CN108315332B - 一种检测硫胺素焦磷酸的rna传感器及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切；本发明还公开了一种包含本发明RNA传感器的试剂盒及检测硫胺素焦磷酸的方法；本发明的RNA传感器检测硫胺素焦磷酸灵敏度高、能够对硫胺素焦磷酸进行定性和定量检测。

Description

一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种快速、灵敏检测硫胺素焦磷酸(TPP)的RNA传感器及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一种神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失认、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。AD最突出的病理特征包括脑内β-淀粉样蛋白沉积、tau样蛋白过度磷酸化、脑内葡萄糖代谢紊乱、神经元及其突触丢失。TPP是葡萄糖代谢途径中丙酮酸脱氢酶复合体，α-酮戊二酸脱氢酶复合体以及磷酸戊糖途径中转酮醇酶的辅酶因子。TPP缺乏会导致以上三种酶类的活性下降、三梭酸循环发生障碍、三磷酸腺苷产生受阻。进一步研究发现，TPP缺乏还会产生大量的活性氧，导致了氧化应激的发生。因此TPP的缺乏与AD的发生和发展密切相关，有望成为AD早期诊断标准物。
目前用于TPP检测的方法主要有荧光法，电化学法，化学发光法，细胞内荧光生物传感器，基于液相色谱-质谱联用的检测方法以及基于纳米金的检测方法等。虽然用于检测TPP的方法种类繁多，但都存在一定的局限和缺点。例如基于液相色谱-质谱联用的检测方法，虽然该技术检测结果较精准，可重复性强，但它需要专业的操作，且设备精良昂贵，最重要的是不能实现临床上的高通量检测。而细胞内荧光生物传感器虽然利用了核糖开关的原理，特异性较好，但操作要求高且较为繁琐，此外这种方法对本底的浓度水平要求较高(微摩尔/升，umol/L)，因此该方法不适合应用到人体生物样本内TPP含量(如血液中：纳摩尔/升，nmol/L)的检测。基于纳米金的检测方法可以达到较低的检出限，但这种检测方法的特异性不高，例如通过静电作用结合其他小分子，造成假阳性信号。基于电化学法和化学发光法的检测手段，虽然较为方便，快速，但均存在对TPP识别特异性不高的缺点。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提供了能够便捷、灵敏地检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用。
在本发明的第一个方面中，提供了一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，包括特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体、连接段RNA和锤头状核酶，其中RNA适配体通过连接段RNA与锤头状核酶连接，当RNA适配体感应到硫胺素焦磷酸时，触发锤头状核酶的自剪切。
优选地，所述连接段RNA由两条RNA序列组成。
优选地，所述两条RNA序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2；
优选地，所述两条RNA序列为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4；
优选地，所述特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体来源于大肠杆菌；所述的硫胺素焦磷酸适配体结合硫胺素焦磷酸的KD值(分离常数：衡量分子间结合力强弱，数值越小结合力越强)在60nmol/L左右，并且可以很好的区分硫胺素焦磷酸类似物硫胺素(T)和硫胺素单磷酸(TMP)以及其它所有的代谢小分子(至少三个数量级的区分度)。硫胺素焦磷酸适配体的超高灵敏度和超强特异性决定了本发明中的硫胺素焦磷酸检测系统可直接应用于检测未经纯化分离的生物样本中的硫胺素焦磷酸含量，如人体外周血等。
优选地，本发明的RNA传感器核酸序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，本发明的RNA传感器核酸序列如SEQ ID NO:6所示；
在本发明的第二个方面中，提供了一种测量硫胺素焦磷酸的方法，包括使用本发明所述的RNA传感器。
优选地，所述测量硫胺素焦磷酸的方法包括以下步骤：
a.将本发明的RNA传感器与待测样品接触；
b.检测RNA传感器自切产生的RNA片段。
优选地，待测样品为血液样品。
优选地，所述步骤b是通过链置换等温扩增反应及化学发光技术检测RNA传感器自切产生的RNA片段。
优选地，步骤b包括：
b1.加入第一扩增序列、第二扩增序列、T4多聚核苷酸激酶、Bsm DNA聚合酶和Nb.BbvCl切口酶进行扩增反应，其中第一扩增序列如SEQ ID NO：7所示，第二扩增序列如SEQ ID NO：8所示；
b2.检测反应生成的G-四联体结构。
优选的，步骤b2包括：加入H2O2与ABTS2-进行显色反应。
优选的步骤b2包括：在波长414nm处检测反应生成的G-四联体含量，将检测结果与硫胺素焦磷酸浓度和G-四联体量之间的对应曲线比对，确定硫胺素焦磷酸含量。
本发明的链置换等温扩增反应是现有技术的改进，改进的链置换等温扩增技术可以将微弱的RNA切割信号放大，进一步提高检出限；链置换等温扩增过程中工具酶的工作温度在37℃，所有操作可在简单的恒温设备中进行，对设备要求很低。改进的链置换等温扩增技术与筛选得到的RNA传感器和化学发光技术结合，放大RNA切割信号，实现对硫胺素焦磷酸的可视化检测：RNA传感器特异感应硫胺素焦磷酸会触发自切割，产生一个RNA小片段，其可以作为一个引发物在Bsm DNA聚合酶和Nb.BbvC1切口酶的作用下引发下游一系列扩增反应，生成大量含有特定功能的G-四联体结构。
G-四联体的生成量与硫胺素焦磷酸的量呈正相关关系，本发明还建立了硫胺素焦磷酸浓度与G-四联体量之间的对应曲线。这些G-四联体还可与Hemin(氯化血红素)结合，催化H2O2(过氧化氢)与ABTS2-(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)反应，产生呈绿色的生成物ABTS-。从而可以实现，一方面能通过可视化观察实现对硫胺素焦磷酸的定性检测，另一方面可通过在波长414nm处检测G-四联体含量间接实现对硫胺素焦磷酸的定量检测。
本发明对生物样本使用量要求低(几十微升)，检测周期用时短(2-3小时)，整个反应可在一个试管内自发进行，操作简便且不易受污染影响。
在临床检测中，硫胺素焦磷酸的不稳定性决定了大量样本采集后需立即快速处理检测，本发明易于实现高通量快速检测，可很好的解决这一临床难题，为阿尔兹海默病的早期诊断提高一个有力的手段。
在本发明的第三个方面中，提供了RNA传感器在制备用于诊断阿尔茨海默病的诊断工具中的应用。
在本发明的第四个方面中，提供了一种检测试剂盒，包含本发明所述的RNA传感器。
本发明的RNA传感器的筛选方法包括，特异感应硫胺素焦磷酸的RNA适配体通过一段随机序列与锤头状核酶连接起来，生成一个初代的RNA序列库。利用指数富集的配体系统进化技术，从初代库中筛选获得可特异感应硫胺素焦磷酸从而触发核酶自切割反应的联动型RNA序列。
优选地，在筛选过程中，通过逐步减少允许核酶自切反应的时间，以及降低硫胺素焦磷酸浓度等手段施加压力，在试管内进化获得灵敏度高、特异性强的RNA传感器。
进一步优选地，所述指数富集的配基系统进化技术的条件包括：循环次数包括12次；RNA自切酶反应的时间在第1-5轮循环为10分钟、第6-11轮循环为5分钟、第12轮循环为1分钟；和/或，硫胺素焦磷酸浓度在第1-4轮循环为200mM，第5-8轮循环为20mM、第9-11轮循环为2mM和第12轮循环为0.2mM。
优选的，本发明的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器的序列如SEQ ID NO:5所示。
优选的，本发明的检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器的序列如SEQ ID NO:6所示。
本发明所述的RNA传感器和检测方法还可以用于非诊断目的硫胺素焦磷酸检测。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下优点：
1、本发明的RNA传感器检测硫胺素焦磷酸方便且灵敏度高；
2、本发明不仅可以利用RNA传感器对硫胺素焦磷酸进行定性检测，还能对硫胺素焦磷酸进行定量检测；
3、本发明改进链置换等温扩增技术，并利用其放大自剪切的RNA信号，建立一种可在体外实现高通量快速定性、定量检测硫胺素焦磷酸的生物传感系统。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例的随机RNA文库序列；
图2是本发明实施例的建库及筛选流程图；
图3是本发明实施例的切割速率测试结果示意图；
图4是本发明实施例的亲和力测试结果示意图；
图5是本发明实施例的链置换等温扩增及化学发光示意图；
图6是本发明实施例的RNA传感器检测不同浓度硫胺素焦磷酸标准物的结果；
图7是本发明实施例的RNA传感器检测不同浓度硫胺素焦磷酸标准物的结果。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
本发明所述的指数富集的配基系统进化技术，包括现有技术(Hongzhou Gu,Kazuhiro Furukawa,Ronald R.Breaker.Engineered allosteric ribozymes that sensethe bacterial second messenger cyclic diguanosyl 5′-monophosphate.Analyticalchemistry,2012)涉及的相关技术。
本发明所述的链置换等温扩增反应，包括现有技术(Yongyun Zhao,Li Zhou，ZhuoTang.Cleavage-based signal amplification of RNA.Nature Communications,2013)涉及的相关技术。
本发明所述的化学发光技术包括利用G-四联体还可与氯化血红素(HEMIN)结合，催化H2O2(过氧化氢)与ABTS2-(2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)反应，产生呈绿色的生成物ABTS-。
本发明所述的引物是一小段RNA，作为复制的起始片段，引发下游扩增反应。
本发明所述的配对是指两条序列中相对应的碱基构成了键(氢键)的连接。
本发明所述的核糖开关(riboswitches)指的是mRNA一些非编码区的序列折叠成一定的构象，这些构象的改变应答于体内的一些代谢分子，从而通过这些构象的改变达到调节mRNA转录的目的。
实施例1 DNA文库的构建
DNA文库的构建，如图2所示，合成DNA序列，经过8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE)纯化后，用荧光成像仪和割胶仪回收目标序列。由于技术限制，超过100bp的DNA双链在体外合成产率不高，所以本发明采用两段单链DNA通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)在体外延伸出双链DNA模板，即Primer 1(SEQ ID NO：9)和Primer 2(SEQ ID NO：10)通过末端互补序列配对，互为模板各自延伸，建立双链DNA文库(随机碱基用N表示)。
PCR反应体系：
Figure BDA0001559915530000051
PCR反应条件：
95℃预变性30s，之后每个循环95℃变性30s，60℃退火30s，68℃延伸30s，为保证所有引物延伸完成，进行5个循环；最后72℃终延伸5min。
Primer1(SEQ ID NO：9)
5′-TAATACGACTCACTATAGGCACCTGATGAGNNNNNCGGGGTGCCCTTGTGCGTCAAGGCTGAGAAATA-3′
Primer2(SEQ ID NO：10)
5′-TAGGCACTACGTGGCTTTCACCACGTTTCGNNNNNTCCCTACGCTGGCATTATCCAGATCAGGTGATACGGGTATTTCTCAGCCTTGACGCACA-3′
实施例2 RNA文库的构建
RNA文库的构建，如图1所示，将上述DNA文库进行体外转录，在37℃下孵育2-3小时。转录得到的RNA利用8％变性PAGE分离得到在硫胺素焦磷酸不存在时不具有切割活性的序列，除去背景信号。即建成筛选所需用的RNA文库，含有10个随机碱基。
转录体系：
Figure BDA0001559915530000061
实施例3 体外筛选
体外筛选，如图2所示。本发明采用指数富集的配基系统进化技术，在体外分为预筛选、筛选、反转录、PCR扩增、转录等步骤进行。在12轮筛选后进行克隆测序。具体筛选步骤包括：
1、预筛选
将转录后电泳分离得到的目标RNA回收，加入50μl缓冲液1，加热到70℃保持3-5分钟，再恢复至室温，加入等体积的缓冲液2，为其提供酶切反应必须的Mg2+，让TPP不存在也能发生自切割的序列发生切割。进行8％变性PAGE，回收在TPP不存在时没有自切割活性的RNA，即完整的序列片段，洗脱过夜。
Figure BDA0001559915530000062
2、筛选
将预筛选得到的RNA洗脱离心后，分为两组：实验组和对照组。实验组加入48μl缓冲液1和2μl的1mM TPP，对照组加入48μl缓冲液1和2μl的ddH2O，均加热至70℃保持3-5分钟，再恢复至室温。分别加入50μl缓冲液2，为其提供自切反应必须的Mg2+，室温下孵育10分钟，让TPP存在时能发生自切割的序列发生切割。进行8％变性PAGE，回收在TPP存在时具有自切割活性的RNA。收集实验组5′切割片段，洗脱过夜。
3、逆转录-PCR
将筛选得到的RNA回收，进行逆转录和PCR，扩充RNA文库，进行下一轮筛选。
逆转录体系：
Figure BDA0001559915530000071
为保证PrimerB(SEQ ID NO：12)能够结合到RNA模板上，先将不加酶的体系加热至70℃保持3-5分钟，再恢复至室温，加反转录酶后在42℃下孵育1小时。
PCR反应体系：
Figure BDA0001559915530000072
Primer A(SEQ ID NO：11)5′-TAATACGACTCACTATAGGCACCTGATGAG-3′
Primer B(SEQ ID NO：12)5′-TAGGCACTACGTGGCTTTCACCACGTTTCG-3′
PCR反应条件：
95℃预变性30s，之后每个循环95℃变性30s，40℃退火30s，68℃延伸30s，扩增25个循环；最后68℃终延伸5min。
4转录
将PCR扩增后的DNA作为模板进行体外转录，在37℃下孵育2-3小时。转录得到的RNA利用8％变性PAGE分离得到在硫胺素焦磷酸不存在时不具有切割活性的序列，除去背景信号。即将未发生切割的条带回收，洗脱过夜。
转录体系：
Figure BDA0001559915530000081
在筛选过程中为得到灵敏度更高，特异性更好的RNA传感器，需要不断的施加筛选压力。在1-5轮的筛选步骤中允许RNA自切酶反应的时间为10分钟；在6-11轮的筛选中，降低酶切时间到5分钟；在第12轮的筛选中，降低酶切反应时间到1分钟。在1-4轮的筛选中，TPP浓度为200μM；在5-8轮的筛选中，降低TPP浓度到20μM；在9-11轮的筛选中，进一步调低TPP浓度到2μM；在第12轮的筛选中，将TPP浓度最终降至0.2μM。在TPP浓度为0.2μM，酶切反应时间为1分钟时，分离出在特异感应TPP并可诱导RNA自切割的序列，得到两类RNA传感器，分别命名为12-I和10-V。经克隆测序，其中12-I的序列如SEQ ID NO:5所示，10-V的序列如SEQID NO:6所示。
本发明利用指数富集的配体系统进化技术进行12轮筛选，分离得到了两类可以高特异性、高灵敏度地感应硫胺素焦磷酸并发生切割的RNA传感器，如图2所示。
实施例4 RNA传感器的性能鉴定
对12-I和10-V进行切割速率测试，即在TPP浓度分别为0和200μmol/L时，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式测定不同反应时间点的切割速率。在TPP浓度为0时，12-I的切割速率常数为0.0028min-1；在TPP浓度为200μmol/L时，12-I的切割速率常数为0.31min-1。在TPP浓度为0时，10-V的切割速率常数为0.0019min-1；在TPP浓度为200μmol/L时，10-V的切割速率常数为0.08min-1。即有TPP存在时的反应速率常数约为没有TPP存在时反应速率常数的100倍左右，这与自然界中存在的别构酶结合配体后反应速率提高的程度是一致的。
如图4所示，对12-I和10-V进行对TPP亲和力测试，即在30分钟时，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方式测定不同TPP浓度下RNA切割百分比，以此来计算KD值。12-I的KD值为86nmol/L，10-V的KD值为218nmol/L。
实施例5 化学发光优化及生物样本中硫胺素焦磷酸定量检测
化学发光优化及生物样本中硫胺素焦磷酸定量检测，如图5所示，将已经得到的RNA分子开关与改良后的链置换等温扩增反应及化学发光技术相结合。当RNA分子开关感应TPP并发生切割时，产生一个含23个碱基的单链RNA片段。在T4多聚核苷酸激酶处理后，这个片段可作为一个引发物，在Bsm DNA聚合酶和Nb.BbvCl切口酶的作用下引发下游一系列DNA模板的扩增反应，通过四个链置换反应进行循环扩增，最终生成大量的G-四联体结构。本发明中使用的G-四联体结构可以与氯化血红素结合，形成具有过氧化氢酶活性的DNA模拟酶。这种模拟酶可以催化H2O2与ABTS2-的反应，生成的产物ABTS-具有绿色，实现可视化检测。
如图6-7所示，用该12-I RNA传感器检测含有硫胺素焦磷酸的生物样本，即将一系列不同浓度的硫胺素焦磷酸标准物加入到未作处理的血液上清中(不含硫胺素焦磷酸，血液中硫胺素焦磷酸存在于红细胞，需经红细胞裂解处理才可用来检测)，模拟真实的生物检测环境。发现该RNA传感器在血液样本中也具有良好的稳定性和灵敏度，在0到100nM的区间中具有很好的线性关系，检出限可达到10nM，能够满足临床检测的需要。
切割反应体系：
Figure BDA0001559915530000091
该反应在37℃下孵育60分钟。
显色反应体系：
Figure BDA0001559915530000101
在37℃孵育60分钟后，加入1.2mM的H2O2与ABTS2-，在室温下保持2分钟后进行比色观察。
第一扩增序列(SEQ ID NO：7)：
5′-GCTGGCTACTTAATCCCAACCCGCCCTACCCTCAGCACAGCAGATGCATACTACGTGGCTTTCACCACGTTTC-3′
第二扩增序列(SEQ ID NO：8)：
5′-ACAGCAGATGCATACCCAACCCGCCCTACCCTCAGCGCTGGCTACTTAATC-3′
本发明可将硫胺素焦磷酸信号检测转化为RNA自切割信号检测。对于较低浓度的硫胺素焦磷酸，其触发RNA切割的信号也相应较低。本发明将获得的特异感应硫胺素焦磷酸的RNA传感器与链置换等温扩增反应及化学发光技术相结合，实现对较低RNA切割信号的再放大，进一步提高硫胺素焦磷酸浓度的检测下限。本发明利用RNA传感器特异感应硫胺素焦磷酸并发生切割时产生的RNA小片段作为引发物，在BsmDNA聚合酶和B.BbvCl切口酶的作用下推动下游针对特定DNA模板的扩增反应，生成大量的G-四联体结构，在H2O2存在的条件下催化ABTS2-氧化显色。通过等温放大信号，本发明实现针对硫胺素焦磷酸的方便、可靠、直观的可视化定性和定量检测。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 复旦大学附属中山医院
<120> 一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器及其应用
<141> 2018-01-23
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
gcucc 5
<210> 2
<211> 5
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
ggcuc 5
<210> 3
<211> 5
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ugucc 5
<210> 4
<211> 5
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
gacuc 5
<210> 5
<211> 123
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
ggcaccugau gaggcucccg gggugcccuu gugcgucaag gcugagaaau acccguauca 60
ccugaucugg auaaugccag cguagggagg cuccgaaacg uggugaaagc cacguagugc 120
cua 123
<210> 6
<211> 123
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
ggcaccugau gagugucccg gggugcccuu gugcgucaag gcugagaaau acccguauca 60
ccugaucugg auaaugccag cguagggaga cuccgaaacg uggugaaagc cacguagugc 120
cua 123
<210> 7
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gctggctact taatcccaac ccgccctacc ctcagcacag cagatgcata ctacgtggct 60
ttcaccacgt ttc 73
<210> 8
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
acagcagatg catacccaac ccgccctacc ctcagcgctg gctacttaat c 51
<210> 9
<211> 68
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
taatacgact cactataggc acctgatgag nnnnncgggg tgcccttgtg cgtcaaggct 60
gagaaata 68
<210> 10
<211> 94
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
taggcactac gtggctttca ccacgtttcg nnnnntccct acgctggcat tatccagatc 60
aggtgatacg ggtatttctc agccttgacg caca 94
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
taatacgact cactataggc acctgatgag 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
taggcactac gtggctttca ccacgtttcg 30

Claims (1)

1.一种检测硫胺素焦磷酸的RNA传感器，其特征在于，所述RNA传感器的序列为SEQ IDNO:5所示。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018603A (zh) * 2015-07-01 2015-11-04 中山大学 一种基于三重放大反应串联的恒温指数放大技术及其在microRNA检测中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Signal-amplification detection of small molecules by use of Mg2+-dependent DNAzyme;Zhijun Guo;《Anal Bioanal Chem》;20131231;全文 *
基于核酶开关的哺乳细胞内硫胺素焦磷酸荧光生物传感器的建立;张媛媛等;《分析化学》;20170228;第45卷(第2期);第3.1节第1段，第160页图2，第161页第3段 *

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