다. 이와 같은 소수성 고분자로 제조된 나노섬유는 친수성을 부여하거나 세포 부착도를 높여주기 위하여 후처리 과정이 필요했다. 세포 친화적인 친수성 고분자를 사용하면 이 과정을 단순화 시킬 수 있지만, 전기방사도가 떨어지는 문제점이 있다. 또한, 나노섬유를 형성하여도 물에서 그 구조를 유지하기 위해서는 추후 가교 과정이 필요한데, 친수성 고분자를 사용할 경우 가교 과정에서 물에 녹아나가기 쉽기 때문에 섬유 구조를 온전히 유지하기 어렵다는 단점이 있다.

또한, 세포의 배양 및 분화를 유도하는 방법으로 종래에는 무기염류, 아미노산 및 비타민류를 포함하는 동물세포 배양용 배지에 우태아 혈청, L-글루타민 및 과립구-대식세포 콜로니 자극인자가 첨가되거나, 제외된 배지를 순차적으로 사용하는 방법(특허문헌 1), 세포에 전기자극을 가하여 세포의 거동을 조절하는 방법(특허문헌 2) 등이 시도되었다. 그러나, 친수성 나노섬유에 세포를 배양하고, 이어서, 반복적인 물리적 자극을 주는 방법에 의해 세포의 분화를 유도하는, 세포 배양 및 분화를 위한 친수성 나노섬유와 이의 제조방법은 제시되지 않았다. 또한, 나노섬유에 세포를 배양한 후 스트레칭 자극을 가함에 따른 분화 유전자의 발현비율을 평가한 기술이 제시되지 않았다.

한국등록특허 제 10-0677054호 한국등록특허 제 10-1772727호

일 양상은 세포의 배양 및 분화를 위한 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공한다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 의해 제조된 친수성 나노섬유를 제공한다.

일 양상은

(a) 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하는 단계;

(b) 상기 제조된 나노섬유를 가교하는 단계;

(c) 상기 가교된 나노섬유에서 소수성 고분자를 제거하고, 친수성 고분자 나노섬유를 남기는 제조 단계;

(d) 상기 제조된 친수성 고분자 나노섬유에 세포를 배양하는 단계; 및

(e) 상기 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 단계를 포함하는, 세포 배양 및 분화를 위한 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공한다.

일 양상에 따른 나노섬유의 제조 방법은 세포를 배양, 증식 및 분화시킴에 따라 세포부터 조직을 형성할 수 있는 간편하고 효과적인 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공한다. 상기 제조방법은 종래 기술보다 단순하고 경제적인 방법으로 세포를 배양, 증식 및 분화시킬 수 있고, 세포로부터 조직을 형성할 수 있는 친수성 나노섬유를 제조할 수 있다. 상기 제조방법은 예를 들어, 근아세포 또는 섬유아세포를 효과적으로 배양할 수 있고, 증식 및 분화를 촉진하여, 세포로부터 조직을 형성하는데 이용될 수 있다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 의해 제조된 친수성 나노섬유를 제공한다. 상기 나노섬유는 세포외기질 구조를 모방하므로 조직공학용 지지체로서 활용도가 높다. 상기 나노섬유는 예를 들어, 근섬유, 근육 조직 또는 섬유성 결합조직 형성에 이용될 수 있다.

도 1은 전기방사한 PCL/Gel NF와 Gel NF를 전자주사 현미경으로 관찰한 사진과 나노섬유의 평균직경을 나타낸다.
도 1(A)는 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 396±97nm).
도 1(B)~(E)는 각각 글루타알데히드 0.1% (GA 0.1%), 0.5% (GA 0.5%), 2% (GA 2%), 및 5% (GA 5%) (v/v) 용액을 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유(Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다.
도 2는 글루타알데히드(GA) 농도를 0.1%, 0.5%, 2%, 및 5% (v/v)로 달리하여 처리하였을 때의 젤라틴 나노섬유의 변형률(%)에 따른 응력(KPa)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 글루타알데히드(GA) 농도에 따른 젤라틴 나노섬유의 수화율을 알아보기 위해 나노섬유의 팽윤비% (w/w)를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 글루타알데히드로 가교시킨 젤라틴 나노섬유를 초기 대비 2.5%와 5%의 비율로 4회에 걸쳐 늘린 후 나노섬유의 Derjaguin, Muller, Toropov (DMT)계수와 변형도를 원자탐침현미경을 이용하여 이미지화 한 결과를 나타낸다.
도 5는 글루타알데히드(GA) 농도를 0.1%, 0.5%, 2%, 및 5% (v/v)로 달리하여 제조한 젤라틴 나노섬유에 인간유래 진피 섬유아세포를 배양 후 7일 동안 인간유래 진피 섬유아세포의 증식도를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6은 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)로부터 젤라틴 나노섬유 (Gel NF)를 제조하는 방법(A) 및 이로부터 제조된 젤라틴 나노섬유에 근아세포의 분화를 위해 변형을 가하는 방법(B)을 도식화한 것이다.
도 7은 근아세포를 부착한 젤라틴 나노섬유를 이용하여 반복적인 스트레스 자극을 가하여 배양 후 5일 동안 상대적 유전자 발현 비율을 비교한 그래프를 나타낸다(y축은 day 1의 NF 0 샘플의 유전자 발현 비율을 1로 두었을 때 나머지 샘플 그룹의 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다). 도 7(A)~(C)은 각각 근섬유 분화 관련 유전자인 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin에 대한 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다. 도 7(A)~(C)에서, 나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 2.5%씩의 비율로 섬유에 스트레칭 자극을 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 2.5로 명명하고, 마찬가지로 초기 길이 대비 5%씩 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 5로 명명하였다.
도 8은 근아세포를 부착한 젤라틴 나노섬유를 이용하여 1회성 스트레스 자극을 가하여 배양 후 10일 동안 상대적 유전자 발현 비율을 비교한 그래프를 나타낸다(y축은 day 1의 NF 0 샘플의 유전자 발현 비율을 1로 두었을 때 나머지 샘플 그룹의 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다). 도 8(A)~(C)는 각각 근섬유 분화 관련 유전자인 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin에 대한 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다. 도 8(A)~(C)에서, 나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 2.5, 5, 10, 15%의 비율로 섬유에 스트레칭 자극을 1회 가하여 변형을 준 샘플을 NF 2.5, NF 5, NF 10, 및 NF 15로 각각 명명하였다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 또한, 본 명세서에 기재된 수치는 명시하지 않아도 "약"의 의미를 포함하는 것으로 간주한다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 전체가 본 명세서에 참고로 통합된다.

일 양상은

(b) 상기 제조된 나노섬유를 가교하는 단계;

(e) 상기 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 단계를 포함하는, 세포의 배양 및 분화를 위한 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공한다.

상기 친수성 고분자는 젤라틴(gelatin), 폴리비닐알코올(polyvinyl alcohol: PVA), 알지네이트(alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 키토산(chitosan), 플루란(pullulan), 및 폴리(γ-글루탐 산)(Poly(γ-glutamic Acid): γ-PGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 친수성 고분자는 젤라틴일 수 있다.

상기 소수성 고분자는 폴리카프로락톤(poly(caprolactone): PCL), 폴리락트산(poly(lactic acid): PLA), 폴리글리콜 산(poly(glycolic acid): PGA) 및 폴리락트산-글리콜산 공중합체(polylactic-co-glycolic acid: PLGA)로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 소수성 고분자는 폴리카프로락톤일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유는 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (a) 단계의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하는 단계는 동축전기방사법에 의한 것일 수 있다. 상기 소수성 고분자 또는 친수성 고분자는 예를 들어, 동축전기방사법(coaxial electrospinning process)으로 가해질 수 있다. 본 명세서에서 동축전기방사법은 두 가지 고분자 용액을 내부에 삽입된 이너 노즐과 아우터 노즐을 통해 독립적으로 토출시키면서 전기 방사를 수행하는 공정을 말한다. 이에 따라, 두 고분자 용액이 서로 섞이지 않으면서 전기장에 의해 젯(jet)이 형성 및 연신되어 코어-쉘 형태의 나노섬유를 얻을 수 있다.

일 구체예에 따른 제조방법은 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 동축전기방사법에 의해 제조함에 따라, 전기방사가 용이할 뿐만 아니라, 세포 친화성을 높이기 위하여 친수성을 부여하는 후처리 과정을 거치지 않을 수 있다.

상기 동축전기방사법에 사용되는 두 개의 고분자 용액은 서로 섞이지 않도록 적절한 용매 및 고분자를 선택할 수 있다. 예를 들어, 아우터 노즐을 통해 소수성 고분자를 유기 용매에 용해한 소수성 고분자 용액을 토출시키고, 이너 노즐을 통해 친수성 고분자를 수성 용매에 용해한 친수성 고분자 용액을 토출시킬 수 있다.

상기 유기용매는 예를 들어, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 및 이들의 혼합 용액 중에서 선택될 수 있다.

상기 수성용매는 예를 들어, 물, 초산완충용액, 인산완충식염수(phosphate buffer saline: PBS), 및 트리스완충식염수(tris buffered saline: TBS) 중에서 선택될 수 있다.

일 구체예에 따른 나노섬유는 동축전기방사법에 의해, 아우터 노즐(outer nozzle)을 통하여 소수성 고분자 용액을 방사하고, 이너 노즐(inner nozzle)을 통하여 친수성 고분자 용액을 방사하는 것일 수 있다.

예를 들어 동축전기방사 공정에서 유기 용매에 용해한 소수성 고분자인 폴리카프로락톤을 아우터 노즐로 방사시키고, 수성 용매에 용해한 친수성 고분자인 알지네이트를 이너 노즐로 방사시킬 수 있다. 아우터 노즐에서 방사되는 소수성 고분자는 유기 용매에 용해시키고, 이너 노즐에서 방사되는 친수성 고분자는 수성 용매에 용해시킴에 따라, 계면에서 두 고분자 용액이 서로 섞이지 않으며, 친수성 고분자로부터 형성되는 코어부와, 소수성 고분자로부터 형성되는 쉘부를 포함하는 코어-쉘 구조로 형성될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (b) 단계는 글루타알데히드(GA) 용액을 가하여 가교하는 것일 수 있다.

다른 일 구체예에서, 상기 (b) 단계에 따른 가교는 (a) 단계에서 제조된 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유에서 특히, 친수성 고분자 예컨대 젤라틴의 가교일 수 있다. 상기 친수성 고분자 예컨대 젤라틴에 대한 가교제로는 글루타알데하이드, 포름알데하이드, 덱스트란 디알데하이드, 또는 게니핀의 용액을 사용할 수 있다.

상기 글루타알데히드 용액은 약 0.001 내지 99.9% (v/v) 용액일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 글루타알데히드 용액은 약 0.001 내지 70.0% (v/v) 용액일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 글루타알데히드 용액은 약 0.01 내지 10.0% (v/v) 용액일 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 글루타알데히드 용액은 약 0.1 내지 5.0% (v/v) 용액일 수 있다.

상기 글루타알데히드 농도 범위 이하에서는 가교가 불충분하여 나노섬유의 강도가 떨어질 수 있고, 상기 농도 이상에서는 지나친 가교로 인해 과도한 섬유화를 나타낼 수 있다.

일 구체예에 따른 제조방법에서 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유 예컨대 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유의 가교제로서 약 0.1 내지 5.0% (v/v)의 글루타알데히드 용액을 사용할 수 있다. 상기 범위 내의 가교제를 사용하여 제조된 나노섬유는 변형률을 최소화할 수 있는 충분한 강도, 세포 배양에 적합한 친수성 환경을 제공할 수 있는 수화율과 팽윤비, 근아세포의 근섬유로의 분화 관련 유전자의 발현을 보여주는 유전자 예컨대 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin의 발현 비율의 증가를 보일 수 있다.

상기 범위 외의 가교제를 사용하여 제조된 나노섬유는 강도, 수화율 및 팽윤비가 지나치게 낮거나 높아 세포 배양 및 분화에 부적합할 수 있고, 근섬유 분화 관련 유전자 발현 빈도가 낮을 수 있다.

일 구체예에 따른 제조방법은 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하고, 이에 따라 제조된 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 가교함에 따라 가교 시 친수성 고분자가 물에 녹아나는 것을 방지하므로, 나노섬유의 구조 유지에 유리하다.

일 구체예에서, 상기 (c) 단계는 가교된 나노섬유에서 소수성 고분자를 제거하고, 친수성 고분자 나노섬유를 남기는 것일 수 있다. 상기 (c) 단계는 소수성 고분자를 용해하여 제거할 수 있는 용매를 사용하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 (c) 단계는 클로로포름 용액을 가하여 소수성 고분자를 제거하는 것일 수 있다. 상기 용매는 소수성 고분자의 종류에 따라 달라질 수 있다. 상기 (c) 단계는 소수성 고분자에 대한 용해성을 갖는 용매 예컨대 디클로로메테인, 아세톤, 디메틸포름아마이드, 또는 디메틸설폭사이드, 테트라하이드로퓨란을 사용할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 상기 (c) 단계에서 클로로포름 용액은 소수성 고분자 예컨대 폴리카프로락톤을 용해하여 제거하는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (d) 단계는 제조된 친수성 고분자 나노섬유에 세포를 배양하는 것일 수 있다. 상기 (d) 단계는 나노섬유의 표면에 세포를 처리하고, 세포 배양 배지, 예컨대 세포 성장용 배지에서 배양하는 것일 수 있다.

용어　"세포　배양"은　세포의 임의의 시험관내　배양을 나타낸다. 예를 들어, 일 구체예에 따른 친수성 나노섬유에 세포를 배양할 수 있다. 용어 "세포　배양　배지"는　세포를　배양하는 환경에서 쓰는 모든 종류의 배지를 지칭한다. 예를 들어, 세포　배양　배지는 아미노산, 에너지원으로서 적어도 하나의 탄수화물, 미량원소, 비타민, 염 및 가능한 추가 성분(예:　세포의 성장, 생산성, 또는 생산물의 품질에 영향을 미치기 위함)을 포함할 수 있다.

용어 "세포　분화"는 덜 특화된　세포가 보다 구별되는 형태 및 기능을 보유하도록 발달하거나 성숙하는 경로를 나타낸다. 용어　"분화된　세포"는　세포　분화　과정에서 덜 특수화된　세포　유형의　세포　(예컨대, 줄기　세포, 예컨대, 유도 만능성 줄기　세포)로부터 유래된 더욱 특수화된　세포　유형의　세포를 의미할 수 있다.

일 구체예에서, 친수성 고분자 나노섬유 중에 배양되는 세포는 목적 및 용도에 따라　예를 들어, 1차　세포(primary cells), 줄기세포, 또는 이들의 혼합물일 수 있다.

용어 "1차　세포(primary cell)"는 개체에서 추출한 조직에서 유전자 등의 조작 없이 분리한　세포로 생체 장기 또는 조직의 기능을 대변하는　세포를 말한다.

상기 1차 세포는 예를 들어, 근원세포(myosatellite cell), 근아세포(myoblast), 근관세포(myotube), 근육세포(myocyte), 섬유아세포(fibroblast), 조골세포(osteoblast), 건세포(tenocyte)， 신경아세포(neuroblast)， 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte)， 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포， 각질세포(keratinocyte)， 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte)， 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포， 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 세포는 근아세포 또는 섬유아세포일 수 있다.

근육을 형성하기 위해 먼저 근원세포(myosatellite cell)가 활성화되고, 활성화 된 근원세포가 근아세포(myoblast)로 분화된다. 여러 개 근아세포는 정렬, 융합되며 근발생(myogenesis)을 통해 근관세포(myotube)로 분화된다. 근관세포는 근육을 구성하는 단위로 수축성을 가진 섬유상　세포로, 근섬유(myofiber)라고도 한다. 이러한 근관세포들이 형성되고 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다. 근육의 수축 기능은 근세포　내 근원섬유(myofibril)에 의해 결정된다. 근원섬유는 액틴(actin), 미오신(myosin), 티틴(titin) 등 긴 단백질로 구성되며 근원섬유의 상호작용으로 수축한다.

근아세포의 근섬유로의 분화와 관련된 유전자에는 유전자 예컨대 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin가 있다. "MyoD "은 근원성 전사인자(myogenic transcription factor)로서 분화 초기 발현이 증가한다. "미오신중쇄(Myosin　heavy　chain:　MHC)"는 근섬유로　분화　시　필요한　단백질 유전자를 말한다. "Myogenin"은 근육발생(myogenesis)에 관여하는 주요 유전자 중 하나이다. 근아세포의 근섬유로의 분화와 함께 상기 유전자들의 발현량이 증가한다.

용어 "근원세포(myosatellite cell)"는 근육조직에서 볼 수 있는 가장 원시적인　세포(satellite cell)로, 정상근육에서 진정기(quiescent) 상태로 있다가 근육에 손상이 가해지면 활성화되어 증식(proliferation)하거나 분화(differentiation)하여 근아세포(myoblast)를 만들 수 있는　세포를 의미한다.

용어 "근아세포(myoblast)"는 근육세포로 분화하는 과정 중의 전구세포(precursor cell)로 근원세포와 마찬가지로 증식을 하며　세포　간에 융합이 일어나서 근관세포(myotube)를 형성하고 근육세포(myogenic cell 또는 myocyte)로 분화할 수 있는　세포를 의미한다. 다시 말해, 근아세포는 아직 분화하지 않은 상태의 근육세포를 말한다.

용어 "근관세포(myotube)"는 근육을 구성하는 단위로 수축성을 가진 섬유상　세포로, "근섬유(myofiber)"라고도 한다. 근섬유에는 예를 들어, 골격근 섬유, 민무늬근 섬유, 심장 근육 섬유가 있다.

용어 "근육세포(myogenic cell, myocyte)"는 근아세포의 분화 과정을 통해, 근아세포로부터 생성된 근조직 또는 근육조직을 구성할 수 있는　세포를 의미하며, "근세포"라고도 한다.

용어 “섬유아세포(fibroblast)”는 동물 조직을 위한 스트로마인　세포외기질과　콜라겐을 합성하는　세포의 일종을 말한다. 섬유아세포는 동물의　결합 조직, 섬유성 결합조직에서 가장 흔한 세포에 속한다.

일 구체예에 따른 제조방법에 따라 제조된 세포가 배양된 친수성 나노섬유에 물리적 자극을 주는 방법에 의해 세포의 분화를 촉진하거나, 이에 따라 세포로부터 조직을 형성할 수 있다. 상기 물리적인 자극을 주는 방법은 세포가 배양된 친수성 나노섬유에 반복적인 스트레칭 자극을 주는 것일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (e) 단계는 상기 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 것으로서, 물리적 자극을 통해 세포의 분화 정도를 향상시킬 수 있다. 상기 세포는 근아세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 상기 근아세포 또는 섬유아세포는 각각 근섬유 또는 섬유 조직으로 증식 및 분화될 수 있다.

상기 (e) 단계는 수성 고분자 나노섬유에 1회 이상의 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 (e) 단계는 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유의 일정한 방향으로 1회 이상의 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 것일 수 있다. 상기 스트레칭 자극은 나노섬유에 대하여 일정한 방향으로, 즉 반복적인 자극이 가해지는 동안 동일한 방향으로 가하는 것일 수 있다. 상기 반복적인 스트레칭 자극은 1회 이상, 5회 이하, 예컨대 1회 내지 5회일 수 있다.

일 구체예에 따른 나노섬유에서 상기 반복적인 스트레칭 자극이 일정한 방향으로 가해짐에 따라 근아세포가 근섬유로 분화하며 한 방향으로 배열될 수 있다. 다른 일 구체예에 따른 나노섬유에서 상기 반복적인 스트레칭 자극이 일정한 방향으로 가해짐에 따라 섬유아세포가 섬유성 결합조직으로 분화하며 한 방향으로 배열될 수 있다.

일 구체예에 따른 상기 1회 내지 5회 이하의 반복적인 스트레칭 자극은 상기 나노섬유에서 근아세포의 근섬유로의 분화 및 배열을 촉진할 수 있다. 다른 일 구체예에 따른 상기 1회 내지 5회 이하의 반복적인 스트레칭 자극은 상기 나노섬유에서 섬유아세포의 섬유성 결합조직으로의 분화 및 배열을 촉진할 수 있다. 상기 범위 이상의 스트레칭 자극이 가해질 경우 나노섬유가 끊어지거나 손상될 수 있으며, 상기 범위 이하의 자극이 스트레칭 가해질 경우 근아세포의 근섬유로의 분화 및 배열이 불충분할 수 있다.

일 구체예에 따른 나노섬유의 망상구조는 스트레칭에 의한 변형이 가능하며, 나노섬유에 배양된 세포의 조직으로의 분화, 예컨대 근아세포의 근섬유로의 분화를 촉진하기 위하여 물리적 자극을 가할 수 있다. 또는 예컨대 섬유아세포의 섬유 조직으로의 분화를 촉진하기 위하여 물리적 자극을 가할 수 있다. 나노섬유에 물리적 자극을 가하는 방법으로는 1회성 스트레칭 자극을 가하는 방법과, 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 방법을 포함할 수 있다.

일 구체예에 따른 제조방법에서 근아세포 또는 섬유아세포가 배양된 나노섬유에 스트레칭 자극을 가하는 방법은 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 것일 수 있다.

일 구체예에 따른 제조방법에서, 반복적인 스트레칭 자극을 가하는 방법은 동일한 크기의 자극을 반복적으로 가하는 방법과, 점진적으로 증가된 자극을 반복적으로 가하는 방법에 의한 것일 수 있다.

일 구체예에서 따른 반복적인 스트레칭 자극은 점진적으로 증가된 자극, 즉 점진적 자극을 가하는 방법일 수 있다. 일 구체예에 따른 나노섬유에서 점진적인 자극을 가하는 경우 근아세포의 근섬유로의 보다 우수한 분화 효과를 나타낼 수 있다. 다른 일 구체예에 따른 나노섬유에서 점진적인 자극을 가하는 경우 섬유아세포의 섬유성 결합조직으로의 보다 우수한 분화 효과를 나타낼 수 있다. 일 구체예에 따른 나노섬유를 제조하기 위한 소수성 고분자의 농도는 약 5 내지 80% (w/v), 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80% (w/v) 일 수 있다. 예컨대 상기 소수성 고분자는 폴리카프로락톤 약 10, 15, 20, 25, 또는 30 % (w/v)일 수 있다.

일 구체예에 따른 나노섬유를 제조하기 위한 친수성 고분자의 농도는 약 5 내지 80% (w/v), 예컨대 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80% (w/v) 일 수 있다. 예컨대 상기 소수성 고분자는 젤라틴 약 5, 10, 15, 20, 또는 25 % (w/v)일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유는 친수성 고분자 대 소수성 고분자가 약 1:1 내지 1:5의 농도 비율로 포함되는 것일 수 있다.

상기 일 구체예에 따른 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유는 나노섬유의 구조적 특성으로 인하여 스트레칭이 가능하며, 근아세포 또는 섬유아세포 배양 시 물리적인 자극을 가하기에 적합한 지지체일 수 있다.

다른 일 양상은 상기 제조방법에 의해 제조된 친수성 나노섬유를 제한다. 상기 친수성 나노섬유는 그 구조의 특성이 세포외기질(extracellular matrix)을 모방하므로 조직공학용 지지체로서 활용도가 높다. 용어 “세포외기질(extracellular matrix)”은 주로 동물의 구조직 지지등을 담당하는 조직을 말한다. 세포외기질은 동물의　결합 조직에 속한다.

일 구체예에 따른 친수성 나노섬유는, 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유일 수 있다. 상기 나노섬유는 가교된 나노섬유에서 소수성 고분자를 제거하고, 친수성 고분자 나노섬유를 남긴 형태일 수 있다.

일 구체예에서, 상기 나노섬유는 근아세포 또는 섬유아세포 배양용 친수성 나노섬유일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 나노섬유를 이용하여 근육 조직 또는 섬유성 결합조직을 형성할 수 있다.

용어 “근육”은 힘줄과 살을 통틀어 이르며,　동물의 운동을 맡은 기관이다. 기능으로 보아 수의근인 골격근과 불수의근인 내장근이 있으며, 구조적으로는 가로무늬근과 민무늬근이 있다. “근육 조직”은 축과 이완을 담당하는 특수화된 조직으로 인체의 전체 또는 부분적 운동을 주도하고, 내부 장기의 움직임에도 관여한다. 근육 조직은 근세포의 종류에 따라 가로무늬가 나타나는 가로무늬근(횡문근,　striated　muscle)과 가로무늬가 없는 민무늬근(평활근,　smooth　muscle)이 있다. 가로무늬근을 구성하는 근세포의 수축에는 액틴으로 이루어진 가는 미세섬유와 미오신으로 이루어진 굵은 미세섬유가 관여한다. 근세포내에는 미세섬유가 잘 배열되어 있는 근절(근원섬유마디,　sarcomere)이라는 단위체가 잘 발달되어 있다. 가로무늬근조직은 분포 지역에 따라 골격근(skeletal　muscle), 내장가로무늬근육(내장횡문근,　visceral　striated　muscle), 심장근(cardiac　muscle)으로 구분된다. 가로무늬근의 근육은 근막이라고 하는 결합 조직의 막에 의해 많은 근섬유가 싸여 있는 구조로 되어 있다. 그 근섬유는 그물 모양의 섬유가 격벽 모양으로 되어 많은 다발로 나뉜다. 가로무늬근의 근육 다발 중 한 가닥의 근섬유(근세포)는 굵기 20~100μm의 가느다란　세포이다.　 가로무늬가 없는 근육을 통틀어 민무늬근이라고 하고, 내장근이라고도 한다.

용어 “섬유성 결합조직(fibrillar　connective　tissue)”은 세포간질로서 섬유성 요소를 주체로 하는　결합조직을 말한다. 상피조직의 대부분을 제외한 다른 각종 조직의 기본성분 사이에 개재하며, 직접 그러한 조직성분 중 하나로서 구성을 한다. 이 조직의 특성은 일반적으로 세포성분이 빈약하고 섬유가 세포간질(기질)의 주성분이 된다는 것이다. 섬유성 결합조직의 기본세포는　섬유아세포라고 한다. 섬유성분의 밀도 차이에 따라 소성 결합조직과 밀성 결합조직으로 크게 나뉜다.

상기 제조 방법은 근섬유 또는 섬유성 결합조직 형성을 위한 간편하고 효과적인 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 제조방법은 전기방사 기술을 이용하여 조직공학에 적용할 수 있는 친수성 나노섬유의 제조방법을 제공하며, 전기방사에 제약이 따르는 고분자 재료로부터도 용이하게 나노섬유를 제조할 수 있다. 또한, 이에 따라 제조된 친수성 나노섬유는 세포가 자랄 수 있는 3차원 환경을 제공하며, 세포외기질을 모방하여 효과적으로 세포가 증식할 수 있다.

상기 방법에 따라 제조된 친수성 나노섬유는 근아세포 또는 섬유아세포의 배양체, 기체-액체 계면 배양용 지지체, 인공피부 지지체 또는 세포외 기질 모방체를 제공할 수 있다.

다른 일 양상은 상기 친수성 나노섬유를 이용한 세포의 배양, 분화 및 증식 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 근아세포 또는 섬유아세포를 나노섬유 중에 배양하여, 근육 조직 또는 섬유성 결합조직으로 분화 또는 증식시키기 위한 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 나노섬유의 제조

나노섬유를 제조하기 위해 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하였다. 제조된 나노섬유를 가교하고, 이어서 가교된 나노섬유에서 소수성 고분자를 제거하여 친수성 나노섬유만을 남겼다.

구체적으로, 나노섬유를 제조하기 위해 먼저 폴리카프로락톤(PCL) (Mw 43000)과 젤라틴(gelatin) 용액을 준비하였다. 폴리카프로락톤은 20% (w/v) 농도로 클로로포름: 메탄올 3: 1 (v/v) 혼합용매에 녹여주었고, 젤라틴은 15% (w/v) 농도로 10% 아세트산(acetic acid) 수용액에 녹여주었다. 젤라틴 용액에는 1%의 폴리비닐알코올(PVA) (Mw 22000)을 함께 녹여주었다.

폴리카프로락톤과 젤라틴을 동축 노즐을 이용하여 토출시키고, 노즐 끝에 전압을 걸어주어 방사하였고, 1시간 동안 원통형 회전드럼(규격: 직경 10cm x 너비 20cm)에 증착시켰다. 토출 용액의 유속은 각각 1.5ml/h, 0.3ml/h이고 전압은 18kV~20kV으로 하였다. 회전드럼의 속도는 200rpm으로 전기방사 시 온도는 25℃이고 습도는 30~40% 환경을 유지하였다.

그 결과 겉은 폴리카프로락톤으로 코팅되어있고, 내부는 젤라틴/PVA로 구성된 동축나노섬유를 얻었다. 나노섬유의 무게를 측정한 후 무게의 100배 부피비를 가지는 글루타알데히드(Glutaldehyde) 0.1 ~ 10% 농도 범위의 에탄올 희석액에 2시간 동안 담가 가교시켰다. 반응에 참여하지 않은 글루타알데히드를 제거하기 위해 깨끗한 에탄올로 3회 씻어준 후 건조시켰다.

젤라틴이 가교된 나노섬유를 클로로포름에 담가 PCL을 1시간 동안 녹여준 뒤, 깨끗한 클로로포름으로 3회 교체해 주어 남아있는 PCL을 모두 제거해 주었다. 젤라틴 나노섬유는 다시 에탄올로 3회 씻어주고, 물로 2회 씻어준 후 동결건조하여 보관하였다.

실험예 1: 나노섬유의 현미경 관찰 및 평균 직경 측정

도 1은 전기방사한 PCL/Gel NF와 Gel NF를 전자주사 현미경으로 관찰한 사진과 나노섬유의 평균직경을 나타낸다.

건조된 나노섬유에 금이온을 스프레이방식으로 코팅한 후 전자주사현미경으로 관찰하였다. 나노섬유의 직경은 20개의 나노섬유 직경을 측정한 후 평균값을 계산하여 나타내었다.

전기방사 한 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)(A)와 PCL을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유((B)~(D))를 전자주사현미경으로 관찰하였다.

도 1(A)는 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 396±97nm).

도 1(B)는 글루타알데히드 0.1% (GA 0.1%) (v/v)용액을 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유(Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 228±60nm).

도 1(C)는 글루타알데히드 0.5% (GA 0.5%) (v/v)용액을 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유(Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 265±85nm).

도 1(D)는 글루타알데히드 2.0% (GA 2%) (v/v)용액을 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유(Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 180±54nm).

도 1(E)는 글루타알데히드 5.0% (GA 5%) (v/v)용액을 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 제거하고 난 후의 젤라틴 나노섬유(Gel NF)의 전자주사현미경 사진을 나타낸다(나노섬유의 평균 직경: 280±58nm).

글루타알데히드 처리 농도와 관계없이 섬유의 구조가 유지되었음을 알 수 있었다. 직경의 변화를 살펴보면 PCL 겉섬유가 존재하는 경우 평균 396±97nm의 직경을 보이는 반면, PCL 제거후 Gel NF의 직경이 감소함을 보였고, 가교 정도에 따른 차이는 보이지 않았다.

실험예 2 : 나노섬유의 응력 측정

도 2는 글루타알데히드 농도를 0.1%, 0.5%, 2.0%, 및 5.0% (v/v)로 달리하여 처리하였을 때의 젤라틴 나노섬유의 변형률(%)에 따른 응력(KPa)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.

응력 측정을 위해 초기 나노섬유의 길이는 5mm로 설정하였고, 10분/분의 속도로 응력을 가하였다. 변형률(%)은 (변형된 길이) / (초기길이) x 100으로 계산한 값이다.

도 2에서와 같이, 글루타알데히드(GA) 농도가 0.1% (v/v)에서 5.0% (v/v)로 증가함에 따라 젤라틴 나노섬유가 견디는 응력이 증가하는 양상을 보였다. 또한, GA 2%와 GA 5.0%로 처리한 나노섬유에서 응력 값이 약 15KPa로 가장 높은 값을 나타내었다.

실험예 3 : 나노섬유의 팽윤비 및 수화율 측정

도 3은 글루타알데히드(GA) 농도에 따른 젤라틴 나노섬유의 수화율을 알아보기 위해 팽윤비% (w/w)를 측정하여 나타낸 그래프이다.

순수하게 얻은 젤라틴 나노섬유를 다시 물에 2시간 동안 담근 후 표면의 물기를 제거하고 무게를 측정하여 가교 정도에 따른 팽윤비를 아래 식으로부터 산출하였다.

팽윤비 (swelling ratio) = {(물에 적신 나노섬유의 무게)-(건조된 나노섬유의 무게)}/(건조된 나노섬유의 무게) x 100

젤라틴 나노섬유를 0.1%, 0.5%, 2.0%, 및 5.0% (v/v)의 글루타알데히드(GA)로 가교시킴에 따른 수화율을 관찰한 결과, 농도가 가장 낮은 0.1% (v/v)의 글루타알데히드(GA)로 가교 시킨 경우 수화율이 가장 높았다. 0.1% (v/v)의 GA로 가교시킨 경우, 초기 건조시킨 나노섬유의 무게 대비 약 8배까지 증가하였다.

5.0% (v/v)의 글루타알데히드(GA)를 처리한 나노섬유에서도 약 6배까지 무게가 증가한 것을 보아 우수한 수화율을 보였다. 이는 나노섬유의 재료인 젤라틴의 친수성과 나노섬유 다공성 구조의 시너지 효과 때문으로 보인다.

실험예 4 : 나노섬유의 DMT 계수 및 변형도 측정

도 4는 글루타알데히드로 가교시킨 젤라틴 나노섬유를 초기 대비 2.5%와 5.0%의 비율로 4회에 걸쳐 늘린 후 나노섬유의 Derjaguin, Muller, Toropov (DMT)계수와 변형도를 원자탐침현미경을 이용하여 이미지화 한 결과를 나타낸다.

폭x길이 1x3cm²의 젤라틴 섬유를 초기 길이 3cm 대비 0.075cm (2.5%), 0.15cm (5.0%)씩 4회에 걸쳐 늘려준 후 섬유를 0.5x0.5cm² 크기로 자른 후 얇은 유리시편 위에 올려 원자탐침현미경을 이용하여 peak force quantitative nanomechanical (PF-QNM) 모드로 관찰하였다. 이 때 섬유는 젖은 상태로 관찰하였다.

가장 우수한 응력을 견디는 것으로 나타난 글루타알데히드(GA) 2.0% 조건으로 가교한 젤라틴 나노섬유를 초기 길이 대비 2.5%와 5.0% 길이만큼 4회에 걸쳐 늘려준 후 나노섬유의 강도 변화를 원자탐침현미경으로 관찰하였다.

그 결과 도 4에서와 같이, DMT계수 값이 감소하였고, 변형도가 증가한 것으로 보아 섬유의 기계적 강도가 점차 약해짐을 알 수 있었다.

실험예 5: 나노섬유에서의 세포 배양 및 증식도 측정

실시예 1에서 제조한 나노섬유를 이용하여 인간유래 진피 섬유아세포를 배양하고 세포의 증식도를 분석 키트(assay kit)를 사용하여 평가하였다.

젤라틴 나노섬유(3mg)의 표면에 (A) 1x10³ cell/3mg 또는 (B) 1x10⁵ cell/3mg 의 농도로 인간유래 진피 섬유아세포를 처리하였다. 이어서 EZ-Cytox^TM를 처리하여 7일 동안 배양하면서 인간유래 진피 섬유아세포의 증식도를 평가하였다. EZ-Cytox^TM는 세포 생존력(cell viability), 증식(proliferation) 및 세포 독성(cytotoxicity)을 측정할 수 있는 분석 키트이다.

도 5는 글루타알데히드(GA) 농도를 0.1%, 0.5%, 2%, 및 5% (v/v)로 달리하여 제조한 젤라틴 나노섬유에 인간유래 진피 섬유아세포를 7일 동안 배양하면서 세포의 증식도를 측정한 결과를 나타낸다.

나노섬유에 인간유래 진피 섬유아세포 처리 후 24시간이 경과한 상태를 day 1로 하였다. 나노섬유에 세포 처리 후 각각 day 1, day 3 및 day 7 경과 후 흡광도(450nm)를 측정하였다. 이로부터 각 글루타알데히드(GA) 농도로 처리하여 제조한 나노섬유에서의 섬유아세포 증식 정도를 구하였다.

도 5의 y축은 day 1 샘플의 세포 증식도를 1로 두었을 때 나머지 샘플 그룹의 세포 증식도 비율을 나타낸다.

세포 증식도 측정을 위해, 세포를 배양한 나노섬유에서 배지를 제거한 후 EZ-Cytox 시약을 10배 PBS에 희석하여 세포에 처리(300uL), 2시간 동안 37°C 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후 상층액을 샘플링 하여 450nm에서 흡광을 관찰하였다.

도 5에서와 같이, 젤라틴 나노섬유에서 인간유래 진피 섬유아세포가 지속적으로 성장하는 양상을 보였고, 세포 독성은 관찰되지 않았다.

도 5(A)에서와 같이, 1x10³ cell을 처리한 그룹에서는 시간이 지남에 따라 젤라틴 나노섬유의 빈 공간으로 세포가 지속적으로 성장하였고, 도 5(B)에서와 같이, 1x10⁵ cell을 처리한 그룹에서는 초기 세포 농도가 높아 증식할 수 있는 공간이 부족하였기 때문에 성장이 저조하였다.

실시예 2 : 반복적인 스트레칭 자극에 의한 세포 배양 및 분화를 위한 제조

실시예 1에서 제조한 나노섬유를 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 반복적인 스트레칭 자극을 가하였다.

도 6은 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)로부터 젤라틴 나노섬유 (Gel NF)를 제조하는 방법(A) 및 이로부터 제조된 젤라틴 나노섬유에 근아세포 분화를 위해 변형을 가하는 방법(B)을 도식화한 것이다.

도 6(A)에서와 같이, 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)에 글루타알데히드를 처리하여 젤라틴을 가교시킨 후 폴리카프로락톤(PCL)을 녹여서 제거해 주었다. 그 결과 글루타알데히드에 의해 가교된 젤라틴 나노섬유를 획득하였다.

도 6(B)에서와 같이, 젤라틴 나노섬유의 표면에 근아세포를 부착한 후 반복적인 스트레칭 자극을 일정한 방향으로 가하여, 반복적으로 섬유를 4회에 걸쳐 24시간 간격으로 늘려주었다. 도 6(B)에서와 같이, 상기 반복적인 스트레칭 자극은 1회, 2회, 3회 및 4회 가해지는 동안 점진적으로 증가하였다.

예컨대 상기 1 내지 4회 동안 가해지는 점진적으로 증가하는 반복적인 스트레칭 자극은, 나노섬유의 한쪽 끝을 당겨 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 0.075cm (2.5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(1회째 자극), 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 1회째에서 증가된 길이 대비 0.075cm (2.5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(2회째 자극), 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 2회째에서 증가된 길이 대비 0.075cm (2.5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(3회째 자극), 및 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 3회째에서 증가된 길이 대비 0.075cm (2.5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(4회째 자극)에 의한 것일 수 있다.

예컨대 상기 1 내지 4회 동안 가해지는 점진적으로 증가하는 반복적인 스트레칭 자극은, 나노섬유의 한쪽 끝을 당겨 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 0.15cm (5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(1회째 자극), 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 1회째에서 증가된 길이 대비 0.15cm (5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(2회째 자극), 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 2회째에서 증가된 길이 대비 0.15cm (5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(3회째 자극), 및 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 3회째에서 증가된 길이 대비 0.15cm (5%)가 늘어나도록 당겨주는 힘(4회째 자극)에 의한 것일 수 있다.

이와 같은 변형에 따른 근아세포의 근섬유로 분화 정도의 차이를 측정하였다. 반복적인 자극이 가해지는 동안 일정한 방향으로 가해지는 스트레칭 자극은 나노섬유에서 근아세포의 근섬유로의 분화 및 배열을 촉진하였다.

실험예 6 : 나노섬유의 상대적 유전자 발현비율 측정 (1)

실시예 2에서 제조한 나노섬유를 이용하여 근아세포를 배양하고, 이로부터 얻은 나노섬유 시트에 반복적인 스트레스 자극을 가하여 근아세포의 근섬유로 분화 정도를 평가하였다.

젤라틴 나노섬유를 폭x길이 1x3cm²로 하고, 나노섬유의 표면에 3.3x10⁴ cells/cm²의 농도로 세포를 처리하였다. 24시간 동안 10%의 혈청(serum)이 첨가된 배지(10% FBS supplemented media, 근아세포 성장용 배지)에서 배양하였다. 세포 처리 후 24시간이 경과한, 근섬유로 분화되기 전 상태를 day 1로 하였다.

24시간 후 2% 혈청을 첨가한 배지(2% FBS supplemented media, 근아세포의 근섬유로의 분화용 배지)로 교체한 후, 나노섬유를 점진적으로 증가된 균일한 힘으로 당겨주어 반복적인 스트레스 자극을 가하였다.

반복성 스트레스 자극을 가하기 위해, 나노섬유의 한쪽 끝을 당겨 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 0.075cm (2.5%) 또는 0.15cm (5%)가 늘어나도록(1회째) 각각 당겨주었다. 24시간 후 다시 동일한 길이만큼 즉, 1회째에서 증가된 길이 대비 0.075cm (2.5%) 또는 0.15cm (5%)가 늘어나도록(2회째 증가) 각각 스트레칭 자극을 가하였다. 이와 같은 방법으로 총 4회 반복(1~4회째 증가, 총 4회 증가)하면서 총 5일 동안 골격근세포를 근섬유로 분화시켜주었다. 세포 처리 후 3일 및 5일이 경과한, 근섬유로 분화시킨 후의 상태를 각각 day 3 및 day 5로 하였다.

나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 2.5%씩 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 2.5로 명명하고, 초기 길이 대비 5%씩 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 5로 명명하였다. 근섬유로 분화시키고 나서 각각 day 3 및 day 5 경과 후 세포의 유전자 발현 양상을 통해 근섬유로 분화 정도를 평가하였다.

도 7은 근아세포를 부착한 젤라틴 나노섬유를 이용하여 반복적인 스트레스 자극을 가하여 배양 후 5일 동안 상대적 유전자 발현 비율을 비교한 그래프를 나타낸다. 도 7(A)~(C)은 각각 근섬유 분화 관련 유전자인 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin에 대한 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다. 도 7(A)~(C)에서, 나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 2.5%씩의 비율로 섬유에 스트레칭 자극을 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 2.5로 명명하고, 마찬가지로 초기 길이 대비 5%씩 총 4회 변형을 준 샘플을 NF 5로 명명하였다. 도 7의 y축은 day 1의 NF 0 샘플의 유전자 발현 비율을 1로 두었을 때 나머지 샘플 그룹의 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다.

도 7에서와 같이, 나노섬유에 반복적인 스트레스 자극을 가하며 총 5일간 실험하여 관찰한 결과, NF 5 군에서 MyoD과 Myogenin의 상대적 유전자 발현 비율이 가장 높게 나타났다(도 7(A) 및 (C) 참조). MHC의 발현 비율은 자극을 가하지 않은 NF 0에 비해 NF 2.5와 NF 5에서 발현율이 유사한 비율로 증가하였다(도 7(B) 참조). 이 결과를 통해 나노섬유에 가해지는 지속적인 자극, 다시 말해 점진적으로 증가된 반복적인 자극이 근아세포의 근섬유로의 분화를 촉진시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 나노섬유의 상대적 유전자 발현비율 측정 (2)

실시예 2에서 제조한 나노섬유를 이용하여 근아세포를 배양하고, 이로부터 얻은 나노섬유 시트에 일회성 스트레스 자극을 가하여 근아세포의 근섬유로 분화 정도를 평가하였다.

24시간 후 2% 혈청을 첨가한 배지(2% FBS supplemented media, 근아세포의 근섬유로의 분화용 배지)로 교체한 후 나노섬유를 균일한 힘으로 1회 당겨주어 스트레스 자극을 가하였다.

일회성 스트레스 자극을 가하기 위해, 나노섬유의 한쪽 끝을 당겨 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 0.075cm (2.5%), 0.15cm (5%), 0.3cm (10%), 및 0.45cm (15%)가 늘어나도록 각각 1회 당겨주어 스트레칭 자극을 가하였다. 총 10일 동안 골격근세포를 근섬유로 분화시켜주었다. 세포 처리 후 5일 및 10일이 경과한, 근섬유로 분화시킨 후의 상태를 각각 day 5 및 day 10으로 하였다.

나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 0.075cm (2.5%), 0.15cm (5%), 0.3cm (10%), 또는 0.45cm (15%)가 늘어나도록 총 1회 변형을 준 샘플을 각각 NF 2.5, NF 2.5, NF 5, NF 10, NF 15로 명명하였다. 근섬유로 분화시키고 나서 각각 day 5 및 day 10 경과 후 세포의 유전자 발현 양상을 통해 근섬유로 분화 정도를 평가하였다.

도 8은 근아세포를 부착한 젤라틴 나노섬유를 이용하여 1회성 스트레스 자극을 가하여 배양 후 10일 동안 상대적 유전자 발현 비율을 비교한 그래프를 나타낸다. 도 8(A)~(C)는 각각 근섬유 분화 관련 유전자인 MyoD, Myosin heavy chain (MHC), Myogenin에 대한 상대적 유전자 발현 비율(Gene fold expression to NF0 at day 1)을 나타낸다. 도 8(A)~(C)에서, 나노섬유에 변형을 가하지 않은 샘플(초기 나노섬유)을 NF 0으로 하고, 초기 나노섬유 길이(3cm) 대비 2.5, 5, 10, 15%의 비율로 늘어나도록 섬유에 스트레칭 자극을 1회 가하여 변형을 준 샘플을 NF 2.5, NF 5, NF 10, 및 NF 15로 각각 명명하였다. 도 8의 y축은 day 1의 NF 0 샘플의 유전자 발현 비율을 1로 두었을 때 나머지 샘플 그룹의 상대적 유전자 발현 비율을 나타낸다.

도 8에서와 같이, 나노섬유에 일회성 스트레스 자극을 가하며 총 10일간 실험하여 관찰한 결과, 세포 분화 시 스트레칭 자극을 가하지 않은 NF 0와 비교하여 자극을 가한 다른 그룹(NF 2.5, NF 5, NF 10, NF 15)을 비교하면, 유전자 발현 양상은 큰 차이 없이 유사하게 나타났다. 또는 15%의 비율로 증가한 NF 15의 경우 유전자의 발현이 오히려 감소하는 역효과가 나타났다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 상기 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

(a) 소수성 고분자를 주형으로 하고, 내부에 친수성 고분자를 담고 있는 형태의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하는 단계;
(b) 상기 제조된 나노섬유를 가교하는 단계;
(c) 상기 가교된 나노섬유에서 소수성 고분자를 제거하고, 친수성 고분자 나노섬유를 남기는 제조 단계;
(d) 상기 제조된 친수성 고분자 나노섬유에 세포를 배양하는 단계; 및
(e) 상기 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 점진적으로 증가된 반복적인 스트레칭 자극을 일정한 방향으로 가하는 단계를 포함하고,
상기 소수성 고분자는 폴리카프로락톤이고, 상기 친수성 고분자는 젤라틴이고, 상기 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유는 폴리카프로락톤/젤라틴 나노섬유(PCL/Gel NF)이고,
상기 세포는 근아세포인, 세포의 배양 및 분화를 위한 친수성 나노섬유의 제조방법.
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청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계의 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유를 제조하는 단계는 동축전기방사법에 의한 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (b) 단계는 글루타알데히드 용액을 가하여 가교하는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 상기 글루타알데히드 용액은 0.001 내지 70.0% (v/v) 용액인 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 6에 있어서, 상기 글루타알데히드 용액은 0.1 내지 5.0% (v/v) 용액인 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (c) 단계는 클로로포름 용액을 가하여 소수성 고분자를 제거하는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (e) 단계는 세포가 배양된 친수성 고분자 나노섬유에 1회 내지 5회 이하의 반복적인 스트레칭 자극을 일정한 방향으로 가하는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
청구항 1에 있어서, 상기 (a) 단계에서 소수성 고분자/친수성 고분자의 나노섬유는 친수성 고분자 대 소수성 고분자가 1:1 내지 1:5의 농도 비율로 포함되는 것인, 친수성 나노섬유의 제조방법.
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