WO2006033348A1 - 標識酵素 - Google Patents

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recognition element
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Kazunori Ikebukuro
Koji Sode
Hironobu Yamamoto
Akira Umezawa
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National University Corporation Tokyo University Of Agriculuture And Technology
O.S.P. Inc.
Umezawa, Kyoko
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/974—Thrombin

Definitions

  • the present invention relates to a labeling enzyme and a method for detecting and Z or quantifying a target substance using the labeling enzyme.
  • EIA enzyme immunoassays
  • ELISA Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
  • the measurement principle of the ELISA method is to react an antigen or antibody that is a target substance with an antibody or antigen linked to a labeling enzyme, and detect and Z or quantify the target substance's enzyme activity. . That is, in the ELISA method, highly sensitive detection of a target substance is achieved by amplifying a signal obtained by molecular recognition by an antibody or an antigen using an enzyme.
  • the above-mentioned labeling enzyme is also commonly used in the case of Satsuichi (Kazunori Ikebukuro, Koji Hayade “Highly Sensitive Detection of DNA Hybridization Using Enzyme Electrode Reaction”, Electrochemistry and Industrial Physics, 72 No. 8 ⁇ , p. 594–597, 2004).
  • the reaction product produced by the reaction catalyzed by the labeling enzyme is generally detected by absorption, fluorescence, or luminescence.
  • the enzyme reaction by the labeling enzyme is electrolyzed. The method of detection is the mainstream.
  • an object of the present invention is to easily and highly sensitively detect a target substance that is not easily affected by a coexisting substance in a method for measuring a target substance using an enzyme reaction, and to detect Z or Z. It is to provide a method for quantification.
  • the present invention relates to the following matters.
  • a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate.
  • step (b) The immobilized molecule recognition element generated in step (a) Target substance A substrate that gels by the catalytic action of the labeling enzyme is added to the complex of the labeled molecule recognition element, and the gel is formed on the substrate.
  • step (c) measuring the change in film thickness and Z or refractive index of the film on the substrate containing the gel produced in step (b),
  • a method for detecting and Z or quantifying a target substance comprising:
  • step (b) The complex molecule recognition element-target substance complex and the immobilized molecule recognition element produced in step (a) are added to the labeled target substance with a substrate that gels by the catalytic action of the label enzyme. And forming a gel on the substrate,
  • step (c) A step of measuring a change in film thickness and Z or refractive index of the film on the substrate containing the gel generated in step (b).
  • a method for detecting and Z or quantifying a target substance comprising:
  • a target substance measurement kit comprising: a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate; and a substrate that gels by the catalytic action of the labeling enzyme.
  • a target substance measurement kit comprising: a molecular recognition element to be obtained and a reagent for linking the labeling enzyme.
  • the labeling enzyme that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme that acts on a substrate to form a gel and can change the film thickness and Z or refractive index of the film. Since only a small amount of enzyme is required for the gelling reaction, according to the present invention, it is possible to construct a highly sensitive measurement system.
  • the labeling enzyme of the present invention is linked to a molecular recognition element such as an antigen or an antibody to label the molecular recognition element.
  • Examples of the labeling enzyme that can be used in the present invention include, but are not limited to, a force that can include a protease, a peptidase, and the like.
  • examples of the substrate that can be used in the present invention include proteins, polypeptides, peptides, and the like.
  • the labeling enzyme used in the present invention an enzyme involved in blood coagulation reaction is preferable. More preferably, the labeling enzyme used in the present invention is thrombin and the substrate is fibrinogen. This is because fibrinogen gelation by thrombin is a coexisting substance. This is because it is possible to perform a stable measurement that is difficult to be affected by. In this case, fibrinogen, which is a substrate, is hydrolyzed and gelled by thrombin, an enzyme involved in blood coagulation reaction, to produce insoluble fibrin. This causes changes in film thickness and z or refractive index.
  • endotoxin endotoxin
  • one of the blood coagulation reactions of horseshoe crab is a gel-like reaction caused by endotoxin or daricans (eg, j8-D darican etc.) and horseshoe moth-hemocyte extract (LA L, lysate).
  • LA L horseshoe moth-hemocyte extract
  • the gely reaction by endotoxin or daricans and horseshoe hemocyte extract is used in the field of quality control of pharmaceuticals and the like as a limulus test, and is easy to handle. It is a reaction.
  • a reagent derived from a horseshoe crab blood cell component that specifically reacts with endotoxin and gels it is commercially available from Wako Pure Chemical Industries (code number: 298 22341) and Seikagaku (Endospe 1). And can be easily obtained.
  • the former is a reconstituted lysate of force butagani after fractionation on a dextran sulfate sepharose column and then removing the factor G fraction.
  • the latter is endotoxin-specific by adding a large excess of carboxymethyl squid curdlan ( ⁇ -D-darlican) to the lysate and conversely suppressing the G factor activity.
  • reagents derived from Kabutoga blood cell components that react specifically with darican and the like to form a gel are commercially available from Seikagaku Corporation, Maruha, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (trade name: ⁇ -glycan test, etc.).
  • reagents derived from Kabutoga blood cell components that react specifically with darican and the like to form a gel are commercially available from Seikagaku Corporation, Maruha, Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (trade name: ⁇ -glycan test, etc.).
  • there is no specificity, but there are no gelling reagents Commercially available from Seikagaku Corporation (trade name: Endotoxin Toxin Test-D, etc.)!
  • Yet another suitable gely reaction is a silkworm fluid activated by darlicans such as peptide darican (one of bacterial cell wall components) and 13 darican (one of fungal cell wall components). Mention is made of Gelby reaction by the extract.
  • the silkworm body fluid extract is commercially available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. as an SLP reagent set (code number: 297-51500), and is readily available and suitable.
  • the labeling enzyme used in the present invention an inactive enzyme before activation or a precursor of an active enzyme can be used.
  • a substrate that can be used in the present invention a precursor of this substrate, which is not only a substrate on which a labeling enzyme acts directly and gels, can be used. That is, the “substrate” in the present invention is a concept including not only a substrate on which a labeling enzyme directly acts but also a precursor thereof.
  • the substrate used in the present invention may be a single substrate alone or a mixture of two or more substrates.
  • various active substances can be added in addition to the substrate. For example, when the gelation reaction is a cascade reaction including a plurality of reactions, an active substance or the like that activates the cascade reaction can be added to the reaction system.
  • the labeling enzyme of the present invention it is possible to amplify a signal obtained by a molecular recognition reaction using a molecular recognition element, and achieve highly sensitive detection of a target molecule.
  • the labeled enzyme of the present invention can be used for any molecular recognition reaction. Therefore, the labeled enzyme of the present invention is an inclusion compound that can be obtained only by a molecular recognition method using biologically related substances such as antibodies and nucleic acids. It can also be used for chemical molecular recognition methods such as molecular imprinting.
  • molecular recognition methods suitable for the present invention include, for example, antibodies, nucleic acids such as Abutama, proteins, hormone receptors, lectins, inclusion compounds, physiologically active substance receptors, and saddle-type formed by molecular imprinting. Examples thereof include molecular recognition methods using molecular recognition elements such as molecules.
  • the present invention can be applied to all known enzyme immunoassays.
  • the present invention can also be applied to an immunosensor using an enzyme immunoassay.
  • the present invention can also be used for a method in which the antibody antigen reaction in the enzyme immunoassay is replaced with a molecular recognition reaction by a molecular recognition element and its recognition target.
  • the enzyme immunoassay refers to a method for detecting and Z or quantifying a target substance by utilizing an enzyme reaction and an immune reaction. More specifically, an antigen-antibody reaction is performed using an enzyme-labeled antigen or antibody, and the target antibody is detected and Z or quantified by detecting the antigen-antibody reaction by measuring enzyme activity. It is a method to do. In general, a competitive method and a non-competitive method (for example, a sandwich method) are known as enzyme immunoassay methods.
  • an antigen or antibody is labeled with a labeling enzyme, and the labeled antigen or antibody is allowed to compete with a free antigen or free antibody in a sample to cause an antigen-antibody reaction with the corresponding antibody or antigen. Then, the substrate is added, and the antigen-antibody reaction signal is amplified by enzymatic reaction, and detection and Z or quantification are performed.
  • a sandwich method that is generally used as a non-competitive method, an unlabeled antibody (primary antibody, first antibody) is bound to a target substance (antigen) in a sample, and then an enzyme-labeled labeled antibody (secondary antibody). Antibody, second antibody) is bound to the complex of antigen and primary antibody.
  • the sandwich method has a wide application range with high detection sensitivity because the signal is amplified by the secondary antibody.
  • double-layer methods and the like are known as enzyme immunoassay methods, and the present invention can be applied to these assay methods.
  • the epidope is usually different between the primary antibody and the secondary antibody, but they may be the same in the present invention.
  • the first molecular recognition element and the second molecular recognition element corresponding to the primary antibody and the secondary antibody have a recognition site for the target molecule. They may be the same or different, but it is preferable that the recognition site for the target molecule is different between the first molecular recognition element and the second molecular recognition element.
  • the target substance refers to a substance that is a measurement target (target) in various measurement methods using the present invention.
  • the target substance is one kind. Or two or more.
  • the target substance is specifically recognized by the molecular recognition element. Therefore, the target substance of the present invention can be a recognition object of the molecular recognition element.
  • the target substance when an antibody is employed as the molecular recognition element, can be an antigen that is a recognition target of the molecular recognition element.
  • the molecular recognition element that can be used in the present invention can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation as long as the target substance can be recognized.
  • the mode of molecular recognition There are no particular restrictions on the mode of molecular recognition.
  • molecules can be recognized using physical adsorption, chemical adsorption, or the like. Therefore, the molecular recognition element of the present invention can recognize a target substance by, for example, hydrogen bonding, intermolecular force (Van 'der Waals force), coordination bond, ionic bond, covalent bond, and the like.
  • the molecular recognition element of the present invention include, as described above, for example, antibodies, nucleic acids such as abutama, proteins, hormone receptors, lectins, inclusion compounds, physiologically active substance receptors, Biologically relevant substances can be preferably mentioned.
  • cage molecules formed by molecular imprinting can be used as molecular recognition elements.
  • recognition targets of these molecular recognition elements include antigens in the case of antibodies, nucleic acids, proteins, tubulin, chitin, etc. in the case of nuclear acids, hormones in the case of hormone receptors, and lectins in the case of lectins.
  • the inclusion component can be mentioned, and in the case of a physiologically active substance receptor, a physiologically active substance can be mentioned.
  • the molecular recognition element and its recognition object are concepts that can be interchanged. That is, in general, even a combination that is considered to be a molecular recognition element and its recognition target object can be considered that the recognition target object recognizes the molecular recognition element from a certain point of view.
  • the recognition element can be considered as a “recognition object” and the recognition object as a “molecular recognition element”.
  • the antibody in molecular recognition using an antibody and an antigen, can be a molecular recognition element and the antigen can be a recognition target, while the antibody is a recognition target and the antigen is a molecular recognition element. It is also possible to think.
  • the antibody that can be used as the molecular recognition element of the present invention is not particularly limited as long as it specifically causes an antigen-antibody reaction with a target antigen (target substance), and both a monoclonal antibody and a polyclonal antibody can be used. Can do. Since detection with high sensitivity is possible, it is preferable to use a monoclonal antibody from the viewpoint of sensitivity.
  • the present invention is applied to the sandwich ELISA method, the primary antibody (first antibody) and the secondary antibody (second antibody) as described above are different even if they have the same epitope. However, it is preferable that they are different.
  • an antibody that can be used as a molecular recognition element may be a part of an antibody.
  • an antibody that recognizes a target substance is a mouse obtained by using a clone of a fusion cell of a spleen cell and a myeloma cell of a mouse immunized with a purified pathogenic factor, that is, a toxin or a fungus body.
  • a purified pathogenic factor that is, a toxin or a fungus body.
  • Polyclonal antibodies were purified from sera obtained by immunizing rabbits, goats, rats, hidges, chickens, butterflies, donkeys, guinea pigs, nu, ushi, etc. using antigens such as toxins. You can use things.
  • IgG, IgM, IgE, IgG Fab ', Fab, F (ab') are used as antibodies.
  • target antigen target substance
  • plasma protein tumor marker, apoprotein
  • Examples of the plasma protein include immunoglobulins (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE), complement components (C3, C4, C5, Clq), CRP, a—antitrypsin, ⁇ —microglobulin.
  • immunoglobulins IgG, IgA, IgM, IgD, IgE
  • complement components C3, C4, C5, Clq
  • CRP C3, C4, C5, Clq
  • a antitrypsin
  • ⁇ microglobulin.
  • tumor marker examples include a-fetoprotein (AFP), carcinoembryonic antigen (CEA), CA19-9, CA125, CA15-3, SCC antigen, prostatic acid phosphatase (PAP), PIVKA — II, y-seminoprotein, TPA, elastase I, nerve specific enolase (NSE), immunosuppressive acidic protein (IAP), etc.
  • AFP a-fetoprotein
  • CEA carcinoembryonic antigen
  • CA19-9 CA125
  • CA15-3 SCC antigen
  • PAP prostatic acid phosphatase
  • PIVKA — II prostatic acid phosphatase
  • TPA y-seminoprotein
  • NSE nerve specific enolase
  • IAP immunosuppressive acidic protein
  • apoprotein examples include apo A-I, apo A-II, apo B, apo C-II, a Po C III, Apo E, etc.
  • viruses antigen examples include hepatitis B virus (HBV) -related antigen, hepatitis C virus (HCV) -related antigen, HTLV-I, HIV, rabies virus, influenza virus, rubella virus and the like.
  • HCV-related antigen examples include HCVclOO 3 recombinant antigen, pHCV-31 recombinant antigen, pHCV-34 recombinant antigen and the like, and a mixture thereof can be preferably used.
  • HIV-related antigens include virus surface antigens and the like, such as HIV-I env. Gp41 recombinant antigen, HIV-I env.
  • infectious diseases other than viruses include MRSA, ASO, toxoplasma, mycoplasma, STD and the like.
  • autoantibodies examples include anti-microsomal antibodies, anti-thyroglobulin antibodies, antinuclear antibodies, rheumatoid factors, anti-mitochondrial antibodies, and myelin antibodies.
  • coagulation / fibrinolytic factor examples include fibrinogen, fibrin degradation product (FDP), plasminogen, a plasmin inhibitor, antithrombin III, j8-thromboglobulin.
  • hormones examples include pituitary hormone (LH, FSH, GH, ACTH, TSH, prolatatin), thyroid hormone (T, sputum, thyroglobulin), calcitonin, parathyroid gland.
  • Hormones ( ⁇ ), corticosteroids (aldosterone, cortisol), gonadal hormones (hCG, estrogen, testosterone, hPL), spleen 'gastrointestinal hormones (insulin, C peptides, glucagon, gastrin), others (renin, angiotensin) I, II, enkephalin, erythropoietin).
  • Examples of the blood drug include antiepileptic drugs such as carbamazepine, primidone and valproic acid, cardiovascular disease drugs such as digoxin, quinidine, digitoxin and theophylline, gentamicin, kanamycin and streptomycin. Antibiotics etc. are mentioned.
  • Nucleic acids can be used as the molecular recognition element of the present invention. Nucleic acids are preferred as the molecular recognition element of the present invention in that an arbitrary sequence can be easily formed. Single-stranded DNA and RNA, etc., double-stranded DNA and RNA, etc. can be used. In this case, the molecular recognition mode of the nucleic acid is not particularly limited, and examples thereof include nucleic acid recognition by double strand formation, triple strand formation, and the like. In addition, since the aptamer of DNA or RNA having a strong affinity with a specific nucleic acid or protein can be obtained relatively easily using an affinity column, the molecular recognition element of the present invention. Is more preferable. It is also possible to recognize nucleic acid molecules using an intercalator as the molecular recognition element of the present invention.
  • the protein that can be used as a molecular recognition element in the present invention is not particularly limited as long as it can recognize a target substance. Therefore, for example, as the molecular recognition element of the present invention, a low molecular weight (about 6000 to 13000) protein having a high affinity for many heavy metals, particularly zinc, cadmium, copper, mercury and the like can be exemplified. They are found in animal liver, kidney, and other tissues, and have recently been found to be present in microorganisms, and contain most aromatic residues with high cysteine content. It is known that it has no amino acid distribution!
  • the inclusion complex that can be used as a molecular recognition element in the present invention can be appropriately selected according to the purpose without particular limitation as long as it has molecular recognition ability.
  • a cylindrical (one-dimensional) cavity is formed.
  • Preferred examples include those having a layered (two-dimensional) cavity and those having a cage (three-dimensional) cavity.
  • Examples of the inclusion complex having a cylindrical (one-dimensional) cavity include urea, thiourea, doxycholic acid, dinitrodiphenyl, dioxytriphenylmethane, triphenylmethane, and methylnaphthalene. , Spirochroman, PHTP (perhydrotriphenylene), cellulose, amylose, cyclodextrin (however, the above-mentioned cavity is cage-shaped in solution), cyclodextrin derivatives, and phenylboric acid.
  • Examples of the recognition target include phenol derivatives, salicylic acid, benzoic acid derivatives and esters thereof, steroids such as cholesterol, vitamins such as ascorbic acid, retinol, and tocopherol, hydrocarbons such as limonene, and glucose. It is done.
  • Examples of the layered (two-dimensional) inclusion complex include clay minerals, graphite, smectite, montmorillonite, and zeolite.
  • Examples of the recognition target object include lyophilic substances, polar compounds, 0, HSO-, halogens, halides, alkali metals, brushes.
  • Codin O-phenylenediamine, benzidine, piperidine, adenine, guanine and their liposides, H 2 O and the like.
  • Examples of the cage-like (three-dimensional) clathrate compound include hydroquinone, gaseous hydrate, tri-o-timotide, oxyflavan, dicyanammine nickel, cryptand, force lix allen, crowny Examples include compounds.
  • the crowny compound includes not only a crown ether having oxygen as an electron-donating donor atom, but also a macrocycle compound having a donor atom such as nitrogen or sulfur as a ring structure constituent atom as an analog thereof. Also included are bicyclic crowny compounds consisting of two or more rings representing cryptands.
  • Examples of the recognition target of the cage inclusion compound include black mouth form, benzene, toluene, isopropyl alcohol, acetone, methanol and the like.
  • the molecular recognition element is labeled with a labeling enzyme.
  • the method for linking the labeling enzyme and the molecular recognition element is not particularly limited, and a chemical method may be used, or a genetic engineering method may be used. Further, the labeling enzyme may be directly linked to the molecular recognition element or indirectly linked.
  • the labeling enzyme when linked to the molecular recognition element by a chemical method, it can be linked directly as described above, or indirectly via a linker or a spacer.
  • the labeling enzyme and the molecular recognition element can be linked by utilizing specific bonds such as digoxigenin, avidin, and piotin.
  • specific bonds such as digoxigenin, avidin, and piotin.
  • thrombin when thrombin is used as the labeling enzyme and Abutama is used as the molecular recognition element, thrombin is labeled with avidin, and after the abutama is labeled with piotin, the thrombin is labeled with tuck polymerase. Can be obtained.
  • a labeling enzyme is linked to a molecular recognition element by a genetic engineering technique
  • an antibody labeled as a fusion protein (chimeric protein) is prepared using a fusion protein method.
  • the coupling of the labeling enzyme to the molecular recognition element is not limited to this, but a known method such as a method using a divalent cross-linking agent may be used. it can. Accordingly, for example, an amino group, a carboxyl group, a hydroxyl group, a thiol group, an imidazole group, a phenol group, and the like can be used.
  • a thiol group for example, a carboxyl group on one side is converted into a succinimide ester, a cysteine is reacted to introduce a thiol group, and a thiol group-reactive divalent crosslinking agent is introduced. Both can be combined using.
  • Other methods using a phenol group include diazotization and alkylation.
  • the molecular recognition element does not have an appropriate functional group for linking with an enzyme, an amino group, a carboxyl group, a thiol group, or the like may be introduced into them. In that case, it may be introduced via a spacer to facilitate ligation with the enzyme.
  • the coupling ratio between the molecular recognition element and the labeling enzyme is not limited to 1: 1, and may be any ratio.
  • a plurality of labeling enzymes can be linked to a molecular recognition element using the dartal aldevid method or the periodic acid method (J. Histochemistry and Cytochemistry 22, 1084, 1974).
  • a molecular recognition element for example, an antibody or the like
  • a recognition target for example, an antigen or the like
  • the molecular recognition element of the present invention is immobilized on a substrate.
  • any known material can be used as the base material for fixing the molecular recognition element or the recognition object. Accordingly, for example, inorganic polymer compounds such as porous glass, silica gel, and hydroxyapatite; and metals such as gold, silver, and platinum can be used as the base material.
  • Synthetic materials such as Sarako, ethylene vinyl acetate copolymer, polyvinyl chloride, polyurethane, polyethylene, polystyrene, nylon, polyester, polycarbonate, etc. Mention may be made of molecules; natural polymers such as starch, dartene, chitin, cellulose, natural rubber; and their derivatives. Further, agarose derivatives having a hydrophobic group, nitrocellulose, derivatives thereof, and the like can also be mentioned as the base material used in the present invention. In particular, in the present invention, the material of the substrate can be selected according to the measurement method to be used. When measuring by the IER method, a highly reflective substrate such as glass, or by the SPR method.
  • the shape of the substrate is not particularly limited, and may be a shape of a microplate, a bead, a film, a sheet, a membrane, a tube, a fiber, a stick, or the like depending on the method of use.
  • a porous material can also be used as the substrate.
  • the immobilization method when an antigen or antibody is immobilized on a substrate, the immobilization method is not particularly limited, and any known method can be used. Therefore, depending on the molecular recognition element or recognition target, and the substrate, physical adsorption, entrapping immobilization, and immobilization by chemical ligation can be used. Examples of physical adsorption include protein adsorption on the surface of hydrophobic rosin.
  • Inclusive fixation is a method of achieving fixation by including a substance to be fixed on a support such as a gel or a polymer.
  • the immobilization method based on a chemical ligation reaction is a method in which a functional group introduced on the surface of a support is chemically coupled to a functional group of a substance to be immobilized.
  • the chemical fixing method includes, for example, fixing a molecular recognition element or a recognition target to a substrate using a silane coupling agent, a plasma polymerization film, or an acid anhydride.
  • a molecular recognition element or an object to be recognized is immobilized on a substrate by a covalent bond via an acid anhydride
  • the molecular recognition element is immobilized via an acid anhydride group present on the substrate surface.
  • an acid anhydride group to other reactive functional groups such as carboxyl group, formyl group, amino group, azide group, isocyanate group, black-formyl group, and epoxy group present on the substrate surface.
  • a molecular recognition element or the like may be immobilized through this acid anhydride group.
  • an acid anhydride group may be introduced directly on the material surface to immobilize the molecular recognition element or the like.
  • an acid anhydride group is introduced to form a molecule.
  • a recognition element or the like may be fixed.
  • the acid anhydride group can be introduced by reacting with a styrene / maleic anhydride copolymer, ethylene / maleic anhydride copolymer, methyl butyl ether / maleic anhydride copolymer, etc.
  • It can also be introduced by graft polymerization using zero rays or electron beams.
  • a method for introducing a reactive functional group onto the surface of a polymer material for example, when introducing a carboxyl group into an ethylene acetate butyl copolymer, saponification of the ethylene acetate butyl copolymer is followed by carboxymethyl ester. Introduced by hesitation.
  • the carboxyl group can be derived into an azide group via a hydrazyl group.
  • the carboxyl group can be converted to a black-formyl group by chlorination with chlorothionyl, chloroacetyl or the like.
  • the saponified ethylene acetate butyl copolymer may be converted into an aminoacetal ester.
  • an epoxy group it may be reacted with epichlorohydrin, diethylene glycol diglycidyl ether or the like.
  • Isocyanate groups can be introduced by reacting with hexamethylene diisocyanate, tolylene diisocyanate and the like.
  • a formyl group can be introduced by reacting with dartalaldehyde, dialdehydedenpene or the like.
  • immobilization methods based on various chemical linkages such as introducing various functional groups onto the surface of the substrate by selecting a monomer gas as a raw material and performing plasma polymerization should be used.
  • a method for introducing a reactive functional group such as a carboxyl group or a amino group into a polymer material surface without having a reactive functional group such as polystyrene a method using plasma treatment is known, for example. More specifically, glow discharge treatment, corona discharge treatment, and the like are known as plasma treatment, and reactive gases such as oxygen, nitrogen, and ammonia, and non-reactive gases such as helium and argon are used as gases. Or mixed gas such as air is known.
  • ammonia gas when introducing an amino group, which is preferably oxygen gas.
  • a molecular recognition element or the like it is also possible to fix a molecular recognition element or the like to a base material using a plasma polymerized film (Non-Patent Table 017033227). Furthermore, the enzyme is held inside the ultrafiltration membrane, The method of coating the surface with plasma polymerized film (Kikuko Yoshimura, et al., “Creation of enzyme-immobilized membrane for sensor by plasma polymerization method”, Analytical Chemistry, 1990, 39: 749-753) and plasma polymerized film It can also be fixed by the comprehensive fixing (JP-A-6-153971).
  • detection and Z or quantification of a target substance is performed by measuring changes in physical properties (for example, film thickness, refractive index, density, weight, etc.) associated with a gel enzyme reaction with a labeling enzyme and its substrate.
  • physical properties for example, film thickness, refractive index, density, weight, etc.
  • the substrate is gelled on the base material by the action of the labeling enzyme to form a thin film, and the film thickness and Z or The refractive index changes. Therefore, when the target substance is detected and Z or quantified using the labeled enzyme of the present invention, it is preferable to use a method for measuring such a change in film thickness and Z or refractive index.
  • Preferable measurement methods include all methods as long as the method can measure changes in film thickness and Z or refractive index. More specifically, measurement methods that can be used in the present invention include, for example, an interference amplification reflection method (Interference Enhanced Reflection Method: IER method), a surface plasmon resonance method (SPR method), and ellipsometry. (Ellipsometry), optical wave method (Optical Wave—Guide: OWG method), etc. Since the optical measurement method allows relatively simple and rapid measurement, the measurement method used in the present invention is preferably an optical method. Furthermore, since the IER method and the SPR method can be measured with a relatively simple measuring device, the IER method is more preferable, particularly because it is easy to develop a general-purpose device with high versatility.
  • IER method Interference Enhanced Reflection Method
  • SPR method surface plasmon resonance method
  • OWG method optical wave method
  • the change in film thickness and Z or refractive index of the film can be measured continuously, intermittently, or in real time. It is.
  • the target substance can also be quantified by creating a calibration curve or the like that can be obtained only by detecting the target substance.
  • the IER method is a method that utilizes the interference phenomenon between two incident light forces of light incident at a certain angle from the air side (or solution side) and the substrate side of the film. For example, with a certain film thickness The reflected light intensity increases as the film thickness increases due to the strengthening of the phase of the light of the two interfacial forces. The reflected light intensity decreases with increasing. Further, at a film thickness at which the reflection intensity shifts from the decrease mode to the increase mode, an anti-reflection coating (AR coating film) in which the reflection intensity is zero is obtained. Therefore, in the IER method, the detected reflected light intensity changes in a sine curve shape according to the optical film thickness (product of refractive index and film thickness).
  • the change of the film thickness and Z or refractive index can be measured by the IER method, and the target substance can be selected. Can be detected.
  • JP-A-6-222006, JP-A-7-260773, JP-A-6-341894, JP-A-8-184560, JP-A-9-329553, JP-A-10-104163, JP-A-2004-117325, etc. describe the IER method. There is.
  • the SPR method is a measurement method that uses the phenomenon that when light of a specific wavelength is applied from a specific angle, the energy of photons is absorbed by electrons on the metal thin film and is not reflected.
  • gold, silver, and platinum are often used as metals.
  • a chip with a gold thin film attached to a glass substrate is used, and a molecular recognition element is connected to the gold surface. It is common. Therefore, in the present invention, when the film thickness changes and the mass near the metal surface changes, it can be measured by the SPR method.
  • JP-A-9 96605, JP-A-11 183372, etc. describe the SPR method.
  • Ellipsometry also called ellipsometry, is a measurement method that can measure changes in the polarization state of light and calculate film thickness, refractive index, and the like.
  • the OWG method is a measurement method that uses evanescent waves generated by light passing through an optical waveguide.
  • the measurement method uses the fact that evanescent waves are absorbed when there is a sample on the surface of the film, so that the amount of light that passes is reduced. It is.
  • JP-A-8-114547, JP-A-10-38801 and the like describe the OWG method.
  • Target container and sample The target substance that can be detected and z or quantified by the method of the present invention is not particularly limited as long as it can be recognized by the molecular recognition element of the present invention as described above. Therefore, according to the present invention, for example, endocrine disruptors, agricultural chemicals, various drugs, hormone-like substances, hormones, nucleic acids, and microorganisms such as viruses and bacteria are detected and detected.
  • endocrine disruptors include, but are not limited to, dioxins, bisphenol A, alkylphenols, benzopyrenes, PCBs, phthalates, and the like.
  • agricultural chemicals include, but are not limited to, the ability to include, for example, amitol, simazine, parathion, and benomyl.
  • the field of application of the present invention covers a wide range such as clinical, pharmaceutical, food, and environmental analysis.
  • the present invention is used for identification of a causative substance of atopic dermatitis, measurement of cedar pollen scattering amount, and the like. Can be used.
  • various samples can be analyzed. Therefore, according to the present invention, in addition to environmental samples such as soil, river water, water and sewage water, and the air, blood (whole blood, plasma, serum), lymph, saliva, urine, tissue diseases, and other living organisms can be used. It is also possible to analyze the sample. When performing prenatal diagnosis, fetal cells existing in amniotic fluid or a part of the dividing egg cells in a test tube can be used as a specimen. It goes without saying that the sample to be analyzed according to the present invention may be subjected to a treatment such as a pretreatment if necessary.
  • a treatment such as a pretreatment if necessary.
  • these specimens are concentrated as sediments directly or if necessary by centrifugation, etc., and then disrupted by, for example, enzyme treatment, heat treatment, surfactant treatment, ultrasonic treatment, or a combination thereof.
  • enzyme treatment heat treatment
  • surfactant treatment ultrasonic treatment
  • the target substance can be extracted with an organic solvent.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in IER signal when fibrinogen is added on a substrate on which thrombin is immobilized (Example 1).
  • (1) shows the case where fibrinogen is added to the thrombin-fixed base material
  • (2) shows the case where fibrinogen is added to the BSA-fixed base material.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in the IER signal when a thrombin-labeled HSA antibody is added to a substrate on which HSA is immobilized (Example 3).
  • (1) is when thrombin-labeled HSA antibody is added to the HSA-immobilized substrate, (2) is when thrombin-labeled HSA antibody and HSA are added to the HSA-immobilized substrate, (3) is In this case, thrombin-labeled HS A antibody is added to the BSA-immobilized base material.
  • FIG. 3 is a diagram showing an IER signal when a thrombin-labeled HSA antibody and HSA are added to a substrate on which HSA is immobilized (Example 3-2).
  • FIG. 4 is a view showing an IER signal when a thrombin-labeled HSA antibody and BSA are added to a substrate on which HSA is immobilized (Example 3-2).
  • FIG. 5 is a graph based on FIG. 3 and FIG. 4, in which the vertical axis represents the change in IER signal and the horizontal axis represents the amount of HSA or BSA added (Example 3-2).
  • FIG. 6 is a diagram showing an IER signal measured without performing a washing step (Example 4) A mode for carrying out the invention
  • the present invention is a labeling enzyme.
  • this labeling enzyme of the present invention is an enzyme that can be used for various labeling agents that catalyze the reaction of gelling a substrate.
  • protease, peptidase and the like that can catalyze the above gelation reaction can be mentioned (in this case, examples of the substrate include protein and polypeptide).
  • the substrate include protein and polypeptide.
  • an enzyme involved in the blood coagulation reaction is preferable, and thrombin (in this case, the substrate is fibrinogen) is more preferable.
  • the present invention is a method for detecting and / or quantifying a target substance by enzyme immunoassay.
  • the present invention can include the following steps:
  • step (a) a sample containing a target substance; an immobilized antibody in which an antibody capable of specifically recognizing the target substance (primary antibody) is immobilized on a base; and a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling the substrate. Reacting with a labeled antibody (secondary antibody) that can specifically recognize the target substance;
  • the immobilized ⁇ antibody produced in step (a) Target substance Labeled ⁇ antibody complex is added with a substrate that gels by the catalytic action of the labeled enzyme to form a gel on the substrate.
  • step (c) A step of measuring a change in film thickness and Z or refractive index of the film on the substrate due to the gel generated in step (b).
  • the present invention can include, for example, the following steps in an enzyme immunoassay by a competitive method:
  • step (b) The immobilized ⁇ antibody target substance complex produced in step (a) and the immobilized ⁇ antibody labeled antigen are added to a substrate that gels by the catalytic action of the labeled enzyme, and A process for generating gels,
  • step (c) A step of measuring a change in film thickness and Z or refractive index of the film on the substrate due to the gel generated in step (b).
  • one sample may contain a target substance and an antigen labeled with a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling the substrate.
  • the present invention provides a target substance measurement kit.
  • the target substance measurement kit of the present invention can specifically recognize a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate, a substrate that gels by the catalytic action of the labeling enzyme, and the target substance.
  • a molecular recognition element A molecular recognition element.
  • the measurement kit of the present invention further includes a substrate on which a molecular recognition element or recognition target (for example, antibody or antigen) is immobilized, a standard solution, a sensitizer for gelation reaction, a knocker, an instruction manual, A package or the like may be included.
  • the present invention provides a kit for labeling a molecular recognition element.
  • the kit of the present invention comprises a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate; and a reagent for linking the labeling enzyme to a molecular recognition element. Connected There may be one kind of reagent for mixing, or two or more kinds.
  • the kit may contain other elements.
  • a solution for storing a molecular recognition element labeled with the labeling enzyme for example, a notfer
  • a molecular recognition element or a recognition target for example, it may contain a substrate on which an antibody or antigen) is immobilized, a standard solution, a sensitizer for gelation reaction, a buffer, instructions for use, a package, and the like.
  • the present invention provides a nanosensor for detecting and Z or quantifying a target substance.
  • the biosensor of the present invention comprises (a) a first molecular recognition element (for example, a primary antibody) immobilized on a substrate and capable of specifically recognizing a target substance; A second molecular recognition element (for example, a secondary antibody) labeled with a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate and capable of specifically recognizing a target substance; a group that gels by the catalytic action of the labeling enzyme A reaction unit that reacts the quality with the target substance; and (b) a measurement unit that measures changes in the film thickness and Z or refractive index of the film on the substrate caused by the gel generated by the reaction.
  • a first molecular recognition element for example, a primary antibody
  • a second molecular recognition element for example, a secondary antibody labeled with a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling a substrate and capable of specifically recognizing a target substance
  • a reaction unit that reacts the quality with the target substance
  • a measurement unit that measures changes
  • the biosensor of the present invention includes: (a) a target substance; a target substance labeled with a labeling enzyme that catalyzes a reaction for gelling the substrate; and immobilized on a substrate.
  • a reaction part that reacts with a fixed molecule recognition element capable of specifically recognizing the target substance; and a substrate that gels by the catalytic action of the labeling enzyme; and (b) the reaction occurs.
  • a measurement unit for measuring a change in film thickness and z or refractive index of the film on the base material caused by the gel.
  • a target substance that is less affected by a coexisting substance can be detected and Z or quantified with high sensitivity. Further, according to the present invention, it becomes possible to detect and Z or quantify a target substance with high sensitivity by a simple apparatus.
  • the gel produced by thrombin and fibrinogen was measured by IER method.
  • Cuff board (14.5 mm x 14.5 mm) is incubated at 99 ° C in 10% 3-aminopropyltriethoxysilane (y APTES: manufactured by Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.), then 2% dartal The mixture was treated with an aldehyde (manufactured by Wako Pure Chemical Industries) solution at room temperature for 3 hours.
  • y APTES 3-aminopropyltriethoxysilane
  • Thrombin solution human thrombin 10 gZml: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was added to the above substrate and incubated at room temperature for 3 hours to immobilize thrombin on the substrate.
  • a substrate on which ushi serum albumin (Bovine serum albumin: BSA, manufactured by Pierce) was immobilized was prepared in the same manner, and the IER signal was measured.
  • thrombin solution with different concentrations (uscithrombin 10 ⁇ gZml, 1 ⁇ gZml: Wako Pure Chemical Industries) on the above substrate and incubate at room temperature for 3 hours to fix thrombin on the substrate .
  • the antibody was thrombin-labeled by the maleimide non-hinge method according to the following procedure.
  • Notfer A A 50 mM potassium phosphate buffer containing 50 mM NaCl and ImM EDTA was prepared and adjusted to pH 7.0 (hereinafter referred to as Notfer A).
  • An IgG solution was prepared by adding 0.5 mg of IgG to a 500 ⁇ I buffer.
  • Notfer B 50 mM calcium phosphate buffer was adjusted to pH 7.0 (hereinafter referred to as Notfer B).
  • the SH group-introduced IgG prepared in 1 above and the maleimide group-introduced thrombin prepared in 2 were mixed and incubated at 4 ° C for 4 hours or longer.
  • the IER signal changes when (1) only thrombin-labeled HSA antibody is added to the substrate on which HSA is immobilized and (2) when thrombin-labeled HSA antibody and HSA are added in competition. Significant differences were confirmed. On the other hand, when thrombin-labeled HSA antibody was added to the BSA-immobilized substrate (3), it was confirmed that there was almost no change in the film thickness and Z or refractive index of the IER signal. . From this result, it was shown that HSA in a sample can be detected by the method of the present invention.
  • the antibody is thrombin labeled by the method described in “A. Thrombin labeling of the antibody” in [Example 3], and produced on the substrate by the same method as described in “B. Detection of HSA by thrombin labeled antibody”.
  • the gel was measured with IER. Atsey was performed by the competition method in the same manner as in Example 3, and added with 500 ⁇ , 5 ⁇ , 50 ⁇ , 500 ⁇ ⁇ , 5 ⁇ ( ⁇ SA was added to the HSA-fixed substrate.
  • 500 pM, 5 nM, 50 nM, 500 nM, and 5 M of BSA were added to an HSA-fixed substrate.
  • thrombin-labeled HSA antibody in addition to thrombin-labeled HSA antibody, the reaction between thrombin-labeled HSA antibody and HSA on the substrate is not competitively inhibited when HSA is not added, so thrombin-labeled HSA antibody
  • the IER signal changes greatly because the gel binds to the HSA on the substrate and the fibrinogen added to form a gel on the substrate.
  • FIG. 4 shows the case where BSA is added.
  • BSA cannot inhibit the reaction between the thrombin-labeled HSA antibody and the HSA on the substrate, so the IER signal was the same even when the concentration of added BSA was changed.
  • the vertical axis represents the IER signal change
  • the horizontal axis represents the amount of HSA or BSA addition.
  • the antibody was labeled with thrombin by the method described in “A. Thrombin labeling of antibody” in [Example 3].
  • the gel produced on the substrate was measured with IER in the same manner as described in “B. Detection of HSA with thrombin-labeled antibody” in [Example 3] except that the washing step was not performed.
  • the assembly was performed by the competition method in the same manner as in Example 3.
  • the target substance can be measured with high sensitivity without performing the cleaning step required in the conventional method. This is because the method of the present invention can measure the target substance without performing a cleaning step in order to measure the gel near the substrate.
  • the present invention is not necessarily bound by this theory. Absent.

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Abstract

　本発明は、標識酵素および標識酵素を利用した標的物質の検出および／または定量方法に関する。本発明によって、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素が提供される。また、本発明の標識酵素が触媒するゲル化反応による膜の膜厚および／または屈折率の変化を始めとする物理量の変化を測定することにより、標的物質を共存物質の影響を受けにくく、迅速かつ高感度に検出および／または定量することが可能になる。                                                                                 

Description

明 細 書
標識酵素
技術分野
[oooi] 本発明は、標識酵素および標識酵素を利用した標的物質の検出および Zまたは 定量方法に関する。
背景技術
[0002] 現在、抗体'抗原間の親和性を利用して標的物質を検出および Zまたは定量する 方法として、 ELISA(Enzyme— Linked Immuno Sorbent Assay:ェライザ）法 に代表される酵素免疫測定法 (EIA：ェンザィムィムノアツセィ）が幅広 ヽ分野で利用 されており、各種診断や種々の生物学的検査になくてはならない技法の 1つとなって いる。また、酵素免疫測定法を応用したノィォセンサーであるィムノセンサーも開発 され、広く利用されている。
[0003] ELISA法の測定原理は、標的物質である抗原または抗体を、標識酵素を連結した 抗体または抗原と反応させ、その標識酵素の酵素活性力 標的物質を検出および Zまたは定量するものである。すなわち、 ELISA法においては、抗体または抗原に よる分子認識により得られた信号を、酵素を利用して増幅することによって、標的物 質の高感度な検出を達成している。
[0004] ここで、 ELISA法にぉ 、て標識酵素として用いられる酵素の大部分は、ペルォキ シダーゼ（F. Patolsky et al. , Langmuir, 15, 3703, 1999)、ァノレカリ フォスファターゼ（E. Kim et al. , Anal. Chem. , 75, 5665, 2003)、 グノレコースォキシダーゼ (K. Kojima et al, Analytical Chemistry, 75 (5 ) , 1116, 2003)、およびガラクトシダーゼであり、 ELISA法を応用したィムノセン サ一の場合も上記標識酵素が一般に使用されている (池袋一典、早出広司「酵素電 極反応を用いた DNAハイブリダィゼーシヨンの高感度検出」電気化学及び工業物理 ィ匕学、 72号 8卷、 p. 594— 597、 2004)。これらの方法においては、上記標識酵素 が触媒する反応によって生じる反応生成物を、吸光、蛍光、発光によって検出する方 法が一般的であり、また、ィムノセンサーの場合、標識酵素による酵素反応を電気化 学的に検出する方法が主流となっている。その他の酵素反応の検出法としては、標 識酵素であるアルカリフォスファターゼ等の反応により不溶性生成物を生成させ、そ の沈殿物を水晶振動子等のピエゾ素子を利用して検出する方法が知られている（F. Patolsky et al. Nat. Biotechnol. , 19 (3) , 253, 2001)。 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] 従来の酵素反応を利用した標的物質の検出および Zまたは定量方法には、不純 物や共存物質の影響を受けやすぐ安定した測定結果を得にくいという問題が存在 した。また、標識酵素を利用して不溶性生成物を生成させる場合は、水晶振動子を 用いて検出するしかなぐ水中での水晶振動子の発振が不安定であることから、高感 度での測定が難 、と 、う問題があった。
[0006] 以上のような状況に鑑み、本発明の課題は、酵素反応を利用した標的物質の測定 方法において、共存物質の影響を受けにくぐ標的物質を簡便かつ高感度に検出お よび Zまたは定量する方法を提供することである。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、酵素によるゲル化反応 によって生じるゲルによる膜の膜厚および zまたは屈折率の変化を始めとする物理 量の変化を測定することにより、共存物質の影響を受けにくぐ標的物質を高感度に 検出および zまたは定量する方法を開発することに成功し、本発明を完成するに至 つた o
[0008] すなわち、本発明は、以下の事項に関する。
(1)基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素。
(2)前記標識酵素がプロテアーゼまたはべプチダーゼである、（1)に記載の標識酵 素。
(3)前記標識酵素が血液凝固反応に関与する酵素である、（1)または（2)に記載の 標識酵素。
(4)前記標識酵素がトロンビンである、 (1)〜（3)の 、ずれか 1項に記載の標識酵素 (5)前記基質がタンパク質である、 (1)〜 (4)の 、ずれか 1項に記載の標識酵素。
(6)前記基質がフイブリノ一ゲンである、 (1)〜（5)の 、ずれか 1項に記載の標識酵 素。
(7) (a)標的物質と;該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定 させた固定化分子認識素子と；基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識 した、該標的物質を特異的に認識し得る標識化分子認識素子;とを反応させる工程
(b)工程 (a)で生じた固定化分子認識素子 標的物質 標識化分子認識素子の複 合体に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲル を生成させる工程、
(c)工程 (b)で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化 を測定する工程、
を含む、標的物質の検出および Zまたは定量方法。
(8) (a)標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した標的 物質とを、該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固 定化分子認識素子と反応させる工程、
(b)工程 (a)で生じた固定ィ匕分子認識素子—標的物質の複合体、および固定ィ匕分 子認識素子 標識化標的物質に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を 添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
(c)工程 (b)で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化 を測定する工程
を含む、標的物質の検出および Zまたは定量方法。
(9)干渉増幅反射法または表面プラズモン共鳴法を利用して膜の膜厚および Zまた は屈折率の変化を測定する、（7)または (8)に記載の標的物質の検出および Zまた は定量方法。
(10)基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と;該標識酵素の触媒作用により ゲル化する基質と；を含む標的物質の測定キット。
(11)基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と;標的物質を特異的に認識し 得る分子認識素子と該標識酵素とを連結させるための試薬と；を含む標的物質の測 定キット。
(12) (a)基材に固定化された、標的物質を特異的に認識し得る第 1の分子認識素 子と;基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特 異的に認識し得る第 2の分子認識素子と;該標識酵素の触媒作用によりゲル化する 基質と;標的物質と;を反応させる反応部、ならびに
(b)前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈 折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および Zまたは定量する ためのバイオセンサー。
(13) (a)標的物質と;基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された 標的物質と;基材に固定化された、該標的物質を特異的に認識し得る固定ィ匕分子認 識素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、な らびに
(b)前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈 折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および Zまたは定量する ためのバイオセンサー。
[0009] 標識酵素: よび 皙
本発明において使用できる標識酵素は、基質に作用してゲルを生じさせ、膜の膜 厚および Zまたは屈折率の変化を生じさせることのできる酵素であれば、特に限定さ れない。ゲルィ匕反応に必要な酵素はごく少量であるので、本発明によれば、高感度 な測定系を構築することが可能である。本発明の標識酵素は、抗原や抗体を始めと する分子認識素子に連結され、分子認識素子を標識する。本発明において使用す ることのできる標識酵素としては、例えば、プロテアーゼ、ぺプチターゼ等を挙げるこ とができる力 これに限定されない。この場合、本発明において使用することのできる 基質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド等を挙げることができる。
[0010] また、本発明に使用する標識酵素として、血液凝固反応に関与する酵素が好適で ある。より好ましくは、本発明に使用する標識酵素はトロンビンであり、基質はフイブリ ノーゲンである。というのは、トロンビンによるフイブリノ一ゲンのゲル化は、共存物質 の影響を受けにくぐ安定した測定が可能であるためである。この場合、血液凝固反 応に関与する酵素であるトロンビンによって、基質であるフイブリノ一ゲンが加水分解 されてゲル化し、不溶性のフイブリンが生成される。これによつて、膜の膜厚および z または屈折率に変化が生じる。
[0011] その他には、本発明において、エンドトキシン（内毒素）によるゲル化反応を利用す ることも好適である。より具体的には、カブトガ二の血液凝固反応の 1つである、エンド トキシンまたはダリカン類 (例えば、 j8— D ダリカン等）とカブトガ-血球抽出物 (LA L、ライセート）とによるゲルィ匕反応を利用することができる。特に、エンドトキシンまた はダリカン類とカブトガ-血球抽出物とによるゲルィ匕反応は、リムルス試験として医薬 品等の品質管理等の分野で利用されており、取り扱いが容易なため本発明において 好適なゲルィ匕反応である。
[0012] カブトガニ血球成分によるゲルィ匕をより詳しく説明すると、以下のような反応が進行 している。すなわち、カブトガ二のライセート中にはエンドトキシンに反応し活性ィ匕され る C因子系と |8— D ダリカン (植物多糖で、真菌細胞壁の構成成分の 1つ）と反応し 活性ィ匕される G因子系が確認されており、これら 2つの経路は途中からは共通である 。すなわち、不活性型凝固酵素 (proclotting enzyme)が活性化され、凝固酵素（ clotting enzyme)が生成され、この酵素がその基質であるコアグロ一ゲン（coagul ogen)を部分水解させ、その結果、ペプチドで (peptide C)が遊離し、コアダリン (co agulin)が生成しゲル化する。
[0013] エンドトキシンと特異的に反応しゲル化するカブトガニ血球成分由来の試薬として、 現在、和光純薬工業 (コード番号： 298 22341)および生化学工業 (エンドスぺシ 一:登録商標)から市販されており、容易に入手することが可能である。前者は力ブト ガ二のライセートをデキストラン硫酸セファロースカラムで分画後、 G因子系の画分を 除いて再構成したものである。後者は、ライセートにカルボキシメチルイ匕カードラン（ β—D—ダリカン)を大過剰添加し、 G因子系の活性ィ匕を逆に抑制させてエンドトキシ ン特異的にしたものである。一方、ダリカン等と特異的に反応しゲル化するカブトガ- 血球成分由来の試薬は、生化学工業、マルハ、和光純薬工業 (商品名： βーグリカ ンテストヮコ一等)から市販されている。その他、特異性はないが、ゲル化する試薬が 生化学工業 (商品名：エンドトキシントキシンテスト - D等)から市販されて!ヽる。
[0014] さらに他の好適なゲルィ匕反応として、ペプチドダリカン (細菌の細胞壁成分の 1つ） や 13 ダリカン (真菌の細胞壁成分の 1つ）等のダリカン類によって活性ィ匕されるカイ コ体液抽出物によるゲルィ匕反応を挙げることができる。また、カイコ体液抽出物は、 S LP試薬セットとして和光純薬工業から市販されており（コード番号： 297— 51500)、 容易に入手可能であり好適である。
[0015] また、本発明に使用する標識酵素として、活性化される前の不活性型の酵素や、活 性型酵素の前駆体を利用することもできる。さらに、本発明に使用できる基質としては 、標識酵素が直接的に作用し、ゲル化する基質だけでなぐこの基質の前駆体等を 利用することができる。すなわち、本発明における「基質」とは、標識酵素が直接的に 作用する基質だけでなぐその前駆体をも含む概念である。また、本発明に使用する 基質は、 1種類の基質だけでもよぐ 2種類以上の基質の混合物であってもよい。また 、本発明においては、種々の活性ィ匕物質を基質の他に添加することもできる。例えば 、ゲル化反応が、複数の反応を含むカスケード反応である場合、該カスケード反応を 活性化させる活性ィ匕物質等を反応系に添加することができる。
[0016] 標 > の 屮,：¾よび/または^ Π 法
本発明の標識酵素によって、分子認識素子を利用した分子認識反応により得られ た信号を増幅し、標的分子の高感度な検出を達成することができる。本発明の標識 酵素は、あらゆる分子認識反応に利用することができ、したがって、本発明の標識酵 素は、抗体や核酸等の生体関連物質を利用した分子認識法だけでなぐ包接化合 物やモレキュラーインプリンティング法等の化学的な分子認識法に利用することもで きる。本発明に好適な分子認識方法としては、例えば、抗体、アブタマ一を始めとす る核酸、タンパク質、ホルモンレセプター、レクチン、包接化合物、生理活性物質受 容体、モレキュラーインプリンティング法により形成した铸型分子等の分子認識素子 を利用した分子認識法を挙げることができる。
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本発明は、公知のあらゆる酵素免疫測定法に対して応用することが可能である。ま た、本発明は、酵素免疫測定法を応用したィムノセンサーに応用することも可能であ る。さらに、酵素免疫測定法における抗体抗原反応を、分子認識素子とその認識対 象物とによる分子認識反応に置き換えた方法に、本発明を利用することも可能である
[0018] 本発明において、酵素免疫測定法とは、酵素反応と免疫反応とを利用することによ り、標的物質を検出および Zまたは定量する方法をいう。より具体的には、酵素で標 識した抗原または抗体を用いて抗原抗体反応を行!ヽ、酵素活性を測定することによ り抗原抗体反応を検出して、標的物質を検出および Zまたは定量する方法である。 また、一般に、酵素免疫測定法には、競合法と非競合法 (例えば、サンドイッチ法)が 知られている。競合法は、抗原または抗体を標識酵素で標識し、標識した抗原また は抗体を試料中の遊離抗原または遊離抗体と競合させて、対応する抗体または抗 原と抗原抗体反応を行わせる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原抗 体反応の信号を増幅し、検出および Zまたは定量を行う。一方、非競合法として一般 的なサンドイッチ法では、非標識抗体 (1次抗体、第 1抗体)を試料中の標的物質 (抗 原)と結合させ、次いで、酵素標識した標識化抗体 (2次抗体、第 2抗体)を、抗原と 1 次抗体との複合体に結合させる。その後、基質を添加して、酵素反応によって抗原 抗体反応の信号を増幅し、標的物質の検出および Zまたは定量を行うものである。 特に、サンドイッチ法は、信号が 2次抗体により増幅されるため、検出感度が高ぐ応 用範囲が広い。その他にも、酵素免疫測定法として、ダブルレイヤー法等が知られて おり、本発明をこれらの測定法に応用することができる。また、サンドイッチ法を始めと する非競合法では、通常、 1次抗体と 2次抗体とではそれぞれェピドープが異なるが 、本発明においては同一であってもよい。また、抗原抗体反応以外の分子認識素子 を利用する場合には、 1次抗体および 2次抗体に対応する第 1の分子認識素子およ び第 2の分子認識素子とでは、標的分子に対する認識部位が同じであっても、異な つていてもよいが、第 1の分子認識素子と第 2の分子認識素子とでは、標的分子に対 する認識部位が異なって 、ることが好ま 、。
[0019] 標的物質
本発明において標的物質とは、本発明を利用した各種測定方法において、その測 定の対象 (標的）となる物質をいう。また、本発明において、標的物質は、 1種類であ つても、 2種類以上であってもよい。さらに、本発明の 1つの態様においては、分子認 識素子によって標的物質を特異的に認識する。したがって、本発明の標的物質は、 分子認識素子の認識対象物であることができる。例えば、本発明の 1態様において、 分子認識素子として抗体を採用した場合、標的物質は、該分子認識素子の認識対 象物である抗原とすることができる。
[0020] 分子認識素子
本発明に使用可能な分子認識素子としては、標的物質を認識することができれば 特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができる。また、分子認識の態様に 特に制限はなぐ例えば、物理吸着、化学吸着等を利用して分子を認識することがで きる。したがって、本発明の分子認識素子は、例えば、水素結合、分子間力（ファン' デル'ワールス力）、配位結合、イオン結合、共有結合等により、標的物質を認識する ことができる。
[0021] 本発明の分子認識素子の具体例としては、上記のように、例えば、抗体、アブタマ 一を始めとする核酸、タンパク質、ホルモンレセプター、レクチン、包接化合物、生理 活性物質受容体等の生体関連物質を好適に挙げることができる。また、モレキュラー インプリンティング法により形成した铸型分子を分子認識素子として使用することがで きる。一方、これらの分子認識素子の認識対象物としては、抗体の場合には抗原、核 酸の場合には核酸、タンパク質、チューブリン、キチン等、ホルモンレセプターの場合 にはホルモン、レクチンの場合には糖等、包接化合物の場合には包接される成分、 生理活性物質受容体の場合には生理活性物質を挙げることができる。また、本発明 において、分子認識素子とその認識対象物とは、入れ替えることが可能な概念であ る。すなわち、一般に、分子認識素子とその認識対象物と考えられている組み合わ せであっても、ある観点からは、該認識対象物が該分子認識素子を分子認識してい るとも考えられるため、分子認識素子を「認識対象物」、認識対象物を「分子認識素 子」と考えることが可能である。本発明においては、例えば、抗体と抗原による分子認 識においては、抗体を分子認識素子、抗原を認識対象物とすることが可能である一 方、抗体を認識対象物、抗原を分子認識素子と考えることも可能である。
[0022] 碰 本発明の分子認識素子として使用できる抗体としては、標的抗原 (標的物質)と特 異的に抗原抗体反応を生じるものであれば特に制限されず、モノクローナル抗体お よびポリクローナル抗体のいずれも使用することができる。高感度での検出が可能で あるため、感度の点からは、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。また、本 発明をサンドイッチ法の ELISA法に適用する場合等は、上記のごとぐ 1次抗体 (第 1抗体)および 2次抗体 (第 2抗体）は、それぞれェピトープが同じであっても異なって いてもよいが、異なっていることが好ましい。さらに、本発明において、分子認識素子 として使用できる抗体は、抗体の一部分であってもよい。
[0023] 標的物質を認識する抗体は、例えば、モノクローナル抗体の場合は、精製した病原 因子すなわち毒素や菌体等を免疫したマウスの脾細胞とミエローマ細胞との融合細 胞のクローンを用いてマウス腹水より誘導したものを用いることができる。またポリクロ ーナル抗体は毒素ゃ菌体等の抗原を用いてゥサギ、ャギ、ラット、ヒッジ、 -ヮトリ、ブ タ、ロバ、モルモット、ィヌ、ゥシ等を免疫して得られる血清より精製したものを用いるこ とがでさる。
[0024] また、本発明においては、抗体として、 IgG、 IgM、 IgE、 IgGの Fab'、 Fab、 F (ab')
2等も使用することができる。一方、標的抗原 (標的物質）に特に制限はなぐ目的に 応じて適宜選択することができ、例えば、血漿タンパク、腫瘍マーカー、アポタンパク
、ウィルス、自己抗体、凝固'線溶因子、ホルモン、血中薬物、 HLA抗原等を挙げる ことができる。
[0025] 上記血漿タンパクとしては、例えば、免疫グロブリン (IgG, IgA, IgM, IgD, IgE)、 補体成分（C3, C4, C5, Clq)、 CRP、 a —アンチトリプシン、 α —マイクログロブリ
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ン、 β —マイクログロブリン、ハプトグロビン、トランスフェリン、セル口プラスミン、フェリ
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チン等が挙げられる。
[0026] 上記腫瘍マーカーとしては、例えば、 aーフエトプロテイン (AFP)、癌胎児性抗原 ( CEA)、 CA19— 9、 CA125、 CA15— 3、 SCC抗原、前立腺酸性ホスファターゼ（P AP)、 PIVKA— II、 y—セミノプロテイン、 TPA、エラスターゼ I、神経特異エノラー ゼ (NSE)、免疫抑制酸性タンパク (IAP)等が挙げられる。
[0027] 上記アポタンパクとしては、例えば、アポ A—I、アポ A— II、アポ B、アポ C—II、ァ ポ C III、アポ E等が挙げられる。
[0028] 上記ウィルス抗原としては、例えば、 B型肝炎ウィルス (HBV)関連抗原、 C型肝炎 ウィルス（HCV)関連抗原、 HTLV— I、 HIV、狂犬病ウィルス、インフルエンザウィル ス、風疹ウィルス等が挙げられる。上記 HCV関連抗原としては、例えば、 HCVclOO 3リコンビナント抗原、 pHCV— 31リコンビナント抗原、 pHCV— 34リコンビナント 抗原等が挙げられ、それらの混合物が好ましく使用できる。上記 HIV関連抗原として は、ウィルス表面抗原等が挙げられ、例えば、 HIV-I env. gp41リコンビナント抗原 、 HIV-I env. gpl20リコンビナント抗原、 HIV-Igag. ρ24リコンビナント抗原、 HI V— II env. p36リコンビナント抗原等が挙げられる。また、ウィルス以外の感染症と しては、例えば、 MRSA、 ASO、トキソプラズマ、マイコプラズマ、 STD等が挙げられ る。
[0029] 上記自己抗体としては、例えば、抗マイクロゾーム抗体、抗サイログロブリン抗体、 抗核抗体、リュウマチ因子、抗ミトコンドリア抗体、ミエリン抗体等が挙げられる。
[0030] 上記凝固 ·線溶因子としては、例えば、フイブリノ一ゲン、フイブリン分解産物 (FDP )、プラスミノゲン、 a プラスミンインヒビター、アンチトロンビン III、 j8—トロンボグロ
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ブリン、第 VIII因子、プロテインおプロテイン S等が挙げられる。
[0031] 上記ホルモンとしては、例えば、下垂体ホルモン（LH、 FSH、 GH、 ACTH、 TSH 、プロラタチン）、甲状腺ホルモン (T、 Τ、サイログロブリン）、カルシトニン、副甲状腺
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ホルモン（ΡΤΗ)、副腎皮質ホルモン（アルドステロン、コルチゾール）、性腺ホルモン (hCG、エストロゲン、テストステロン、 hPL)、脾 '消化管ホルモン (インスリン、 C ぺ プチド、グルカゴン、ガストリン）、その他（レニン、アンジォテンシン I, II、エンケファリ ン、エリスロポエチン）等が挙げられる。
[0032] 上記血中薬物としては、例えば、カルバマゼピン、プリミドン、バルプロ酸等の抗て んかん薬、ジゴキシン、キ-ジン、ジギトキシン、テオフィリン等の循環器疾患薬、ゲン タマイシン、カナマイシン、ストレプトマイシン等の抗生物質等が挙げられる。
[0033]
本発明の分子認識素子として、核酸を利用することができる。核酸は、任意の配列 を容易に形成することができる点で、本発明の分子認識素子として好ましぐ例えば、 1本鎖 DNAおよび RNA等、 2本鎖 DNAおよび RNA等を使用することができる。こ の場合、核酸の分子認識の様式は、特に制限されず、例えば、 2本鎖形成、 3本鎖 形成等による核酸の認識を挙げることができる。また、特定の核酸やタンパク質と親 和性の強 、DNAや RNAのァプタマ一は、ァフィユティーカラム等を利用して比較的 容易に取得することが可能であるため、本発明の分子認識素子としてより好ましい。 また、インターカレーターを本発明の分子認識素子として利用し、核酸を分子認識す ることち可會である。
[0034] タンパク質
本発明において分子認識素子として使用できるタンパク質は、特に制限されず、標 的物質を認識できさえすればよい。したがって、例えば、本発明の分子認識素子とし て、多くの重金属、特に亜鉛、カドミウム、銅、水銀等に高い親和性を示す低分子量 ( 約 6000〜13000)のタンパク質等を挙げることができる。これらは、動物の肝臓、腎 臓、その他の組織中に存在し、最近では微生物体内にも存在することが見出されて おり、また、システィン含有量が多ぐ芳香族の残基を殆ど含まないアミノ酸分布を呈 して 、ることが知られて!/、る。
[0035] 句,榇化合物
本発明において分子認識素子として使用できる包接ィ匕合物としては、分子認識能 を有する限り特に制限はなぐ目的に応じて適宜選択することができ、例えば、筒状（ 一次元）の空洞を有するもの、層状（二次元）の空洞を有するもの、かご状 (三次元） の空洞を有するもの等が好適に挙げられる。
[0036] 筒状 (一次元）の空洞を有する包接ィ匕合物としては、例えば、尿素、チォ尿素、デ ォキシコール酸、ジニトロジフエニル、ジォキシトリフエニルメタン、トリフエニルメタン、 メチルナフタリン、スピロクロマン、 PHTP (ペルヒドロトリフエ-レン）、セルロース、アミ ロース、シクロデキストリン (但し、溶液中では上記空洞がかご状）、シクロデキストリン 誘導体、フエ-ルホウ酸等が挙げられる。この認識対象物としては、例えば、フエノー ル誘導体、サリチル酸、安息香酸誘導体及びそのエステル、コレステロール等のステ ロイド、ァスコルビン酸、レチノール、トコフエロール等のビタミン、リモネン等の炭化水 素類、ブドウ糖等が挙げられる。 [0037] 層状（二次元）の包接ィ匕合物としては、例えば、粘土鉱物、グラフアイト、スメクタイト 、モンモリロナイト、ゼォライト等が挙げられる。この認識対象物としては、例えば、親 水性物質、極性化合物、 0、 HSO―、ハロゲン、ハロゲン化物、アルカリ金属、ブルシ
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ン、コディン、 O—フエ二レンジァミン、ベンジジン、ピぺリジン、アデニン、グイァニン 及びこれらのリポシド、 H O等が挙げられる。
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[0038] 上記かご状 (三次元）の包接ィ匕合物としては、例えば、ヒドロキノン、気体水化物、ト リ一 o—チモチド、ォキシフラバン、ジシァノアンミンニッケル、クリプタンド、力リックス アレン、クラウンィ匕合物等が挙げられる。ここで、クラウンィ匕合物としては、電子供与性 のドナー原子として酸素を持つクラウンエーテルのみではなぐそのアナログとして窒 素、硫黄等のドナー原子を環構造構成原子として持つ大環状化合物を含み、また、 クリプタンドを代表する 2個以上の環よりなる複環式クラウンィ匕合物も含まれる。かご 状包接化合物の認識対象物としては、例えば、クロ口ホルム、ベンゼン、トルエン、ィ ソプロピルアルコール、アセトン、メタノール等が挙げられる。
[0039] 標識酵素による分早認識素早の標識
本発明においては、標識酵素によって分子認識素子を標識する。標識酵素と分子 認識素子とを連結する方法は、特に制限されず、化学的手法を用いてもよいし、遺 伝子工学的手法を用いてもよい。また、標識酵素を分子認識素子に直接連結しても よいし、間接的に連結させてもよい。
[0040] 化学的手法により標識酵素を分子認識素子に連結する場合、上記のごとぐ直接 連結することもできるし、リンカ一やスぺーサーを介して間接的に連結させることもで きる。また、ジゴキシゲニン、アビジン、ピオチン等の特異的結合を利用して、標識酵 素と分子認識素子とを連結することができる。例えば、標識酵素としてトロンビン、分 子認識素子としてアブタマ一を用いる場合、トロンビンをアビジン標識し、アブタマ一 をピオチン標識した後に、両者を混合することにより、タックポリメライゼーシヨンによつ てトロンビン標識されたアブタマ一を得ることができる。
[0041] また、遺伝子工学的手法により標識酵素を分子認識素子に連結する場合、融合タ ンパク質法を利用して、例えば、融合タンパク質 (キメラタンパク質)として酵素標識さ れた抗体等を作製することもできる。 [0042] 具体的には、標識酵素の分子認識素子への連結は、これに限定されるものではな いが、二価架橋剤を使用する方法を始めとする公知の方法を利用することができる。 したがって、例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、イミダゾール 基、フエ-ル基等を利用することができる。アミノ基相互間を結合する場合、例えば、 イソシァネート法、グルタルアルデヒド法、ジフルォロベンゼン法、ベンゾキノン法等を 挙げることができる。また、ァミノ基とカルボキシル基とを結合する場合、カルボキシル 基をサクシ二ルイミドエステルイ匕する方法の他、カルポジイミド法、ウッドワード試薬法 、ァミノ基と糖鎖を架橋する過ヨウ素酸酸ィ匕法 (Nakane法)も適用できる。さらに、チ オール基を利用する場合には、例えば、一方の側のカルボキシル基をサクシ-ルイミ ドエステルイ匕して、これにシスティンを反応させてチオール基を導入し、チオール基 反応性二価架橋剤を用いて双方を結合させることができる。その他、フエ-ル基を利 用する方法としてはジァゾ化法、アルキルィ匕法等がある。
[0043] なお、分子認識素子に酵素と連結させるための適当な官能基がない場合には、こ れらにァミノ基、カルボキシル基或いはチオール基等を導入してもよい。その際には スぺーサーを介して導入し、酵素と連結し易くしてもよい。
[0044] また、分子認識素子と標識酵素との連結比は 1： 1には限定されず、任意の比率と することができる。例えば、ダルタルアルデビド法ゃ過ヨウ素酸法 (J. Histochemis try and Cytochemistry 22, 1084, 1974)を利用して、分子認識素子に複 数の標識酵素を連結することができる。
[0045] 皿
本発明の 1つの態様において、分子認識素子 (例えば、抗体等)または認識対象物 (例えば、抗原等)を基材に固定ィ匕することができる。例えば、本発明を ELISA法に 適用する場合等では、本発明の分子認識素子が基材に固定化される。本発明にお V、て分子認識素子または認識対象物を固定ィ匕する基材としては、公知のあらゆる材 料を使用することができる。したがって、例えば、多孔性ガラス、シリカゲル、ヒドロキシ アパタイト等の無機高分子化合物;および、金、銀、白金等の金属；が基材として利 用可能である。さら〖こ、エチレン 酢酸ビニル共重合体、ポリ塩化ビニル、ポリウレタ ン、ポリエチレン、ポリスチレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート等の合成高 分子；デンプン、ダルテン、キチン、セルロース、天然ゴム等の天然高分子；およびこ れらの誘導体を挙げることができる。また、疎水基を有するァガロース誘導体、ニトロ セルロース、およびそれらの誘導体等も、本発明に使用する基材として挙げることが できる。特に、本発明においては、使用する測定方法に応じて基材の材質を選択す ることができ、 IER法により測定する場合にはガラスを始めとする高反射性基材、また 、 SPR法により測定する場合には金または銀の薄膜を用いることが好ましい。さらに、 上記の基材の形状は、特に限定されず、使用方法に応じて、マイクロプレート、ビー ズ、フィルム、シート、膜、チューブ、繊維、スティック等の形状とすることができる。ま た、基材として、多孔性の物質を採用することもできる。
[0046] 分早認識素早または認識針象物の某材への困定化
本発明において、抗原または抗体を基材に固定ィ匕する場合、固定ィ匕の方法は、特 に限定されず、公知のあらゆる方法を使用することができる。したがって、分子認識 素子または認識対象物、ならびに基材に応じて、物理吸着、包括固定、そして化学 的な連結反応による固定ィ匕を利用することができる。物理吸着としては、疎水性榭脂 表面へのタンパク質の吸着を挙げることができる。包括固定は、ゲルやポリマー等の 支持体に固定ィヒすべき物質を包括させることによって固定ィヒを達成する方法である 。また、化学的な連結反応に基づく固定ィ匕方法は、支持体表面に導入された官能基 を、固定化すべき物質の官能基と化学的に連結させる方法である。
[0047] 化学的な固定ィ匕方法としては、例えば、シランカップリング剤、プラズマ重合膜、酸 無水物を利用して、分子認識素子または認識対象物を基材へ固定ィ匕すること等を挙 げることができる。例えば、酸無水物を介した共有結合によって、分子認識素子また は認識対象物を基材上に固定化する場合、基材表面に存在する酸無水物基を介し て分子認識素子等を固定ィ匕してもよいし、基材表面に存在するカルボキシル基、ホ ルミル基、アミノ基、アジド基、イソシァネート基、クロ口ホルミル基、エポキシ基等の他 の反応性官能基に酸無水物基を導入した後、この酸無水物基を介して分子認識素 子等を固定化してもよい。また、酸無水物基、反応性官能基のいずれも高分子材料 表面に無い場合には材料表面に直接酸無水物基を導入して分子認識素子等を固 定化してもよいし、あるいは反応性官能基を導入した後、酸無水物基を導入して分子 認識素子等を固定ィ匕してもよい。酸無水物基はスチレン 無水マレイン酸共重合体 、エチレン 無水マレイン酸共重合体、メチルビ-ルエーテル 無水マレイン酸共重 合体等と反応させることにより導入できる他、例えばポリウレタンに無水マレイン酸を
0線や電子線によりグラフト重合させることにより導入することもできる。
[0048] 高分子材料表面に反応性官能基を導入する方法としては、例えばエチレン 酢酸 ビュル共重合体にカルボキシル基を導入する場合は、エチレン 酢酸ビュル共重合 体をケン化した後、カルボキシメチルイ匕することにより導入される。また、カルボキシル 基はヒドラジル基を経てアジド基に誘導することができる。さらに、カルボキシル基は 塩ィ匕チォニル、塩ィ匕ァセチル等によりクロルイ匕することによりクロ口ホルミル基に変え ることちでさる。
[0049] エチレン 酢酸ビュル共重合体にアミノ基を導入するには、ケン化したエチレン 酢酸ビュル共重合体をアミノアセタールイ匕すればよ 、。エポキシ基を導入するには、 ェピクロルヒドリン、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル等と反応させればよ ヽ 。イソシァネート基はへキサメチレンジイソシアナート、トリレンジイソシアナート等と反 応させること〖こより導入できる。ホルミル基はダルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプ ン等と反応させることにより導入できる。
[0050] また、原料となるモノマーガスを選択してプラズマ重合を行うことによって、基材表面 に多様な官能基を導入する等、種々の化学的な連結に基づく固定化方法を利用す ることも可能である。ポリスチレン等のように反応性官能基をもたな 、高分子材料表 面にカルボキシル基ゃァミノ基等の反応性官能基を導入する方法としては、例えば プラズマ処理による方法が知られている。より詳しくは、プラズマ処理として、グロ一放 電処理、コロナ放電処理等が知られており、用いるガスとして、酸素、窒素、アンモ- ァ等の反応性ガス、ヘリウム、アルゴン等の非反応性ガス、あるいは空気等の混合ガ スが知られている。特に、高分子材料表面にカルボキシル基を導入する場合、酸素 ガスを用いるのが好ましぐアミノ基を導入する場合、アンモニアガスを用いるのが好 ましい。
[0051] その他にも、プラズマ重合膜を利用して、分子認識素子等を基材へ固定ィ匕すること も可能である (特再表 017033227)。さらに、限外ろ過膜内部に酵素を保持させ、 その表面をプラズマ重合膜でコートする方法 (吉村菊子、他， 「プラズマ重合法による センサー用酵素固定ィ匕膜の作成」，分析化学， 1990, 39 : 749— 753)や、プラズマ 重合膜を利用した包括固定により固定ィ匕することもできる（特開平 6— 153971)。
[0052] 膜厚および Zまたは屈折率の測定
本発明においては、標識酵素およびその基質によるゲルィ匕反応に伴う物性 (例え ば、膜厚、屈折率、密度や重量等)の変化を測定することによって、標的物質の検出 および Zまたは定量を行うことができる。し力しながら、上記したように、本発明の方 法によれば、標識酵素の働きによって基材上で基質がゲル化され、薄膜を形成し、 基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率が変化する。したがって、本発明の標識酵 素を利用して標的物質を検出および Zまたは定量する場合、かかる膜厚および Zま たは屈折率の変化を測定する方法を用いることが好ま 、。
[0053] 本発明に好まし 、測定方法としては、膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化を測 定することが可能な方法であれば、あらゆる方法を挙げることができる。より具体的に は、本発明において使用できる測定方法として、例えば、干渉増幅反射法 (Interfer ence Enhanced Reflection Method :IER法）、表面プラズモン共鳴法（Surf a ce Plasmon Resonance Method: SPR法)、エリプソメトリー (Ellipsometry)、 光導波路法（Optical Wave— Guide : OWG法）等を挙げることができる力 これに 限定されな!、。光学的な測定方法は比較的簡便かつ迅速な測定が可能なことから、 本発明に用いる測定方法としては光学的な方法が好ましい。さらに、 IER法や SPR 法は、比較的簡単な測定装置により測定することができるため、より好ましぐ特に、 汎用性が高ぐ汎用器の開発が容易な点から、 IER法がさらに好ましい。
[0054] また、本発明においては、膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化を、連続的に測 定しても、間欠的に測定してもよぐまた、リアルタイムで測定することも可能である。ま た、本発明においては、標的物質の検出だけでなぐ検量線等を作成することにより 、標的物質の定量も可能である。
[0055] 干渉増幅反射法（Interference Enhanced Reflection Method: IER法）
IER法は、ある角度で入射された光の、膜の空気側（又は溶液側）と基材側からの 2 つの界面力もの反射光同士の干渉現象を利用する方法である。例えば、ある膜厚で は、 2つの界面力 の光の位相が強め合うことにより膜厚の増加と共に反射光強度が 増加し、また、別の膜厚では、 2つの界面力もの光の位相が弱め合うことにより膜厚の 増加と共に反射光強度が減少する。さらに、反射強度が減少モードから増加モード へ移行する膜厚では、反射強度がゼロとなる無反射状態 (Anti— Reflective Coat ing ;ARコート膜)となる。したがって、 IER法においては、検出される反射光強度が、 膜の光学膜厚 (屈折率と膜厚の積）に応じて、サインカーブ状に変化する。よって、本 発明の標識酵素の働きによって、膜の膜厚および Zまたは屈折率が変化した場合は 、 IER法によりその膜厚および Zまたは屈折率の変化を測定することができ、標的物 質を検出することができる。例えば、特開平 6— 222006、特開平 7— 260773、特開 平 6— 341894、特開平 8— 184560、特開平 9— 329553、特開平 10— 104163、 特開 2004— 117325等に IER法に関する記載がある。
[0056] 表面プラズモン共鳴法（Surface Plasmon Resonance Method : SPR法）
SPR法は、特定の波長の光を、特定の角度から当てると金属の薄膜表面で、光子 のエネルギーが金属表面の電子に吸収されて反射されなくなる現象を利用した測定 法である。実際の測定では、金属として金、銀、白金を用いることが多ぐ通常、ガラ ス等の基材に金の薄膜を貼り付けたチップを用い、金の表面に分子認識素子を連結 させることが一般的である。したがって、本発明において膜厚が変化し、金属表面近 傍の質量が変動した場合には、 SPR法によって測定することが可能である。例えば、 特開平 9 96605、特開平 11 183372等に SPR法に関する記載がある。
[0057] エリプソメトリー（Ellipsometrv)
エリプソメトリーは偏光解析法とも呼ばれ、光の偏光状態の変化を測定して、膜の膜 厚や屈折率等を算出することのできる測定法である。
[0058] 光導波路法（Optical Wave Guide： OWG法)
OWG法は、光導波路内を通過する光により生じるエバネッセント波を利用する測 定法で、膜の表面に試料があるとエバネッセント波が吸収されるため、通過する光が 減少することを利用した測定法である。例えば、特開平 8— 114547、特開平 10— 3 8801等に OWG法に関する記載がある。
[0059] 標的物皙および試料 本発明の方法により検出および zまたは定量することのできる標的物質は、特に限 定されず、上記のごとぐ本発明の分子認識素子によって認識し得る物質であればよ い。したがって、本発明によって、例えば、内分泌攪乱物質、農薬、各種薬剤、ホル モン様作用物質、ホルモン、核酸、および、ウィルスや細菌等の微生物を検出および
Zまたは定量することができる。より具体的には、内分泌攪乱物質として、例えば、ダ ィォキシン類、ビスフエノール A、アルキルフエノール、ベンゾピレン、 PCB、フタル酸 エステル等を挙げることができるが、これに限定されない。また、農薬としては、例え ば、アミトール、シマジン、パラチオン、べノミル等を挙げることができる力 これに限 定されない。
[0060] したがって、本発明の利用分野は、臨床、医薬品、食品、環境分析等、広範囲に渡 り、例えば、アトピー性皮膚炎の原因物質特定、スギ花粉の飛散量測定等に、本発 明を利用することができる。
[0061] また、本発明においては、種々の試料を分析することができる。したがって、本発明 によって、土壌、河川の水、上下水道水、大気等の環境試料の他にも、血液 (全血、 血漿、血清）、リンパ液、唾液、尿、組織病片等の生体からの試料を分析することも可 能である。また、出生前診断を行う場合等には、羊水中に存在する胎児の細胞や、 試験管内での分裂卵細胞の一部を検体とすることもできる。本発明により分析する試 料は、必要に応じて、前処理等の処理を施してもよいことは言うまでもない。例えば、 これらの検体は直接、又は必要に応じて遠心分離操作等により沈渣として濃縮した 後、例えば、酵素処理、熱処理、界面活性剤処理、超音波処理、或いはこれらの組 み合わせ等による細胞破壊処理を予め施したものを使用することができる。したがつ て、標的物質がダイォキシン類のような有機化合物の場合には、標的物質を有機溶 媒で抽出することができる。
図面の簡単な説明
[0062] [図 1]図 1は、トロンビンを固定ィ匕した基板上にフイブリノ一ゲンを添カ卩した場合の IER シグナルの変化を示す図である（実施例 1)。図中、（1)はトロンビン固定ィ匕基材にフ イブリノ一ゲンを添加した場合、 (2)は BSA固定ィ匕基材にフイブリノ一ゲンを添加した 場合である。 [図 2]図 2は、 HSAを固定ィ匕した基板上にトロンビン標識 HSA抗体を添加した場合 の IERシグナルの変化を示す図である（実施例 3)。図中、（1)は HSA固定化基材に トロンビン標識 HSA抗体を添加した場合、 (2)は HSA固定ィ匕基材にトロンビン標識 HSA抗体および HSAを添カ卩した場合、 (3)は BSA固定ィ匕基材にトロンビン標識 HS A抗体を添加した場合である。
[図 3]図 3は、 HSAを固定ィ匕した基板上に、トロンビン標識 HSA抗体と HSAとを添カロ した場合の IERシグナルを示す図である（実施例 3— 2)。
[図 4]図 4は、 HSAを固定ィ匕した基板上に、トロンビン標識 HSA抗体と BSAとを添カロ した場合の IERシグナルを示す図である（実施例 3— 2)。
[図 5]図 5は、図 3及び図 4を基に、縦軸を IERシグナルの変化、横軸を HSA又は BS Aの添加量とした図である（実施例 3— 2)。
[図 6]図 6は、洗浄工程を行わずに測定した IERシグナルを示す図である（実施例 4) 発明を実施するための態様
[0063] m
本発明は、 1つの態様において、標識酵素である。本発明のこの標識酵素は、上記 したように、基質をゲル化させる反応を触媒する、各種の標識ィ匕に用いることができる 酵素である。例えば、上記ゲル化反応を触媒することができるプロテアーゼ、ぺプチ ダーゼ等を挙げることができる（この場合の基質としては、タンパク質、ポリペプチド等 を挙げることができる）。中でも、血液凝固反応に関与する酵素が好適であり、さらに は、トロンビン (この場合の基質はフイブリノ一ゲン）がより好適である。
[0064] 標 の ίΒおよび/または 法
本発明は、 1つの態様において、標的物質を酵素免疫測定法により検出およびま たは定量する方法である。したがって、例えば、サンドイッチ法に本発明を利用した 場合、本発明は、以下の工程を含むことができる：
(a)標的物質を含む試料と;該標的物質を特異的に認識し得る抗体 (1次抗体)を基 材に固定させた固定化抗体と;基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識 した、該標的物質を特異的に認識し得る標識化抗体 (2次抗体）；とを反応させる工程 (b)工程 (a)で生じた固定ィ匕抗体 標的物質 標識ィ匕抗体の複合体に、該標識酵 素の触媒作用によりゲルィ匕する基質を添加して、該基材上にゲルを生成させる工程
(c)工程 (b)で生じたゲルによる該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化 を測定する工程。
[0065] また、本発明は、競合法による酵素免疫測定法において、例えば、以下の工程を 含むことができる：
(a)標的物質を含む試料と；基質をゲル化する反応を触媒する標識酵素で標識した 抗原を含む試料と;該標的物質および該抗原を特異的に認識し得る抗体を基材に 固定させた固定ィ匕抗体と；を反応させる工程、
(b)工程 (a)で生じた固定ィ匕抗体 標的物質の複合体、および固定ィ匕抗体 標識 化抗原に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲ ルを生成させる工程、
(c)工程 (b)で生じたゲルによる該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化 を測定する工程。
[0066] ここで、上記態様にぉ ヽては、標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標 識酵素で標識した抗原とが 1つの試料に含まれて 、てもよ 、。
[0067] 測定キット
本発明は、 1つの態様において、標的物質の測定キットを提供する。本発明の標的 物質の測定キットは、ある態様において、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵 素と、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と、標的物質を特異的に認識し 得る分子認識素子とを含む。本発明の測定キットは、さらに、分子認識素子または認 識対象物 (例えば、抗体または抗原)が固定化される基材、標準溶液、ゲル化反応の 増感剤、ノ ッファー、使用説明書、パッケージ等を含んでもよい。
[0068] また、本発明は、 1つの態様において、分子認識素子を標識するためのキットを提 供する。本発明のキットは、ある態様において、基質をゲル化させる反応を触媒する 標識酵素と;該標識酵素を分子認識素子と連結させるための試薬とを含む。連結さ せるための試薬は、 1種類であっても、 2種類以上であってもよい。また、上記キットは 、他の要素を含んでいてもよぐ例えば、上記標識酵素によって標識した分子認識素 子を保存するための溶液 (例えば、ノ ッファー等）、分子認識素子または認識対象物 (例えば、抗体または抗原)が固定化される基材、標準溶液、ゲル化反応の増感剤、 ッファー、使用説明書、パッケージ等を含んでもよい。
[0069] バイオセンサー
本発明は、 1つの態様において、標的物質を検出および Zまたは定量するための ノィォセンサーを提供する。
[0070] 本発明のバイオセンサーは、 1つの態様において、（a)基材に固定ィ匕された、標的 物質を特異的に認識し得る第 1の分子認識素子 (例えば 1次抗体)と;基質をゲルイ匕 する反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特異的に認識し得る第 2の分子認識素子 (例えば 2次抗体)と;該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基 質と;標的物質と;を反応させる反応部、ならびに、（b)前記反応により生じたゲルに 起因する、該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化を測定する測定部と を備える。
[0071] また、本発明のバイオセンサーは、 1つの態様において、（a)標的物質と;基質をゲ ル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された標的物質と;基材に固定化さ れた、該標的物質を特異的に認識し得る固定ィ匕分子認識素子と;該標識酵素の触 媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、ならびに、（b)前記反応により 生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および zまたは屈折率の変化を測定 する測定部とを備える。
[発明の効果]
本発明によれば、共存物質の影響が少なぐ標的物質を高感度に検出および Zま たは定量することができる。また、本発明によれば、簡便な装置により、標的物質を高 感度に検出および Zまたは定量することが可能になる。
実施例
[0072] 以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に 限定されるものではない。 [実施例 1]
トロンビンとフイブリノ一ゲンとにより生じるゲルを IER法により測定した。
[0073] 実,験手順
1.カフス 板 (14. 5mm X 14. 5mm)を、 10% 3― aminopropyltriethoxysilan e ( y APTES :信越ィ匕学工業製）中で 99°Cにてー晚インキュベートし、次いで、 2 % ダルタルアルデヒド (和光純薬工業製)溶液で室温にて 3時間処理した。
2.上記基板上にトロンビン溶液 (ヒトトロンビン 10 gZml:和光純薬工業製)を lm 1添加し、室温にて 3時間インキュベートして、基板上にトロンビンを固定した。
3.基板を洗浄後、フイブリノ一ゲン溶液（2mgZml、 Total volume 200 1:和光 純薬工業製)を添加し、 IERシグナルを測定した。
4.対照として、同様の手順でゥシ血清アルブミン（Bovine serum albumin : BSA 、 Pierce社製)を固定ィ匕した基板を作成し、 IERシグナルを測定した。
[0074] 沏 菓
結果を図 1に示す。トロンビンを固定ィ匕した基板については、フイブリノ一ゲンを添 加すると、フイブリノ一ゲンのゲルイ匕が起こり、このゲルによる膜厚および Zまたは屈 折率の変化を IER法により測定できることが確認された。一方、トロンビンを基板上に 固定ィ匕せず、単にフイブリノ一ゲンを添加しただけの場合、大きな IERシグナルの変 化を測定することはできなカゝつた。すなわち、基板のごく近傍で薄膜が形成された場 合にのみ、大きな IERシグナルの変化が測定された。一方、 BSAを固定ィ匕した基板 では、 IERシグナルの変化は観察されなかった。これは、 BSAによってはフイブリノ一 ゲンのゲル化が起こらな 、ため、 IERシグナルの変化が測定されなかったものと考え られる。
[0075] 以上から、標識酵素としてトロンビンを固定ィ匕した基板に、基質であるフイブリノーゲ ンを添加すると、フイブリノ一ゲンがフイブリンに分解されゲルイ匕し、このゲルィ匕により 生じた膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化を IER法により測定できることが確認さ れた。
[実施例 1 2]
トロンビンとフイブリノ一ゲンとにより生じるゲルをエリプソメトリー法により測定した。 [0076] 実,験手順
トロンビンを固定ィ匕した基板をエリプソメトリーにより測定した以外は、実施例 1と同 様にして、トロンビンとフイブリノ一ゲンとの反応によるゲルィ匕を測定した。
[0077] エリプソメトリーの測定条件は以下の通りである。
自動エリプソメーター： DHA— XA (溝尻光学工業製）
光源： He— Neレーザー、波長 632. 8nm
入射角度： 70度
沏 I
測定の結果、トロンビンとフイブリノ一ゲンとの反応により生じたゲルが確認され、ゲ ルの膜厚は 113. 5應であった。
[0078] 以上から、標識酵素としてトロンビンを固定ィ匕した基板に、基質であるフイブリノーゲ ンを添加すると、フイブリノ一ゲンがフイブリンに分解されゲルイ匕し、このゲルィ匕により 生じた膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化をエリプソメトリーによっても測定できる ことが確認された。また、エリプソメトリーによるゲル膜厚の測定により、基板に固定ィ匕 されたトロンビンとフイブリノ一ゲンとによるゲル力 基板の近傍で生じていることが確 f*i¾ れ 。
[実施例 2]
纖
1.カフス 板 (14. 5mm X 14. 5mm)を、 10% 3― aminopropyltriethoxysilan e ( y — APTES :信越ィ匕学工業製）中で 99°Cにてー晚インキュベートし、次いで、 2 % ダルタルアルデヒド (和光純薬工業製)溶液で室温にて 3時間処理した。
2.上記基板上に異なる濃度のトロンビン溶液 (ゥシトロンビン 10 μ gZml、 1 μ gZ ml:和光純薬工業製)を lml添加し、室温にて 3時間インキュベートして、基板上にト ロンビンを固定した。
3.基板を洗浄後、フイブリノ一ゲン溶液（2mgZml、 Total volume 200 1:和光 純薬工業製)を添加し、 IERシグナルを測定した。
4.対照として、同様の手順でゥシ血清アルブミン（Bovine serum albumin : BSA 、 Pierce社製)を固定ィ匕した基板を作成し、 IERシグナルを測定した。 [0079] 沏 菓
結果を表 1に示す。 10 μ gZmlおよび 1 μ gZmlのゥシトロンビン溶液を基板に添 カロした場合、この基板にフイブリノ一ゲンを添加した後 8分経過時点において、 IERシ グナルの変化が確認された。一方、 BSAを基板に添カ卩した場合は、 IERシグナルの 変化はほとんど検出されな力つた。この結果から、トロンビンを固定ィ匕した基板上にフ イブリノ一ゲンを添加して、ゲルを生じさせ、それにより生じた膜の膜厚および Zまた は屈折率の変化を IER法により測定できることが確認された。
[0080] [表 1]
Figure imgf000025_0001
[0081] [実施例 3]
纖棚
A.抗体のトロンビン標識
以下の手順に従い、マレイミド 'ノンヒンジ法により抗体をトロンビン標識した。
I. IgGへの SH基導入
(1) l50mMのNaCl、 ImMの EDTAを含む、 50mMのリン酸カリウムバッファーを 調製し、 pH7. 0に調整した (以下、ノ ッファー Aとする）。
(2) 500 μ Iのバッファー Αに IgGを 0. 5mg添加し、 IgG溶液を調製した。
(3)上記 IgG溶液に、 N—スクシンィミジル 3—（2 ピリジルジチォ）プロピオネート (SPDP、 Pierce社製）の DMSO溶液（20mM、 80 /z l)を添加し、 30°Cにて 10分間 インキュベートして、ジスルフイド結合を形成させた。
(4)バッファー Aで透析し、未反応の SPDPを除去した。 (5) IgGサンプル lmlあたりジチオスレィトール（DTT、和光純薬製）を 12mg添カロし 、室温にて 30分間インキュベートし、 SH基を導入する。
(6)インキュベート後、すぐに冷却し、 PBSで透析して、 DTTを除去する。
2. トロンビンへのマレイミド基導入
(1) 50mMのリン酸カルシウムバッファーを pH7. 0に調整した（以下、ノッファー Bと する)。
(2) 1mlのバッファー Bにトロンビンを 400 g添カロし、トロンビン溶液を調製した。
(3)上記トロンビン溶液に、 250 gの Sulfo— SMCC (Pierce社製）を添カ卩し、 30°C にて 10分間インキュベートした。
(4)インキュベート後、すぐに冷却した。
(5)脱塩カラム NAP10で処理し、リン酸バッファー（PBS)で処理した。
3. IgGへのトロンビンの連結
上記 1で調製した SH基導入 IgGと、 2で調製したマレイミド基導入トロンビンとを混 合して、 4°Cにて 4時間以上インキュベートした。
B. トロンビン標識抗体による HSAの検出
(1)実施例 1と同様にして、ガラス基板上に HS A (ヒト血清アルブミン)および BSAを 固定化した。
(2) HSA固定ィ匕基板上に、トロンビン標識抗体約 400 μ g/mlを含む溶液 200 μ 1を 添加し、 30分間室温でインキュベートした後、抗体溶液を取り除いて PBSで 3回洗浄 した。その後 2 mg/mlフイブリノ一ゲン溶液を 200 1添カ卩して、 IERシグナルを測 し 7こ。
(3)トロンビン標識抗体溶液 200 1に 3. 5 mgの HSA (抗体のモル量の約 100倍の モル量)を添加し、 10分間室温でインキュベートした。その後、 HSA固定ィ匕基板上 に、上記のインキュベートした溶液を 200 1添カ卩し、 30分間室温でインキュベートし た後、抗体溶液を取り除いて PBSで 3回洗浄した。その後 2 mgZmlフイブリノ一ゲン 溶液を 200 1添カ卩して、 IERシグナルを測定した。
(4) BSA固定ィ匕基板を用い、上記（2)と同様に IERシグナルを測定した。
沏 菓 結果を図 2に示す。 HSA固定ィ匕基板にトロンビン標識 HSA抗体を添加した場合 ( 1)、 IERシグナルに大きな変化が測定され、トロンビンとフイブリノ一ゲンとによるゲル 化によって生じた HSA固定ィ匕基板上の膜の膜厚等の変化を検出することができた。 一方、トロンビン標識 HSA抗体と HSAとをあら力じめ混合した溶液を、 HSA固定ィ匕 基板に添加した場合（2)、 IERシグナルに変化が見られた力 （1)のシグナル変化よ りは小さかった。すなわち、 HSAを固定ィ匕した基板に、（1)トロンビン標識 HSA抗体 のみを添加した場合と、 (2)トロンビン標識 HSA抗体と HSAとを競合させて添加した 場合とで、 IERシグナルの変化に有意な差が確認された。一方、 BSA固定ィ匕基板に トロンビン標識 HSA抗体を添加した場合（3)、 IERシグナルの変化はほとんどなぐ 膜の膜厚および Zまたは屈折率の変化がほとんど生じて 、な 、ことが確認された。こ の結果から、本発明の方法によって、試料中の HSAを検出できることが示された。
[実施例 3— 2]
纖
[実施例 3]の「A.抗体のトロンビン標識」に記載の方法により抗体をトロンビン標識 し、「B. トロンビン標識抗体による HSAの検出」に記載されたものと同様の方法により 基板上に生じたゲルを IERで測定した。アツセィは、実施例 3と同様に競合法で行い 、トロンビン標識抗体の添カロとともに、 500ρΜ, 5ηΜ, 50ηΜ, 500ηΜ, 5 μ Μ(ΌΗ SAを HSA固定ィ匕基板に添加した。また、コントロールとして、トロンビン標識抗体とと もに、 500pM, 5nM, 50nM, 500nM, 5 Mの： BSAを HSA固定ィ匕基板に添カロし た。
沏 菓
図 3に示すように、トロンビン標識 HSA抗体に加えて、 HSAを添カ卩しなかった場合 、トロンビン標識 HS A抗体と基板上の HS Aとの反応が競争阻害されないため、トロン ビン標識 HSA抗体と基板上の HSAとが多く結合し、フイブリノ一ゲンの添カ卩によって 基板上にゲルが生じるため、 IERシグナルの変化が大きかった。一方、トロンビン標 識 HSA抗体にカ卩えて、 HSAを添カロした場合は、トロンビン標識 HS A抗体と基板上 の HSAとの反応が、添カ卩した HSAにより阻害されるため、トロンビン標識 HSA抗体 と基板上の HSAとの反応が少なくなり、フイブリノ一ゲンを低下しても多くのゲルが生 じず、 IERシグナルの変化は小さくなつた。
[0084] 一方、 BSAを添カ卩した場合を図 4に示す。この場合、 BSAは、トロンビン標識 HSA 抗体と基板上の HSAとの反応を阻害できないため、 IERシグナルは、添加する BSA の濃度が変化しても同じだった。
[0085] さらに、縦軸を IERシグナルの変化、横軸を HSA又は BSAの添カ卩量とした図を図
5に示す。これによれば、 HSAの濃度が 5nM程度であっても、本発明の方法により 十分に検出可能であることが示された。
[実施例 4]
纖棚
[実施例 3]の「A.抗体のトロンビン標識」に記載の方法により抗体をトロンビン標識 した。そして、洗浄工程を行わないこと以外は、 [実施例 3]の「B.トロンビン標識抗体 による HSAの検出」に記載されたものと同様の方法により基板上に生じたゲルを IER で測定した。アツセィは、実施例 3と同様に競合法で行い、トロンビン標識抗体の添 加とともに、 5 Mの HSAを HSA固定ィ匕基板に添加する場合、及び、トロンビン標識 抗体の添カ卩のみで、 HSAを HSA固定化基板に添カ卩しない場合について、 IERを測 し 7こ。
[0086] 沏 菓
図 6に示すように、トロンビン標識 HSA抗体に加えて、 HSAを添カ卩しなかった場合 、 IERシグナルの変化は大きく（ A IERシグナル = -0. 00181V/sec)、トロンビン 標識 HSA抗体にカ卩えて、 HSAを添カ卩した場合は、 IERシグナルの変化は小さかつ た（A IERシグナル =— 0. 00058VZsec)。
[0087] このように本発明によれば、従来法では必要とされた洗浄工程を行わなくとも、目的 物質を高感度で測定できることが示された。これは、本発明の方法では基板近傍の ゲルを測定するために特に洗浄工程を行わなくとも目的物質の測定が可能になった ものと思われる力 本発明は必ずしもこの理論に拘束されるわけではない。

Claims

請求の範囲
[1] 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素。
[2] 前記標識酵素がプロテアーゼまたはべプチダーゼである、請求項 1に記載の標識 酵素。
[3] 前記標識酵素が血液凝固反応に関与する酵素である、請求項 1または 2に記載の 標識酵素。
[4] 前記標識酵素がトロンビンである、請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の標識酵素
[5] 前記基質力 Sタンパク質である、請求項 1〜4のいずれか 1項に記載の標識酵素。
[6] 前記基質力^イブリノ一ゲンである、請求項 1〜5のいずれか 1項に記載の標識酵 素。
[7] (a)標的物質と;該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定さ せた固定化分子認識素子と;基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識し た、該標的物質を特異的に認識し得る標識化分子認識素子;とを反応させる工程、
(b)工程 (a)で生じた固定化分子認識素子 標的物質 標識化分子認識素子の 複合体に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を添加して、該基材上にゲ ルを生成させる工程、
(c)工程 (b)で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変 化を測定する工程、
を含む、標的物質の検出および Zまたは定量方法。
[8] (a)標的物質と、基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素で標識した標的物 質とを、該標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子を基材に固定させた固定 化分子認識素子と反応させる工程、
(b)工程 (a)で生じた固定ィ匕分子認識素子—標的物質の複合体、および固定ィ匕分 子認識素子 標識化標的物質に、該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質を 添加して、該基材上にゲルを生成させる工程、
(c)工程 (b)で生じたゲルを含む該基材上の膜の膜厚および Zまたは屈折率の変 化を測定する工程 を含む、標的物質の検出および Zまたは定量方法。
[9] 干渉増幅反射法または表面プラズモン共鳴法を利用して膜の膜厚および Zまたは 屈折率の変化を測定する、請求項 7または 8に記載の標的物質の検出および Zまた は定量方法。
[10] 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；
該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；
を含む標的物質の測定キット。
[11] 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素と；
標的物質を特異的に認識し得る分子認識素子と該標識酵素とを連結させるための 試薬と；
を含む標的物質の測定キット。
[12] (a)基材に固定化された、標的物質を特異的に認識し得る第 1の分子認識素子と； 基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された、標的物質を特異的 に認識し得る第 2の分子認識素子と;該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質 と;標的物質と；を反応させる反応部、ならびに
(b)前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および Zまたは 屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および Zまたは定量す るためのノィォセンサー。
[13] (a)標的物質と;基質をゲル化させる反応を触媒する標識酵素により標識された標 的物質と;基材に固定化された、該標的物質を特異的に認識し得る固定ィ匕分子認識 素子と；該標識酵素の触媒作用によりゲル化する基質と；を反応させる反応部、なら びに
(b)前記反応により生じたゲルに起因する、該基材上の膜の膜厚および Zまたは 屈折率の変化を測定する測定部とを備えた、標的物質を検出および Zまたは定量す るためのノィォセンサー。
PCT/JP2005/017378 2004-09-22 2005-09-21 標識酵素 WO2006033348A1 (ja)

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