CN110938690B - 基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用 - Google Patents
基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用，以核酸为靶标，在酶的辅助下反应并有多种途径形成能产生比色信号的G‑四链体序列，进行可视化检测核酸的方法。该方法控制反应条件，在T4 DNA连接酶的作用下被目标基因打开的发夹探针(HGP)与另一条双链DNA(DGP)连接在一起，完成重塑。然后在DNA聚合酶和限制性内切酶的协同作用下，目标DNA实现了循环利用，并且产生了多个生成G‑四链体序列的渠道。本发明以酶辅助DNA反应，形成大量的G‑四链体，通过紫外分光光度计进行检测，也可以用肉眼进行可视化检测。检测方法便捷，所用材料均已商品化，生物安全性高。
Description
技术领域
本发明属于核酸可视化检测领域，特别是指基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用。
背景技术
核酸的高灵敏检测在生物医药应用领域极具潜力。DNA和RNA包含了疾病病理学特征和发展过程中重要的信息，可以作为研究癌症发病机制、识别感染及其耐药性的重要生物标志物。急性淋巴细胞白血病（ALL）作为最常见的人类恶性肿瘤疾病之一，在儿童中的患病率最高。Pax-5是在造血系统中发现的唯一paired-box（PAX）家族成员，它可以分为Pax-5a，Pax-5b，Pax-5c，Pax-5d和Pax-5e。其中，Pax-5a是最重要的，Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5对于B细胞分化和发育非常重要，其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而，目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。因此，开发一些简便有效的Pax-5基因检测方法是非常迫切且极具生命学意义的。
然而由于核酸含量在生物体中非常低，对信号进行扩增放大的方法因此被广泛应用，如PCR扩增或者实时PCR扩增。PCR扩增尽管有明显的优势，但昂贵的设备和专业技术人员的要求限制了该方法的广泛使用。因此更加简便的扩增方法成为研究的热点。最近一些研究报道了G-四链体作为信号源的检测手段都展现了良好的检测性能，G-四链体是由四个鸟嘌呤（G）碱基首尾相连通过π-π堆积进一步形成的特殊类型的DNA二级结构，当与小分子（如氯化血红素，硫黄素T（ThT）和N-甲基中卟啉IX（NMM））结合使用时，G-四链体可以用作构建一系列基于G-四链体的有效信号转导子，并且不需要额外的对核酸进行修饰。因此，这种基于G-四链体构建的生物传感器对核酸序列进行定量分析极具应用潜力。
发明内容
本发明提出基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用，解决了高灵敏检测Pax-5的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器，包括发夹探针HGP和双链DNA序列DGP，其中发夹探针HGP包括靶DNA配对区域、G-四链体序列区域和被目标基因打开后自身的杂交结合区域；双链DNA序列DGP包括LCP和LGP两条单链DNA，LGP为一段G-四链体序列；LCP包括与目标基因结合的区域、被核酸内切酶识别的序列区域，以及与LCP杂交结合的序列区域。
所述发夹探针HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修饰一个磷酸基团；LCP序列如SEQ ID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。
所述的无标记比色传感器在制备高灵敏检测Pax-5基因的试剂盒或检测仪中的应用。
利用所述的无标记比色传感器检测Pax-5基因的方法，包括以下步骤：
（1）将单链DNA LCP和单链DNA LGP按1:1的体积比混合，37 ℃孵育，得双链的DGP溶液，于4℃保存备用；
（2）将发夹探针HGP与不同浓度Pax-5的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育2 h，再加入步骤（1）中的DGP溶液和T4 DNA连接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性内切酶，使反应管内体系的体积为20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80℃加热20 min使酶失活；
（3）将经步骤（2）处理的反应体系冷却到室温，加入HEPES缓冲液和氯化血红素溶液，37 ℃孵育40分钟；
（4）向经步骤（3）处理的反应体系中加入双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10 min后，采用紫外可见分光光度计检测吸收峰的变化；
（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
（6）用待测样本溶液代替不同浓度Pax-5的标准溶液重复步骤（1）-（5），将测得的电信号变化值代入标准曲线得到待测样本中Pax-5的浓度。
所述步骤（1）中单链DNA LCP和单链DNA LGP的物质的量浓度为10 μM。
所述步骤（2）中发夹探针HGP的物质的量浓度为10 μM，体积为1 μL；不同浓度Pax-5的标准溶液的浓度分别为300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、1 nM、0.5nM、0.1 nM、50 pM、25 pM、10 pM、5 pM、0 pM；缓冲液体系为1μL 的CutSmart缓冲液和1μL的NEB buffer 2。
所述步骤（2）中DGP溶液的体积为2 μL，T4 DNA连接酶的浓度为1U/mL，体积为2μL；DNA聚合酶为0.5 μL浓度为5 U/μL的Klenow Fragment；dNTPs浓度为10 mM，体积为1 μL；限制性内切酶为0.5 μL浓度为10 U/μL的Nt.BbvCI。
所述步骤（3）中加入HEPES缓冲液的体积为108 μL，浓度为10 mM；加入氯化血红素溶液的体积为2 μL浓度为50 μM；
所述步骤（4）中加入双氧水的体积为10 μL，浓度为20 mM；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积为10 μL，浓度为10 mM。
所述步骤（4）中紫外可见分光光度计的测试波长范围为350-750 nm。
本发明具有以下有益效果：
（1）本申请构建的实验方案中有多种可以产生G-四链体序列的方式，HGP被目标序列打开后会产生G-四链体序列，DGP中含有一段G-四链体序列，同时也包含G-四链体的互补序列，用于酶辅助扩增时产生大量的G-四链体序列，同时，目标序列发生循环重复上面的反应。多种方式产生大量G-四链体序列，实现对目标的灵敏检测。
（2）在目标序列的作用下，通过T4 DNA连接酶，使HGP和DGP发生重构，形成G-四链体序列的扩增模板，为后续的信号放大提供条件；通过DNA聚合酶和限制性内切酶的相互协同作用，实现了目标基因的循环利用同时也产生了大量的G-四链体序列，放大了检测信号；在200 nM至5 pM的目标基因浓度范围内，紫外吸收峰峰值与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，检测限低至3.2 pM，本发明通过酶促扩增反应的引入，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请的无标记比色传感器的原理示意图。
图2是按照实施例1测得的验证实验方案可行性的紫外吸收光谱。
图3是按照实施例1对标准样检测结果，A：实施例1紫外吸收峰变化与检测目标物浓度对应的紫外吸收光谱图；B：紫外吸收峰峰值变化与检测目标物浓度折线图，插图为紫外吸收峰峰值与检测目标物在低浓度对数的线性图。
图4是实施例1的选择性考察结果。
图5是实施例1的在复杂基质检测能力的考察结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一、基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器的制备，其制备原理见图1，制备步骤如下：
（1）DNA预处理：所有DNA（发夹探针HGP、LCP和LGP）在使用前要经过预处理，其中发夹探针HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修饰一个磷酸基团；LCP序列如SEQ ID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示；处理方法为：将装有DNA序列的微量离心管在离心机中5000 rpm，离心3 min，用pH为8.0的Tris-EDTA缓冲液稀释至10 μM；具有发夹结构的DNA均在95 ℃加热5 min，然后缓慢冷却至室温，使探针形成发夹结构。
（2） 将相同体积的10 μM LGP和10 μM LCP在反应管中混合，孵育2 h，置于4 ℃保存备用；
（3） 将1 μL浓度为10 μM的HGP和不同浓度（300 nM，200 nM，150 nM,100 nM，50nM, 25 nM,10 nM，1 nM，0.5 nM，0.1 nM, 50 pM, 25 pM, 10 pM, 5 pM, 0 pM）的Pax5基因的标准溶液在反应管中混合，补充CutSmart缓冲液(20 mMTris-HAc, 50 mMKAc, 10 mMMgAc2, 0.1 g/mL BSA, pH 7.9)和NEB buffer 2 (10 mMTris-HCl, 50 mMNaCl, 10 mMMgCl2, 1 mMdithiothreitol (DTT), pH 7.9)，37 ℃孵育2小时；再加入2 μL步骤（2）中的溶液和2 μL浓度为1 U/mLT4 DNA连接酶37 ℃下孵育60分钟；然后加入0.5 μL浓度为5 U/μL的Klenow Fragment、1 μL浓度为10 mM的dNTPs和0.5 μL浓度为10 U/μL Nt.BbvCI，使反应体系为20 μL，37 ℃恒温孵育90分钟，然后80℃加热20分钟以使酶失活；
（4）待步骤（3）中的溶液冷却到室温时，将108 μL浓度为10 mM的HEPES缓冲液以及2 μL浓度为50 μM的氯化血红素溶液加入，37℃孵育40分钟；
（5）向步骤（4）的溶液中加入浓度为20 mM的双氧水10 μL和浓度为10 mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液10 μL，反应10 min后，产生肉眼可分辨的颜色变化，完成无标记比色传感器的构建；采用紫外可见分光光度计检测吸收峰的变化，测试波长范围为350 -750nm，结果如图2所示，图中曲线分为两大组，a和b为加入了连接酶有望发生重构的组，样品a中加入了HGP、DGP、连接酶、聚合酶和内切酶，b样品与a相比多加了目标物Pax-5。c、d样品中为了不会使其发生重构，都没有加入连接酶，其中样品c加入了HGP、DGP、聚合酶和内切酶，d样品中与c相比也是多加了Pax-5基因序列如SEQ ID No.8所示。
二、无标记比色传感器标准曲线的建立
根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5的标准溶液浓度，绘制标准曲，如图3所示；其中A为对标准样检测得的紫外吸收峰与检测目标物浓度对应的紫外可见光谱图。B为在200 nM至5 pM的目标基因浓度范围内，紫外吸收峰峰值与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，可知本申请传感器的检测限低至3.2 pM。
实施例2
无标记比色传感器的特异性检测
考虑到实用性的要求，为了评估本发明方法的特异性，用含有不同错配碱基的最终浓度为250 nM的DNA溶液代替不同浓度Pax-5的标准溶液重复实施例1的步骤，参照的实施例1实验步骤对单碱基错配序列MT1序列如SEQ ID No.4所示、三碱基错配序列MT2序列如SEQ ID No.5所示、五碱基错配序列MT3序列如SEQ ID No.6所示、完全错配序列NT序列如SEQ ID No.7所示，进行检测，检测结果如图4所示，考察该方法对特定目标物的特异性和选择性，选择以单碱基错配序列（MT1），三碱基错配序列（MT2），五碱基错配序列（MT3）和完全错配序列（NT）作为干扰物对传感器相应信号的影响。实验结果证实该传感器对不同的干扰组分基本没有响应或响应较低，对特定目标物响应明显，说明其具有良好的选择性和特异性
实施效果例
无标记比色传感器在复杂基质下的检测能力:
用生理盐水稀释后的人血清溶液配制四种不同浓度的Pax-5a待测液，使Pax-5a浓度分别为0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM；用待测液代替标准溶液进行上述检测，根据检测到的电信号和标准曲线信号的对比，考察本方法在检测复杂生物基质中的靶DNA的可行性，结果如图5所示。图5展现了本方法在复杂生物基质中对目标基因检测的能力，用生理盐水稀释后的人血清溶液配制四种不同浓度的Pax-5a待测液进行目标基因的加标回收实验。结果显示，目标基因的回收率可以达到91.03％-103.47％，在误差允许的范围之内，这说明了该传感器在复杂基质环境中检测目标基因的潜在应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110> 江西师范大学
<120> 基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用
<160> 8
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（71）
<400> 1
ccaactcaac ccgccctaca gcgtatacag tattttttgg gtagggcggg ttgggttttt 60
ttactgtata c 71
<210> 2
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（45）
<400> 2
gtacccaacc cgccctaccc ttagctgagg atgagtctcc ccatg 45
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（20）
<400> 3
gggtagggcg ggttgggtac 20
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（45）
<400> 4
tctgctgtag ggcgggttga gttcgcatgg ggagactcag tcgta 45
<210> 5
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（45）
<400> 5
tctgctgtag ggcgggttga gttcgcttcg ggagactcag tcgta 45
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（45）
<400> 6
tctgctgtag ggccgcttca gatcgcatgg ggagactcag tcgta 45
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_difference
<222> （1）…（42）
<400> 7
cagctttgag gtgcgtgttt gtgcctgtgg tgagagaaac tg 42
<210> 8
<211> 42
<212> DNA
<213> Homo
<220>
<221> gene
<222> （1）…（42）
<400> 8
tctgctgtag ggcgggttga gttggcatgg ggagactcag tcgta 42
Claims (9)
1.基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器，其特征在于：包括发夹探针HGP和双链DNA序列DGP，其中发夹探针HGP包括靶DNA配对区域、G-四链体序列区域和被目标基因打开后自身的杂交结合区域；双链DNA序列DGP包括LCP和LGP两条单链DNA，LGP为一段G-四链体序列；LCP包括与目标基因结合的区域、被核酸内切酶识别的序列区域，以及与LCP杂交结合的序列区域；
所述发夹探针HGP序列如SEQ ID No.1所示，其5'端修饰一个磷酸基团；LCP序列如SEQID No.2所示，LGP序列如SEQ ID No.3所示。
2.权利要求1所述的无标记比色传感器在制备高灵敏检测Pax-5基因的试剂盒或检测仪中的应用。
3.利用权利要求1所述的无标记比色传感器检测Pax-5基因的非疾病诊断为目的的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将单链DNA LCP和单链DNA LGP按1:1的体积比混合，37 ℃孵育2 h，得双链的DGP溶液，于4℃保存备用；
（2）将发夹探针HGP与不同浓度Pax-5的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，37℃孵育2 h，再加入步骤（1）中的DGP溶液和T4 DNA连接酶孵育1 h，然后加入DNA聚合酶、dNTPs和限制性内切酶，使反应管内体系的体积为20 μL，于37℃孵育1.5 h，于80 ℃加热20min使酶失活；
（3）将经步骤（2）处理的反应体系冷却到室温，加入HEPES缓冲液和氯化血红素溶液，37℃孵育40分钟；
（4）向经步骤（3）处理的反应体系中加入双氧水和3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液，反应10 min后，采用紫外可见分光光度计检测吸收峰的变化；
（5）根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
（6）用待测样本溶液代替不同浓度Pax-5的标准溶液重复步骤（1）-（5），将测得的电信号变化值代入标准曲线得到待测样本中Pax-5的浓度。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中单链DNA LCP和单链DNALGP的物质的量浓度为10 μM。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中发夹探针HGP的物质的量浓度为10 μM，体积为1 μL；不同浓度Pax-5的标准溶液的浓度分别为300 nM、200 nM、150 nM、100 nM、50 nM、25 nM、10 nM、1 nM、0.5 nM、0.1 nM、50 pM、25 pM、10 pM、5 pM、0 pM；缓冲液体系为1 μL 的CutSmart缓冲液和1 μL 的NEB buffer 2。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中DGP溶液的体积为2 μL，T4DNA连接酶的浓度为1 U/mL，体积为2 μL；DNA聚合酶为0.5 μL浓度为5 U/μL的KlenowFragment；dNTPs浓度为10 mM，体积为1 μL；限制性内切酶为0.5μL浓度为10 U/μL的Nt.BbvCI。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中加入HEPES缓冲液的体积为108μL，浓度为10 mM；加入氯化血红素溶液的体积为2μL浓度为50 μM。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中加入双氧水的体积为10 μL，浓度为20 mM；3,3',5,5'-四甲基联苯胺溶液的体积为10 μL，浓度为10 mM。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中紫外可见分光光度计的测试波长范围为350-750 nm。
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2019
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