KR20230034001A - 전기화학적 면역분석을 위한 표면 개질 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (a) 기판 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 아민기가 도입된 기판 표면에 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용액을 처리하는 단계를 포함하는, 표면 개질 방법에 관한 것으로, 전기화학적 단백질 분석 방법에서 신호가 규칙적으로 나타나 분석 효율을 상승시킬 수 있다.

Description

전기화학적 면역분석을 위한 표면 개질 방법 {Surface modification method for electrochemical immunoassay}
본 발명은 고분자 용액, 상세하게는 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 또는 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)를 포함하는 용액을 이용한 바이오센서 기판의 표면 개질 방법에 관한 것으로, 전기화학적 면역분석에서 이용되는 바이오센서 기판의 표면 개질 방법에 관한 것이다.
바이오센서는 측정 대상물로부터 정보를 얻기 위하여 생물학적 요소를 이용하되, 이를 인식 가능한 신호로 변환시키는 시스템으로, 1962년 포도당 측정을 위한 Clark의 투석막을 이용한 센서를 개발한 이래로, 생물, 화학, 전자 등의 다방면에서 기술발전에 따라 함께 발전되어 왔다. 바이오센서는 일반적으로 생체감지물질, 센서매트릭스 및 신호변환기를 구성으로 하고, 이의 종류에 따라 매우 다양한 종류의 바이오센서가 존재하고 그에 따라 특정 대상을 정성적으로 또는 정량적으로 측정할 수 있는 방법이 매우 다양하게 존재한다.
면역센서는 바이오센서의 하나로, 선택성 및 결합력이 높은 항원-항체 간의 특이적 결합을 이용한 센서로, 1975년 Kohler와 Milstein에 의한 단일클론항체 생산기술의 개발이후 각광을 받기 시작하여 현재까지 유용하게 사용되고 있다. 면역센서는 신호변환기의 종류에 따라 전기화학적, 광학적, 질량, 열적 면역센서가 존재한다. 이 중, 전기화학적 면역센서는 생물학적 물질의 특이적 반응에 의해 생긴 전자이동변화를 측정하는 면역센서로, 전위차법(potentiometric), 전류법(amperometric), 전도도법(conductometric), 또는 임피던스법(impedimetric) 등을 이용하여 분석한다.
면역분석의 대표적인 방법은 효소결합면역흡착검사(ELISA)로, 효소가 표지된 항체를 플레이트에 결합시키고, 기질을 첨가하여 원 시료에 존재하는 항원의 양에 비례하는 색 또는 광 변화를 측정하여 분석 대상물을 정성, 정량분석하는 검사방법으로, 환경, 식품 안전, 바이오마커, 질병 진단, 제약 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다.
효소결합면역흡착검사(ELISA)는 크게 직접 효소결합면역흡착검사(Direct ELISA), 간접 효소결합면역흡착검사(Indirect ELISA), 샌드위치 효소결합면역흡착검사(Sandwich ELISA), 경쟁적 효소결합면역흡착검사(Competitive ELISA) 등 여러 가지 방법이 존재한다. 효소결합면역흡착검사는 고정항체, 측정 대상 단백질, 검출항체, 효소 등의 생물학적 물질을 이용하며, 이들이 가지는 선택성과 안정성을 유지하기 위한 방법이 요구된다. 이를 위하여 표면 개질을 하며, 통상적으로는 기판에 다수의 반응성 작용기를 가지는 물질을 도입하여 지지대를 형성하는 방법에 의하고 있다. 이후, 반응성 작용기를 가지는 물질을 도입 후 고정항체와 특정 화학결합을 통해 항체를 기판에 고정시키는 방법에 의해 분석을 진행할 수 있다. 이 때 사용되는 표면 개질 방법으로는 코로나 방전(Corona Discharge Treatment), 플라즈마 처리(Plasma Treatment), 레이저 어블레이션(Laser Ablation), 자외선 조사 등의 물리적 표면 개질, 금속 증착(Metalization), 고분자 중합(Plasma Polymerization), 가수분해(Hydrolysis) 등의 화학적 표면 개질 방법이 있다.
다만, 표면개질을 하더라도 고정항체 이외에 검출항체, 효소 등의 경우에도 표면에 아민기, 카르복실기, 히드록시기, 할로기, 에폭시기, 알데히드기, 티올기 등의 다양한 작용기에 의해 기판에 고정될 가능성이 있고, 이러한 결합은 분석 오류로 나타난다. 이와 관련하여, 대한민국등록특허 제10-0555793호에서는 아미노-덱스트란 또는 키토산으로 그래프팅된 고체 지지체 표면을 형성하고, 이후 광분해성 보호기가 있는 스페이서를 결합시켜 특이적으로 생체물질을 고정화하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국등록특허 제10-1489868호에서는 폴리비닐피롤리돈 및 글루타르알데히드를 통해 표면개질하는 방법이 개시되어 있으며, 대한민국등록특허 제10-1596287호에서는 실리콘옥사이드, APTES(3-아미노프로필트리에톡시실란), 및 숙신안하이드라이드를 통해 카르복실기로 표면을 개질하는 방법이 개시되어 있다.
본 발명자들은 이와 달리 전기화학적 면역분석, 특히 미결합 검출항체에 따른 전기화학적 면역분석에서 특이적으로 우수한 효과를 보이는 표면 개질 방법을 밝힘에 따라, 본 발명을 완성하였다.
한국등록특허 제10-0555793호 한국등록특허 제10-1489868호 한국등록특허 제10-1596287호
면역센서의 기술동향 및 전망, 박소정 외, KIC News, Volume 14, No. 1, 2011
본 발명은 비특이적 결합을 감소시킬 수 있는 표면 개질 방법을 제공하고자 한다. 본 발명은 미반응 검출 항체에 따른 전기화학적 면역분석에서 비특이적 결합을 감소시킴에 따라 분석 효율 및 안정성을 향상시키기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 기판 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 아민기가 도입된 기판 표면에 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 표면 개질 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 기판은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화티타늄(TiO2), 유리(glass), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate), 폴리설폰(Polysulfone), 및 폴리에테르설폰(Polyethersulfone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 기판은 폴리스티렌이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 아민기 도입은 3-아미노프로필 트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane, APTES) 용액에 의한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액은 수용액이고, 0.1 내지 1.0 % (w/v)이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 피라나 용액으로 표면 처리한 후, 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액으로 기판 표면에 아민기를 도입하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)에서 처리 용액은, 극성용매와 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)의 혼합용액이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)에서 처리 용액의 농도는 1 내지 10 % (w/v)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 표면 개질 방법은 전기화학적 단백질 검출에 사용되는 것이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 전기화학적 단백질 검출은 1차 항체, 분석 대상 단백질 및 2차 항체를 순차적으로 투입하는 단계로 수행되는 것이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 전기화학적 단백질 검출은, (i) 표면 개질된 기판 상에 1차 항체를 고정시키는 단계; (ii) 분석 대상 단백질을 투입하여 1차 항체와 결합시키는 단계; (iii) 분석 대상 단백질과 2차 항체를 결합시키는 단계; 및 (iv) 상기 단계에서 전극에 노출시켜 전류 변화를 측정하며, 2차 항체 투입 전후의 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 표면 개질 방법에 따라 표면 개질된 바이오 센서를 제공한다.
본 발명은 표면 개질됨에 따라 기판과 고정 항체의 특이적 결합은 높으나, 기판과 분석 대상 단백질, 기판과 검출 항체의 결합은 현저하게 낮춤으로써, 전기화학적 단백질 분석 방법에서 신호가 규칙적으로 나타나 분석 효율이 우수하다는 이점이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 실시형태는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명은 (a) 기판 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)에서 아민기가 도입된 기판 표면에 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 표면 개질 방법에 관한 것이다.
본 발명의 각 단계에서, 세척하거나 교반시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 표면 개질의 효율을 높이기 위하여 조절될 수 있다. 이 때, 세척하거나 교반하는 방법 예를 들어, 세척 주기, 세척 회수 등은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 표면 개질 방법은 비특이적 결합을 감소시킴에 따라 전기화학 신호를 규칙적으로 수신할 수 있어, 분석 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서, 상기 단계 (a)에서 기판 표면을 효율적으로 아민기로 처리하기 위해, 각종 작용기, 예를 들어, 할라이드기, 에폭시기, 알데히드기, 히드록시기 등을 처리한 후, 아민작용기를 포함하는 화합물을 투입하여 표면을 아민기로 처리할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 기판은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화티타늄(TiO2), 유리(glass), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate), 폴리설폰(Polysulfone), 및 폴리에테르설폰(Polyethersulfone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 기판은 폴리스티렌이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)에서 아민기 도입은 3-아미노프로필 트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane, APTES) 용액에 의한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액은 수용액이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액은 0.1 내지 1.0 % (w/v)이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (a)는 피라나 용액으로 표면 처리한 후, 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액으로 기판 표면에 아민기를 도입하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)에서 처리 용액은, 극성용매와 카르복시메틸 덱스트란, N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)의 혼합용액이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 단계 (b)에서 처리 용액은, 극성용매와 카르복시메틸 덱스트란, N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드의 혼합용액이고, 농도는 1 내지 10 % (w/v)이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 표면 개질 방법은 전기화학적 단백질 검출에 사용되는 것이다.
본 발명에서, 카르복시메틸 덱스트란으로 표면 처리 됨에 따라, 다른 작용기로 처리된 표면에 비하여 전기화학적 단백질 검출에서 분석 효율을 높일 수 있다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 전기화학적 단백질 검출은 1차 항체, 분석 대상 단백질 및 2차 항체를 순차적으로 투입하는 단계로 수행되는 것이다.
구체적인 본 발명의 일 양태에서, 상기 전기화학적 단백질 검출은, (i) 표면 개질된 기판 상에 1차 항체를 고정시키는 단계; (ii) 분석 대상 단백질을 투입하여 1차 항체와 결합시키는 단계; (iii) 분석 대상 단백질과 2차 항체를 결합시키는 단계; 및 (iv) 상기 단계에서 전극에 노출시켜 전류 변화를 측정하며, 2차 항체 투입 전후의 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명 전기화학적 단백질 검출의 각 단계에서, 배양하는 단계 및/또는 세척하는 단계를 더 포함할 수 있다. 각 단계에서 미반응 고정화 되지 않은 제1항체, 및/또는 결합되지 않은 분석 대상 단백질 등에 의한 배경 신호를 줄이기 위하여 반복하여 세척할 수 있고, 이를 통해 항체와 분석 대상 단백질 사이의 높은 상호 작용을 나타내도록 할 수 있다.
또한, 본 발명 전기화학적 단백질 검출의 각 단계에서 버퍼 흡인을 실시 할 수 있고, 버퍼 흡인을 통해, 잔류 버퍼, 부적합 결합체, 부적합 항체를 제거할 수 있다. 이때 사용되는 버퍼는 해당 분야에서 통상적으로 알려진 버퍼, 예를 들면, PBS(Phosphate-Buffered Saline), Tween-20, BSA(Bovine serum albumin), TBS(Tris-Buffered Saline), 수산화나트륨(NaOH), 과산화수소(H2O2) 등을 사용할 수 있으며, 이는 예시적인 것으로 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 전기화학적 단백질 검출의 각 단계에서 식별가능한 전기화학적 신호를 수신하기 위하여 반응시간, 희석배수, 세척회수, 플레이트 등을 적절한 방법에 의해 조절할 수 있다.
또한, 전기화학적 단백질 검출에서 사용되는 제1항체, 분석 대상 단백질, 제2항체는 특별히 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 표면 개질 방법에 따라 표면 개질된 바이오 센서를 제공한다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 아민기(-NH 2 ) 표면 처리
투명 폴리스티렌(polystyrene) 마이크로 플레이트(#439454)를 사용하여 표면 처리를 실시하였다. 투명 폴리스티렌 마이크로 플레이트 표면에서 피라나 용액(Piranhy solution, H2SO4, H2O, H2O2)을 밤새 30분 정도 반응시킨 후 표면을 증류수 및 에탄올로 세척하였다. 그 후, 플레이트와 0.5% w/v 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane, APTES) / 증류수(DI water) 혼합용액 200 μL 투입하고, 실온에서 30분간 동안 반응시켰다. 이후 300 μL 증류수로 800 rpm에서 1분간 교반하는 과정을 3회 반복하여 세척하였다. 이후, 1시간 동안 건조하여 아민기(-NH2)로 표면 개질된 투명 폴리스티렌 마이크로 플레이트를 수득하였다.
<실시예 2> 덱스트란 추가 표면 처리
상기 실시예 1에서 아민기로 표면 개질된 투명 폴리스티렌 마이크로 플레이트에서, 5% w/v 카르복시메틸 덱스트란(carboxymethyl dextran) / N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide) 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide) / DMSO(dimethyl sulfoxide) 혼합 용액을 20 μL 투입하여, 2시간 동안 반응시켰다. 이 후, DMSO 및 MC(methylchloride)로 800 rpm에서 1분간 교반하는 과정을 3회 반복하여 세척하였다. 이후, 1시간 동안 건조하여 펩타이드 결합(-NHCO)에 의해 덱스트란으로 표면 개질된 투명 폴리스티렌 마이크로 플레이트를 수득하였다.
<비교예 1-1> 아민기로 표면 개질
상기 실시예 1과 동일한 방법에 의해 아민기로 표면 개질된 플레이트를 수득하였다.
<비교예 1-2> 덱스트란으로 표면 개질
투명 폴리스티렌(polystyrene) 마이크로 플레이트(#439454)에서, 5% 아미노덱스트란(aminodextran) / DMSO(dimethyl sulfoxide) / 0.1% DMAP(dimethylaminopyridine) 혼합 용액을 200 μL 투입하여, 1시간 동안 반응시켰다. 이 후, DMSO 및 MC(methylchloride)로 800 rpm에서 1분간 교반하는 과정을 3회 반복하여 세척하였다. 이후, 1시간 동안 건조하여 덱스트란으로 표면 개질된 플레이트를 수득하였다.
<비교예 1-3> 아미노덱스트란으로 표면 개질
상기 비교예 1-2와 동일한 방법에 의해 덱스트란으로 표면 개질된 플레이트를 수득한 후, 0.02% 과요오드화나트륨 / DDW(dueterium depleted water) 용액을 투입하고, 12시간 반응시켜 알데히드로 표면 개질된 플레이트를 수득하였다. 이후, 0.1% 시아노히드리도붕산나트륨(NaBH3CN) / 0.5% 염화암모늄(NH4Cl) / DDW 혼합 용액을 준비하고, 아세트산을 pH 6까지 투입한 후, 48시간 동안 아미노화 반응을 진행시켰다. 이후, DDW 및 아세톤으로 세척한 후, 30분간 건조하여 아미노덱스트란으로 표면 개질된 플레이트를 수득하였다.
<실험예 1> 전기화학적 면역분석 실험
<실험예 1-1> 단백질 검출 프로토콜
하기와 같은 프로토콜을 거쳐 단백질 검출 프로토콜을 실시하였으며, 플레이트 표면에 고정된 항체, 분석 대상 단백질, 검출 항체의 효율을 비교하였다.
항체의 표면 고정화
PS 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)로 구성된 96 웰(well)을 코팅 버퍼(coating buffer)인 5% 과산화수소(H2O2)를 사용하여 pH 6.2에서 5 μg/mL 농도로 고정 항체를 코팅하였다. 이후 플레이트를 덮고 4 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 후, 코팅 용액을 제거하고, 각 웰에 수산화나트륨(NaOH) 100 mM을 채워 플레이트를 세척하였다.
분석 대상 단백질 결합
각 웰에 5% PBS(phosphate-buffered saline) 버퍼 200 μL를 투입한 후 플레이트를 덮고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 희석된 분석 대상 단백질 샘플 100μL를 각 웰에 투입하고, 37 ℃에서 90분 동안 배양하였다. 이후, 샘플을 제거하고 각 웰에 5% PBS 버퍼 200 μL를 투입하여 플레이트를 세척하였다.
검출 항체의 결합 및 미결합
희석된 검출 항체 100 μL를 각 웰에 투입하고, 플레이트를 덮고 실온에서 1시간 동안 배양하였다.
상기 각 단계에서 전극(Au)을 각 웰에 투입하여 어드미턴스(Admittance)를 측정하였다.
<실험예 1-2> 실험결과
상기 단백질 검출 프로토콜에 의해 코로나바이러스(Coronavirus, COVID-19)를 검출하였다. 고정 항체, 분석대상 단백질 및 검출 항체는 하기와 같다.
- 고정 항체: 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체
- 분석 대상 단백질: 코로나바이러스(Coronavirus, SARS-CoV-2, COVID-19)
- 검출 항체: 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 항체
분석결과, 본원 실시예 1 및 2를 통해 표면 개질된 플레이트에서 검출 항체의 비특이적인 결합이 우수하여 시간 및 검출항체의 농도에 따라 비례적으로 전기화학 신호(어드미턴스, Admittance)를 나타내는 것을 확인하여 신호안정성이 우수한 것을 확인였다. 이에 비해, 비교예 1-1 내지 1-3에 따른 표면 개질된 플레이트의 경우, 전기화학 신호가 불규칙적이거나 노이즈를 나타내어 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다.
<실험예 2> 비특이적 결합 억제 효과 비교
<실험예 2-1> 표면 개질된 플레이트를 사용한 면역분석
상기 실시예 1에 의해 표면 처리된 플레이트를 이용하여 전기화학적 면역분석 실험을 진행하였다. 각 프로토콜은 상기 실험예 1에 나타난 바와 같다.
<비교예 2-1> BSA(Bovine Serum Albumin)로 블로킹(blocking) 후 면역분석
폴리스티렌 마이크로 플레이트에서, 항체 표면 고정 후 BSA 용액을 통해 블로킹(blocking) 하였다. 1% BSA(aminodextran) / 0.02% Azide / PBS(phosphate-buffered saline) 혼합 용액을 200 μL 투입하여, 1시간 동안 반응시키고 밤새 인큐베이션 시켰다. 이 후, 0.02% 아자이드(azide)를 포함하는 PBS를 1분간 교반하는 과정을 3회 반복하여 세척하여, BSA로 블로킹 처리된 플레이트를 수득하였다. 이후, 알려진 방법에 따라 분석 대상 단백질, 검출 항체를 배양시키고, 상기 실험예 1에 따른 전기화학적 면역 분석을 실시하였다.
<비교예 2-2> 카제인(casein)으로 블로킹(blocking) 후 면역분석
상기 비교예 2-1과 동일한 방식에 의하되, 카제인(casein) 용액 대신 5% 카제인(casein) / PBS 혼합 용액을 사용하여 블로킹 후 전기화학적 면역 분석을 실시하였다.
<비교예 2-3> 유리 플레이트 / 실리콘 플레이트 사용하여 면역분석
상기 실시예 1, 2의 방식에 의하되, 폴리스티렌 마이크로 플레이트 대신 유리 플레이트 또는 실리콘 플레이트를 사용하여, 표면개질한 후 전기화학적 면역 분석을 실시하였다. 또는, 유리 플레이트 또는 실리콘 플레이트를 사용하여, 상기 비교예 2-1, 2-2와 같이 블로킹 처리 후 전기 화학적 면역 분석을 실시하였다.
<실험예 3> 실험결과
분석결과, 본원 실시예 1 및 2를 통해 표면 개질된 플레이트에서 검출 항체의 비특이적인 결합이 우수하여 시간 및 검출항체의 농도에 따라 비례적으로 전기화학 신호(어드미턴스, Admittance)를 나타내는 것을 확인하여 신호안정성이 우수한 것을 확인였다.
이에 비해, 비교예 2-1 내지 2-3에 따라 블로킹되거나, 타 플레이트를 사용한 경우, 전기화학 신호가 불규칙적으로 나타나거나 노이즈를 다소 포함되어 안정성이 떨어지는 것을 확인하였다.

Claims (13)

  1. (a) 기판 표면에 아민기(-NH2)를 도입하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 아민기가 도입된 기판 표면에 카르복시메틸 덱스트란(carboxylmethyl dextran), N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide 및 N-하이드록시숙신이미드(N-Hydroxysuccinimide)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용액을 처리하는 단계;를 포함하는, 표면 개질 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 기판은 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 구리(Cu), 산화규소(SiO2), 산화알루미늄(Al2O3), 산화티타늄(TiO2), 유리(glass), 폴리스티렌(Polystyrene), 폴리메틸 메타크릴레이트(Polymethyl Methacrylate), 폴리카보네이트(Polycarbonate), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(Polyethylene terephthalate), 폴리설폰(Polysulfone), 및 폴리에테르설폰(Polyethersulfone)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인, 표면 개질 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 기판은 폴리스티렌인, 표면 개질 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서 아민기 도입은 3-아미노프로필 트리에톡시실란((3-Aminopropyl)triethoxysilane, APTES) 용액에 의한 것인, 표면 개질 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액은 수용액인 것인, 표면 개질 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액은 0.1 내지 1.0 % (w/v)인, 표면 개질 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)는 피라나 용액으로 표면 처리한 후, 3-아미노프로필 트리에톡시실란 용액으로 기판 표면에 아민기를 도입하는 것인, 표면 개질 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 처리 용액은, 극성용매와 카르복시메틸 덱스트란, N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드의 혼합용액인 , 표면 개질 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 처리 용액은, 카르복시메틸 덱스트란, N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드 및 N-하이드록시숙신이미드의 혼합용액이고, 농도가 1 내지 10 % (w/v)인, 표면 개질 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표면 개질된 기판은 전기화학적 단백질 검출에 사용되는 것인, 표면 개질 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 단백질 검출은,
    1차 항체, 분석 대상 단백질 및 2차 항체를 순차적으로 투입하는 단계로 수행되는 것인, 표면 개질 방법.
  12. 제10항에 있어서,
    상기 전기화학적 단백질 검출은,
    (i) 표면 개질된 기판 상에 1차 항체를 고정시키는 단계;
    (ii) 분석 대상 단백질을 투입하여 1차 항체와 결합시키는 단계;
    (iii) 분석 대상 단백질과 2차 항체를 결합시키는 단계; 및
    (iv) 상기 단계에서 전극에 노출시켜 전류 변화를 측정하며,
    2차 항체 투입 전후의 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하는 것인, 표면 개질 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따라 표면 개질된 바이오 센서.
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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KR101489868B1 (ko) 2014-02-25 2015-02-05 강원대학교산학협력단 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트
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Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100555793B1 (ko) 2002-06-25 2006-03-03 주식회사 마크로젠 고분자 그래프팅에 의해 표면이 개질된 바이오 지지체 및 그 제조방법
KR101489868B1 (ko) 2014-02-25 2015-02-05 강원대학교산학협력단 생체 분자의 도입을 위한 고상 표면 개질방법, 이에 의해 표면이 개질된 나노입자 및 시트
KR101596287B1 (ko) 2014-04-24 2016-02-23 한국과학기술원 바이오물질 부착을 위한 기질필름의 표면처리방법 및 이를 이용한 면역센서칩

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
면역센서의 기술동향 및 전망, 박소정 외, KIC News, Volume 14, No. 1, 2011

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