CN113376124A - 一种表面等离子共振传感芯片及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表面等离子共振传感芯片，包括从下到上依次层叠设置的玻璃基板、传感层和石墨烯修饰层。该表面等离子共振传感芯片，表面设置石墨烯修饰层，实现抗体探针的有效固定，能够灵敏度较高的检测待测蛋白。所述表面等离子共振传感芯片还包括流通池；可选的，所述流通池包括至少2个通道；所述流通池与石墨烯修饰层可拆卸的结合；可选的，所述流通池材料为硅橡胶。该传感芯片可以在单个芯片上实现同时检测多个样品的功能，大大提高了样品的检测效率，缩短了样品的检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表面等离子共振传感芯片及其制备方法和应用。
背景技术
近年发展起来的表面等离子共振(SPR)检测技术具有实时动态分析、无标记、灵敏度高等优点，已成为一种重要的研究生物分子相互作用动力学的工具，并广泛地应用于化学和生物分析物的检测。SPR成像传感技术通过将SPR技术与成像系统结合，可实现2D阵列高通量的免疫传感，为开发新型准确、高通量的蛋白新方法提供了新的方向。
在SPR免疫传感器的制备中，传感器的灵敏度对检测的有效性至关重要。抗原与抗体直接结合引起的共振波长变化通常较小，导致检出限过高，无法满足临床检测的需求，因此还需要基于SPR成像检测平台引进信号放大技术以提高SPR传感的灵敏度。
发明内容
因此，为了提高表面等离子共振传感芯片检测的灵敏度，本发明提供一种表面等离子共振传感芯片，包括从下到上依次层叠设置的玻璃基板、传感层和石墨烯修饰层。
可选的，所述玻璃基板的厚度0.5-1mm；所述传感层的厚度为45nm-50nm；所述传感层材料为金。
可选的，所述等离子共振传感芯片还包括流通池，所述流通池包括包括至少2个通道；所述流通池与石墨烯修饰层可拆卸的结合；所述流通池材料为硅橡胶；设置多个通道(通孔)可以一次性检测多个样品；可选的，每个通道包括一个进样口和一个出样口；
一种表面等离子共振传感芯片制备方法，包括如下步骤：提供玻璃基板，在玻璃基板上依次形成传感层和石墨烯修饰层。
形成石墨烯修饰层的具体步骤包括如下步骤：
1、取单面CVD生长石墨烯的铜箔，放在匀胶机吸盘上，在铜箔上滴加PMMA溶液，甩胶，烘干；
2、将铜箔胶面朝上放置在氯化铁溶液(浓度为3mol/L，溶剂为纯水)之上，铜箔被刻蚀；
3、铜箔被刻蚀完毕后将透明的石墨烯薄膜，转移到玻璃薄片上，然后将石墨烯薄膜转移到纯水中，清洗，之后将透明的石墨烯薄膜转移到步骤(2)处理后的SPR芯片传感层(金薄膜)上；
可选的，放在匀胶机之前，还包括将单面CVD生长石墨烯的铜箔剪成15-20mm(15mm)边长的正方形的步骤；
可选的，PMMA溶液质量分数为3％-5％(4％)；
可选的，甩胶的条件为：3000r/min-5000r/min的速度甩胶30s-60s(30s)；
上述步骤1中烘干的条件为：在50℃-80℃(50℃)下烘1min-5min(1min)。
可选的，在石墨烯修饰层形成之前形成传感层。
一种检测蛋白的装置，包括：上述的SPR传感芯片，还包括检测检测模块，所述检测模块适于检测SPR传感芯片上加入待测蛋白前后的共振波长变化。
一种检测蛋白的方法，包括使用上述SPR传感芯片或上述的检测装置检测蛋白的步骤。
可选的，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测蛋白、纳米颗粒与待测蛋白的抗体2形成偶联物；
(2)在表面等离子共振传感芯片的石墨烯修饰层负载待测蛋白的抗体1；
(3)将步骤(1)中的偶联物与步骤(2)中的待测蛋白的抗体1接触；
(4)监测步骤(1)中的偶联物与步骤(2)中的待测蛋白的抗体1接触前后的共振波长变化；
所述抗体1和抗体2与待测蛋白结合的位点不同。
可选的，所述纳米颗粒为功能化微球或磁珠；所述功能化微球为羧基聚苯乙烯微球。
将待测蛋白、功能化微球(直径为0.1-1μm)与待测蛋白的抗体2形成偶联物的具体步骤包括：
第一步：功能化微球(羧基聚苯乙烯微球)与羧基活化剂反应后，与抗体2孵育形成功能化微球与抗体2偶联物；
第二步：功能化微球与抗体2偶联物与待测蛋白溶液孵育，形成待测蛋白、功能化微球与待测蛋白的抗体2的偶联物；
可选的,上述反应的具体步骤为：
S1：将羧基聚苯乙烯微球重悬在10mL MES缓冲液中，羧基聚苯乙烯微球的浓度为80-150mg/ml(100mg/ml)，加入羧基活化剂，反应；
S2：使用PBS缓冲液清洗羧基聚苯乙烯微球后，将羧基聚苯乙烯微球重悬在5mlPBS缓冲液中，与抗体2溶液(浓度为0.4mg/ml)混合均匀，振荡反应2到4个小时(2小时)，形成羧基聚苯乙烯微球和抗体2偶联物；
S3：使用淬火剂(40mM乙醇胺和1％BSA混合物)清洗羧基聚苯乙烯微球和抗蛋白单克隆抗体2偶联物，使得该偶联物重悬在10mL淬火剂中，振荡反应(30分钟)。
S4：使用保存剂(0.1％BSA)清洗偶联物；
S5:将该偶联物重悬在保存剂中，形成微球-抗体2偶联物；可选的，重悬后微球的浓度为10mg/ml；
S6：将待测蛋白样品溶液与微球-抗体2偶联物按100:1体积比混合均匀，反应(37℃下反应1小时)，形成待测蛋白、功能化微球与待测蛋白的抗体2形成偶联物。
本发明技术方案，具有如下优点：
1)本发明提供一种表面等离子共振传感芯片，包括从下到上依次层叠设置的玻璃基板、传感层和石墨烯修饰层。该表面等离子共振传感芯片，表面设置石墨烯修饰层，实现抗体探针的有效固定，能够灵敏度较高的检测待测蛋白。
2)本发明提供一种表面等离子共振传感芯片，所述表面等离子共振传感芯片还包括流通池；可选的，所述流通池包括包括至少2个通道；所述流通池与石墨烯修饰层可拆卸的结合；可选的，所述流通池材料为硅橡胶。该传感芯片可以在单个芯片上实现同时检测多个样品的功能，大大提高了样品的检测效率，缩短了样品的检测时间。
3)本发明提供一种检测蛋白的方法，发明采用表面等离子共振传感芯片的表面设置石墨烯修饰层，实现抗体探针的有效固定，此外还采用功能化微球实现了SPR信号的放大，两者结合可以大大提高检测的灵敏度，降低了检测的检出限。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例3中蛋白检测原理图；
图2是实施例3中不同浓度蛋白组的实时共振波长变化曲线图；
图3是实施例3中蛋白浓度与共振波长变化量的标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
一种SPR传感芯片，包括从下到上依次层叠设置的玻璃基板、传感层和石墨烯修饰层。
具体的，所述玻璃基板的厚度为0.5mm(可以为0.5mm-1mm)；所述传感层的传感层的厚度为45nm(45nm-50nm)；所述传感层材料为金。
具体的，玻璃基板与传感层之间还包括粘附层，粘附层的材料为铬；
具体的，所述SPR传感芯片还包括流通池，所述流通池包括至少2个通道(本实施例为6个)，所述流通池与石墨烯修饰层可拆卸的结合；设置多个通道可以一次性检测多个样品；
具体的，每个通道包括一个进样口和一个出样口；
所述流通池材料为硅橡胶。
实施例2
一种SPR传感芯片的制备方法，包括如下步骤：
提供玻璃基板，在玻璃基板上依次形成传感层和石墨烯修饰层。
具体的，在石墨烯修饰层形成之前形成传感层。
具体的，还包括在形成传感层之前形成粘附层。
具体的，还包括形成多通道(或通孔)流通池的步骤。
SPR传感芯片的制备方法包括如下步骤：
(1)SPR传感芯片传感层和粘附层的形成：以厚度为0.5mm、6英寸直径的BK7玻璃为基底，在玻璃上磁控溅射2nm厚(可以为2nm-5nm)的铬(Cr)薄膜作为粘附层，接着磁控溅射45nm厚(可以为45nm-50nm)的金(Au)薄膜作为传感层，切割成20mm*20mm的芯片大小。
(2)清洗：依次使用无水乙醇和纯水冲洗芯片表面，用于除去电极表面的无机污染物，使用氮气吹干芯片表面。
(3)SPR传感芯片石墨烯修饰层的形成：取单面CVD生长石墨烯的铜箔剪成15mm(可以为15-20mm)边长的正方形，用玻璃片压平后放在匀胶机吸盘上，在铜箔上滴加10微升PMMA溶液(质量分数为4％，溶剂为苯甲醚)，以3000r/min的速度甩胶30s(可以为30s-60s)，在50℃(50℃-80℃)下烘1min(1min-5min)。将铜箔(胶面朝上)放置在氯化铁溶液(3mol/L，溶剂为纯水)之上，铜箔缓慢被刻蚀。铜箔被刻蚀完毕后将透明的石墨烯薄膜，转移到玻璃薄片上。然后将石墨烯薄膜转移到纯水中，清洗3次(可以为3-4次)每次1h(可以为1-2h)，直到水变得澄清无色，之后将透明的石墨烯薄膜转移到步骤(2)处理后的SPR芯片上金(Au)薄膜上，形成SPR传感基础芯片。SPR传感基础芯片在空气中自然晾干后转移到烘箱中50℃烘干5min(可以为50℃-80℃烘干5min-10min)。烘干后将SPR传感基础芯片依次浸泡在无水乙醇中5min(可以为5min-10min)、丙酮中30min(可以为30min-60min)、异丙醇15min(可以为15min-30min)和纯水5min(可以为5min-10min)中，以清洗掉石墨烯修饰层表面的PMMA。最后将SPR传感基础芯片在空气中自然晾干后转移到烘箱中50℃烘干10min(可以为50℃-80℃，5min-10min)。
(4)制备多通道(或通孔)流通池：将道康宁SYLGARD 184硅橡胶按基本组分与固化剂10:1的重量比进行混合。使用搅拌器缓慢搅拌10分钟。将混合均匀的胶放入真空箱中，保持抽真空状态直至混合液膨胀固定且无气泡为止。接着将PDMS胶倒入流通池模具中，放入150℃烘箱中，固化20分钟。使用刀具将固化好的流通池从模具中剥离出来。使用打孔器打出通道的进样口和出样口，得到多通道(或通孔)流通池。
(5)将流通池放置在石墨烯层之上，使用弹簧装置固定。
实施例3一种检测蛋白的方法
(1)制备微球-抗体偶联物：首先使用MES缓冲液(0.1mol/L，pH＝5.3)清洗羧基聚苯乙烯微球(直径为0.1μm)两次，将清洗后的羧基聚苯乙烯微球重悬在10mL MES缓冲液中，羧基聚苯乙烯微球的浓度为100mg/ml，加入羧基活化剂(EDC，100mg)，振荡反应15分钟。使用PBS缓冲液(0.01mol/L，pH＝7.2)清洗两次，重悬在5ml PBS缓冲液中，与5mL的抗蛋白单克隆抗体2(简称抗体2)溶液(0.4mg/ml)混合均匀，振荡反应2小时(可以为2到4个小时)，形成羧基聚苯乙烯微球和抗蛋白单克隆抗体2偶联物。使用淬火剂(40mM乙醇胺和1％BSA混合物)清洗羧基聚苯乙烯微球和抗蛋白单克隆抗体2偶联物，使得该偶联物重悬在10mL淬火剂中，振荡反应30分钟。使用保存剂(0.1％BSA)清洗偶联物，最后将该偶联物重悬在保存剂中，使微球的浓度保持在10mg/ml，保存在4℃冰箱中。
(2)实施例1中的SPR传感芯片的石墨烯层负载待测蛋白的抗体1：首先在多通道流通池的通道中通入抗蛋白单克隆抗体1(浓度为20μg/ml)。10分钟后通入PBS溶液，冲洗掉未吸附的抗蛋白单克隆抗体1。然后在通道中通入牛血清白蛋白(浓度为5mg/ml)做封闭。10分钟后通入PBS溶液,冲洗掉未吸附的牛血清白蛋白。
(7)蛋白标准曲线建立与蛋白样品检测：将PBS对照组溶液、20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和200ng/ml的蛋白标准溶液以及待测蛋白样品溶液分别与10mg/ml的微球-抗体2(抗体1和抗体2与待测蛋白结合的位点不同)偶联物按100:1体积比混合均匀，在37℃下反应1小时。将这些溶液分别通入不同的通道，实时监测微球-抗体2-蛋白偶联物与抗体1的特异性结合引起的共振波长变化，反应10分钟后通入PBS溶液，冲洗掉未特异性结合的物质。将蛋白组的共振波长实时变化量减去PBS对照组的实时变化量得到抗原-抗体结合引起的实际共振波长变化曲线，用作后续的计算。取检测结束时20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml和200ng/ml蛋白组的共振波长变化量作拟合得到标准曲线方程，将样品组的变化量带入标准曲线方程，从而得到样品中蛋白的浓度结果。图1为蛋白检测原理图，图2为不同浓度蛋白组的实时共振波长变化曲线图，图3为蛋白浓度与反应前后共振波长变化量的关系图及拟合的标准曲线。从结果可以看出，该传感方法对蛋白的检出限为5.5ng/ml(3倍空白标准偏差/标准曲线斜率)。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (9)
1.一种表面等离子共振传感芯片，其特征在于，包括从下到上依次层叠设置的玻璃基板、传感层和石墨烯修饰层。
2.根据权利要求1所述的表面等离子共振传感芯片，其特征在于，所述玻璃基板的厚度0.5-1mm；所述传感层的厚度为45nm-50nm；所述传感层材料为金。
3.根据权利要求1或2所述的表面等离子共振传感芯片，其特征在于，所述表面等离子共振传感芯片还包括流通池；可选的，所述流通池包括包括至少2个通道；所述流通池与石墨烯修饰层可拆卸的结合；可选的，所述流通池材料为硅橡胶。
4.一种表面等离子共振传感芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：提供玻璃基板，在玻璃基板上依次形成传感层和石墨烯修饰层。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在石墨烯修饰层形成之前形成传感层。
6.一种检测蛋白的装置，其特征在于，包括：权利要求1-3任一所述的表面等离子共振传感芯片，还包括检测检测模块，所述检测模块适于检测表面等离子共振传感芯片上加入待测蛋白前后的共振波长变化。
7.一种检测蛋白的方法，其特征在于，包括使用权利要求1-3任一所述表面等离子共振传感芯片或权利要求6所述的检测装置检测蛋白的步骤。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测蛋白、纳米颗粒与待测蛋白的抗体2形成偶联物；
(2)在表面等离子共振传感芯片的石墨烯修饰层负载待测蛋白的抗体1；
(3)将步骤(1)中的偶联物与步骤(2)中的待测蛋白的抗体1接触；
(4)监测步骤(1)中的偶联物与步骤(2)中的待测蛋白的抗体1接触前后的共振波长变化；
所述抗体1和抗体2与待测蛋白结合的位点不同。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒为功能化微球或磁珠；所述功能化微球为羧基聚苯乙烯微球。
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- 2021-04-25 CN CN202110447743.3A patent/CN113376124A/zh active Pending
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