CN110408679A - 一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax‑5a检测方法，其基于发卡型DNA探针(HP)控制转录的终止和翻译的效率优势，目标基因Pax‑5a打开HP，启动HP的复制模板功能，在DNA聚合酶和限制性内切酶的协同作用下，一方面辅助DNA促使目标基因Pax‑5a循环打开HP；另一方面，也产生大量的G‑四链体序列。G‑四链体序列由于碱基互补作用被金电极表面上的巯基修饰的探针捕获，然后在氯化血红素和钾离子的存在下形成G‑四链体/氯化血红素复合物，可以催化还原双氧水而产生电化学信号，电流的变化与目标基因浓度在一定范围内存在线性相关关系。该方法基于发卡型DNA探针酶辅助循环信号放大机制及一键式电化学检测平台，可以实现对目标基因高灵敏和高选择性检测。
Description
技术领域
本发明涉及电化学生物分析领域，具体涉及急性白血病基因Pax-5a的检测方法。
背景技术
作为最常见的人类恶性肿瘤疾病之一，急性淋巴细胞白血病(ALL)在儿童中的患病率最高。在美国，每年约有3,000至4,000人被诊断患有ALL，其中三分之二是2至5岁的儿童。Pax-5是在造血系统中发现的唯一paired-box(PAX)家族成员，它可以分为Pax-5a，Pax-5b，Pax-5c，Pax-5d和Pax-5e。其中，Pax-5a是最重要的，Pax-5通常是指Pax-5a。Pax-5对于B细胞分化和发育非常重要，其异常表达可引起B淋巴细胞性白血病。然而，目前关于变异的Pax5基因检测及该基因在临床急性淋巴细胞白血病患者中的表达的研究较少。因此，开发一些简便有效的Pax-5基因突变检测方法是非常迫切且极具生命学意义的。
目前，关于DNA的传统检测方法主要有实时定量聚合酶链式反应(PCR)法、荧光光谱法、紫外光谱法、比色法、免疫测定等，尽管这些方法各具优势，但是昂贵的仪器，一定的操作技能，繁琐复杂的标记处理方法，检测信号低以及试剂的不稳定性，使得这些方法的应用还面临着挑战。
电化学DNA传感器作为近年发展迅速的DNA分析检测技术，由电化学输出设备、信号转换元件和灵敏性的分子识别层三部分组成。电化学DNA传感器终极是在电极界面进行的反应，且每步骤之间会进行淋洗，有效避免因在均相中反应时大量干扰物同时存在，从而提高了检测的灵敏度。DNA的碱基之间特异性结合，运用到电化学传感器能够提高检测的选择性。由于电化学DNA传感器具有分析速度快和效率高等这些优点，已应用到众多研究领域中，成为DNA检测的重要手段。
G-四链体是由四个鸟嘌呤(G)碱基首尾相连通过π-π堆积进一步形成的特殊类型的DNA二级结构。近年来，G-四链体受到科学家们越来越多的关注，并已被应用于抗癌治疗的研究。G-四链体与小分子结合后形成的G-四链体DNAzyme具有高稳定性和过氧化物酶模拟活性的优点，其广泛用于电化学生物传感器、荧光生物传感器、光电化学生物传感器等。因此，具有过氧化物酶催化活性的G-四链体/hemin复合物用于电化学DNA传感器的构建是可行和高效的。
然而，电化学生物传感器通常在信号产生方面具有某些限制。一方面，在构建电化学生物传感器时，需要标记适当的电活性物质，这可能会限制检测灵敏度；第二方面，一般电化学层层组装反应会在电极表面不断引入干扰物；第三方面，直接在电极界面将适当的信号放大技术引入电化学生物传感器的构建是存在效率问题。因此，在电极表面上开发新型信号放大策略、抗干扰及信号放大效率等以提高分析物检测灵敏度为指标方法对于扩大电化学分析应用和性能具有重要意义。
发明内容
为了方便地检测急性白血病基因Pax-5a，本发明提供一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法。
所述检测方法的技术原理是：在目标基因存在的时候，通过DNA聚合酶和限制性内切酶的协同作用，辅助目标基因参与循环，会有大量的G-四链体序列生成并通过碱基之间的互补配对被引入到电极表面，氯化血红素嵌入G-四链体结构中，形成的辣根过氧化物模拟酶G-四链体/hemin复合物能够催化双氧水的还原，产生很强的电流信号；在没有目标基因条件下，G-四链体序列不能够生成，从而电流信号较低；电流信号强度与目标基因浓度有确定的关系，从而实现对急性白血病基因Pax-5a的灵敏检测。
具体地，本发明提供的一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法，包括以下步骤：
首先，构建超灵敏电化学传感器：
(1)用三(2-羧基乙基)膦溶液处理巯基修饰的探针，将处理后的巯基修饰的探针转移到金电极上，使巯基修饰的探针与金电极表面结合，再淋洗金电极除去未结合的巯基修饰的探针，并用巯基乙醇溶液进行封闭，得到改性金电极；
(2)将发夹探针和不同浓度Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，孵育一段时间；再加入引物、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸和限制性内切酶，孵育一段时间，然后通过加热使酶失活；
(3)将步骤(2)中的混合溶液转移到步骤(1)中的改性金电极上，孵育一段时间，淋洗除去残留的DNA；再将氯化血红素溶液转移到改性金电极上，孵育一段时间；
其次，检测急性白血病基因Pax-5a：
(4)采用三电极系统，以含有双氧水的HEPES缓冲液为电解液，以经过步骤(3)处理的改性金电极为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分伏安脉冲法检测电信号变化；
(5)根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
(6)对于未知浓度的待测液，按照步骤(2)至(4)并用待测液代替Pax-5a的标准溶液进行检测，根据检测到的电信号和标准曲线信号的对比，得出待测液中Pax-5a的浓度。
优选的，三(2-羧基乙基)膦溶液的浓度为2mM；巯基修饰的探针为5’-TGAGCTCCCCATGCCAGCGATTT-SH-3’，其浓度为0.1～0.7μM；巯基乙醇溶液的浓度为2mM。
优选的，发夹探针为5’-CCCAACCCGCCCTACCCACTGAGTCTCCCCATGCCAGCTGAGGTTTTTCTCAGTGGGTTCAGC-3’，其浓度为1～10μM；Pax-5a的标准溶液的浓度分别为500pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM、500fM、100fM、10fM、0fM；引物为5’-ACCCA-3’，其浓度为1～10μM。DNA聚合酶为Klenow Fragment，其浓度为5U/μL；限制性内切酶为Nt.BbvCI，其浓度为10U/μL。
优选的，氯化血红素的浓度为2.5～25μM。
优选的，在含有双氧水的HEPES缓冲液中，双氧水的浓度为3mM，HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH为7.2。
优选的，在检测电信号变化时，施加电位的范围为-0.15～-0.5V，振幅为50mV。
本发明的有益效果如下：
(1)在构建电化学生物传感器时引入了G-四链体序列，避免了标记电活性物质所造成的检测干扰或电化学性失活问题；
(2)通过DNA聚合酶和限制性内切酶两种酶的相互协同作用，实现了目标基因的循环利用，放大了检测信号；酶促扩增产生的G-四链体可以与hemin结合形成具有辣根过氧化物模拟酶性质的G-四链体/hemin复合物，利用其催化双氧水的还原产生的稳定的电流信号，实现了对目标基因的灵敏检测；
(3)酶促扩增反应在电极外部进行，提高了反应速度，降低了操作的复杂程度；同时也避免了电极表面反应各步骤中物质的吸附(包括核酸链和酶蛋白等)会造成的检测干扰。
附图说明
图1是一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法原理示意图。
图2是按照实施例1测得的G-四链体/hemin复合物催化双氧水还原的差分脉冲伏安特征图谱。
图3是按照实施例1对标准样检测结果，A：实施例1电流变化与检测目标物浓度对应的电流响应曲线，B：电流变化与检测目标物浓度对数线性图。
图4是按照实施例1对添加了不同浓度目标DNA的复杂基质测得的回收率结果。
图5是实施例1的选择性考察结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
在本发明中，TCEP表示三(2-羧基乙基)膦，TP表示巯基修饰的探针，MCH表示巯基乙醇，Tris-HCl表示三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，MCH/TP/AuE表示改性金电极，HP表示发夹探针，dNTPs表示三磷酸碱基脱氧核苷酸，hemin表示氯化血红素。
实施例1
(1)用2mM TCEP在37℃处理巯基修饰的探针(TP)2小时以减少二硫键的存在；然后，将10μL浓度为0.3μM处理后的巯基修饰的探针(TP)溶液滴加到金电极表面，4℃孵育12小时，然后用Tris-HCl缓冲液(10mM,1mM EDTA)淋洗电极除去未结合的TP探针，并将电极用2mM MCH进行封闭，得到处理好的改性金电极MCH/TP/AuE；
(2)将2μL浓度为10μM的发夹探针(HP)和1μL浓度分别为500pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM、500fM、100fM、10fM、0fM的Pax-5a的标准水溶液在反应管中混合，补充CutSmart缓冲液(20mM Tris-HAc,50mM KAc,10mM MgAc2,0.1g/mL BSA,pH 7.9)，37℃孵育1小时；然后将2μL浓度为10μM的引物(Primer)、0.4μL浓度为5U/μL的Klenow Fragment，1μL浓度为10mM的dNTPs和1μL浓度为10U/μL Nt.BbvCI加入，37℃恒温孵育3小时，然后80℃加热20分钟以使酶失活；
(3)将步骤(2)中的混合溶液转移到步骤(1)中制备好的改性金电极上，37℃孵育60分钟，用10mM的Tris-HCl缓冲液淋洗除去残留的DNA；将10μL浓度为20μM的氯化血红素溶液滴加到改性金电极上，37℃孵育1小时；
(4)采用三电极系统，以含有3mM双氧水的浓度为10mM的HEPES缓冲液为电解液，以经过步骤(3)处理的改性金电极为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分伏安脉冲法检测电信号变化，电位范围-0.15～-0.5V，振幅50mV；由于G-四链体/hemin复合物能催化双氧水还原从而产生电流信号，电流信号强度与目标基因浓度有确定的关系，从而实现对急性白血病基因Pax-5a的灵敏检测；
(5)根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线(如图3所示)；
(6)用含有B淋巴细胞裂解液的溶液配制四种不同浓度的Pax-5a待测液，使Pax-5a浓度分别为100fM、10fM、1pM、10pM；用待测液代替标准溶液进行上述检测，根据检测到的电信号和标准曲线信号的对比，考察本方法在检测复杂生物基质中的靶DNA的可行性。
相同条件下，以单碱基错配序列(MT1)，双碱基错配序列(MT2)，三碱基错配序列(MT3)和完全错配序列(Non)分别作为目标物，考察该方法的选择性。
实施例1所用DNA序列如下：
图1是本发明所涉及的一种酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测过程及原理图。
图2是G-四链体/hemin复合物催化双氧水还原的差分脉冲伏安特征图谱。图中曲线a为修饰了巯基修饰的探针的改性金电极的测试结果，曲线b为改性金电极和不含有目标基因的反应液孵育后的测试结果，曲线c为改性金电极在和含有目标基因的反应液孵育后的测试结果。由图2可以看出，在目标基因不存在时，没有明显的差分脉冲伏安特征峰(曲线a、b)；而当目标基因存在时，在扫描电位-0.35V附近得到一个峰形良好的差分脉冲伏安特征峰(曲线c)，其峰高直接跟目标基因Pax-5a浓度相关。
图3A是按照实施例1对标准样检测得到的电流变化与检测目标物浓度对应的电流响应曲线。在10fM至500pM的目标基因浓度范围内，电流响应与目标基因浓度对数存在良好的线性关系，且检测限低至4.6fM。(图3B)。
为了考察本方法在检测复杂生物基质中的目标基因的可行性，用含有B淋巴细胞裂解液的溶液配制四种不同浓度的Pax-5a待测液进行目标基因的加标回收实验。结果显示，目标基因的回收率可以达到96.73％～103.99％，在误差允许的范围之内，这说明了该传感器在复杂基质环境中检测目标基因的潜在应用(图4)。
考虑到实用性的要求，考察该方法对特定目标物的特异性和选择性，选择以单碱基错配序列(MT1)，双碱基错配序列(MT2)，三碱基错配序列(MT3)和完全错配序列(Non)作为干扰物对传感器相应信号的影响。实验结果证实该传感器对不同的干扰组分基本没有响应或响应较低，对特定目标物响应明显，说明其具有良好的选择性和特异性(图5)。
以上所述仅为本发明的最佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (6)
1.一种基于酶辅助循环信号放大的电化学急性白血病基因Pax-5a检测方法，包括以下步骤：
(1)用三(2-羧基乙基)膦溶液处理巯基修饰的探针以减少二硫键的存在；将巯基修饰的探针转移到金电极上，使巯基修饰的探针与金电极表面结合，再淋洗金电极除去未结合的巯基修饰的探针，并用巯基乙醇溶液进行封闭，得到改性金电极；
(2)将发夹探针和不同浓度Pax-5a的标准溶液在反应管中混合，加入缓冲液体系，孵育一段时间；再加入引物、DNA聚合酶、三磷酸碱基脱氧核苷酸和限制性内切酶，孵育一段时间，然后通过加热使酶失活；
(3)将步骤(2)中的混合溶液转移到步骤(1)中的改性金电极上，孵育一段时间，淋洗除去残留的DNA；再将氯化血红素溶液转移到改性金电极上，孵育一段时间；
(4)采用三电极系统，以含有双氧水的HEPES缓冲液为电解液，以经过步骤(3)处理的改性金电极为工作电极，以饱和甘汞电极为参比电极，以Pt电极为对电极，采用差分伏安脉冲法检测电信号变化；
(5)根据检测到的电信号变化值及其对应的Pax-5a的标准溶液浓度，绘制标准曲线；
(6)对于未知浓度的待测液，按照步骤(2)至(4)并用待测液代替Pax-5a的标准溶液进行检测，根据检测到的电信号和标准曲线信号的对比，得出待测液中Pax-5a的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：三(2-羧基乙基)膦溶液的浓度为2mM；巯基修饰的探针为5’-TGAGCTCCCCATGCCAGCGATTT-SH-3’，其浓度为0.1～0.7μM；巯基乙醇溶液的浓度为2mM。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：发夹探针为5’-CCCAACCCGCCCTACCCACTGAGTCTCCCCATGCCAGCTGAGGTTTTTCTCAGTGGGTTCAGC-3’，其浓度为1～10μM；Pax-5a的标准溶液的浓度分别为500pM、100pM、50pM、10pM、5pM、1pM、500fM、100fM、10fM、0fM；引物为5’-ACCCA-3’，其浓度为1～10μM；DNA聚合酶为Klenow Fragment，其浓度为5U/μL；限制性内切酶为Nt.BbvCI，其浓度为10U/μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯化血红素的浓度为2.5～25μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在含有双氧水的HEPES缓冲液中，双氧水的浓度为3mM，HEPES缓冲液的浓度为10mM，pH为7.2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：在检测电信号变化时，施加电位的范围为-0.15～-0.5V，振幅为50mV。
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