发明内容
本发明的第一方面的目的,在于提供一种检测核酸的CRISPR-SPR生物传感器芯片。
本发明的第二方面的目的,在于提供第一方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法。
本发明的第三方面的目的,在于提供一种包含本发明第一方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片的CRISPR-SPR检测系统。
本发明的第四方面的目的,在于提供本发明第一方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片和/或本发明第三方面的CRISPR-SPR检测系统在检测核酸中或制备检测核酸的产品中的应用。
本发明的第五方面的目的,在于提供一种检测核酸的方法。
为了实现上述目的,本发明所采取的技术方案是:
本发明的第一个方面,提供一种检测核酸的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于所述SPR生物传感器芯片表面的Cas蛋白、与所述Cas蛋白结合的sgRNA;所述核酸的序列包含靶核酸序列;所述sgRNA包含向导序列和锚定序列,所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补,所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合。
优选地,所述Cas蛋白包括dCas9、Cas9、Cas12a、dCas12a、Cas13a和dCas13a中的至少一种;进一步优选地,所述Cas蛋白包括dCas9。
优选地,所述dCas9(dead Cas9)、dCas12a(dead Cas12a)、dCas13a(dead Cas13a)分别由Cas9、Cas12a、Cas13a改造而成,其失去了核酸酶活性,但保留基因转录激活结构域(AD)或抑制结构域(ID)。
优选地,所述sgRNA从5’端到3’端依次包含向导序列和锚定序列。
优选地,所述sgRNA的长度为40~120bp。
优选地,所述sgRNA的向导序列的长度为8~35bp;进一步为16~23bp。
优选地,所述sgRNA的5’端还包含GGG。
优选地,所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
优选地,所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种。
优选地,所述核酸来自动物、植物或微生物样品。
优选地,所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
优选地,所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
优选地,所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
优选地,所述SPR生物传感芯片是一种基底为高透光玻璃且表面具有纳米级贵金属镀层的光学芯片。
优选地,所述贵金属包括金、银、铜中的至少一种。
优选地,所述SPR生物传感器芯片可以通过市购得到,也可以采用本领域常规方法制备得到。
优选地,所述SPR生物传感芯片是通过物理气相沉积(PVD)法在厚度为50~300μm的高透光玻璃片表面沉积厚度为40~50nm的贵金属镀层制备而得。
优选地,所述SPR生物传感器芯片为经非金属材料修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述非金属材料包括碳衍生物。
优选地,所述碳衍生物包括石墨炔、石墨烯、石墨和富勒烯中的至少一种;进一步优选地,所述碳衍生物包括石墨炔和石墨烯中的至少一种;更进一步优选地,所述碳衍生物包括石墨炔。
优选地,所述SPR生物传感器芯片为经石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述经石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片通过铜催化液相合成在SPR生物传感器芯片的贵金属镀层表面原位生长而得。
优选地,所述SPR生物传感器芯片为经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述Cas蛋白通过(a1)~(a3)中任一种方式固定于所述SPR生物传感器芯片表面:
(a1)共价键;(a2)生物素-链霉亲和素,即生物素标记的Cas蛋白接在链霉亲和素修饰的SPR生物传感器芯片表面;(a3)His标签-His抗体或His标签-镍-NTA,即His标签标记的Cas蛋白接在His抗体或镍-NTA标记的SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述Cas蛋白通过共价键固定于所述SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述Cas蛋白通过酰胺共价键固定于所述SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述sgRNA与Cas9蛋白通过sgRNA中的向导序列与Cas蛋白配对的茎环结构相互结合,形成锚定的核糖核蛋白(RNP)复合物。
优选地,所述Cas蛋白的质量(ug)与所述SPR生物传感器芯片的表面积(mm2)的比例为(1~10):400;进一步为(1~5):400;更进一步为5:400。
优选地,所述Cas蛋白与所述sgRNA的质量比为(1~25):5;进一步为(1~5):5;更进一步为5:5。
优选地,所述核酸为pUC19-Origin(序列如SEQ ID NO.1所示)、pUC19-Mut1(序列如SEQ ID NO.4所示)、pUC19-Mut2(序列如SEQ ID NO.7所示)、pUC19-Mut3(序列如SEQ IDNO.10所示)中的至少一种。
优选地,所述核酸为pUC19-Origin时,所述sgRNA的向导序列如SEQ ID NO.13所示。
优选地,所述核酸为pUC19-Mut1时,所述sgRNA的向导序列如SEQ ID NO.14所示。
优选地,所述核酸为pUC19-Mut2时,所述sgRNA的向导序列如SEQ ID NO.15所示。
优选地,所述核酸为pUC19-Mut3时,所述sgRNA的向导序列如SEQ ID NO.16所示。
优选地,所述Cas蛋白为dCas9时,所述sgRNA的锚定序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明的第二个方面,提供第一方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法,将Cas蛋白通过(a1)~(a3)中任一种方式固定于所述SPR生物传感器芯片表面,然后与所述sgRNA孵育,得到;
(a1)共价键;(a2)生物素-链霉亲和素,即生物素标记的Cas蛋白接在链霉亲和素修饰的SPR生物传感器芯片表面;(a3)His标签-His抗体或His标签-镍-NTA,即His标签标记的Cas蛋白接在His抗体或镍-NTA标记的SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述Cas蛋白通过共价键固定于所述SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述Cas蛋白通过酰胺共价键固定于所述SPR生物传感器芯片表面。
优选地,所述制备方法包括如下步骤:
1)对经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片的羧基采用活化酯法进行活化,然后与所述Cas蛋白反应,得到固定Cas蛋白的SPR生物传感器芯片;
2)将所述固定Cas蛋白的SPR生物传感器芯片与所述sgRNA混合,孵育,得到CRISPR-SPR生物传感器芯片。
优选地,步骤1)中所述活化酯法的步骤为:将经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片浸入缓冲液,加入EDC和Sulfo-NHS,反应10~30min。
优选地,所述缓冲液包括MES缓冲液。
优选地,步骤1)中所述活化后还包括清洗。
优选地,所述清洗的溶液为水。
优选地,步骤1)中所述反应前还包括加入缓冲液。
优选地,所述缓冲液包括PBS缓冲液。
优选地,步骤1)中所述反应的条件为室温反应1~4小时。
优选地,步骤1)中所述反应后还包括清洗。
优选地,所述清洗的溶液为缓冲液。
优选地,所述缓冲液包括PBS缓冲液。
优选地,步骤2)中所述孵育的条件为35~40℃条件下孵育0.5~2小时。
优选地,所述经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片的制备方法为:将石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片在等离子发生气体、真空度5~15Pa下反应60~180s,得到经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述等离子发生气体为氮气、氩气、氦气、二氧化碳、空气中的至少一种。
优选地,所述经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片的制备方法为:将石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片置于真空等离子体清洗机中,在氩气气氛、真空度5~15Pa、功率50~150W,频率200~300Hz下反应60~180s,得到经羧基化氧化石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片的制备方法如下:将铜箔、石墨炔前体和SPR生物传感器芯片混合,反应,得到石墨炔修饰的SPR生物传感器芯片。
优选地,所述反应通过催化剂促进反应。
优选地,所述催化剂包括吡啶。
优选地,所述反应的条件为50~70℃下反应48~96h。
优选地,所述反应在惰性气体下进行。
优选地,所述反应在避光条件下进行。
优选地,所述反应后还包括:清洗、干燥。
优选地,所述铜箔为去表面氧化物的铜箔。
优选地,所述脱保护的石墨炔前体的制备方法为:
1)将石墨炔前体与有机溶剂A混合,得到溶液A;
2)将溶液A与四正丁基氟化铵混合,得到溶液B;
3)将溶液B与有机溶剂B混合,分离,得到脱保护的石墨炔前体。
优选地,步骤1)中所述石墨炔前体包括六(三甲硅基乙炔基)苯。
优选地,步骤1)中所述有机溶剂A包括四氢呋喃。
优选地,步骤1)中所述混合的条件为惰性气体保护、冰浴下搅拌20~40min。
优选地,步骤2)中所述四正丁基氟化铵的溶剂为所述有机溶剂A。
优选地,步骤2)中所述混合的条件为惰性气体保护下搅拌至溶液变色。
优选地,步骤3)中所述有机溶剂B包括乙酸乙酯。
优选地,步骤3)中所述分离之前还包括:清洗。
本发明的第三个方面,提供一种CRISPR-SPR检测系统,包含本发明的第一个方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片。
优选地,所述CRISPR-SPR检测系统还包含:SPR检测仪。
本发明的第四个方面,提供本发明第一方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片和/或本发明第三方面的CRISPR-SPR检测系统在(1)或(2)中的应用;
(1)非诊断目的地检测核酸;
(2)制备检测核酸的产品。
本发明的第五个方面,提供一种非诊断目的地检测核酸的方法,包括采用本发明的第一个方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片或本发明第三个方面的CRISPR-SPR检测系统的步骤。
优选地,所述方法包括如下步骤:将本发明第一个方面的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载于SPR检测仪中,将核酸置于SPR检测仪中,启动SPR检测仪。
优选地,所述核酸包括DNA和RNA中的至少一种。
优选地,所述DNA包括ssDNA和dsDNA中的至少一种。
优选地,核酸来自动物、植物或微生物样品。
优选地,所述动物样品包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血浆、血清、痰、呼吸、尿液、精液、唾液、脑膜液、羊水、腺液、淋巴液、乳头抽吸物、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、细胞、细胞提取物、粪便、组织、组织活检、脑脊液中的至少一种。
优选地,所述植物样品包括细胞、细胞提取物、组织中的至少一种。
优选地,所述微生物样品包括细菌、病毒、真菌或其提取物。
优选地,所述核酸置于SPR检测仪前还可以包括如下步骤:对所述核酸进行扩增。
本发明的有益效果是:
本发明提供了一种检测核酸的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含SPR生物传感器芯片、固定于所述SPR生物传感器芯片表面的Cas蛋白、与所述Cas蛋白结合的sgRNA;所述核酸的序列包含靶核酸序列;所述sgRNA包含向导序列和锚定序列,所述向导序列与所述靶核酸序列相同或与所述靶核酸序列反向互补,所述锚定序列与所述Cas蛋白特异性结合;通过扫描核酸样本,当且仅当核酸样本存在与sgRNA的向导序列完全一致或反向互补的序列时,CRISPR系统(Cas蛋白及sgRNA)可辨识并结合靶核酸序列从而捕获包含靶核酸序列的核酸,使芯片表面折射率发生变化,再利用通过SPR高灵敏度的光学检测手段传感得到最终检测结果,实现非标记、快速、高效、特异性地检测核酸,检测下限可达1.3fM。
本发明提供了一种非诊断目的地检测核酸的方法,采用本发明的CRISPR-SPR生物传感器芯片,通过将CRISPR技术和SPR技术结合,相比诸如荧光、吸收光谱等传统光学检测手段,本方法具有无法比拟的超高灵敏度,相比测序或荧光显色等检测方法;本方法对样品处理的要求非常简单,不需要复杂的分子标记手段,从而极大简化了检测操作流程,同时降低了认为操作可能引入的检测误差的风险;并且本方法可以实现对检测样本进行长时间的实时监测,从而获得对检测样本各种复杂分子间相互作用的大范围动力学分析数据,进而得到分子间亲和、解离、作用力等更加全面的分析;同时,本方法具有极佳的兼容性,尤其是与微流控技术相结合,可以实现自动化、高通量、高灵敏度的样品检测;并且本方法通过CRISPR系统(Cas蛋白及sgRNA),通过sgRNA的向导序列实现高特异性识别,实现核酸的精确识别和定量;并且相比常规核酸检测方法,本方法可以不需要对核酸进行扩增,所需要样品量更小,检测时长更短(10min左右,如图1所示,阳性样本10min内达到或接近平台期即可判断为阳性),操作更加简便,成本更低,检测下限最低可达1.3fM。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
本实施例中所使用的材料、试剂等,如无特别说明,为从商业途径得到的试剂和材料。
本实施例中采用的SPR生物传感器芯片为CM5传感芯片,购于Cytiva。
本实施例中2-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液的配制方法如下:将21.3g的2-吗啉乙磺酸和29.2g的氯化钠加入1L去离子水中,充分搅拌至完全溶解,再使用1M稀盐酸溶液调pH至6.0,得到0.1M的MES缓冲液。
本实施例中采用的SPR检测仪购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司,型号为SPR-2010。
本实施例中的dCas9购自英茂盛业,货号为PC1351。
本实施例中CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法及检测方法的示意图如图4所示。
实施例1一种检测pUC19-Origin的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Origin(序列如SEQ ID NO.1所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为5:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为5:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.2,其中,向导序列(单下划线部分)与pUC19-Origin中的CTAGAGTCGACCTGCAGGCA(SEQ ID NO.3)反向互补,锚定(scaffold)序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Origin的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法,包括如下步骤:
(1)将铜箔(CVD级别铜箔)裁剪为2cm×2cm,在烧杯内用100mL的4M盐酸进行超声清洗5分钟,以去除表面氧化物,得到去除表面氧化物的铜箔;
(2)将石墨炔前体(六(三甲硅基乙炔基)苯,CAS号为100516-62-9)溶解于四氢呋喃中至浓度10mg/mL,氮气保护下在冰水浴中持续搅拌30分钟,得到溶液A;向溶液A中加入1M四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(加入量为溶液A体积的1/20),在氮气保护下继续搅拌15分钟,至溶液变色,得到溶液B;使用等体积的乙酸乙酯稀释溶液B,然后用饱和食盐水反复清洗3次,每次清洗后使用分液漏斗对混合液进行分离,得到脱保护的石墨炔前体溶液;
(3)将去除表面氧化物的铜箔和脱保护的石墨炔前体溶液置于三口烧瓶内,使用小型固定架台在三口烧瓶内放置1片SPR生物传感器芯片,加入乙酸乙酯体积的1/10量的吡啶作为催化剂,在氮气保护条件下,升温至60℃,反应72小时,反应全程避光;反应结束后,石墨炔会以薄膜形式原位生长在铜箔以及SPR生物传感器芯片表面,随后将体系降温至室温,取出SPR生物传感器芯片,使用热丙酮小心反复清洗去除有机副产物,再使用去离子水清洗去除水溶性副产物,最后氮气吹干,得到石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,常温保存避光保存备用;
(4)将石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片放置在真空等离子体清洗机中,使用氩气(Ar)气氛,在真空度10Pa,功率100W,频率300Hz的条件下,对样品进行处理60s,处理完成后,SPR生物传感器芯片表面的石墨炔纳米层即可被部分氧化并引入羧基活性基团,得到被氧化及羧基活化的SPR生物传感器芯片;
(5)将被氧化及羧基活化的SPR生物传感器芯片浸入10mL的MES缓冲液中,加入400mg的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)和1.1g N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS),对羧基采用活化酯法进行活化,在室温中进行20分钟,反应结束后将SPR生物传感器芯片用去离子水反复仔细清洗;随后再将SPR生物传感芯片浸入到10mL磷酸盐缓冲液(PBS,pH=7.4)中,加入20μL、250ng/μL的dCas9蛋白,在室温反应1小时,对dCas9蛋白进行表面固定,反应完成后使用磷酸盐缓冲液对芯片表面反复仔细清洗,得到固定有dCas9蛋白的SPR生物传感器芯片;
(6)单链引导RNA(sgRNA)的制备方法具体如下:针对待测基因及固定于SPR生物传感器芯片的dCas9蛋白设计sgRNA序列,再通过商业化DNA合成得到与目标sgRNA互补的单链DNA模板;随后,使用T7转录酶完成体外转录反应:在20μL反应体系中,分别加入2μL的单链DNA模板溶液,2μL的T7转录酶,8μL的核糖核酸(NTP)混合溶液以及8μL的体外转录缓冲液;反应在37℃下进行4小时,产物使用紫外分光光度计在260nm及280nm处测定吸收光谱,从而确定sgRNA产物的浓度和纯度;
(7)sgRNA产物(序列如SEQ ID NO.2所示)5μg使用去RNA酶水稀释到250ng/μL,随后仔细将20μL sgRNA溶液加入到上述固定有dCas9蛋白的SPR生物传感器芯片表面,在37℃条件下孵育1小时,孵育完成后使用去RNA酶水仔细清洗芯片表面以去除所有非结合的sgRNA分子,得到检测pUC19-Origin的CRISPR-SPR生物传感器芯片。
实施例2一种检测pUC19-Mut1的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut1(序列如SEQ ID NO.4所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为5:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为5:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.5,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut1中的CTAGGTGCGACCTGCAGGCA(SEQ ID NO.6)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut1的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例1中的制备方法相同,区别仅在于sgRNA不同。
实施例3一种检测pUC19-Mut2的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut2(序列如SEQ ID NO.7所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为5:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为5:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.8,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut2中的CTAGGTGAACCCTGCAGGCA(SEQ ID NO.9)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut2的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例1中的制备方法相同,区别仅在于sgRNA不同。
实施例4一种检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为5:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为5:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.11,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut3中的CTAGTGTGGAGCTGCAGGCA(SEQ ID NO.12)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例1中的制备方法相同,区别仅在于sgRNA不同。
实施例5一种检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为4:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为4:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.11,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut3中的CTAGTGTGGAGCTGCAGGCA(SEQ ID NO.12)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例4中的制备方法相同,区别仅在于dCas9蛋白浓度不同:本实施例中dCas9蛋白浓度为200ng/μL。
实施例6一种检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为3:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为3:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.11,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut3中的CTAGTGTGGAGCTGCAGGCA(SEQ ID NO.12)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例4中的制备方法相同,区别仅在于dCas9蛋白浓度不同:本实施例中dCas9蛋白浓度为150ng/μL。
实施例7一种检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为2:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为2:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.11,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut3中的CTAGTGTGGAGCTGCAGGCA(SEQ ID NO.12)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例4中的制备方法相同,区别仅在于dCas9蛋白浓度不同:本实施例中dCas9蛋白浓度为100ng/μL。
实施例8一种检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片
一种检测pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)的CRISPR-SPR生物传感器芯片,包含:SPR生物传感器芯片、固定于SPR生物传感器芯片表面的dCas9蛋白、与dCas9蛋白结合的sgRNA,其中,SPR生物传感器芯片为石墨炔纳米片修饰的SPR生物传感器芯片,dCas9蛋白的质量(ug)与SPR生物传感器芯片的表面积(mm
2)的比例为1:400;dCas9蛋白与sgRNA的质量比为1:5,sgRNA的序列为:
(SEQ ID NO.11,其中,向导序列(单下划线部分,单下划线部分中的大写字母表示突变位点)与pUC19-Mut3中的CTAGTGTGGAGCTGCAGGCA(SEQ ID NO.12)反向互补,锚定序列(双下划线部分)与dCas9蛋白特异性结合)。
上述检测pUC19-Mut3的CRISPR-SPR生物传感器芯片的制备方法与实施例4中的制备方法相同,区别仅在于dCas9蛋白浓度不同:本实施例中dCas9蛋白浓度为50ng/μL。
效果实施例
1.dCas9蛋白含量对CRISPR-SPR生物传感器芯片的检测效果的影响
分别将实施例4~8制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Mut3溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut3溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描,结果如图1所示:不同dCas9蛋白浓度制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片检测pUC19-Mut3的SPR信号不同,随着dCas9蛋白含量的增加,CRISPR-SPR生物传感器芯片的信号响应值越高,其中,当dCas9蛋白浓度为250ng/μL(总含量为5μg)时,可使芯片表面蛋白负载量趋近于饱和。
2.CRISPR-SPR生物传感器芯片的特异性检测
将实施例1制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Origin(序列如SEQ ID NO.1所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Origin溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Origin溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;将实施例2制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut1(序列如SEQ IDNO.4所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Mut1溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut1溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;将实施例3制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut2(序列如SEQ ID NO.7所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Mut2溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut2溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;将实施例4制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Mut3溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut3溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;将实施例1制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut3(序列如SEQ IDNO.10所示,错配)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为1000ng/μL pUC19-Mut3溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut3溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;将实施例1制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,,使用微量蠕动泵将缓冲液(NEBuffer2.1,购于NEB)以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描;结果如图2所示:本申请提供的CRISPR-SPR生物传感器芯片能够特异性识别目标核酸,对错配的序列和缓冲液无任何响应。
3.CRISPR-SPR生物传感器芯片的灵敏度检测
将实施例4制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片装载在SPR检测仪内,取pUC19-Mut3(序列如SEQ ID NO.10所示)用无核酸酶水(无DNA酶和无RNA酶水)配制为浓度为不同浓度的(0.064、0.32、1.6、8、40、200、1000ng/μL,5倍递增)pUC19-Mut3溶液,使用微量蠕动泵将pUC19-Mut3溶液以2mL/min的流速泵入样品流通池;使用650nm激光,全角度扫描模式模式对样本进行SPR角度扫描(每种浓度重复3次);结果如图3所示:本申请实施例4制备得到的CRISPR-SPR生物传感器芯片的检测下限为1.37ng/μL,约1.3fM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳大学
<120> 一种CRISPR-SPR生物传感器芯片及其制备方法与应用
<130>
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 892
<212> DNA
<213> 人工序列
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