KR101489868B1 - 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트 - Google Patents

생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트 Download PDF

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윤제필
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명에 따른 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법은, (a) 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 표면 개질제를 준비하는 단계, (b) 고상 표면을 전처리하는 단계, (c) 상기 단계 (a)에서 준비된 표면 개질제로 상기 고상 표면을 개질하는 단계로 구성된다.
본 발명에 따르면, 표면 개질제를 이용해 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 작용기를 고상의 표면견고하고 강하게 고정함으로써 각종 생체 분자를 안정하게 접합시킬 수 있으며, 더욱이, 고상의 재질이나 형상에 따라 표면 개질의 정도가 영향을 받지 않기 때문에 본 발명은 바이오 센서 등의 제조에 광범위하고 유용하게 사용될 수 있다.

Description

생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트{Method for modifying surface of solid phase for introducing biomolecules to the surface, nano-sized particle and sheet having surface modified thereby}
본 발명은 표면 개질제를 이용하여 고상의 표면에 생체분자가 부착 가능한 작용기를 도입하는 고상의 표면 개질방법에 관한 것이다.
최근 들어 생명공학과 반도체 제조 기술을 접목시켜 핵산, 단백질, 효소, 항원, 항체 등과 같은 생체 분자들을 보다 효율적으로 탐지할 수 있는 방법과 관련한 노력이 확산되고 있다.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 바이오 센서(biosensor), DNA칩 어레이, 단백질칩 어레이, 바이오 일렉트로닉 디바이스(bioelectronic device)등과 같이 작은 고체상 칩 위에 반도체 가공 기술을 이용하여 원하는 생체분자의 작용기를 고정하고 이를 생화학적으로 검색하는 생물학적 분석 기술을 이용하여 생체분자를 탐지하는 방법이 연구되고 있다.
이른바, 바이오칩(biochip)의 개발에 대한 관심이 증대되면서, 이러한 분석용 칩을 제작하기 위하여 생체물질을 고정화할 수 있는 효과적인 칩을 제조하기 위해 표면 개질 방법이 중요한 연구 분야로 대두되고 있으며 이를 위해서 생명공학과 반도체 제조 기술을 이용해서 기존에 개발된 바이오 물질 또는 기능성 물질을 나노미터 정도의 분자수준에서 융합시켜 표면을 개질시키고 기존의 특성을 조절하는 것이 매우 중요하다.
이러한 기술의 발전을 위해서는, 바이오 물질 또는 기능성 물질로 개질된 표면이 장기간 안정성이 보장되어야 하고, 원하는 표면만 선택적으로 개질시키며, 생체물질 탐침의 특이성과 안정성을 결정하는 작용기를 도입하는 표면의 코팅 기술의 개발이 매우 중요하다.
즉, 생체물질 탐침이 본래의 특이적 반응성과 안정성을 유지한 채, 특정 위치에 고정되고, 다양한 생체분자와 특이적으로 반응시킬 수 있는 것이 바이오 칩 제작에 중요한 기술적 관건이며 이러한 생체물질의 고정화 과정을 효율적으로 유도하기 위해서는 칩 표면을 화학적으로 수식하여 생체물질과의 친화성을 적절히 조절하는 것이 중요하다.
또한, 소형 진단칩 또는 반응칩(Lab-on-a-chip)의 개발에서도 생체분자의 분리 또는 제어가 중요한 배경기술이 될 뿐만 아니라 의약품 디자인 및 개발에 있어서도 생체 분자의 효율적인 고정화 방법이 중요하다.
한편, 현재 이용되고 있는 통상적인 생체 분자의 고정화 방법은 기판(substrate)에 다수의 반응성 작용기를 가지는 연결물질(linker)을 도입하여 지지대를 형성하고, 연결물질의 작용기와 생체 분자와의 특정 화학결합을 유도하여 생체 분자를 지지대에 고정하는 방법이다.
예컨대, 생체 분자 표면에 존재하는 아민기, 카르복실기, 알코올기, 알데히드기, 티올기 등이 상기한 고정하는 방법의 반응에서 다양한 결합, 예컨대, 공유결합, 이온결합, 배위결합, 수소결합, 중첩(packing) 등의 결합을 형성하여 지지대 상에 고정된다.
상기한 바와 같은 다양한 형태의 결합을 통해 고체 표면을 개질하는 방법을 이용하여 바이오 센서 혹은 바이오 칩을 제조하기 위해서는 생체분자과 친화성이 큰 물질의 표면을 개질하기 위한 기술이 필요하며, 표면 개질된 물질을 생체 내에 도입을 원할 때는 인체에 무해한 물질의 표면 개질방법이 필요하기 때문에 이러한 목적을 이루기 위한 물질의 표면 개질에 관해 다양한 방법이 제시되고 있다.
한편, 이에 기판 재질로 소다 라임과 같은 유리 재질이 가장 널리 사용되고 있다. 유리 기판은 표면 개질이 용이하고, 우수한 광학 특성을 가질 뿐만 아니라 채널에서 유체의 흐름이 원활히 이루어져 각종 분석이 용이하다는 이점이 있다.
그러나 미세 공정이 실리콘에 비해 매우 까다로우며 공정용이 매우 비싸다는 단점이 있으며, 공정 중 사용되는 용액이 강산, 강염기이므로 폐기물이 발생하는 등 환경오염과 같은 다양한 문제를 안고 있어 유리 기판을 이용한 바이오칩의 양산화가 용이하지 않다.
이에 유리 기판을 대체할 수 있도록 금속이나 무기재료 또는 플라스틱 재질 등 다양한 물질이 기판 재료로 제안되었으며 특히, 고분자나 세라믹의 경우 가공성, 광학 특성, 공정의 용이성, 대량 생산 비용 절감 등 많은 장점을 지니고 있어 상용화 재료로 많은 연구가 수행되고 있다.
일례로, 고분자나 세라믹을 기판으로 사용하는 경우 사출 성형(Injection molding), 레이저어블레이션(Laser-ablation), 임프린팅(Imprinting), 핫엠보싱(Hot embossing)과 같은 다양한 방법 이용이 가능하여 가공에 대한 선택폭이 넓어지고, 유체 흐름에 유리한 표면을 형성할 수 있으며, 가격이 싸고 공정의 선택이 비교적 자유롭다는 장점이 있다.
그러나 이러한 이점에도 고분자나 세라믹의 경우 분자 구조 내 소수성 관능기로 이해 소수성 표면을 가지는 특성으로 인해 수용액과 낮은 젖음성을 유발하여 유체의 흐름이 원활하지 못한 문제점이 발생한다.
또한, 대부분의 생체물질이 소수성 표면과 소수성 결합 및 반데르발스 결합에 의하여 비특이적 흡착이 발생 되기 때문에 표면 개질된 고체를 유체분석 칩으로 사용하는 경우 그 성능이 저하될 수 있다.
더욱이, 고분자나 세라믹 표면에 생체물질의 고정이 어렵고 그 결과 분석 결과의 신뢰도가 크게 저하한다.
이를 해소하기 위해 고체의 표면에 극성 관능기를 도입하여 표면의 젖음성(wettability)이나 부착성(adhesion) 등을 증가시킬 수 있는 다양한 개질 방법이 제안되었다.
이러한 고체의 표면을 개질하는 방법은, 크게 물리적 표면 개질 방법과 화학적 표면 개질 방법으로 나눌 수 있으며 물리적 표면 개질 방법은, 프레임(Flame)을 이용한 고체 표면 처리 방법, 코로나 방전(Corona Discharge Treatment), 플라즈마 처리(Plasma Treatment), 어블레이션과 형질전환(Ablation and Transformation), 자외선 조사(UV Irradiation)등의 방법이 있다.
그러나, 이러한 물리적 표면 개질 방법은 처리 공정이 간편하나 고체의 표면 개질이 일시적이고 장기간 사용시 소수성 성질로 다시 변환하거나, 일부 방법의 경우 장치가 고가인 문제가 있다.
한편, 화학적 표면 개질 방법으로는 금속 증착(Metalization), 플라즈마를 이용한 고분자 중합(Plasma Polymerization), 가수 분해(Hydrolysis), 자기조립박막적층 방법(SAM deposition)등의 방법이 있다.
상기 화학적 표면 개질 방법은 개질이 영구적이라는 이점이 있으나 자기조립박막 등의 경우 고체 표면과 낮은 접착력을 갖고 공정의 민감성과 폐기물로 인해 다량 생산에 한계가 있다.
한국공개특허: 10-2011-0055904 (공개일: 2011.05.26) 한국공개특허: 10-2004-0010640 (공개일: 2004.01.31) 한국등록특허: 10-2006-0123685 (등록일: 2007.09.27) 한국공개특허: 10-2004-0094686 (공개일: 2004.11.10)
본 발명은 상기와 같은 종래 기술에서의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 고상의 재질이나 형상에 따른 제약 없이 고상 표면에 바이오 물질 또는 기능성 물질 등의 활성물질을 강하고 안정적으로 고정화시킬 수 있도록 고상 표면을 개질하는 방법 및 이에 의해 개질된 표면을 가지는 입자 또는 시트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 (a) 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 표면 개질제를 준비하는 단계, (b) 고상 표면을 전처리하는 단계, (c) 상기 단계 (a)에서 준비된 표면 개질제로 상기 고상 표면을 개질하는 단계로 구성되는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법을 제공한다.
또한, 본 발명에서 사용되는 표면 개질제는, 폴리비닐피롤리돈 (Polyvinylpyrrolidone, PVP)과 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 표면 개질제를 제조하는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]
Figure 112014018419002-pat00001
(단, 상기 화학식에서 n : m = α : 1-α이며, 0 < α < 1 임).
또한, 상기 단계 (b)에서, 상기 고상의 표면과 아민기 도입 물질을 반응시켜 아민기를 도입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 아민기 도입 물질은 시스테아민, 페닐아민, 아미노티오페놀, 아릴옥시알킬아민, 3-멀캡토프로필트리매톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메 톡시실란, N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이 클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로 이루어진 군에서 선택 되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고상은 금속, 세라믹 또는 고분자로 이루어진 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 금속은 강(steel), 티타늄(Ti), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd) 및 구리(Cu)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 세라믹은 산화규소(SiO2), 산화티타늄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화니오븀(Nb2O5), 수산화인회석(hydroxyapatite), 유리(glass)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose), 나일론(nylon) 및 폴리비닐리덴플루오리드(PVDF)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (b)에서는, 유리 플레이트의 표면을 피라나 용액(piranha solution)과 반응시킨 후 알코올과 반응시켜 히드록실기를 도입하고, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란을 이용하여 유리 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (b)에서는, 금(Au) 플레이트를 알코올과 반응시켜 표면에 히드록실기를 도입하고, 시스테아민(MEA)을 이용하여 금 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (b)에서는, 실리카 입자를 알코올과 3-멀캡토프로필트리매톡시실란(MPTS)과 반응시켜 표면에 티올기를 도입하고, 아민기를 가지는 양자점을 티올기가 표면에 도입된 실리카 입자에 부착시켜 실리카 입자 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (b)에서는, 폴리스티렌(PS) 플레이트 표면을 산소 플라즈마 처리한 후 테트라에틸올쏘실리케이트(TEOS)와 반응시켜 표면에 히드록실기를 도입하고, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APMES)과 반응시켜 폴리스티렌 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (c)는 상기 고상 표면에 상기 표면 개질제를 첨가하여 교반하는 방법으로 반응시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 (c)를 거친 후 글루타알데히드를 첨가하여 고상 표면과 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
그리고, 본 발명은 다른 측면으로서 상기 표면 개질방법에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트를 제공한다.
본 발명에 따르면, 표면 개질제를 이용해 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 작용기를 고상의 표면견고하고 강하게 고정함으로써 각종 생체 분자를 안정하게 접합시킬 수 있으며, 더욱이, 고상의 재질이나 형상에 따라 표면 개질의 정도가 영향을 받지 않기 때문에 본 발명은 바이오 센서 등의 제조에 광범위하고 유용하게 사용될 수 있다.
나아가, 상기 표면 개질제를 파우더 형태로 제조함으로써 이를 이용하여 제조장소 및 생산설비에 영향을 받지 않고 고상 표면을 개질 할 수 있다.
도 1은, 본 발명에 따른 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법에 대한 공정도이다.
도 2는, 본 발명에 따른 고상 표면 개질방법에 따라 표면 개질제(PVP-GA)로 표면이 개질된 고상 시트를 모식적으로 보여주는 개념도이다.
도 3은, 본원 실시예에서 표면 개질제로서 사용되는 PVP-GA의 제조과정을 보여주는 개념도이다.
도 4는, 본원 실시예 1에 따른 유리 플레이트의 표면을 개질하는 과정을 보여주는 개념도이다.
도 5는, 본원 실시예 2에 따른 금(Au) 플레이트의 표면 개질과정을 보여주는 개념도이다.
도 6은, 본원 실시예 3에 따른 양자점으로 코팅된 실리카 입자의 표면 개질과정을 보여주는 개념도이다.
도 7은, 본원 실시예 4에 따른 폴리스티렌 마이크로플레이트의 표면 개질과정을 보여주는 개념도이다.
도 8은, 본원 실시예에서 표면 개질된 유리 플레이트와 금 플레이트 표면에 형광물질이 도입된 항체를 컨주게이션하여 형광분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시 예의 상세한 설명은 첨부된 도면들을 참조하여 설명할 것이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다.
본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시 예들을 도면에 예시하고 본 명세서 또는 출원에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나 이는 본 발명의 개념에 따른 실시 예를 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시 예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 실시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다음으로, 본 발명에 따른 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법에 대해 설명한다.
본 발명에 따른 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법은, (a) 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 표면 개질제를 준비하는 단계, (b) 고상 표면을 전처리하는 단계, (c) 상기 단계 (a)에서 준비된 표면 개질제로 상기 고상 표면을 개질하는 단계를 포함하며, 이하에서 상기 각 단계에 대해 상세히 설명한다.
먼저, 본 발명의 고상 표면 개질방법에서 단계 (a)는 고상의 표면을 개질하기 위해 표면 개질제를 제조하는 단계로서, 본 발명에서 사용되는 표면 개질제로서는, 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP)과 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)을 반응시켜 형성되며, 생체분자가 도입될 수 있는 알데히드기를 말단에 가지는 하기 화학식 1로 표시되는 고분자를 사용하는 것이 바람직하다.
[화학식 1]
Figure 112014018419002-pat00002
(단, 상기 화학식에서 n : m = α : 1-α이며, 0 < α < 1 임).
또한, 본 발명의 고상 표면 개질방법의 단계 (b)는, 표면 개질제를 고상 표면에 고정시키기 전에 고상의 표면을 전처리하는 단계로서, 본 단계의 구체적인 수행 방법은 표면 개질제 및/또는 고상의 재질에 따라 적절하게 택할 수 있으며, 상기 화학식 1로 표시되는 표면 개질제를 사용할 경우에는 고상 표면과 아민기 도입 물질을 반응시켜 고상 표면에 아민기를 도입하는 것이 바람직하며, 이하에서는 이를 기초로 상세히 설명한다.
고상 표면에 아민기를 도입하기 위해서는 먼저 고상의 표면에 히드록실기 또는 티올기 등의 반응성 작용기를 도입하는 것이 바람직하며, 이를 위해 고상의 재질에 따라 과산화물 용액, 과유산물 및 알코올 등으로 표면을 처리하거나 코로나 방전기(corona discharger), 플라즈마 발생기(plasma system), 플라즈마 애셔(plasma asher) 등 다양한 형태의 플라즈마 발생 장치를 이용해 표면을 처리해 고상 표면히드록실기 또는 티올기 등의 반응성 작용기를 도입할 수 있다.
그리고나서, 아민기 도입 물질로서 아민기 포함 화합물을 이용해 히드록실기 또는 티올기 등의 작용기가 도입된 고상의 표면에 아민기를 도입하게 되는데, 이를 위한 구체적인 방법은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 아미노 실란(amino silane)을 포함하는 용액에 기판을 침지시키거나 상기 용액을 스핀 코팅(spin coating)을 통해 기판상에 도포하는 방법으로 수행할 수 있다.
이때, 상기 아미노 실란은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며 시스테아민, 페닐아민, 아미노티오페놀, 아릴옥시알킬아민, 3-멀캡토프로필트리매톡시실란(MPTS), 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES), 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS), N-6-아미노헥실-3-아미노프로필트리메톡시실란(AHAPS), N-2-아미노에틸-3-아미노프로필메틸디메톡시실란(AEAPS), 3-아미노프로필-디메틸에톡시실란(APMES), 3-N,N-디메틸-아미노프로필트리메톡시실란(DMAPS) 등을 그 구체적인 예로 들 수 있다.
본 단계에서 고상의 표면에 아민기를 도입하기 위한 보다 구체적인 방법은 고상의 재질에 따라 상이할 수 있다.
예를 들어, 유리 플레이트는 표면을 피라나 용액(piranha solution)과 반응시킨 후 알코올과 반응시켜 히드록실기를 도입하고, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란을 이용하여 유리 플레이트 표면에 아민기를 도입할 수 있다.
또한, 금(Au) 플레이트의 경우에는 알코올과 반응시켜 표면에 히드록실기를 도입하고, 시스테아민(MEA)을 이용하여 금 플레이트 표면에 아민기를 도입할 수 있다.
또한, 실리카 입자는 알코올과 3-멀캡토프로필트리매톡시실란(MPTS)과 반응시켜 표면에 티올기를 도입하고, 아민기를 가지는 양자점을 티올기가 표면에 도입된 실리카 입자에 부착시켜 실리카 입자 표면에 아민기를 도입할 수 있다.
또한, 폴리스티렌 플레이트는 표면을 산소 플라즈마 처리 후 테트라에틸올쏘실리케이트(TEOS)와 반응시켜 히드록실기를 도입하는 공정과 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APMES)과 반응시켜 아민기를 도입하는 공정으로 구성되며, 도 7은 공정 과정을 도식적으로 보여주는 공정도이다.
한편, 본 발명에 따른 고상 표면 개질방법에 있어서, 고상의 재질은 상기에서 언급한 소재에 국한된 것이 아님은 물론이며, (i)강(steel), 티타늄(Ti), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu) 등과 같은 금속, (ii)산화규소(SiO2), 산화티타늄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화니오븀(Nb2O5), 수산화인회석(hydroxyapatite), 유리(glass) 등과 같은 세라믹, (iii) 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose), 나일론(nylon), 폴리비닐리덴플루오리드(polyvinylidene fluoride) 등과 같은 고분자 등 다양한 소재로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에서 표면이 개질되는 고상은 그 형상에 있어서도 제약을 갖지 않으므로, 입자(particle), 펠릿(pellet), 플레이트(plate), 시트(sheet), 스트립(strip) 등 어떠한 형상을 가져도 무방하다.
다음으로, 본 발명의 고상 표면 개질방법의 단계 (c)는 고상에 표면 개질제를 첨가하여 교반하는 방법 등을 통해 고상 표면과 표면 개질제를 충분한 시간동안 반응시켜 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 관능기를 가지는 표면 개질를 고상 표면에 고정시키게 된다.
참고로, 도 2는 아민기가 도입된 고상 표면에 상기에서 언급한 화학식 1로 표시되는 표면 개질제를 이용해 표면에 알데히드기가 노출되도록 고상 표면을 개질하는 것을 모식적으로 보여주는 개념도이다.
상기 단계 (c)를 수행한 후의 선택적인 단계로서, 생체분자와 결합할 수 있는 기능기가 고상 표면 전체에 걸쳐 보다 고르게 형성될 수 있도록 상기 기능기 포함 물질을 고상 표면과 반응시키는 단계를 더 수행할 수 있으며, 예를 들어, 글루타알데히드를 첨가하여 고상 표면과 반응시킬 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고상 표면 개질방법은 고상 표면을 개질하는 단계 후에 고상의 표면에 PVP-GA를 잘 고정하기 위해 pH를 약알칼리(pH 8 ~ 9)로 조정해 주는 탄산수소나트륨(NaHCO3)용액으로 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 단계 (c)를 수행한 후에 고상의 표면에 존재하는 작용기인 알데히드기를 통해 생체 분자와 컨주게이션(conjugation)시키는 단계를 추가적으로 수행하여 목적하는 바이오 센서를 제작할 수 있는데, 고상 표면에 도입 가능한 생체 분자는 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(strept avidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin) 및 방사선 동위원소 표지 물질등으로 다양한 생체분자를 선택적으로 도입할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예에 따라 본 발명에 따른 표면개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 상세하게 설명한다.
<실시예 1> 유리 플레이트 표면의 개질
(1)표면 개질제(PVP-GA)의 제조
도 3은, 본 실시예에서 고상 표면의 개질에 사용되는 표면 개질제인 PVP-GA의 제조 과정을 도식적으로 나타낸 공정도로서, 도 3에 따르면, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100mM)에 PVP(40KDa)와 glutaraldehyde를 2:1의 몰 비율로 첨가하여 3시간 동안 상온에서 반응을 시킨 후 반투막(cut off: 12KDa)을 이용해서 PVP-glutaraldehyde(PVP-GA)를 정제하며, 상기와 같은 방법으로 얻은 PVP-GA는 동결 건조하여 파우더 형태로 보관한다.
(2)유리 플레이트 표면의 개질
도 4은, 본 발명에 따른 표면 개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 이용하여 유리 플레이트의 표면을 개질하는 방법에 대한 개념도이다.
본 발명에 따른 표면 개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 이용하여 유리 플레이트의 표면을 개질하는 방법은 먼저, 유리 플레이트의 표면에 세척 및 히드록실기를 도입하기 위해 피라나 용액(H2SO4:H2O2)에 15분 정도 반응시킨 후 유리 플레이트의 표면을 증류수 및 이소프로필알코올로 각각 3차례 세척한다.
다음, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란 100㎕와 IPA 10㎖을 혼합한 1% v/v 용액 1㎖과 유리 플레이트를 상온에서 100 rpm으로 3시간 동안 교반하여 아민기(-NH2)로 표면 개질된 유리 플레이트를 얻는다.
상기한 방법으로 처리되어 아민기가 도입된 유리 플레이트의 표면을 IPA 및 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100m㏖)으로 세척한다.
다음, PVP-GA 80mg와 탄산수소나트륨(NaHCO3)용액(pH 9, 100m㏖) 2㎖를 혼합한 용액에 유리 플레이트를 담가 상온에서 6시간 동안 100rpm으로 교반한 후 수소화붕소나트륨(NaBH4) 1mg을 넣어 1시간 더 반응을 시킨다.
다음, 상기의 반응 후 유리 플레이트의 표면을 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100m㏖)으로 1회 세척한 후 글루타알데히드 20㎕와 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100m㏖) 2㎖를 넣어 상온에서 1시간 동안 100rpm으로 교반시킨다.
마지막으로, 탄산수소나트륨(NaHCO3)용액(pH 9, 100m㏖)으로 3차례 세척하여 표면이 알데히드기(-CHO)로 개질된 유리 플레이트를 제조하였다.
<실시예 2> 금 플레이트 표면의 개질
도 5는, 본 발명에 따른 표면개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 이용하여 금플레이트를 개질하기 위해 수행되는 공정 단계에 대한 개념도이다.
본 실시예 1에서 제조된 표면 개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법으로 금 플레이트 표면을 개질하는 방법은 먼저, 금 플레이트의 일측면을 에탄올로 세척하고, 7.715mg의 MEA(시스테아민)과 10 ㎖ 에탄올로 이루어진 혼합용액 1㎖을 금 플레이트와 상온에서 3시간 동안 100rpm으로 교반한 후 에탄올로 3차례 세척을 하면 아민기(-NH2)가 금 플레이트 표면에 도입된다.
상기한 방법으로 처리된 금 플레이트 표면을 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100m㏖)으로 세척을 한 후, 80mg PVP-GA와 2㎖ 탄산수소나트륨(NaHCO3, pH 9, 100m㏖)을 혼합한 용액에 담가 상온에서 6시간 동안 100 rpm으로 교반한 후, 수소화붕소나트륨(NaBH4) 1mg을 넣어 1시간 더 반응을 시킨다.
상기한 방법으로 처리한 금 플레이트를 탄산수소나트륨(NaHCO3)용액(pH 9, 100m㏖)으로 세척 후 20㎕ 글루타알데히드와 2㎖ 탄산수소나트륨(NaHCO3) 용액(pH 9, 100m㏖)을 넣어 상온에서 1시간 동안 100rpm으로 교반한다.
마지막으로, 탄산수소나트륨용액(pH 9, 100m㏖)으로 3차례 세척하여 표면이 알데히드기로 개질된 금 플레이트를 제조한다.
<실시예 3> 양자점으로 코팅된 실리카입자의 표면개질
도 6은, 표면 개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 이용하여 실리카 입자표면을 개질하는 방법의 공정단계에 대한 개념도이며, 도 6에서 나타난 이미지는 각 공정단계의 반응결과물을 전자주사현미경(Scanning Electron Microscope)으로 관찰한 결과이다.
본 실시예 1에서 제조된 표면개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법으로 실리카입자표면을 개질하는 방법은 먼저, 1 ㎛의 크기의 실리카 입자를 증류수 1 ㎖에 녹인 후, 원심분리하여 실리카 입자를 침전시킨다.
다음, 실리카입자 표면을 에탄올 1㎖로 3회 세척하며 이와 같은 과정으로 증류수를 에탄올로 치환시킨 다음, 에탄올로 세척한 실리카입자 표면을 3-멀캡토프로필트리매톡시실란 2㎕와 암모니아수(Na4OH) 5㎕의 혼합용액과 함께 상온에서 12시간 동안 교반하여 실리카입자표면의 작용기를 히드록실기에서 티올기로 바꿔준다.
다음, 실리카입자표면을 에탄올로 세척하고, 1 ㎖ 클로로포름(CHCl3)에 녹여주는데 이와 같은 과정을 3회 반복한 후, 클로로포름에 녹아있는 실리카 입자를 50 ㎕의 양자점(Quantum Dot)과 상온에서 3분 동안 교반하여 실리카입자를 아민기가 고정된 양자점으로 코팅하여, 실리카 입자와 결합되지 않은 양자점을 원심분리하여 제거하고 아민기가 고정된 양자점이 도입된 실리카입자를 클로로포름으로 3번 세척한다.
상기한 방법으로 처리하여 아민기가 고정된 양자점이 도입된 실리카 입자를, 1mg PVP-GA와 함께 클로로포름(CHCl3) 1㎖에 혼합하고, 상온에서 3시간 동안 교반하여 소수성이였던 실리카 입자를 양친매성으로 치환하고, 탄산수소나트륨(NaHCO3) 완충액(pH 9, 0.1 ㏖)으로 3회 세척한 후 글루타알데히드(glutaraldehyde) 3㎕를 넣고 2분 동안 교반한다.
상기한 방법으로 제조된 용액을 탄산수소나트륨 완충액으로 세 번 세척하여 알데히드기로 표면이 개질된 양자점 실리카 입자를 만들었다.
<실시예 4> 고분자 표면의 개질
먼저, 도 7은 본 단계에서 수행되는 표면 개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법을 이용하여 폴리스티렌 플레이트의 표면을 개질하는 방법의 공정단계에 대한 개념도이다.
본 실시예 1에서 제조된 표면개질제를 이용한 고상의 표면 개질방법으로 폴리스티렌 plate의 표면을 개질하는 방법은 먼저, 폴리스티렌 plate를 O2 plasma로 5분간 처리하여 산화시키고, 에탄올에 혼합된 1%(v/v) TEOS(테트라에틸올쏘실리케이트)를 각 well당 200 ㎕씩 넣고 150rpm으로 3시간 교반한 후 에탄올로 3회 세척하여 폴리스티렌 plate의 표면의 작용기를 아민기로 치환한다.
다음, 에탄올에 혼합된 1%(v/v) APMES(3-아미노프로필디메틸에톡시실란)을 각 well당 200㎕씩 넣고 150rpm으로 2시간 교반하고, 에탄올로 2회 세척한 후, 탄산수소나트륨(NaHCO3)용액(pH 9, 100m㏖)으로 다시 2회 세척한다.
마지막으로 PVP-GA 80mg 와 탄산수소나트륨 용액(pH 9, 100m㏖) 2㎖를 혼합 한 용액을 각 well당 200㎕씩 넣고 150rpm으로 2시간 교반 후, 탄산수소나트륨용액으로 3회 세척하여 알데히드기로 표면이 치환된 폴리스티렌 플레이트를 제조한다.
도 8은 상기 실시예 1 및 2에서 표면 개질된 유리 플레이트와 금 플레이트 표면에 형광물질이 도입된 CD11b 항체를 컨주게이션하여 형광 신호를 측정한 결과를 보여주는데, 도 8로부터 본 발명에 따른 고상 표면의 개질방법에 의해 고상 표면이 개질되어 생체분자의 결합이 가능한 알데히드기가 표면에 노출되었음을 간접적으로 확인할 수 있다.

Claims (16)

  1. (a) 말단에 생체 분자의 도입이 가능한 표면 개질제를 준비하는 단계;
    (b) 고상 표면을 전처리하는 단계;
    (c) 상기 단계 (a)에서 준비된 표면 개질제로 상기 고상 표면을 개질하는 단계;를 포함하되,
    상기 단계 (a)에서, 폴리비닐피롤리돈(Polyvinylpyrrolidone, PVP)과 글루타알데히드(Glutaraldehyde, GA)를 반응시켜 하기 화학식 1로 표시되는 표면 개질제를 제조하는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법:
    [화학식 1]
    Figure 112014125530151-pat00012

    (단, 상기 화학식에서 n : m = α : 1-α 이며, 0 < α < 1 임).
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서, 상기 고상의 표면과 아민기 도입 물질을 반응시켜 아민기를 도입하는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 아민기 도입 물질은 시스테아민, 페닐아민, 아미노티오페놀, 아릴옥시알킬아민, 3-멀캡토프로필트리매톡시실란, 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-2-아미노에틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 고상은 금속, 세라믹 또는 고분자로 이루어진 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 금속은 강(steel), 티타늄(Ti), 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd) 및 구리(Cu)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 세라믹은 산화규소(SiO2), 산화티타늄(TiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화니오븀(Nb2O5), 수산화인회석(hydroxyapatite) 및 유리(glass)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    상기 고분자는 폴리스티렌(PS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 폴리술폰(polysulfone), 폴리에테르술폰(polyethersulfone), 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose), 나일론(nylon) 및 폴리비닐리덴플루오리드(polyvinylidene fluoride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  9. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서는, 유리 플레이트의 표면을 피라나 용액(piranha solution)과 반응시킨 후 알코올과 반응시켜 히드록실기를 도입하고, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란을 이용하여 유리 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  10. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서는, 금(Au) 플레이트를 알코올과 반응시켜 표면에 히드록실기를 도입하고, 시스테아민(MEA)을 이용하여 금 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  11. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서는, 실리카 입자를 알코올과 3-멀캡토프로필트리매톡시실란(MPTS)과 반응시켜 표면에 티올기를 도입하고, 아민기를 가지는 양자점을 티올기가 표면에 도입된 실리카 입자에 부착시켜 실리카 입자 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 하는 생체분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  12. 제 3항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서는, 폴리스티렌(PS) 플레이트 표면을 산소 플라즈마 처리한 후 테트라에틸올쏘실리케이트(TEOS)와 반응시켜 표면에 히드록실기를 도입하고, 3-아미노프로필디메틸에톡시실란(APMES)과 반응시켜 폴리스티렌 플레이트 표면에 아민기를 도입하는 것을 특징으로 하는 생체분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)는 상기 고상 표면에 상기 표면 개질제를 첨가하여 교반하는 방법으로 반응시키는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)를 거친 후 글루타알데히드를 첨가하여 고상 표면과 반응시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법.
  15. 제 1항 및 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 표면이 개질된 나노입자.
  16. 제 1항 및 제 3항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 표면이 개질된 시트.
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