CN102007221A - 通过用抗切割探针形成切割结构而检测靶核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及通过利用抗切割探针产生表明样品中存在靶核酸的信号的组合物和方法。
Description
相关申请
本申请是依据美国专利法35U.S.C.§120要求2005年4月14日递交的美国专利申请11/106,237的优先权的部分继续申请，而美国专利申请11/106,237是2000年11月30日递交的美国专利申请09/728,574的分案申请，而美国专利申请09/728,574是2000年8月30日递交的美国专利申请09/650,888(即现在的美国专利6,548,250)的部分继续申请，而美国专利申请09/650,888是1999年10月29日递交的美国专利申请09/430,692(即现在的美国专利6,528,254)的部分继续申请，以上申请的全部教导内容通过引用纳入本文。
发明背景
DNA复制、重组和修复的保真性对于维持基因组的稳定性是必不可少的，所有这些过程均依赖于存在于所有生物中的5′→3′外切核酸酶。对于DNA修复而言，需要这些酶进行受损片段的切除和重组错配的校正。对于复制而言，这些核酸酶对于后随链DNA合成期间冈崎片段的有效加工是至关重要的。在大肠杆菌(Escherichia coli)内，这后一种活性是由DNA聚合酶I(PolI)提供的；具有PolI 5′-3′外切核酸酶结构域失活突变的大肠杆菌菌株由于无法加工冈崎片段不能存活。但真核生物DNA聚合酶缺乏内在的5′→3′外切核酸酶结构域，这一关键的活性是由多功能的结构特异性金属核酸酶(metallonuclease)FEN-1(5′外切核酸酶-1(five′exonuclease-1)或活瓣内切核酸酶-1(flap endonuclease-1))提供的，该酶也可作为5′DNA活瓣结构(5′DNA flap)的内切核酸酶(Hosfield等人，1998a，Cell，95：135综述)。
本领域已知这样的检测和/或测定核酸的方法，所述方法使用酶产生标记的核酸片段。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了一种切割靶DNA分子的方法，其中以自水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离的DNA聚合酶(Taq聚合酶)和可与序列在理想切割位点处杂交的部分互补寡核苷酸温育5′标记的靶DNA。通过形成含有具有与理想切割位点相对的3′延伸的双链体的底物结构，该部分互补的寡核苷酸指导Taq聚合酶结合到靶DNA上，其中寡核苷酸的非互补区提供了3′臂，而底物分子未退火的5′区域提供了5′臂。未杂交时或与靶序列在理想切割位点杂交时，该部分互补的寡核苷酸包含可形成短发夹的3′核苷酸延伸部。Taq聚合酶进行切割后，检测到标记片段的释放。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了具有极少或没有可检测的合成活性和具有野生型热稳定核酸酶活性的突变热稳定DNA聚合酶的生成。之所以说突变聚合酶有用，是因为它们缺乏5′到3′的合成活性；在检测法的DNA切割步骤中，这样的合成活性是不良的副反应。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了野生型Taq聚合酶或缺乏合成活性的突变Taq聚合酶，在结合到发夹结构3′臂的引物的存在下，通过切割由先热变性后冷却而形成的5′端标记的发夹结构，可释放标记的片段。而且，美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还教导，缺乏合成活性的突变Taq聚合酶也可在没有结合到发夹结构3′臂的引物的情况下切割该发夹结构。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了在结合到发夹结构3′臂的引物的存在下，缺乏合成活性的突变Taq聚合酶对该发夹结构的切割生成了单一种类的标记切割产物，而由于野生型Taq聚合酶具有高水平的合成活性，野生型Taq聚合酶在dNTP的存在下产生了多种切割产物，并将发夹结构转变为双链形式。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了表现出合成活性下降的突变Taq聚合酶(而非野生型Taq聚合酶)通过切割含有5′端标记靶核酸和互补的寡核苷酸的线性核酸底物可释放单个标记的片段，其中该互补寡核苷酸与靶核酸的一部分杂交，使得该靶核酸的5′区域和3′区域没有退火到寡核苷酸上，仍保持单链状态。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了在天然存在的二级结构区切割标记的核酸底物的方法。根据该方法，通过PCR制备生物素标记的DNA底物，与野生型Taq聚合酶或CleavaseBN(一种突变的Taq聚合酶，其具有降低的合成活性并具有野生型的5’至3’核酸酶活性)混合，95℃温育5秒钟以变性底物，然后快速冷却至65℃以便通过允许互补碱基之间形成链内氢键而使得DNA呈现出其独特的二级结构。该反应混合物在65℃温育以便允许发生切割并检测生物素酰化的切割产物。
本领域已知这样的检测和/或测定核酸的方法，所述方法中使用FEN-1酶产生标记的核酸片段。
美国专利5,843,669公开了一种使用热稳定的FEN-1核酸酶在表现出合成活性下降的突变Taq聚合酶存在或不存在的情况下通过裂解酶片段长度多态性分析来检测多态性的方法。根据该方法，使用5′端标记的引物(以TMR荧光染料标记)经PCR反应标记双链丙型肝炎病毒(HCV)的DNA片段。TMR标记的PCR产物加热到95℃进行变性，随后冷却到55℃，以生成切割结构。美国专利5,843,669公开了一种包含含有二级结构的单链核酸底物区域的切割结构。在CleavaseBN核酸酶或源自古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)的FEN-1核酸酶或这两种酶存在的情况下进行切割。标记的反应产物以凝胶电泳和随后的荧光成像进行显示。美国专利5,843,669公开了CleavaseBN核酸酶和詹氏甲烷球菌FEN-1核酸酶产生可轻易相互区分开的切割模式，来自含有这两种酶的反应的切割模式包括每种酶切割所产生的模式成分，但不仅仅是每种酶产生的切割模式的组合。这表明不被一种酶切割的一些片段(在该酶的模式上以条带出现)可在相同的反应混合物中被第二种酶切割。
Lyamichev等人公开了一种检测DNA的方法，其中与靶DNA的区域部分互补的寡核苷酸探针的重叠配对与靶DNA进行混合，形成5′活瓣区域(flapregion)，其中热稳定FEN-1核酸酶对标记的下游探针的切割产生标记的切割产物。Lyamichev等人还公开了反应条件，其中对于单个靶序列，可在没有温度循环的条件下切割多个拷贝的下游寡核苷酸探针，以扩增切割信号和允许在亚阿托摩尔(sub-attomole)水平下定量检测靶DNA(Lyamichev等人，1999，Nat.Biotechnol.，17：292)。
美国专利4,683,202、4,683,195和4,800,159公开了聚合酶链反应(PCR)技术。最简单形式的PCR是一种使用两个与相反链杂交且位于靶DNA目的区域两侧的寡核苷酸引物进行特异DNA序列酶促合成的体外方法。包括模板变性、引物退火和DNA聚合酶所催化的退火引物延伸的一系列重复步骤导致特异片段的指数性累积，其中特异片段的末端由两个引物的5′端限定。据报道PCR可选择性地富集特异的DNA序列，使其增加109倍。Saiki等人，1985，Science，230：1350也描述了PCR方法。
尽管PCR技术是极为有效的核酸序列扩增方法，但检测扩增的物质需要对PCR产物进行额外的操作和后续处理以确定是否存在靶DNA。因此需要减少目前用于检测扩增物质所需的后续处理步骤的数量。与在扩增步骤过程中不产生信号的PCR方法相比，靶序列被扩增的同时即产生信号的分析系统要求更少的用于检测扩增物质的处理步骤。
美国专利5,210,015和5,487,972公开了一种用于释放标记探针的基于PCR的检测，其包括在PCR反应的扩增步骤期间在待扩增的核酸、具有5′到3′外切核酸酶活性的Taq聚合酶和5′端或3′端标记的探针或5′端和3′端均标记的探针存在下产生信号，其中该探针包含与扩增区域互补的区域和附加的非互补5′尾区。美国专利5,210,015和5,487,972还公开了当Taq聚合酶被上游探针以不依赖于聚合的方式例如在没有dNTP存在的情况下定位于标记探针附近时，该基于PCR的检测可释放杂交探针的5′标记末端。
发明内容
本发明提供产生表明样品中存在靶核酸序列的信号的方法，其包括温育含有靶核酸序列的样品与核酸聚合酶以形成切割结构，并以FEN核酸酶切割所述切割结构以产生信号，其中产生所述信号表明所述样品中存在靶核酸序列。本发明的一个实施方式基于非侵入型切割来检测样品中的靶核酸序列，其中探针是抗切割探针。由该抗切割探针形成的切割结构仅在形成非重叠切割结构(非侵入型)时才能被切割剂切割，而在形成重叠结构(侵入型)时不能被切割剂切割。通过在探针的一部分内引入一或多个本发明的核酸修饰而实现探针对切割的抗性，假如没有这样的修饰，探针在形成重叠结构后将被切割。
使用抗切割探针的方法和组合物
在一个方面，本发明涉及产生表明序列中存在靶核酸的信号的方法，该方法基于使用抗切割探针形成非侵入型切割结构。通过将含有所述靶的样品与聚合酶、引物好所述抗切割探针温育而形成本发明的非侵入型切割结构。引物与所述抗切割探针上游的靶杂交。聚合酶延伸引物，合成与靶互补的核酸分子。该合成的链所形成的双链核酸与靶核酸上的如下区域不重叠(即不形成杂交体)，所述区域是由抗切割探针与靶核酸形成杂交体的区域。所谓的非重叠切割结构当存在切割剂(例如，FEN核酸酶)时被切割，由此产生切割片段，后者作为切割的结果而自切割结构释放，和/或由此产生可表明样品中存在靶核酸和/或样品中靶核酸的量的检测信号。
在本发明中，本发明的″抗切割探针″是这样的探针，其所形成的切割结构当形成非重叠(非侵入型)切割结构时易于被切割剂切割，而当形成重叠(侵入型)切割结构时不能被切割剂切割。通过引入一或多个修饰而实现这种对切割的抗性，所述修饰造成被重叠结构所靶向的探针部分能够抵抗切割。因此，抗切割探针至少具有可抵抗本发明的切割剂的部分。
在一个实施方式中，抗切割探针在+1和/或+2位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针可抵抗本发明的切割剂的切割(图13)。这些修饰使得探针可抵抗重叠(侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13B)。但是，抗切割探针易在非重叠(非侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13A)。合适的修饰包括但不限于将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和/或将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。其他适宜的修饰包括2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2′F-ANA)核苷酸、锁核酸(locked-nucleic acids，LNA)和ENA：2′-O，4′-C-亚乙烯基桥连核酸(2′-O，4′-C-ethylene-bridged nucleic acids)。
在一个实施方式中，抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的解链温度(Tm)低于进行引物延伸的温度(图13C)。
在另一实施方式中，抗切割探针具有位于肘弯(elbow)上游并与之相连的一段两个或更多个胸苷。在另一个实施方式中，抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段三个或更多个胸苷。在另一个实施方式中，抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段四个或更多个胸苷。
在本发明中，″连续的(contiguous)″是指每一区域(例如，肘弯和第一胸苷)与下一区域为直接的核苷酸-核苷酸接触。例如，相接处的肘弯和第一上游胸苷(位置-1)之间没有任何额外的核苷酸。在本发明中，″一段胸苷″指的是两个或更多个连续的胸苷。
在本发明中，″肘弯″指的是位于5′活瓣(flap)的第一个单链核苷酸和第一个双链核苷酸(例如与靶核酸杂交的核苷酸；+1位)之间的磷酸酯键。
在另一实施方式中，聚合酶具有热稳定性。合适的聚合酶包括病毒、反转录病毒好细菌的酶。例如，聚合酶可以是：大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶。
在另一实施方式中，切割剂是FEN核酸酶。FEN可具有热稳定性。
下游抗切割探针可包括至少一个能够提供可检测信号的标记部分。或者，下游抗切割探针包括一对产生相互作用信号的标记部分。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的标记部分被有效地放置以便猝灭可检测信号的产生。所述标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点的分开。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包括猝灭剂部分和荧光部分。
在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便当非重叠结构被切割后它们分开并产生可检测信号，但当形成重叠结构时它们不分开也不产生可检测信号。例如，荧光剂可有效地偶联于所述探针的+1位，而猝灭剂可有效地偶联于所述探针的5’活瓣，使得当+1位上游发生非侵入型切割时，所述标记物分开，并产生可检测信号(图14)。
在另一实施方式中，在反应中进一步加入上游寡核苷酸，其中所述上游寡核苷酸的3’末端具有一或多个非互补核苷酸。因此，反应含有两种不同上游寡核苷酸的混合物，即所述具有非互补3’末端的上游寡核苷酸和所述引物。所述引物和上游寡核苷酸均与靶的相同的通用区域互补。上游寡核苷酸形成非侵入型切割结构，其可促成切割所述下游抗切割探针，而所述引物促成所述靶的扩增。在另一实施方式中，反应包括与所述靶的如下区域互补的一或多种引物，所述区域不同于与所述上游寡核苷酸互补的区域，例如，正向引物与靶的位于上游寡核苷酸上游的部分互补，而反向引物与与靶互补的核酸分子互补。
在另一方面，本发明涉及产生表明样品中存在靶核酸的信号的方法。将上游引物、下游抗切割探针、聚合酶和切割剂与所述样品混合。将混合物置于如下反应条件，所述条件允许上游引物和下游抗切割探针与靶退火，(ii)延伸上游引物，以及(iii)切割非重叠切割结构。聚合酶合成引物延伸产物，后者与下游抗切割探针形成非重叠切割结构。然后切割剂切割非重叠切割结构，自所述切割结构释放出标记的片段，由此产生可检测的标记的片段。检测和/或测定代表所述样品中存在靶序列的这些标记的片段。或者，通过检测和/或测定切割结构被切割后所产生的信号(例如，一对产生相互作用信号的标记部分的分开)而确定所述靶的存在。
在一个实施方式中，抗切割探针在+1和/或+2位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针抵抗切割(图13)。这些修饰使得探针可抵抗重叠(侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13B)。但是，抗切割探针易在非重叠(非侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13A)。合适的修饰包括但不限于将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和/或将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。
在一个实施方式中，抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的Tm低于进行引物延伸的温度(图13C)。
在另一实施方式中，聚合酶具有热稳定性。合适的聚合酶包括病毒、反转录病毒好细菌的酶。例如，聚合酶可以是：大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶。
在另一实施方式中，切割剂是FEN核酸酶。FEN可具有热稳定性。
下游抗切割探针可包括至少一个标记部分，后者能够提供可检测信号。或者，下游抗切割探针包括一对产生相互作用信号的标记部分。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的标记部分被有效地放置以便猝灭可检测信号的产生。标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点分开。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包括猝灭剂部分和荧光部分。
在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便当非重叠结构被切割后它们分开并产生可检测信号，但当形成重叠结构时它们不分开也不产生可检测信号。例如，荧光剂可有效地偶联于所述探针的+1位，而猝灭剂可有效地偶联于所述探针的5’活瓣，使得当+1位上游发生非侵入型切割时，所述标记物分开，并产生可检测信号(图14)。
在某些实施方式中，下游抗切割探针包括5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸至少部分互补并退火，而所述5’区域形成活瓣。
在另一实施方式中，在反应中进一步加入上游寡核苷酸，其中所述上游寡核苷酸的3’末端具有一或多个非互补核苷酸。因此，反应含有两种不同上游寡核苷酸的混合物，即所述具有非互补3’末端的上游寡核苷酸和所述引物。所述引物和上游寡核苷酸均与靶的相同的通用区域互补。上游寡核苷酸形成非侵入型切割结构，其可促成切割所述下游抗切割探针，而所述引物促成所述靶的扩增。
在另一方面，本发明提供检测靶核酸的方法，其中提供上游引物和下游抗切割探针。上游引物与靶核酸的第一区域至少部分互补，而所述下游抗切割探针的3’区域与靶核酸的第二区域至少部分互补。所述靶的第一区域和第二区域被延伸区域分开。在允许所述靶核酸与所述上游引物以及所述靶与所述下游抗切割探针的3’区域之间形成双链体的条件下将所述靶与所述探针和引物混合。进行反应的反应条件允许聚合酶活性通过聚合与所述靶上的一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补的DNA链而延伸上游引物。反应条件还允许切割剂切割非重叠切割结构。切割结构被切割，释放下游抗切割探针的可检测片段，后者可被检测到。或者，通过检测和/或测定切割结构被切割后所产生的信号(例如，一对产生相互作用信号的标记部分的分开)而确定所述靶的存在。
在一个实施方式中，抗切割探针在+1和/或+2位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针抵抗切割(图13)。这些修饰使得探针可抵抗重叠(侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13B)。但是，抗切割探针易在非重叠(非侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13A)。合适的修饰包括但不限于将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和/或将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。在一个实施方式中，抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的Tm低于进行引物延伸的温度(图13C)。
在另一实施方式中，聚合酶具有热稳定性。合适的聚合酶包括病毒、反转录病毒好细菌的酶。例如，聚合酶可以是：大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶。
在另一实施方式中，切割剂是FEN核酸酶。FEN可具有热稳定性。
下游抗切割探针可包括至少一个标记部分，其能够提供可检测信号。或者，下游抗切割探针包括一对产生相互作用信号的标记部分。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的标记部分被有效地放置以便猝灭可检测信号的产生。标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点分开。在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包括猝灭剂部分和荧光部分。
在另一实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便当非重叠结构被切割后它们分开并产生可检测信号，但当形成重叠结构时它们不分开也不产生可检测信号。例如，荧光剂可有效地偶联于所述探针的+1位，而猝灭剂可有效地偶联于所述探针的5’活瓣，使得当+1位上游发生非侵入型切割时，所述标记物分开，并产生可检测信号(图14)。
在一个实施方式中，聚合酶活性聚合与一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补的核苷酸，使得所聚合的互补核酸的3’端邻近双链体的下游抗切割探针。
在另一实施方式中，聚合酶活性聚合与一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补的核苷酸，使得所述延伸区域成为完全双链的核酸。
当与靶杂交后，下游抗切割探针的5’区域形成5’活瓣。
在另一方面，本发明提供用于进行本发明的方法的组合物。本发明提供的组合物包括聚合酶、切割剂、引物和下游抗切割探针。聚合酶可以是
在某些实施方式中，聚合酶具有热稳定性。
在进一步的实施方式中，组合物包括靶核酸。切割剂可以是5’核酸酶(例如，FEN-1核酸酶)。核酸酶可具有热稳定性。
在某些实施方式中，下游抗切割探针具有偶联于3’末端核苷酸的封闭基团。下游抗切割探针优选地是标记的。例如，下游抗切割探针可具有至少一种能够产生信号的标记部分。或者，下游抗切割探针具有一对产生相互作用信号的标记部分(例如，猝灭剂和荧光剂)。标记物可有效地偶联于下游抗切割探针的5’区域或3’区域。在某些实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分有效地偶联于下游抗切割探针，使得所述标记物被对FEN核酸酶敏感的位点分开。
在另一实施方式中，在反应中进一步加入上游寡核苷酸，其中所述上游寡核苷酸的3’末端具有一或多个非互补核苷酸。因此，反应含有两种不同上游寡核苷酸的混合物，即所述具有非互补3’末端的上游寡核苷酸和所述引物。所述引物和上游寡核苷酸均与靶的相同的通用区域互补。上游寡核苷酸形成非侵入型切割结构，其可促成切割所述下游抗切割探针，而所述引物促成所述靶的扩增。
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包括：靶核酸，所述靶核酸在3’至5’方向具有第一区域、延伸区域和第二区域；引物，其与靶核酸的第一区域至少部分互补；下游抗切割探针，其具有5’区域和3’区域，其中所述3’区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，而其中5’区域不与靶核酸互补；聚合酶；以及切割剂。
在一个实施方式中，抗切割探针在+1和/或+2位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针抵抗切割(图13)。这些修饰使得探针可抵抗重叠(侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13B)。但是，抗切割探针易在非重叠(非侵入型)切割结构所靶向的切割区域被切割(图13A)。合适的修饰包括但不限于将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。
在一个实施方式中，抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的Tm低于进行引物延伸的温度(图13C)。
在最后这两方面任一的一个实施方式中，切割剂是5’核酸酶(例如，FEN-1核酸酶)。在另一实施方式中，FEN-1核酸酶和/或聚合酶具有热稳定性。
下游抗切割探针的3’末端核苷酸可包括封闭基团。所述抗切割探针优选地是标记的。例如，下游抗切割探针可包括至少一种能够产生信号的标记部分。或者，下游抗切割探针包括一对产生相互作用信号的标记部分(例如，猝灭剂和荧光剂)。
在另一方面，本发明提供包含上述任一组合物的试剂盒。
在本发明中，术语″探针″指的是这样的寡核苷酸，其与靶核酸内的序列形成双链体结构，这是因为探针内的至少一种序列与靶区域内的序列具有互补性。优选地，探针是标记的。探针优选地不含有与引物内所使用的序列互补的序列。探针包含与靶核酸互补的一或多个区域(例如，靶核酸结合序列)(例如图4的C)。在某些实施方式中，本发明的″探针″具有二级结构且还包含结合部分，当探针与靶核酸结合时所述二级结构发生改变。本发明的″探针″结合靶核酸以形成可被核酸酶切割的切割结构，其中切割在切割温度下进行，且其中探针的二级结构在没有结合靶核酸时优选地在切割温度或低于切割温度下具有稳定性。本发明的探针在结合靶核酸之前不能被本文所述的“核酸酶”切割产生信号。在本发明的一个实施方式中，探针可包含不结合靶核酸或与靶核酸不互补的区域。在本发明的另一实施方式中，探针结合于靶核酸时不具有二级结构。在一个实施方式中，探针具有5’区域和3’区域。所述3’区域与靶互补，而所述5’区域与靶可互补或不互补。
抗切割探针
在本发明中，本发明的″抗切割探针″是这样的探针，其所形成的切割结构当形成非重叠(非侵入型)切割结构时可被切割剂切割，而当形成重叠(侵入型)切割结构时不能被切割剂切割。通过引入一或多个修饰而实现这种对切割的抗性，所述修饰造成被重叠结构所靶向的探针部分能够抵抗切割。因此，抗切割探针至少具有可抵抗被本发明的切割剂切割的部分。
在一个实施方式中，探针易于在+1位上游(例如，非重叠切割结构所靶向的部分)被切割，但可抵抗在+1位下游或+2位下游(例如，重叠结构所靶向的部分；图13)被切割。
抗切割修饰不必存在于探针的整个互补部分(例如，+1位至3’末端)，只要探针的非修饰的且与靶互补的区域的解链温度(Tm)低于进行聚合酶延伸反应的温度(例如72℃)即可(图13C)。因此，探针被设计为使得如果探针的整个修饰部分(抗切割部分)从靶上被置换(例如，当上游引物延伸形成重叠结构时)，探针将不再与靶形成双链体(图15C)。可用于本发明的这一非修饰的互补区域的Tm低于切割/延伸反应的温度(低至少1℃，且优选地10℃)。″切割温度″最初选定为特定核酸酶能够用于且优选地能够最佳地用于切割反应。
例如，23个核苷酸的探针可具有20个核苷酸的靶互补区(核苷酸位置+1至+20)和3个核苷酸的5’活瓣(核苷酸位置-1至-3)。探针可被修饰为使得核苷酸+2至+15可抵抗FEN的切割(图15)。非修饰的核苷酸16-20不被切割，因为要靶向这些核苷酸需要引物延伸通过探针的互补部分并置换寡核苷酸1-15。剩余的互补核苷酸(+16-+20)在切割/延伸条件下(1X Pfu缓冲液，60-72℃)将不再与靶形成稳定的双链体并将解离，而不会将探针切割。
类似地，43个核苷酸的探针可具有40个核苷酸的靶互补区(核苷酸位置+1至+40)和3个核苷酸的5’活瓣(核苷酸位置-1至-3)。探针可被修饰为使得核苷酸+2至+32可抵抗FEN的切割(图15)。非修饰的核苷酸33-40不被切割，因为要靶向这些核苷酸需要引物延伸通过探针的互补部分并置换寡核苷酸1-32。剩余的互补核苷酸(+33至+40)在切割/延伸条件下(1X Pfu缓冲液，60-72℃)将不再与靶形成稳定的双链体并将解离，而不会将探针切割。
确定互补性非修饰的靶互补区的Tm的方法是已知的且在此加以讨论。类似地，确定不需要被修饰的抗切割探针的靶互补区的大小的方法是已知的且在此加以讨论(见III.C.探针)。
确定探针的修饰区域是否抵抗切割的方法是已知的且在此加以讨论。例如，可进行I.A节所述的FEN内切酶活性测定或实施例14所述的切割测定，其中使用的探针已经被改变至少使其一部分抵抗切割。
在本发明中，″修饰″或″修饰的″指的是核酸探针内的变化，其造成探针的修饰部分可抵抗本发明的核酸酶的切割。此类修饰包括将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。其他适宜的修饰包括2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2′F-ANA)核苷酸、锁核酸(LNA)和ENA：2′-O，4′-C-亚乙烯基桥连核酸。
锁核酸代表一类构象限制性核苷酸类似物，例如参见WO 99/14226，通过引用将后者并入本文。含有锁核苷酸的寡核苷酸可参见Koshkin，A.A.，et al.，Tetrahedron(1998)，54：3607-3630)和Obika，S.et al.，Tetrahedron Lett.(1998)，39：5401-5404)，通过引用将上述文献并入本文。将锁核苷酸引入寡核苷酸可改善对互补序列的亲和力，并使得解链温度提高若干度(Braasch，D.A.and D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，8：1-7)。可使用任何已知的LNA实施本发明，例如WO 99/14226和Latorra D，et al.，2003.Hum.Mutat.22：79-85所公开的那些LNA，通过引用将上述文献并入本文。使用LNA类似物可获得更加特异性的结合，并可采用更加严格的洗涤条件，其优点是显著降低了背景噪音的量。含LNA的寡核苷酸可从例如Proligo，LLP(Boulder，CO)购得。
在本发明中，″抗切割″或″抵抗″或″抗切割部分″指的是本文所述的修饰的探针部分，使得其能够在本文所述的切割反应条件(例如，1x Pfu缓冲液，60-72℃)下不被本发明的核酸酶(例如，FEN核酸酶)切割。因此，为了可用于本发明，抗切割的探针部分在切割反应条件下所产生的切割产物的量不能超过未经修饰的相同探针所产生的切割产物的量的10％、5％、1％、0.5％、0.1％，且最优选地为0％。用于确定探针是否抵抗切割的切割测定的方法是已知的且在此加以讨论(见I.A节和实施例10和14)。
在本文中，抗切割部分可包含探针的整个杂交部分(靶互补部分)。或者，抗切割部分小于探针的整个杂交部分。例如，本领域人员可仅修饰探针上的(经如上所述的上游引物延伸后)形成稳定双链体的靶互补区部分。例如，具有40个与靶互补的核苷酸的43个核苷酸的探针可仅在位置+2至位置+32包含修饰。类似地，具有20个与靶互补的核苷酸的23个核苷酸的探针可仅在位置+2至位置+15包含修饰。确定靶互补区的大小的方法是已知的且在此加以讨论。
在本发明中，″聚合酶延伸条件″指的是使得核酸聚合酶能够延伸引物的3’末端且优选地能够最佳地延伸引物的3’末端的缓冲液、温度温育步骤和时间。此类反应条件是已知的且在此加以描述。
在本发明中，″双链体″指的是包含两种寡核苷酸(例如，靶核酸和探针)的复合体，其中至少部分靶的互补核苷酸碱基和探针因形成氢键而杂交。
在本发明中，探针上与靶互补并杂交的核苷酸被定义为是+1位直至+X位。+1位被定义为是下游探针的杂交区域的5’末端核苷酸，区域+2被定义为是位于+1位直接下游的核苷酸，依此类推(见图13)。5’活瓣的核苷酸被定义为位于-1位直至-X位。-1位被定义为是活瓣的位于肘弯直接上游的3’末端核苷酸。-2位被定义为是位于-1位直接上游的核苷酸，依此类推(见图13)。
具有二级结构的探针
在本发明中，″二级结构″指的是三维构象，例如发夹、茎环结构、内环、凸环、分支结构或假结(图1和3)；多个茎环结构、三叶草型结构或任何三维结构。本文中所用的“二级结构”包括三级、四级等结构。包含这种三维结构的探针结合到靶核酸，形成可被核酸酶在切割温度下切割的切割结构。探针没有结合到靶核酸时的三维结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。在本发明中，“二级结构”可以指包含第一单链碱基序列(在本文中称为“互补核酸序列”(例如图4的b))与其后的第二互补序列(或在同一分子中(例如图4的b’)，或在包含探针的第二分子中)的序列发生自身折叠，生成反平行的双链体结构，其中单链序列和互补序列(即互补核酸序列)经形成氢键发生退火。本发明使用的寡核苷酸探针包括含二级结构的寡核苷酸，包括但不限于分子信标、别针(safety pin)(图9)、蝎型(Scorpion)(图10)、和sunrise/amplifluor探针(图11)，下文和附图中描述了它们的细节和结构。
在本发明中，第一“互补”核酸序列和第二“互补”核酸序列互相互补，可通过互补碱基之间形成的氢键发生退火。
二级结构还指包含本文所述的亲和对(affinity pair)的核酸分子的构象，其中所述亲和对因包含所述亲和对的一对部分之间存在吸引力而反向结合。在本发明中，二级结构防止探针的结合部分结合捕获元件，而当探针与靶核酸结合后二级结构改变且结合的探针随后被切割后，可允许结合部分被捕获元件捕获。
本发明的″探针″可以是单分子。在本发明中，“单分子”探针包含单个分子，其结合到靶核酸上形成可被核酸酶切割的切割结构，其中在切割温度下实施切割，且其中“单分子”探针未结合到靶核酸时，其二级结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。可用于本发明的单分子探针包括但不限于信标探针、包含发夹、茎环、内环、凸环或假结结构的探针、蝎型探针和sunrise/amplifluor探针。
本发明的″探针″可以多于一个分子(例如，双分子或多分子)。包含双分子或多分子探针的分子的至少其中之一结合到靶核酸上形成可被核酸酶切割的切割结构，其中在切割温度下实施切割，且其中在未结合到靶核酸时，探针分子的二级结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。包含多分子探针的分子通过分子间键(例如，氢键或共价键)彼此结合。可用于本发明的多分子探针的实例为，例如，异源环(heterologous loop)(见图1)，或三叶草型结构，其中所述三叶草型结构的一或多个环包含不同的分子，且其中这些结合形成三叶草型结构的分子通过形成分子间键(例如，形成氢键或形成共价键)结合。
在本发明中，″分子″指的是多核苷酸，并包括进一步包含附着有亲和对的成员的多核苷酸。
″探针″或包含探针的″分子″的长度为5-10,000个核苷酸，长度理想地为6-5000、7-1000、8-500、9-250、10-100和17-40个核苷酸，不过也可使用不同长度的探针或包含不同长度的探针的分子。
本发明的“探针”具有约5至约10,000个核苷酸和优选具有10至约140个核苷酸的靶核酸结合序列。在一个实施方式中，本发明的“探针”包含至少第一和第二互补核酸序列或区域，它们的长度是3-250个核苷酸，优选是4-150个核苷酸，更优选地是5-110个核苷酸，且最优选是6-50个核苷酸。第一互补核酸序列和第二互补核酸序列可具有相同或不同长度。本发明提供这样的探针，其中第一互补核酸序列和第二互补核酸序列均位于靶核酸结合位点的上游(5′)。或者，第一互补核酸序列和/或第二互补核酸序列可均位于靶核酸结合位点的下游(3′)。在另一实施方式中，本发明提供这样的探针，其中第一互补核酸序列位于靶核酸结合位点上游(5’)，而第二互补核酸序列位于靶核酸结合位点下游(3’)。在另一实施方式中，本发明提供这样的探针，其中第二互补核酸序列位于靶核酸结合位点上游(5’)，而第一互补核酸序列位于靶核酸结合位点下游(3’)。参照靶核酸结合序列来选择实际的长度，这样当探针在实施切割结构(包含结合于靶核酸的探针)切割的温度下没有结合到靶核酸时，探针的二级结构优选地是稳定的。随着靶核酸结合序列的大小增加到500个核苷酸，互补核酸序列的长度可增加到15-125个核苷酸。对于长于100个核苷酸的靶核酸结合序列，互补核酸序列的长度不会进一步增加。如果探针还是等位基因区分探针，正如下文讨论，互补核酸序列的长度受到更多限制。
在本发明中，″靶核酸结合序列″指的是探针与靶核酸特异性结合的区域。
″发夹结构″或″茎″指的是通过单链的RNA或DNA内邻近的、倒置的互补序列之间的碱基配对所形成的双螺旋区域。
″茎环″结构指的是这样的发夹结构，其在一段还包含非配对碱基环。
在本发明中，当未结合于靶核酸时具有“稳定”二级结构的探针指的是这样的二级结构，其中在允许探针与靶核酸杂交但缺乏靶核酸的条件下，50％或以上(例如，50％、55％、75％或100％)的构成探针的碱基对不解离。
核酸双链体的“稳定性”取决于解链温度或“Tm”。特定核酸双链体在特定条件下(例如，盐浓度和/或是否存在有机溶剂)的Tm是指双链体分子的一半(50％)的碱基对发生解离(即彼此没有杂交成碱基对)时的温度。
可采用如下方法确定未结合于靶核酸时的探针二级结构的“稳定性”，解链温度测定、荧光共振能量转移(FRET)测定或荧光猝灭测定(详情见标记为″确定探针的稳定性或二级结构″的部分)。
在某些实施方式中，可用于本发明的探针当未结合靶且在切割反应的温度下或低于该温度的温度下将优选地具有“稳定的”二级结构。因此，在本发明中，核酸酶切割探针/靶核酸杂交体时的温度必须低于二级结构的Tm。在解链温度测定中，如果在切割反应温度(即发生切割时的温度)或低于该温度的温度下的光吸收水平低于在等于或高于所述探针的Tm的温度下的光吸收水平(即至少低5％，优选地低20％，且最优选地低25％，等等)，则在解链温度测定中，所述探针的二级结构在切割反应温度或低于该温度的温度下是稳定的。
根据本发明的方法，通过FRET测定或荧光猝灭测定来测定二级结构的稳定性(参见标题为″确定探针二级结构的稳定性″的部分)。在本发明中，荧光猝灭测定可包括FRET测定。本发明的探针标记了合适的相互作用标记物对(例如，FRET对(例如参见标题为″确定探针二级结构的稳定性″的部分，下文)，它们能够相距例如2个核苷酸的一段距离而相互作用；或非FRET对(例如，四甲基罗丹明和DABCYL)，它们能够相距例如20个核苷酸的一段距离而相互作用)。例如，本发明的探针可标记被上荧光团和猝灭剂，然后在缺乏靶核酸的情况下测定不同温度时的荧光。Tm是荧光水平为观察到的特定探针的最高荧光水平的50％时的温度，见图12e。在探针的核酸序列已知的情况下，可根据现有技术的方法预测特定特征的Tm。因此，可在一定范围的温度内测定本发明的探针的荧光，例如，其中该范围的温度下限为Tm或预测的Tm以下至少50℃，而该范围的温度上限为Tm或预测的Tm以上至少50℃。
在FRET测定中，如果荧光的水平或波长相对于在探针的Tm处所观察到的FRET的水平或波长升高或降低(例如，至少低5％，优选地低20％，更优选地低25％，等等)，则二级结构被定义为在切割温度下或低于该温度的温度下是“稳定的”(见图12e和f)。例如，在本发明的FRET测定中可出现FRET的升高或降低。在另一实施方式中，在本发明的FRET测定中，可出现波长迁移，这导致新的迁移波长的增加，或新的迁移波长的降低。
根据本发明，可在荧光猝灭测定中测定二级结构的“改变”，在荧光猝灭测定中，本发明的探针包含荧光团和猝灭剂，它们被放置的位置使得在缺乏靶核酸且在低于探针的Tm的温度下出现荧光猝灭(如上所述)。在本发明中，当本发明的探针结合于靶核酸时出现的二级结构的“改变”指的是该测定法中的荧光增强，使得在低于探针的Tm的温度下，探针结合于靶核酸之后的荧光水平高于在缺乏靶核酸时所观察到的荧光水平(例如，高至少5％、优选地5-20％、以及更优选地25％或更高)(见图12g)。
根据本发明，可通过对包含荧光团和猝灭剂的探针进行荧光猝灭测定(如上所述)而检测二级结构。表现出荧光的改变与温度的改变相关联的探针可能能够形成二级结构，见图12e(例如，随着FRET反应温度的升高荧光增强)。
在本发明中，本发明可采用的″切割温度″是低于具有二级结构的探针的Tm的温度(至少低1℃，优选地低10℃)。″切割温度″最初选定为特定核酸酶能够用于且优选地能够最佳地用于切割反应。
优选地，如果反应中使用活性聚合酶，探针的3’末端将被“封闭”以防止探针掺入引物延伸产物。可使用非互补的碱基或向最后一个核苷酸的3′羟基加入化学部分例如生物素或磷酸基来实现“封闭”，所选的部分还可通过作为标记物用于随后检测或捕获附着于所述标记物的核酸，以达到双重目的。还可通过除去3′-OH或使用缺乏3′-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸来实现封闭。
术语探针包括等位基因区分探针。在本发明中，″等位基因区分″探针优先与完全互补的靶核酸杂交，并区分至少有1个核苷酸差异的序列。与靶核酸相比至少有1个核苷酸差异的核酸序列(下称“靶样核酸序列”)因此不是本发明的等位基因区分探针的靶核酸。等位基因区分探针不能与靶样核酸序列在由实验优化而确定的允许等位基因区分探针区分具有至少1个单核苷酸差异的靶序列和靶样核酸序列的特定温度下或温度范围内充分杂交，因此在仅有靶样核酸序列存在和在支持等位基因区分探针与靶核酸杂交的条件下等位基因区分探针结合到靶样核酸序列上时，其二级结构不会发生变化，其中与靶核酸互补序列相比，靶样核酸序列含有一个或多个核苷酸错配。
在一个实施方式中，本发明的“等位基因区分探针”指的是与靶样核酸序列杂交的探针，其中靶样核酸序列与靶核酸序列存在至少1个核苷酸的差异，其中变异核苷酸不位于等位基因区分位点。根据本发明的该实施方式，“等位基因区分探针”不能在由实验优化而确定的允许等位基因区分探针区分具有至少1个单核苷酸差异的靶序列和靶样核酸序列的特定温度下或温度范围内结合到在等位基因区分位点还至少具有1个核苷酸差异的靶样核酸序列。单个核苷酸差异只影响结合到靶序列或靶样核酸序列的探针比例。例如，本发明提供了一种完全匹配的探针，其中在过量探针的存在下，多达100％的靶位于探针-靶复合物中(例如与探针结合)。本发明还提供了包含至少1个单碱基错配的探针，其中至少1-5％、优选5-10％的靶样序列在用于形成包含靶序列和完全匹配的探针的复合物的相同条件下结合到探针上。
本文中所用的“等位基因区分位点”指的是不同于包含靶核酸序列的所有可能的等位基因相应区域(即至少一个核苷酸不同)的靶核酸的区域。
可用于本发明的等位基因区分探针还包括相比于靶序列，以更低效率结合到靶样序列上的探针。在靶样序列或靶序列存在下，在低于探针二级结构Tm的温度下(低至少1℃，优选10℃或更多)，实施FRET测定，测量探针结合到靶序列或靶样序列的效率。靶序列存在或不存在时荧光水平的变化与靶样序列存在或不存在时荧光水平的变化的比较，提供了探针结合到靶序列或靶样序列的效率的有效衡量标准。
在本发明的一种方法中，与靶核酸序列杂交相比，探针与靶样序列杂交时，与靶序列相比以更低效率结合到靶样序列的探针其二级结构将发生更小的变化(例如优选是25-50％，更优选是50-75％，最优选是75-90％的结合到靶核酸序列时的荧光变化值)，例如由本文描述的FRET测定所测量的荧光来确定。在本发明的一个方法中，与靶序列相比，以更低效率结合到靶样序列的探针将产生指示样品中靶样核酸序列存在的信号。但是，信号的强度会发生变化(例如优选地比探针结合到靶核酸序列时的荧光变化小或大25-50％、更优选地小或大50-75％、最优选地小或大75-90％)，而在靶序列存在下产生的信号强度，正如上文描述的，变化更小。
“表明靶核酸序列或靶样核酸序列存在的信号”指的是相当于靶核酸序列或靶样核酸序列的1个分子到1020个分子、更优选约100个分子到1017个分子和最优选约1000个分子到1014个分子所产生信号的信号。
在本发明中，″结合部分″指的是探针的区域(例如图4的ab)，该区域当探针被核酸酶切割后被释放，并因该结合部分与捕获元件之间存在吸引力而特异性结合捕获元件，且其中所述结合部分与捕获元件之间的特异性结合仅在探针二级结构发生本文中所定义的″改变″时才出现。″特异性结合″指的是通过与互补核酸形成氢键或通过，例如，结合部分与能够特异性结合于所述结合部分的核酸序列的结合蛋白之间的相互作用。″结合部分″不干扰探针结合靶核酸的能力。当探针处于其天然二级结构构象时，结合部分不能结合捕获元件，因此，当结合于靶或模板核酸时，二级结构改变的方式允许结合部分结合捕获元件，优选地在被切割剂切割之后。
在一个实施方式中，探针上被切割以形成结合部分的区域不能与靶核酸杂交。″结合部分″上的不是本文所述的″互补核酸序列″的区域(例如，图4的A)的长度是1-60个核苷酸，优选地1-25个核苷酸，且更优选地为1-10个核苷酸长。检测本文所定义的结合部分与本文所定义的捕获元件之间的特异性结合的方法是本领域已知的并在下文中描述。
在本发明的一个实施方式中，探针还包含″报道剂″。
在本发明中，“报道剂”指的是下文定义的″标记物″和/或下文定义的″标签″。
在本发明中，″标记物″或″能够产生信号的标记部分″指的是任何原子或分子，它们可用于提供可检测的(优选可定量的)信号，且它们可有效地连接于核酸。标记物可通过荧光、放射性、比色法、密度测定、X-线衍射或吸收、磁性、酶活性、质谱、结合亲和力、杂交、射频、纳米结晶技术等等提供可检测信号。本发明的方法的标记探针可在5’末端、3’末端或内部进行标记。标记物可以是“直接的”，即染料，或者是“间接的”，即生物素、地高辛、碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)等。为了检测″间接标记物″，需要加入额外的成分例如标记的抗体或酶底物以观察捕获的、释放的、标记的核酸片段。在本发明的一个实施方式中，除非二级结构发生了本文所述的“改变”(例如，使得结合部分可以被接近)，否则标记物不能提供可检测信号。
″结合部分″还指″标签″。在本发明中，″标签″指的是有效连接于探针5’末端的部分(例如图1的R)，并因该标签与捕获元件之间存在吸引力而特异性结合捕获元件，且其中所述标签与捕获元件之间的特异性结合仅在探针二级结构发生改变(例如，使得标签可以被捕获元件接近)时才出现。当涉及″标签″和捕获元件时，″特异性结合″指的是通过形成共价键或氢键或静电相互作用或通过，例如，蛋白质和配体之间、抗体和抗原之间、蛋白质亚基之间或核酸结合蛋白和核酸结合位点之间的相互作用。标签不干扰探针退火至靶核酸的能力。标签包括但不限于生物素、生物链菌素、抗生物素蛋白抗体、抗原、半抗原、蛋白质或具有化学反应性的部分。本文所述的″标签″可结合本文所述的″捕获元件″。根据本发明，″标签″和″捕获元件″作为结合对起作用。例如，在一个实施方式中，如果标签是生物素，则相应的捕获元件是抗生物素蛋白。或者，在另一实施方式中，如果标签是抗体，则相应的捕获元件是抗原。
本发明预期了包含结合部分的″探针″、包含本文所述的″标签″的″探针″、和既包括结合部分又包括″标签″的″探针″，所述结合部分是探针上的区域(例如结合捕获元件的核酸序列)，其在探针被核酸酶切割后被释放。
在本发明中，″捕获元件″指的是例如通过化学交联或共价键附着于固相基材的物质，其中所述物质因结合部分与捕获元件之间存在吸引力而(例如，通过形成氢键或通过核酸结合蛋白与核酸结合位点之间或互补核酸之间的相互作用)特异性结合于结合部分，且其中所述结合部分与捕获元件之间的特异性结合仅在包含所述结合部分的探针的二级结构发生本文中所定义的″改变″时才出现。捕获元件包括但不限于核酸结合蛋白或核苷酸序列。
在本发明中，″捕获元件″还指例如通过化学交联或共价键附着于固相基材的物质，其中所述物质因标签与捕获元件之间存在吸引力而(例如，通过形成共价键或氢键或静电吸引或通过蛋白质和配体之间、抗体和抗原之间、蛋白质亚基之间或核酸结合蛋白和核酸结合位点之间或互补核酸之间的相互作用)特异性结合于标签，且其中所述标签与捕获元件之间的特异性结合仅在包含所述标签的探针的二级结构发生本文中所定义的″改变″时才出现。捕获元件包括但不限于生物素、抗生物素蛋白、生物链菌素、抗体、抗原、半抗原、蛋白质或具有化学反应性的部分。本文所述的″标签″可结合本文所述的″捕获元件″。根据本发明，″标签″和″捕获元件″作为结合对起作用。例如，在一个实施方式中，如果标签是生物素，则相应的捕获元件是抗生物素蛋白。或者，在另一实施方式中，如果捕获元件是抗体，则相应的标签是抗原。
在本发明中，″固相支持物″指的是分子(例如捕获元件)可与之不可逆结合的表面，包括但不限于膜、琼脂糖珠、磁珠、组织培养板、基于二氧化硅的基质、基于膜的基质、包含表面的珠包括但不限于苯乙烯、乳胶或基于二氧化硅的材料和其他聚合物例如醋酸纤维素、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、尼龙、硝化纤维素、聚酯、碳酸酯、聚砜、金属、沸石、纸、氧化铝、玻璃、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚酰胺、塑料、滤纸、葡聚糖、锗、硅、(聚)四氟乙烯、砷化镓、磷化镓、二氧化硅、硝酸硅及其组合。附着本文所述的捕获元件的方法是本领域熟知的并在下文描述。其他的固相支持物在下文讨论。
在本发明中，″亲和对″指的是如下一对部分(例如互补核酸序列、蛋白质-配体、抗体-抗原、蛋白质亚基、和核酸结合蛋白结合位点)，所述一对部分因它们之间存在吸引力所以能够可逆性结合。″亲和对″结合部分与相应的捕获元件的组合以及标签与相应的捕获元件的组合。
在包含能够彼此可逆性相互作用的互补核酸区域的亲和对的实施方式中，所选择的靶核酸结合序列的长度以及包含亲和对的核酸序列使得探针在所进行的杂交测定的条件下具有合适的热力学功能。杂交测定领域的人员能够理解有关的条件包括探针、靶和溶质浓度、检测温度、存在的变性剂和体积排阻剂、以及其他杂交影响因素。靶核酸结合序列的长度范围可以是7至大约10,000个核苷酸、优选地8-5000、9-500、9-250、且最优选地10至140个核苷酸。如果所述探针也是等位基因区分探针，则长度更加有限，见下文(本句话在逻辑上从结合部分：捕获元件概念跳跃至探针：靶概念)。
在包含能够彼此可逆性相互作用但不能与靶核酸杂交或不与靶核酸互补的互补核酸区域的亲和对的实施方式中，亲和对的互补核酸区域序列应该具有足够的长度，以便在测定条件和检测温度下，当探针未结合于靶时，探针的结构使得探针的结合部分不会结合捕获元件，例如，互补核酸序列发生结合。根据所采用的测定条件，长度为3-25个核苷酸的互补核酸序列可实现这一功能。4-15个以及更加优选地5-11个核苷酸的中间范围通常是合适的。参考靶核酸结合序列来选择实际的长度，以便当探针在以下温度未结合于靶核酸时，探针的二级结构是稳定的，所述温度是包含结合于靶核酸的探针的切割结构被切割的温度。随着靶核酸结合序列的大小增加至100个核苷酸，互补核酸序列的长度可增加至15-25个核苷酸。对于超过100个核苷酸的靶核酸结合序列，互补核酸序列的长度不需要进一步增加。如果所述探针也是等位基因区分探针，则互补核酸序列的长度更加有限，见下文。
不与与靶核酸互补序列相比含有一或多个核苷酸错配的靶样核酸序列充分杂交的等位基因区分探针需要被设计为使得，在所使用的测定条件下，仅当靶核酸互补序列找到完全互补的靶序列时，才会在特定反应条件下发生探针二级结构的降低或消失以及与靶核酸杂交。特定反应条件可包括，例如，经实验优化而确定的特定温度或温度范围，所述温度或温度范围允许等位基因区分探针能够区分靶序列和具有至少一个单个核苷酸差别的靶样序列。
在一个实施方式中，本发明的″等位基因区分探针″指的是这样的探针，其与与靶核酸相比具有至少一个核苷酸的变异的靶样核酸序列杂交，其中所述变异的核苷酸不位于等位基因区分位点。根据本发明的这一实施方式，″等位基因区分探针″在特定反应条件下不能有效地结合在等位基因区分位点内还具有至少一个核苷酸的变异的靶样核酸序列。特定反应条件可包括，例如，经实验优化而确定的特定温度或温度范围，所述温度或温度范围允许等位基因区分探针能够区分靶序列和具有至少一个单个核苷酸差别的靶样序列。
在本发明的一个实施方式中，本发明的等位基因区分探针优选地包含6-25个核苷酸的靶核酸结合序列，优选地7-25个核苷酸，和3-8个核苷酸的互补核酸序列。二级结构和探针-靶杂交体的鸟嘌呤核苷-胞嘧啶核苷含量、盐和测定温度均需考虑，例如镁盐具有强稳定作用，对于设计短的等位基因区分探针特别重要。
如果等位基因区分探针要具有长度为大约50个核苷酸的靶核酸结合序列，待区分的单个核苷酸错配在所设计的序列中应该出现在靶核酸互补序列的中间或其附近。例如，包含长度为21个核苷酸的序列的探针应该优选地被设计为使得错配出现在对应着靶核酸互补序列的位于最中间的14个核苷酸之一处，更优选地出现在对应着位于最中间的7个核苷酸之一处。设计探针使得待区分的错配出现在靶核酸结合序列/靶样核酸结合序列的中间或其附近，这被认为可改善等位基因区分探针的表现。
在本发明中，提到结合部分被捕获元件捕获或标签被捕获元件捕获时，“捕获”指的是通过形成氢键、共价键或通过例如蛋白质与配体之间、抗体与抗原之间、蛋白质亚基之间、核酸结合蛋白与核酸结合位点之间、或互补核酸之间的相互作用而特异性结合，其中相互作用对的一个成员附着于固相支持物。在稳定捕获的条件下，结合导致形成异二聚体，在合适的条件下，其具有的解离常数(KD)为至少大约1x103M-1、通常至少1x104M-1、典型地至少1x105M-1、优选地至少1x106M-1至1x107M-1或更高。用于进行本文所述的捕获元件和本文所述的结合部分或标签之间的结合反应的方法是本领域熟知的并在下文描述。将本发明的捕获元件附着于本文所述的固相支持物的方法是本领域熟知的并在下文描述。
在本发明中，″野生型″指的是具有分离自天然来源的基因或基因产物的特征(即，具有基因的序列或编码或具有酶的序列或活性)的基因或基因产物。
核酸酶和切割结构
在本发明中，″核酸酶″或″切割剂″指的是这样的酶，其特异于，即切割，本发明的切割结构，而不特异于，即基本上不切割，未与靶核酸杂交的探针或引物、或未与探针或引物杂交的靶核酸。术语″核酸酶″包括具有5’核苷酸内切活性的酶，例如DNA聚合酶，如来自大肠杆菌的DNA聚合酶I和来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)和黄栖热菌(Thermus flavus)(TfI)的DNA聚合酶。术语核酸酶还包括FEN核酸酶。术语″FEN核酸酶″包括具有5’外切核酸酶和/或内切酶活性的酶。术语″FEN核酸酶″还包括5’活瓣特异性核酸酶。本发明的核酸酶或切割剂包括但不限于来自Archaeglobus fulgidus、詹氏甲烷球菌、强烈炽热球菌、人、小鼠或爪蟾(Xenopus laevis)的FEN核酸酶。本发明的核酸酶还包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RAD27和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)RAD2、Pol I DNA聚合酶相关的5’至3’外切核酸酶结构域(例如大肠杆菌、水生栖热菌(Taq)、黄栖热菌(TfI)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)(Bca)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae))和FEN的噬菌体功能同源物，包括但不限于T55′到3′外切核酸酶、T7基因6外切核酸酶和T3基因6外切核酸酶。优选情况下，仅使用Taq、Tfl和Bca FEN核酸酶的5′到3′外切核酸酶结构域。术语“核酸酶”不包括核糖核酸酶H。
本发明的″5’活瓣特异性核酸酶″(在此也称为″活瓣特异性核酸酶″)是内切酶，其能够除去作为5’单链而突出的单链活瓣。在本发明的一个实施方式中，本发明的活瓣特异性核酸酶还可切割假Y结构。本发明的活瓣特异性核酸酶的底物包括本文所述的靶核酸和寡核苷酸探针，它们包括与靶核酸互补的区域。在另一实施方式中，本发明的活瓣特异性核酸酶的底物包括本发明的靶核酸、与靶核酸互补的上游寡核苷酸和下游探针，其包括与靶核酸互补的区域。在一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。在另一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸上的邻近区域杂交。
在本发明中，″邻近″指的是被少于20个核苷酸，例如，15个核苷酸、10个核苷酸、5个核苷酸、或0个核苷酸分开。
本发明的活瓣特异性核酸酶的底物还包括靶核酸、第二核酸(其中的一部分与靶核酸特异性杂交)和来自与靶核酸特异性杂交的第三核酸的引物延伸产物。
在本发明中，″切割结构″指的是多核苷酸结构(例如图1所示)，其至少包括具有单链区域的双链体核酸，所述单链区域包括活瓣、环、单链泡(single-stranded bubble)、D-环、切口或缺口。本发明的切割结构因此包括多核苷酸结构，其包括分叉核酸的活瓣链，其中5’单链多核苷酸活瓣从其与所述结构的双链部分的接合处附近的位置伸出，且优选地所述活瓣标记了可检测标记物。本发明的切割结构的活瓣优选地为大约1-10,000个核苷酸、更优选地大约5-25个核苷酸、且更优选地大约10-20个核苷酸，且优选地，被切割的位置是位于分叉结构的″肘弯″处的磷酸酯或是位于活瓣链肘弯的近端和/或远端的一至十个磷酸酯中的任一磷酸酯。在本发明中，″肘弯″指的是位于5’活瓣的第一个单链核苷酸和第一个双链(例如，与靶核酸杂交的)核苷酸之间的磷酸酯键。在一个实施方式中，切割结构的活瓣不能与靶核酸杂交。
在本发明中，如果上游寡核苷酸(例如，引物)的一或多个核苷酸和下游寡核苷酸(例如，探针)均与靶的同一区域互补，则切割结构被称为是″重叠″或″侵入型″的。在这一实施方式中，这两种寡核苷酸将竞争结合靶的同一区域。
在本发明中，如果上游寡核苷酸和下游寡核苷酸不与靶的同一区域互补，则切割结构被称为是″非重叠″或″非侵入型″的。在这一实施方式中，当这两种寡核苷酸与靶核酸杂交时，这两种寡核苷酸将不会竞争与靶杂交。
本文中所用的“缺口(gap)”是指位于上游寡核苷酸/引物的3′端互补核苷酸和下游寡核苷酸的最5′端的互补核苷酸之间的至少1个核苷酸(例如0-2个核苷酸、2-20个核苷酸、20-50个核苷酸或多于50个核苷酸)的一部分靶。
本文中所用的“切口(nick)”是指上游寡核苷酸/引物和下游寡核苷酸直接毗邻时，位于上游寡核苷酸/引物的3′端互补核苷酸和下游寡核苷酸最5′端的互补核苷酸之间的一部分靶。当上述寡核苷酸不重叠并且它们之间不存在缺口，例如它们之间有0个核苷酸(即直接毗邻)时，即存在切口。
根据本发明的一个实施方式的切割结构优选地包含靶核酸，且还可包括本发明的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针通过互补于靶核酸的一或多个区域与靶核酸特异性杂交，以及从杂交的寡核苷酸探针伸出的活瓣。在本发明的另一实施方式中，切割结构包含靶核酸(例如图4的B)、与靶序列互补的上游寡核苷酸(例如图4的A)、和包含互补于靶序列的一或多个区域的本发明的下游寡核苷酸探针(例如图4的C)。在一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。在另一实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的邻近区域杂交。
本发明的切割结构可以是包含活瓣的多核苷酸结构，所述活瓣从本发明的下游寡核苷酸探针伸出，其中所述活瓣是通过由核酸聚合酶的合成活性导致上游寡核苷酸延伸、以及下游寡核苷酸的5’末端随后部分脱离而形成的。在这一切割结构中，下游寡核苷酸的3’末端可被封闭，以防止下游寡核苷酸的3’末端的延伸。
可通过靶核酸与寡核苷酸探针杂交而形成根据本发明的一个实施方式的切割结构，其中所述寡核苷酸探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，且所述探针还包括结合部分和与靶核酸退火的互补区、以及不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补区域。
切割结构也可以是假Y结构，其中如果活瓣上游的链(在此称为活瓣邻近链或引物链)不存在且双链DNA底物含有缺口或切口，则形成假Y结构。在本发明中，″切割结构″不包括仅具有3’单链活瓣的双链核酸结构。在本发明中，″切割结构″包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，因此可以是RNA或DNA。
本发明的切割结构可以是重叠活瓣，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸的3’末端(例如图4的A)与退火至靶核酸的本发明的下游寡核苷酸探针的1个碱基对(例如图4的C)相同，且其中所述重叠位于单链活瓣伸出位置的直接下游。
通过如下步骤形成根据本发明的一个实施方式的切割结构：1.在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下温育a)上游3’末端、优选地寡核苷酸引物，b)寡核苷酸探针，其位于上游引物的下游不超过10,000个核苷酸并包括至少一个可检测标记物，c)合适的靶核酸，其中靶序列与上游引物和下游探针均至少部分互补，和d)合适的缓冲液；和2.通过聚合酶的合成活性延伸上游寡核苷酸引物3’末端，例如，RT，使得新合成的上游寡核苷酸引物3’端邻近下游寡核苷酸探针5’端和/或置换下游寡核苷酸探针5’端的至少一部分(即，至少1-10个核苷酸)。根据本发明的方法，缓冲液和延伸温度利于通过本发明的特定核酸聚合酶进行链置换。优选地，下游寡核苷酸的3’末端被封闭以防止下游寡核苷酸的3’末端延伸。
在本发明的另一实施方式中，可通过温育靶核酸和具有至少一个可检测标记物的寡核苷酸探针而制备本发明的切割结构，所述寡核苷酸探针还包含不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补5’区域以及与靶核酸退火的互补3’区域。
在本发明的另一实施方式中，可通过温育靶核酸与下游寡核苷酸探针和上游寡核苷酸引物而制备本发明的切割结构，所述下游寡核苷酸探针具有的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变，所述下游寡核苷酸探针还包含结合部分和不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补5’区域以及与靶核酸退火的互补3’区域。在一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。在另一实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的邻近区域杂交。
在本发明的另一实施方式中，通过如下步骤形成切割结构：1.在允许核酸序列与寡核苷酸探针杂交并允许启动子区域结合RNA聚合酶的条件下温育a)寡核苷酸探针，其位于启动子区域的下游不超过10,000个核苷酸并包括至少一个可检测标记物，b)合适的靶核酸，其中靶序列包含启动子区域并与下游探针均至少部分互补，和c)合适的缓冲液；和2.通过RNA聚合酶的合成活性合成RNA，使得所合成的RNA的新合成3’端邻近下游寡核苷酸探针5’端和/或置换下游寡核苷酸探针5’端的至少一部分(即，至少1-10个核苷酸)。根据本发明的方法，缓冲液和延伸温度利于通过本发明的RNA聚合酶进行链置换。优选地，下游寡核苷酸的3’末端被封闭以防止下游寡核苷酸的3’末端延伸。
在本发明的一个优选的实施方式中，切割结构是标记的。通过如下步骤形成根据本发明的一个实施方式的标记的切割结构：1.在允许核酸序列与引物杂交的条件下温育a)上游3’末端可延伸的引物，例如，寡核苷酸引物，b)标记的探针，其具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，且所述探针还包括结合部分，所述探针位于上游引物的下游不超过10,000个核苷酸且更优选地不超过500个核苷酸，c)合适的靶核酸，其中靶序列与引物和标记的探针均互补，和d)合适的缓冲液；以及，在本发明的一个实施方式中，2.通过聚合酶的合成活性延伸上游引物3’末端，使得新合成的上游引物3’末端部分置换下游探针5’末端。根据本发明的方法，缓冲液和延伸温度利于通过本发明的特定核酸聚合酶进行链置换。优选地，下游寡核苷酸的3’末端被封闭以防止下游寡核苷酸的3’末端延伸。在一个实施方式中，上游引物和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。
在另一实施方式中，可通过温育靶核酸和探针而制备本发明的切割结构，所述探针具有的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变，所述探针还包含结合部分和不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域以及与靶核酸退火的互补3’区域。在另一实施方式中，可通过温育靶核酸与下游探针和上游寡核苷酸引物而制备本发明的切割结构，所述下游探针具有的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变，所述探针还包含结合部分和不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域以及与靶核酸退火的互补3’区域。在一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。在另一实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的邻近区域杂交。
在本发明中，″产生信号″、″产生可检测信号″或″可检测信号″指的是检测或测定从切割结构释放出的释放的核酸片段，所述释放的核酸片段表明样品中存在靶核酸。在一个实施方式中，产生信号也指的是检测或测定释放的核酸片段，所述释放的核酸片段是通过结合部分与固相支持物上的捕获元件的结合而捕获的。在另一实施方式中，″产生信号″、″产生可检测信号″或″可检测信号″也指的是检测或测定(例如，通过FRET测定)标记的探针(例如，下游抗切割探针)被切割后的荧光信号。
在本发明中，″可检测信号″是高于对照信号的信号，可通过本领域人员已知的标准统计学方法而确定。最优选地，″可检测信号″明显高于背景，例如，高于合适的背景或对照信号两倍或更高。例如，如果用抗切割探针进行反应，可检测信号(例如，在一对相互作用的标记物之间切割)是高于阴性对照(例如，未切割探针或在两个相互作用的标记物的下游切割导致标记物没有分开)两倍或更高的信号。优选地，可检测信号高于对照信号2、3、4、5、6、7、8、9、10、20或更多倍。本文描述了测定本发明的可检测信号的方法，其中包括FRET和荧光猝灭测定。
在本发明中，″样品″指的是含有或推测含有感兴趣的核酸(靶核酸)的任何物质或其本身是含有或推测含有感兴趣的靶核酸的核酸。术语″样品″因此包括样品核酸(基因组DNA、cDNA、RNA)、细胞、生物体、组织、体液，或物质，包括但不限于，例如，血浆、血清、脑脊液、淋巴液、滑膜液、尿液、泪液、粪便、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养物成分的样品、天然分离物(例如饮用水、汗水、固体物质)、微生物标本和已经用核酸示踪剂分子“标记”的物体或标本。
在本发明中，″靶核酸″或″模板核酸序列″指的是要被复制、扩增和/或检测的核酸区域。在一个实施方式中，″靶核酸″或″模板核酸序列″存在于用于扩增的两种引物序列之间。
在某些实施方式中，″靶核酸″在3’至5’方向包含第一区域、延伸区域和第二区域，所述第一区域与第一寡核苷酸的至少一部分互补，而所述第二区域与第二寡核苷酸的至少一部分互补。靶核酸可包括单链或双链DNA或RNA。
在本发明中，″第一区域″当涉及的是靶核酸时，指的是足以允许上游寡核苷酸(例如，引物)杂交的一段长度的核苷酸，其中“第一区域”与本文所述的上游寡核苷酸至少部分互补。“第一区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最优选范围是10-25个核苷酸。
在本发明中，″延伸区域″指的是足以允许寡核苷酸(例如，上游寡核苷酸)通过核酸聚合活性得以延伸的一段长度的核苷酸。“延伸区域”的长度范围是约1个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约1-100个核苷酸，更优选范围是3-50个核苷酸，最优选范围是5-10个核苷酸。″延伸区域″的长度足以使得本发明的切割剂不切割下游寡核苷酸(例如，探针)，除非上游引物已经通过互补于延伸区域的核酸的聚合而被延伸至使得引物的3’端足够靠近下游寡核苷酸(即，与第二区域杂交)，以致允许活瓣(即下游寡核苷酸的5’部分)被切割剂切割。
在本发明中，″第二区域″当涉及的是靶核酸时，指的是足以允许下游寡核苷酸(例如，探针)杂交的一段长度的核苷酸，其中“第二区域”与本文所述的下游寡核苷酸至少部分互补。″第二区域″的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最优选范围是10-25个核苷酸。
在本发明中，″核酸聚合酶″指的是催化三磷酸核苷聚合的酶。一般而言，所述酶将在退火到靶序列上的引物的3′端启动合成，并沿模板的5′-方向前进，如果还具有5′到3′的核酸酶活性，所述酶会水解插入的退火探针，释放标记的探针片段和未标记的探针片段，直到合成终止。已知的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶。术语″核酸聚合酶″也包括RNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，“核酸聚合酶”则指RNA依赖的聚合活性，例如反转录酶。
已知的反转录酶包括，例如：Moloney小鼠白血病病毒(Moloney MurineLeukemia Virus，M-MLV)RT、人类免疫缺陷病毒(HIV)RT、禽类造白细胞组织增生肉瘤病毒(Avian Sarcoma-Leukosis Virus，ASLV)RT、劳斯肉瘤病毒(RSV)RT、禽髓母细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus，AMV)RT、禽成红细胞增生病毒(Avian Erythroblastosis Virus，AEV)辅助病毒MCAV RT、禽髓细胞瘤病病毒(Avian Myelocytomatosis Virus)MC29辅助病毒MCAV RT、禽网状内皮组织增生病毒(Avian Reticuloendotheliosis Virus，REV-T)辅助病毒REV-A RT、禽肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV RT、禽肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV RT、劳斯相关病毒(RAV)RT、和禽白血病病毒(MAV)RT。
在本发明中，术语″RNA聚合酶″指的是催化聚合RNA分子的酶。RNA聚合酶包括DNA依赖的RNA聚合酶和RNA依赖的RNA聚合酶。适合用于本发明的RNA聚合酶包括噬菌体T7、T3和SP6RNA聚合酶、大肠杆菌RNA聚合酶全酶、大肠杆菌RNA聚合酶核心酶、和人RNA聚合酶I、II、III、人线粒体RNA聚合酶和来自HCV的NS5B RNA聚合酶。
在本发明中，″5’至3’外切核酸酶活性″或″5’→3’外切核酸酶活性″指的是模板特异性核酸聚合酶的活性，例如通常与某些DNA聚合酶相关的5’→3’外切核酸酶活性，其中以顺序的方式自多核苷酸的5’末端去除单核苷酸或寡核苷酸(即，大肠杆菌DNA聚合酶I具有这一活性，而Klenow(Klenow et al.，1970，Proc.Natl.Acad.ScL.USA，65：168)片段则不具有(Klenow et al.，1971，Eur.J.Biochem..22：371))，或通过可能是5’至3’外切核酸酶活性的内在核苷酸内切活性从5’末端去除多核苷酸。
在本发明中，术语″基本上缺乏5’至3’外切核酸酶活性″或″基本上缺乏5’→3’外切核酸酶活性″指的是活性低于野生型酶活性的10％、5％、1％、0.5％、或0.1％。术语″缺乏5’至3’外切核酸酶活性″或″缺乏5’→3’外切核酸酶活性″指的是检测不到5’至3’外切核酸酶活性或活性低于野生型酶的5’至3’外切核酸酶活性的1％、0.5％、或0.1％。
为了检测结构特异性核苷酸内切活性，使用由活瓣结构组成的DNA模板，其中所述下游活瓣寡核苷酸的5’末端被放射性标记。使用DNA聚合酶在存在各种dNTP的情况下进行反应(以延伸上游引物)。凝胶电泳观察放射性标记的切割产物(Lyamichev et al.，1993，Science 260：778)。
或者，使用具有切口的均一标记的双链DNA测定DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性。在存在或不存在dNTP情况下测定由DNA聚合酶释放的放射性(TCA可溶性cpm)。具有5’-3’外切核酸酶活性的非校正DNA聚合酶被存在dNTP时出现的伴随聚合刺激10倍或更高(存在dNTP时释放的cpm的增加)。具有3’-5’外切活性的校正DNA聚合酶被存在dNTP时出现的伴随聚合完全抑制(存在dNTP时释放的cpm的降低)(美国专利No.：5,352,778)。
可用于本发明的核酸酶包括任何具有5’核苷酸内切活性的酶，例如DNA聚合酶，例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶I和来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)和黄栖热菌(TfI)的DNA聚合酶。可用于本发明的核酸酶还包括具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，包括但不限于真细菌DNA聚合酶I，包括来自栖热菌的酶(Taq、TfI、Tth、Tea(caldophilus)Tbr(brockianus))、来自芽孢杆菌的酶(Bst、Bca、Magenta(全长聚合酶，NOT N-截短形式))、来自栖热袍菌的酶(Tma(海栖热袍菌、Tne(neopolitana))和大肠杆菌DNA聚合酶I。术语核酸酶还包括FEN核酸酶。额外的可用于本发明的核酸聚合酶见下文标题为″核酸聚合酶″的部分。
在本发明中，″切割″指的是将切割结构酶性分开为不同的(即不与其他片段或核酸通过磷酸二酯键在物理上相连)片段或核苷酸以及从切割结构释放的片段。例如，切割标记的切割结构指的是将如下所述的本发明的标记的切割结构分开为不同的片段，包括来自与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸的片段或其中所述不同的片段中的一个是来自靶核酸的标记的核酸片段和/或来自与靶核酸特异性杂交的寡核苷酸的标记的核酸片段，可通过本领域已知的且在本文描述的适合检测存在于标记的片段上的标记部分的方法来检测和/或测定它们。
在本发明中，″内切酶″指的是切割核酸分子内的键、优选地磷酸二酯键的酶。本发明的内切酶可特异于单链或双链DNA或RNA。
在本发明中，″外切核酸酶″指的是从多核苷酸的末端逐个切割核苷酸之间的键、优选地磷酸二酯键的酶。本发明的外切核酸酶可特异于DNA或RNA分子的5’或3’末端，且在此称为5’外切核酸酶或3’外切核酸酶。
在本发明中，″切割工具″指的是特异切割本发明的切割结构的因子，优选为酶。
在本发明中，″活瓣″指的是从双链核酸分子延伸出的单链DNA区域。本发明的活瓣优选地具有大约1-10,000个核苷酸，更优选地大约5-25个核苷酸，更优选地大约10-20个核苷酸。
在一个优选的实施方式中，结合部分是标签。
在另一个优选的实施方式中，结合部分是结合捕获元件的核酸序列。
本发明还提供检测或测定靶核酸的方法，其包括如下步骤：通过温育含有靶核酸的样品与探针形成切割结构，所述探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，所述探针还包含结合部分；用核酸酶切割切割结构以释放核酸片段，其中切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的；以及检测和/或测定代表所述样品中存在靶序列的片段的量，所述片段通过以结合部分结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获。
在本发明中，″检测靶核酸″或″测定靶核酸″指的是确定样品中的特定靶核酸的存在或确定样品中的特定靶核酸的量，作为代表样品中存在靶核酸的指示。可被测定或检测到的靶核酸的量优选地为大约1个分子至1020个分子，更优选地大约100个分子至1017个分子，更优选地大约1000个分子至1014个分子。根据本发明的一个实施方式，所检测的核酸来自本发明的切割结构的下游探针的标记的5’末端(例如图4的C)，其通过本发明的切割结构的上游探针的3’延伸而从靶核酸被置换(例如图4的A)。根据本发明，标记物附着于包含本发明的切割结构的下游探针的5’末端(例如图4的C)。或者，标记物附着于下游探针的3’末端，而猝灭剂附着于下游探针的5’活瓣。根据本发明，标记物可附着于包含本发明的切割结构的下游探针的3’末端(例如图4的C)。
根据本发明，下游探针(例如图4的C)可以是内部标记的。在一个优选的实施方式中，可通过温育靶核酸与探针而制备本发明的切割结构，所述探针具有的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变，所述探针还包含不与靶核酸退火而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域以及与靶核酸退火的互补3’区域。根据本发明的这一实施方式，所检测的核酸来自探针的标记的5’活瓣区域。优选地，靶核酸的量与被切割并检测的核酸所产生的信号之间具有直接的相关性。
在另一实施方式中，探针标记了一对相互作用的标记物(例如，FRET对或非FRET对)，它们被放置为允许所述标记物在寡核苷酸探针解折叠(例如，由于探针二级结构的改变)或水解过程中被分开。在本发明中，″检测被固相支持物上的捕获元件所捕获的片段的量″或″测定被固相支持物上的捕获元件所捕获的片段的量″或″检测被固相支持物上的捕获元件所捕获的片段的量″或″测定被固相支持物上的捕获元件所捕获的片段的量″指的是确定样品中标记的或非标记的片段的存在或确定样品中标记的或非标记的片段的量。可使用已知的和本文所述的方法来检测或测定结合于固相支持物上的捕获元件的标记的或非标记的片段的释放，或在标记的或非标记的片段从固相支持物上的捕获元件释放之后来检测或测定。本文所述的检测方法可有效用于检测片段，其中可检测任意量的片段，无论其在反应所产生的片段中占据的比例是大还是小。检测或测定标记的片段的释放的方法应该适合测定或检测存在于结合于固相支持物上的捕获元件上的标记的片段的标记部分。检测或测定非标记的片段的释放的方法包括，例如，根据本领域熟知的方法进行凝胶电泳或通过杂交。当检测到最少1或2个分子(且可多达1或2百万个，例如10个、100个、1000个、10,000个、1百万个分子)的释放的片段时，本文所述的检测方法是有效的。
在本发明中，″标记的片段″指的是来自本发明的标记的切割结构的切割的单核苷酸或小寡核苷酸或寡核苷酸，其中所述切割的寡核苷酸优选地为大约1-1000个核苷酸，更优选地为大约5-50个核苷酸，更优选地为大约16-18个核苷酸，它们被核酸酶从切割结构上切下，并可通过本领域已知的和本文所述的方法检测。在一个实施方式中，探针是双分子或多分子探针，其中包括探针的第一分子标记了荧光团而包括探针的第二分子标记了猝灭剂。在本发明中，″亚探针″和″亚猝灭剂″指的是根据本发明的双分子或多分子探针的标记了荧光团的第一分子和根据本发明的双分子或多分子探针的标记了猝灭剂的第二分子。根据这一实施方式，在双分子或多分子探针结合于靶核酸并被核酸酶切割之后，亚探针与亚猝灭剂彼此解离(即亚探针与亚猝灭剂之间的距离增加)，且亚探针和亚猝灭剂的这种解离和随后的分开导致产生信号。
在一个优选的实施方式中，结合部分是标签。
在另一个优选的实施方式中，结合部分是核酸序列，其结合捕获元件。
在一个优选的实施方式中，所述方法还包括核酸聚合酶。
在另一个优选的实施方式中，切割结构还包括5’活瓣。
在另一个优选的实施方式中，切割结构还包括寡核苷酸引物。
在另一个优选的实施方式中，二级结构选自茎环结构、发夹结构、内环、凸环、分叉结构、假结结构或三叶草型结构。
在另一个优选的实施方式中，核酸酶是FEN核酸酶。
在另一个优选的实施方式中，FEN核酸酶选自来自Archaeglobus fulgidus、詹氏甲烷球菌、强烈炽热球菌、人、小鼠或爪蟾的FEN核酸酶。本发明的核酸酶还包括酿酒酵母RAD27和粟酒裂殖酵母RAD2、Pol I DNA聚合酶相关的5’至3’外切核酸酶结构域(例如大肠杆菌、水生栖热菌(Taq)、黄栖热菌(TfI)、热坚芽孢杆菌(Bca)、肺炎链球菌)和FEN的噬菌体功能同源物，包括但不限于T5 5′到3′外切核酸酶、T7基因6外切核酸酶和T3基因6外切核酸酶。
优选地，仅使用Taq、TfI和Bca FEN核酸酶的5’至3’外切核酸酶结构域。
在另一个优选的实施方式中，探针还包括报道剂。
在另一个优选的实施方式中，报道剂包括标签。
在另一个优选的实施方式中，通过标签结合于捕获元件而捕获片段。
在另一个优选的实施方式中，形成的切割结构包括至少一种能够产生信号的标记部分。
在另一个优选的实施方式中，形成的切割结构包括一对产生相互作用信号的标记部分，它们被有效地放置在探针上以便当探针未结合于靶核酸时猝灭产生的可检测信号。
在另一个优选的实施方式中，标记部分被易于被核酸酶切割的位点分开，由此允许核酸酶的核酸酶活性通过在易于被核酸酶切割的位点进行切割而将产生第一相互作用信号的标记部分与产生第二相互作用信号的标记部分分开，由此产生产生可检测信号。
存在上述一对产生相互作用信号的标记部分将允许区分可结合捕获元件的退火的未切割探针与结合于捕获元件的释放的标记片段。
在另一个优选的实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
本发明还提供用于检测样品中的靶核酸的聚合酶链反应方法。该方法包括：提供包含探针的切割结构，所述探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变且所述探针还包含结合部分；一组寡核苷酸引物，其中第一引物含有与靶核酸的一条链上的区域互补的序列并引发合成互补DNA链，而第二引物含有与靶核酸的第二条链上的区域互补的序列并引发合成互补DNA链。该方法还包括使用核酸聚合酶作为模板依赖性聚合剂在允许进行如下PCR循环步骤的条件下扩增靶核酸：(i)扩增所需的引物与靶核酸内所含的模板核酸序列退火，(ii)延伸引物，条件是核酸聚合酶合成引物延伸产物，和(iii)使用核酸酶作为切割剂来切割切割结构，以便从切割结构释放标记的片段，由此产生可检测的标记片段。根据这一方法，切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下第二引物的二级结构在未结合于靶核酸时是稳定的。检测和/或测定通过结合部分结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获的释放的标记片段的量，作为代表所述样品中存在靶序列的指示。
在本发明中，″寡核苷酸引物″指的是单链DNA或RNA分子，其能够与核酸模板杂交并引发酶促合成第二核酸链。可用于本发明的寡核苷酸引物的长度为大约6-100个核苷酸，优选地大约17-50个核苷酸，更优选地大约17-45个核苷酸。可用于形成本发明的切割结构的寡核苷酸探针的长度为大约17-40个核苷酸，优选地大约17-30个核苷酸，更优选地大约17-25个核苷酸。
在本发明中，″模板依赖性聚合剂″指的是，在存在足量的四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和dTTP)或本文所述的类似物，并在包括合适的盐、金属阳离子、合适的稳定剂以及pH缓冲体系的反应介质内，能够延伸寡核苷酸引物的酶。模板依赖性聚合剂是已知能够催化引物依赖性和模板依赖性DNA合成并具有5’至3’核酸酶活性的酶。优选地，本发明的模板依赖性聚合剂缺乏5’至3’核酸酶活性。
在本发明中，″扩增″指的是产生额外拷贝的核酸序列，包括聚合酶链反应方法。
在一个优选的实施方式中，核酸酶是FEN核酸酶。
在一个优选的实施方式中，结合部分是标签。
在另一个优选的实施方式中，结合部分是核酸序列，其结合捕获元件。
在另一个优选的实施方式中，步骤b的寡核苷酸引物被如此定位，使得正向引物位于切割结构上游，而反向引物位于切割结构下游。
在另一个优选的实施方式中，核酸聚合酶具有链置换活性。
展现出链置换活性并可用于本发明的核酸聚合酶包括但不限于具有″温度活化的″链置换活性的古细菌DNA聚合酶(Vent、Deep Vent、Pfu、JDF-3、KOD(LTI的商品名Pfx)、Pwo、9 degrees North、Thermococcus aggregans、Thermococcus gorgonarius的exo+形式和exo-形式)，和具有链置换活性的真细菌DNA聚合酶(exo-Bst、exo-Bca、Genta、Klenow片段、exo-Klenow片段、exo-T7 DNA聚合酶(Sequenase)。
在另一个优选的实施方式中，核酸聚合酶具有热稳定性。
在另一个优选的实施方式中，核酸酶具有热稳定性。
在本发明中，″热稳定″指的是，一种酶与例如具有类似活性的非热稳定形式的酶相比，其在温度高达优选地为大约90-100℃且更优选地为大约70-98℃时对热是稳定的并具有活性。例如，与来自大肠杆菌的核酸聚合酶或哺乳动物FEN酶相比，来自嗜热性生物体例如强烈炽热球菌、詹氏甲烷球菌、A.fulgidus或P.horikoshii的热稳定核酸聚合酶或FEN核酸酶在高温下更加稳定且具有更高活性。美国专利4,889,818描述了一种分离自水生栖热菌的代表性热稳定核酸聚合酶(Taq)，Saiki等人，1988，Science 239：487描述了一种在常规PCR中使用该酶的方法。Lundberg等人，1991，Gene，108：1-6描述了另一种分离自强烈炽热球菌(Pfu)的代表性热稳定核酸聚合酶。其他的代表性温度稳定型聚合酶包括例如提取自嗜热细菌黄栖热菌、红栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(其最适温度比其他列出的细菌略低)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermus rubens)、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)或提取自嗜热古细菌Thermococcus litoralis和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)的聚合酶。
温度稳定型聚合酶和FEN核酸酶优选用于热循环方法，其中双链核酸在PCR循环中暴露于高温下(约95℃)发生变性。
在另一个优选的实施方式中，核酸酶是活瓣特异性核酸酶。
在另一个优选的实施方式中，探针还包括报道剂。
在另一个优选的实施方式中，报道剂包括标签。
在另一个优选的实施方式中，通过所述标签结合于捕获元件而捕获所述片段。
在另一个优选的实施方式中，形成的切割结构包括至少一种能够产生信号的标记部分。
在另一个优选的实施方式中，形成的切割结构包括一对产生相互作用信号的标记部分，它们被有效地放置在探针上以便当探针未结合于靶核酸时猝灭产生的可检测信号。
在另一个优选的实施方式中，标记部分被易于被核酸酶切割的位点分开，由此允许核酸酶的核酸酶活性通过在易于被核酸酶切割的位点进行切割而将产生第一相互作用信号的标记部分与产生第二相互作用信号的标记部分分开，由此产生产生可检测信号。
在另一个优选的实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
在另一个优选的实施方式中，核酸聚合酶选自Taq聚合酶和Pfu聚合酶。
本发明提供聚合酶链反应方法，其中靶核酸的扩增和检测同时进行(即，实时检测)。本发明还提供聚合酶链反应方法，其中靶核酸的扩增先于靶核酸的检测进行(即，终点检测)。
本发明还提供聚合酶链反应方法，所述方法用于同时形成切割结构、扩增样品中的靶核酸并切割所述切割结构。该方法包括以下步骤：(a)提供：上游寡核苷酸引物，其互补于靶核酸的一条链的第一区域；下游标记探针，其互补于靶核酸的同一链的第二区域，其中所述下游标记探针能够形成二级结构，所述二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，所述探针还包含结合部分；和下游寡核苷酸引物，其互补于靶核酸的第二链的区域。根据该方法的这一步骤，上游引物引发合成互补DNA链，且下游引物引发合成互补DNA链。该方法还包括步骤(b)：检测所产生的并通过结合部分结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获的核酸。检测到的核酸由包括靶核酸的扩增和切割的反应产生，其中核酸聚合酶是模板依赖性聚合剂，反应条件允许进行以下PCR循环步骤：(i)引物退火至靶核酸，(ii)延伸步骤(a)的引物，条件是核酸聚合酶合成引物延伸产物，且步骤(a)的上游引物的引物延伸产物部分置换步骤(a)的下游探针，形成切割结构。所述条件还允许：(iii)使用核酸酶作为切割剂来切割切割结构，以便从切割结构释放可检测的标记的片段。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下探针的二级结构在未结合于靶核酸时是稳定的。
在一个优选的实施方式中，切割结构还包括5’活瓣。
本发明还提供形成切割结构的方法，其包括以下步骤：(a)提供靶核酸，(b)提供上游引物，其互补于靶核酸，(c)提供下游探针，所述探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，所述探针还包含结合部分；和(d)靶核酸、上游引物和下游探针退火。可在切割温度下用核酸酶切割切割结构。在切割温度下或低于该温度的温度下，所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。
在一个优选的实施方式中，切割结构包括5’活瓣。
本发明还提供组合物，其包括靶核酸；探针，所述探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，所述探针还包含结合部分；和核酸酶。组合物的探针和靶核酸可结合形成切割结构，后者在切割温度下可被核酸酶切割。在切割温度下或低于该温度的温度下，所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。
在一个优选的实施方式中，组合物还包括寡核苷酸引物。
在另一个优选的实施方式中，探针和寡核苷酸与靶核酸的非重叠区域杂交。本发明还提供用于产生表明样品中存在靶核酸的信号的试剂盒，其包括：探针，所述探针具有的二级结构在探针与靶核酸结合之后可改变，所述探针还包含结合部分；和核酸酶。试剂盒的探针可结合靶核酸以形成切割结构，后者在切割温度下可被核酸酶切割。在切割温度下或低于该温度的温度下，所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。
在一个优选的实施方式中，试剂盒还包括寡核苷酸引物。
在另一个优选的实施方式中，核酸酶是FEN核酸酶。
在另一个优选的实施方式中，探针包括至少一个标记部分。
在另一个优选的实施方式中，探针包括一对产生相互作用信号的标记部分，所述标记部分被有效地放置，以便当探针未结合于靶核酸时猝灭可检测信号的产生。
在另一个优选的实施方式中，标记部分被易于被核酸酶切割的位点分开，由此允许核酸酶的核酸酶活性通过在易于被核酸酶切割的位点进行切割而将产生第一相互作用信号的标记部分与产生第二相互作用信号的标记部分分开，由此产生产生可检测信号。
在另一个优选的实施方式中，所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
本发明的其他特征和优点见下文。本发明提供产生检测和/或测定靶核酸的信号的方法，其中信号的产生代表样品中存在靶核酸。本发明的方法不需要多个步骤。本发明还提供基于PCR的用于检测和/或测定靶核酸的方法，包括产生代表存在靶核酸的信号。本发明允许同时扩增并检测和/或测定靶核酸。本发明还提供基于PCR的用于检测和/或测定靶核酸的方法，包括在缺乏表现出5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶的情况下产生信号。
通过以下对实施方式的描述和附图以及权利要求书，本发明的其他特征和优点将更加清楚。
附图说明
图1显示了FEN核酸酶切割结构。
图2显示可用于检测FEN核酸酶活性的三种模板(以1，2和3标出)。
图3显示了二级结构。
图4是阐述根据本发明产生信号的合成和切割反应的图解。
图5是Sypro Orange染色的聚丙烯酰胺凝胶，显示CBP标记的PFU FEN-1蛋白。
图6是FEN-1核酸酶测定法的放射自显影。
图7示意了用于滚环扩增的开环探针。
图8示意了滚环扩增。
图9示意了别针探针。
序列tcgcagtgtc gacctgcgc是SEQ ID NO：31
序列cagccgtcga tccgcaggtc gacactgccg tcgacggctg是SEQ ID NO：32
序列gcagctgccg ac是SEQ ID NO：33
序列tccgcaggtc gacactgccg tcgacggctg是SEQ ID NO：34
图10示意了蝎型探针。
图11示意了sunrise/amplifluor探针。
图12a的图显示了双链对单链DNA的光吸收差异。
图12b的图显示了DNA解链曲线。
图12c的图显示了温度对DNA的相对光吸收的影响。
图12d的图显示了温度对DNA的相对光吸收的影响。
图12e的图显示了温度对标记了一对相互作用的标记物的DNA的荧光的影响。
图12f的图显示了温度对标记了一对相互作用的标记物的DNA的荧光的影响。
图12g的图显示了靶核酸对标记了一对相互作用的标记物的DNA的荧光的影响。
图13显示了抗切割探针的一个实施方式。
图14显示了使用抗切割探针的本发明的方法的一个实施方式。
图15显示了本发明的重叠和非重叠结构以及切割所靶向的相应位点。
图16显示了实施例15和16中使用的上游寡核苷酸和下游探针。
发明详述
本发明提供产生用于检测样品中存在的靶核酸的信号的方法，其中以核酸聚合酶和核酸酶(例如，FEN核酸酶)的组合处理核酸。本发明还提供检测或测定核酸的方法，其允许同时扩增、切割和检测样品中的靶核酸序列。
在一个方面，探针是本发明的抗切割探针。抗切割探针形成切割结构，当形成非重叠切割结构(非侵入型)时，所述切割结构可被切割剂切割，但当形成重叠结构(侵入型)时，所述切割结构不被切割。通过在探针中被重叠结构所靶向的部分引入一或多个本发明的修饰而实现这种对切割的抗性。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术，这些技术均位于本领域的技术范围内。这些技术在文献中进行了充分的解释。参看例加Sambrook，Fritsch & Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait，ed.，1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Harnes & SJ.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)；以及丛书Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Short Protocols In Molecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。本文上下文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用纳入本文。
I.核酸酶
可用于本发明的核酸酶包括任何具有5’核苷酸内切活性的酶，例如DNA聚合酶，例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶I和来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)和黄栖热菌(TfI)的DNA聚合酶。可用于本发明的核酸酶还包括具有5’-3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶，包括但不限于真细菌DNA聚合酶I，包括来自栖热菌的酶(Taq、TfI、Tth、Tea(caldophilus)Tbr(brockianus))、来自芽孢杆菌的酶(Bst、Bca、Magenta(全长聚合酶，NOT N-截短形式))、来自栖热袍菌的酶(Tma(海栖热袍菌、Tne(neopolitana))和大肠杆菌DNA聚合酶I。术语核酸酶还包括FEN核酸酶。可用于本发明的核酸酶不切割不与靶核酸杂交的探针或引物或不与探针或引物杂交的靶核酸。
FEN-1是～40kDa的依赖二价金属离子的外切核酸酶和内切核酸酶，其特异识别5′单链活瓣链，并沿该臂迁移到位于接合处的切割位点，在该接合处，双链体DNA的两条链毗邻单链臂。内切核酸酶活性和外切核酸酶活性对于活瓣或切口最5′位置的碱基均表现出很低的敏感性。FEN-1的内切核酸底物结合和切割和外切核酸底物结合和切割受上游寡核苷酸(活瓣邻近链或引物)刺激。对于大肠杆菌pol I同样也是如此。该酶的内切核酸酶活性不依赖5′活瓣的长度，可切割仅有1个核苷酸长的5′活瓣。内切核酸酶活性和外切核酸酶活性对底物的化学性质不敏感，可切割DNA和RNA。
内切核酸活性和外切核酸活性受生理浓度内的盐浓度抑制。与0mM NaCl相比，50mM NaCl将外切核酸酶活性抑制为原来的1/50。50mM NaCl仅将内切核酸酶活性抑制为原来的1/7(综述见Lieber 1997，见上)。
虽然5′-OH末端是FEN-1装载到5′活瓣底物上的良好底物，但当5′-OH是双链DNA结构中的切口的一部分时，它是极差的底物。末端磷酸的静电排斥可能有利于使得底物转变为假-活瓣构象，从而为FEN-1提供底物的活性形式。这样的解释表明存在单一活性位点和将FEN-1装载到活瓣的5′单链DNA末端或切口的假-活瓣构型的单一机制。与该模型一致的是，观察到切口处的最佳活性需要极低的Mg2+和单价盐浓度，它们将破坏碱基配对的稳定性，并促进切口向活瓣的转变。更高的Mg2+和单价盐浓度不利于转变，并抑制确实需要转变而转化为活瓣的切口结构或缺口结构的切割。稳定活瓣结构的切割最适合在中等Mg2+水平下进行，而且不会随Mg2+浓度升高而减少。这是因为活瓣结构无需解开碱基对以实现其结构；因此它对Mg2+完全不敏感。虽然内切核酸活性随单价盐而降低，但降低程度不如外切核酸活性那么明显。而且，以前已表明单核苷酸活瓣是有效底物。所有这些观察结果与以下事实一致，即当FEN-1用作外切核酸酶时，降解产物的长度从1个核苷酸到几个核苷酸不等。预计切口转变为不同长度的活瓣随局部序列而变化，这取决于G/C含量。总而言之，切口转变形成过渡活瓣意味着FEN-1的外切核酸活性与内切核酸活性相同(综述见Lieber，1997，见上)。
FEN-1的外切核酸酶活性和外切核酸酶活性无需辅助蛋白即可切割DNA和RNA。但在复制叉处，FEN-1不与其他蛋白相互作用，包括DNA解旋酶和增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA聚合酶δ和ε的持续因子(processivity factor)。PCNA显著刺激FEN-1的内切核酸活性和外切核酸活性。
FEN-1酶的功能与几种更小的噬菌体5′→3′外切核酸酶例如T55′外切核酸酶和T4核糖核酸酶H以及更大的真核生物核苷酸切除修复酶例如XPG相关，其中XPG在氧化性碱基损伤的转录偶联修复中也发挥作用。在真细菌例如大肠杆菌和水生栖热菌中，冈崎片段的加工由Pol I 5′→3′外切核酸酶结构域提供。这些细菌和噬菌体酶与FEN-1共享两个具有有限序列同源性的区域，名为N(N-末端)区和I(中间)区，其中残基相似性集中在7个保守的酸性残基周围。根据T4核糖核酸酶H和T5外切核酸酶的晶体结构以及诱变数据，有人认为这些残基结合到影响DNA水解所需的两个Mg2+离子上，但尚不完全清楚每个金属离子在催化循环中发挥的作用，该作用在每种酶中略有不同(综述见Hosfield et al.，1998b，见上)。
编码可用于本发明的FEN-1酶的fen-1基因包括鼠fen-1、人fen-1、大鼠fen-1、爪蟾fen-1和源自四种古细菌Archaeglobus fulgidus、詹氏甲烷球菌、强烈炽热球菌和Pyrococcus horikoshii的fen-1。已从人(GenBank检索号：NM_004111和L37374)、小鼠(GenBank检索号：L26320)、大鼠(GenBank检索号：AA819793)、爪蟾(GenBank检索号：U68141和U64563)和强烈炽热球菌(GenBank检索号：AF013497)分离出编码FEN-1酶的cDNA克隆。也已测定P.horikoshii活瓣内切核酸酶的完整核苷酸序列(GenBank检索号：AB005215)。FEN-1家族还包括酿酒酵母RAD27基因(GenBank检索号：Z28113 Y13137)和粟酒裂殖酵母RAD2基因(GenBank检索号：X77041)。Methanobacterium thermautotrophiculum的古细菌基因组也已测序。虽然FEN-1同原核生物和病毒的5′→3′外切核酸酶的序列相似性低，但真核生物界内的FEN-1在氨基酸水平上高度保守，其中人和酿酒酵母的FEN-1蛋白有60％的相同性，78％的相似性。三种古细菌FEN-1蛋白也可与真核FEN-1酶高度同源(综述见Matsui et al.，1999.，J.Biol.Chem..274：18297，Hosfield et al.，1998b，J.Biol.Chem..273：27154和Lieber，1997，BioEssavs.19：233)。
人和其他FEN-1家族成员之间两个保守的核酸酶结构域(N-末端即N结构域和中间或I结构域)的序列类似性是92％(鼠)、79％(酿酒酵母)、77％(粟酒裂殖酵母)、72％(A.fulgidus)、76％(詹氏甲烷球菌)和74％(强烈炽热球菌)。
FEN-1特异识别5′单链活瓣链的主干，沿该活瓣臂迁移至位于接合处的切割位点，其中接合处位于双链体DNA和单链臂的两条链之间。如果除去活瓣上游的链(有时称为活瓣邻近链或引物链)，形成的结构称为假-Y(见图1)。该结构被FEN-1切割，但效率是原来的1/20到1/100。FEN-1不切割3′单链活瓣。但是，作为外切核酸酶的FEN-1将水解含有缺口或切口的双链DNA底物(综述见Hosfield et al.，1998a，见上，Hosfield et al.，1999b，见上，和Lieber1997，见上)。就其外切核酸活性而言，FEN-1作用于切口，并以更低的效率作用于缺口或dsDNA的5′凹端。对于缺口结构，FEN-1结合和切割的效率随缺口大小增加到多达5个核苷酸时而降低，随后效率稳定在等同于在双链DNA内部5′凹端上的活性的切割水平。平端双链DNA、3′凹端和单链DNA不被切割(综述见Lieber 1997，见上)。描述FEN酶的切割活性的文献有Yoonet al.，1999，Biochemistry.38：4809；Rao，1998，J.BacterioL 180：5406和Hosfieldet al.，1998，CeU，95：135-146，通过引用将它们并入本文。
已从各种生物包括人(GenBank检索号：NM_004111和L37374)、小鼠(GenBank检索号：L26320)、大鼠(GenBank检索号：AA819793)、酵母(GenBank检索号：Z28113 Y13137和GenBank检索号：X77041)和爪蟾(GenBank检索号：U68141和U64563)分离出可用于本发明的FEN核酸酶。可使用本领域熟知的常规技术克隆和过表达这类酶。
本发明的FEN核酸酶优选是热稳定的。已从各种热稳定生物包括四种古细菌分离和鉴定出热稳定FEN核酸酶。已测定了强烈炽热球菌活瓣内切核酸酶的cDNA序列(GenBank检索号：AF013497)和氨基酸序列(Hosfield等人，1998a，同上和Hosfield等人，1998b)。测定了P.horikoshii活瓣内切核酸酶的完整核苷酸序列(GenBank检索号：AB005215)和氨基酸序列(Matsui等人，同上)。还测定了詹氏甲烷球菌活瓣内切核酸酶(Hosfield等人，1998b和Matsui等人，1999，同上)和A.fulgidus活瓣内切核酸酶(Hosfield等人，1998b)的氨基酸序列。
可使用本领域熟知技术和Hosfield等人，1998a，同上；Hosfield等人，1998b；Kaiser等人，1999，J.Biol.Chem.，274：21387和Matusi等人，同上和本文名为“克隆Pfu FEN-1”的实施例2描述的技术克隆和过表达热稳定FEN1酶。
可通过包括下列方法的各种方法测量FEN酶的内切核酸酶活性。
A.FEN内切酶活性测定
1.使用模板(例如图2显示)评估本发明的FEN核酸酶活性。
模板1是具有下列序列的5′33P标记的寡核苷酸(Heltest4)：
5’AAAATAAATAAAAAAAATACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG3’(SEQ ID NO：1)。Heltest4的下划线部分代表与M13mp18+互补的区域。切割产物是具有序列AAAATAAATAAAAAAAAT(SEQ ID NO：2)的18个核苷酸的片段。
Heltest4结合到M13上，产生互补的双链结构域以及非互补的5′突出端。该双链体形成了还用于解旋酶测定的模板2(图2)。模板3(图2)具有结合到M13上的附加引物(FENAS))，并直接邻近Heltest 4。FENAS的序列是5′CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA 3′(SEQ ID NO：3)。在模板3的存在下，FEN结合到Heltest4的游离5′端，迁移到接头处，切割Heltest4，产生18个核苷酸的片段。模板1和模板2用作对照，但模板2还可用作模板。
依据下文描述方法制备模板：
模板1 模板2 模板3
Heltest4 14μl 14μl 14μl
M13 ** 14μl 14μl
FENAS ** ** 14μl
H2O 28μl 14μl **
1x Pfu缓冲液 4.6μl 4.6μl 4.6μl
1x Pfu缓冲液可从Stratagene(目录号#200536)获得。根据本发明所述方法，稀释1x Pfu缓冲液，使得反应在1x缓冲液中进行。
M13是M13mp18+链，浓度是200ng/μL，33P标记的Heltest4浓度是适宜的0.7ng/μl，FENAS的浓度是4.3ng/μl。基于这些浓度，Heltest4和M13的摩尔量(5x10-14)大致相等，FENAS为约10倍摩尔过量(6x10-13)。
模板混合物在95℃下加热5分钟，冷却至室温，放置45分钟，随后4℃过夜储存。
2μl FEN-1或2μl H2O(对照)与这三种模板按如下比例混合：
3 μl 模板
0.7 μl 10x克隆Pfu缓冲液
0.56 μl 100mM MgCl2
2.00 μl酶或H2O
0.74 μl H2O
7.00 μl总体积
反应在50℃下进行30分钟，向每份样品加入2μl甲酰胺″测序终止″液终止反应。样品在95℃下加热5分钟，上样到6％丙烯酰胺/7M尿素Cast Away(Stratagene)凝胶。
或者，可在下列缓冲液中分析FEN活性，其中使用1小时的温育时间。
10x FEN缓冲液
500mM Tris-HCl pH 8.0
100mM MgCl2
下面的反应混合物与2μl FEN或2μl H2O(对照)混合。
3 μl模板
0.7 μl 10x FEN缓冲液
2.00 μl酶或H2O
1.3 μl H2O
7.00 μl总体积
样品在Robocycler 96孔热盖热循环仪中50℃温育1小时。加入2μl测序终止染液后，样品在99℃下加热5分钟。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中干燥2小时。凝胶与X射线胶片过夜接触。
2.还可以依据Kaiser等人(同上)的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，反应在含有10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，10μg/ml tRNA、用于TaqPol和TthPol的200mM KCl或用于其他所有酶的50mM KCl的10μl体积中进行。反应条件可依分析的切割结构而变化。底物(21M)和各种量的酶与指出的(上文)反应混合物混合，Chill-out(MJ Research)液体石蜡封盖。底物在90℃下加热20秒进行变性，冷却至50℃，随后加入MgCl2或MnCl2启动反应，反应在50℃下温育一段指定长度的时间。加入10μl含10mM EDTA和0.02％甲基紫(Sigma)的95％甲酰胺，终止反应。样品在90℃下加热1分钟，随即在含7M尿素的20％丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)上电泳，缓冲液为45mM Tris硼酸，pH 8.3，1.4mM EDTA。除非另有说明，每泳道上样1μl的终止的反应液。使用505nm滤镜以FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)扫描凝胶。根据未切割底物和切割底物的相应条带强度，以FMBIO分析软件(6.0版，Hitachi)测定切割产物的比例。切割产物的比例不应超过20％，以确保测量结果近似于最初的切割率。切割率定义为切割产物的浓度除以酶浓度和反应时间(分钟)。对于每种酶，使用三个数据点来测定切割率和实验误差。
3.还可以依据Hosfield等人，1998a，同上的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，不同量的FEN和1.54pmol标记切割底物的终体积为13μl，在不同的温度下温育30分钟，随后以等体积的终止液(10mM EDTA，95％去离子甲酰胺和0.008％溴酚蓝和和二甲苯蓝)终止反应。样品以变性的15％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使用IPLabGel系统(Stratagene)，运行MacBAS图像分析软件，定量起始材料和产物的相对量。多数反应在标准的测定缓冲液(10mMTris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2和50μg/ml牛血清白蛋白)中进行，但在一系列实验中改变标准缓冲液，研究不同二价金属和pH值的效应。对于二价金属，弃用MgCl2，使用终浓度为10mM的不同金属离子。为了研究pH的影响，使用终浓度为10mM的含有不同量的Tris-HCl、甘氨酸和乙酸钠的缓冲液，以得到25℃下宽泛的pH值范围。
4.还可以依据Matusi等人，1999，同上的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，酶反应在含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1.5mM MgCl2，0.5mMβ-巯基乙醇，100μg/ml牛血清白蛋白和0.6pmol标记切割结构的15μl反应混合物中进行。60℃温育30分钟后，加入含有10mM EDTA和1mg/ml溴酚蓝的15μl 95％甲酰胺终止反应。样品在95℃下加热10分钟，随后上样到含有7M尿素和10x TBE(89mM Tris-HCl，89mM硼酸，2mM EDTA(pH 8.0))的15％聚丙烯酰胺凝胶(35cmx42.5cm)，随后以2000V电泳2小时。使用Phosphorlmager(Bio-Rad)显示和定量反应产物。大小标准参照物即寡核苷酸以[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶标记5′端。
为了测定最佳pH，在含有1.5mM MgCl2，0.5mM β-巯基乙醇，100μg/ml牛血清白蛋白和0.6pmol 5′端标记的切割结构的测定混合物(15μl)和下列其中一种50mM缓冲液中进行反应，60℃下反应30分钟。使用3种不同的50mM缓冲液，以得到如下的宽泛pH范围：乙酸钠缓冲液(pH 4.0-5.5)、磷酸缓冲液(pH 5.5-8.0)和硼酸缓冲液(pH 8.0-9.4)。
B.FEN外切核酸酶活性测定
可用Matsui等人，1999，同上描述和上文总结的测定FEN-1内切核酸酶活性的方法来测量本发明的FEN核酸酶的外切核酸酶活性。
或者，可用Hosfield等人，1998b，同上描述的方法分析FEN酶的外切核酸酶活性。简而言之，使用带有切口的FEN底物在与内切核酸酶测定相同的条件下(上文描述)检测外切核酸酶活性。
可使用Klenow片段的3′-5′外切核酸酶活性通过部分消化5′32P-标记的模板链，得到外切核酸酶实验和内切核酸酶实验中DNA切割的精确位置。
根据本发明的一个实施方式的切割结构包含被部分置换的退火至靶核酸的寡核苷酸探针的5’末端。本发明另一种切割结构包含：靶核酸(例如图4的B)；根据本发明的上游寡核苷酸探针，其包含与靶序列互补的一或多个区域(例如图4的A)；和下游寡核苷酸，其与靶序列互补(例如图4的C)。可如下形成本发明的切割结构：通过上游寡核苷酸和下游探针之间的重叠，或通过核酸聚合酶的合成活性延伸上游寡核苷酸，并随后部分置换下游寡核苷酸的5’末端。根据标题为″切割结构″的部分所述的方法形成此类切割结构。
或者，通过靶核酸退火至本发明的寡核苷酸探针而形成本发明的切割结构，其中寡核苷酸探针包括互补于靶核酸的一或多个区域以及非互补区域，所述非互补区域不退火至靶核酸，而是形成5’活瓣。根据这一实施方式，切割结构包含由寡核苷酸的非互补区域形成的5’活瓣。
本发明的切割结构还包含重叠活瓣，其中能够退火至靶核酸的上游寡核苷酸的3’末端(例如图4的A)互补于退火至靶核酸的本发明的下游寡核苷酸探针的1(或多)个碱基对(例如图4的C)，且其中1(或多)个碱基对重叠位于单链活瓣的延伸点的直接下游，所述切割结构根据标题为″切割结构″的部分所述的方法形成。在一个实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的非重叠区域杂交。在另一实施方式中，上游寡核苷酸和下游探针与靶核酸的邻近区域杂交。
II.核酸聚合酶
本发明提供核酸聚合酶。优选地，本发明的核酸聚合酶具有热稳定性。
可用于本发明的已知的DNA聚合酶包括，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶。适合用于本发明的已知的RNA聚合酶包括，例如，噬菌体T7、T3和SP6RNA聚合酶、大肠杆菌RNA聚合酶全酶、大肠杆菌RNA聚合酶核心酶、和人RNA聚合酶I、II、III、人线粒体RNA聚合酶和来自HCV的NS5B RNA聚合酶。
适合用于本发明的核酸聚合酶还包括反转录酶。可用于本发明的已知的反转录酶包括，例如：Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)RT、人类免疫缺陷病毒(HIV)RT、禽类造白细胞组织增生肉瘤病毒(ASLV)RT、劳斯肉瘤病毒(RSV)RT、禽髓母细胞白血病病毒(AMV)RT、禽成红细胞增生病毒(AEV)辅助病毒MCAV RT、禽髓细胞瘤病病毒MC29辅助病毒MCAV RT、禽网状内皮组织增生病毒(REV-T)辅助病毒REV-A RT、禽肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV RT、禽肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV RT、劳斯相关病毒(RAV)RT、和禽白血病病毒(MAV)RT。
可用于本发明的基本上缺乏5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶包括但不限于Klenow DNA聚合酶和Klenow exo-DNA聚合酶、以及T7DNA聚合酶(Sequenase)。
可用于本发明的基本上缺乏5’至3’外切核酸酶活性的热稳定核酸聚合酶包括但不限于Pfu、exo-Pfu(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Pfu突变形式)、Taq的Stoffel片段、N-截短的Bst、N-截短的Bca、Genta、JdF3exo-、Vent、Ventexo-(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Vent突变形式)、Deep Vent、Deep Vent exo-(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Deep Vent突变形式)、U1Tma、ThermoSequenase和Thermus Thermostable RNA Polymerase。
可用于本发明的核酸聚合酶既包括天然聚合酶也包括缺乏5′到3′外切核酸酶活性的聚合酶突变体。可用于本发明的核酸聚合酶可具有不同程度的热稳定性。优选地，本发明的核酸聚合酶在其能够延伸核酸引物的温度展现出链置换活性。在本发明的一个优选的实施方式中，核酸聚合酶缺乏5’至3’和3’至5’外切核酸酶活性。
下面列出可用于本发明的其他基本上缺乏5’至3’外切核酸酶活性的具有不同程度热稳定性的核酸聚合酶。
A.噬菌体DNA聚合酶(用于37℃测定)：
噬菌体DNA聚合酶没有5′到3′的外切核酸酶活性，因为这一活性由不同的多肽编码。适宜DNA聚合酶的实例是T4、T7和Φ29DNA聚合酶。可商购获得的酶是：T4(可从许多来源例如Epicentre获得)和T7(可从许多来源例如Epicentre得到未修饰形式和从USB得到3′到5′exo-T7″测序酶″DNA聚合酶)。
B.古细菌DNA聚合酶：
已从古细菌鉴定出两类不同的DNA聚合酶：1.B家族/polα类型(来自强烈炽热球菌的Pfu同源物)和2.pol II类型(强烈炽热球菌DP1/DP22-亚基聚合酶的同源物)。已表明来自这两类的DNA聚合酶天然缺乏相关的5′到3′外切核酸酶活性，但具有3′到5′外切核酸酶(校正)活性。适宜的DNA聚合酶(polα或pol II)可源自具有类似于所需测定温度的最佳生长温度的古细菌。适宜古细菌的实例包括但不限于：
1.不耐热的(可用于37℃测定)-例如沃氏甲烷球菌(Methanococcusvoltae)。
2.热稳定的(可用于非PCR测定)-例如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarium)、詹氏甲烷球菌、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)。据估计，适宜的古细菌表现出＜80-85℃的最高生长温度或＜70-80℃的最佳生长温度。
3.热稳定的(可用于PCR测定)-例如热球菌类(强烈炽热球菌、菌种GB-D、菌株KOD1、woesii、abysii、horikoshii)、热球菌类(litoralis、菌种9°North-7、菌种JDF-3、gorgonarius)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)和闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)。据估计，适宜的古细菌表现出＞80-85℃的最高生长温度或＞70-80℃的最佳生长温度。来自古细菌polαDNA聚合酶组的适宜PCR酶可商购获得，包括KOD(Toyobo)、Pfx(Life Technologies，Inc.)、Vent(NewEngland BioLabs)、Deep Vent(New England BioLabs)和Pwo(Boehringer-Mannheim)。
下列参考文献描述了与上文列出的古细菌相关的其他古细菌：Archaea：ALaboratory Manual(Robb，F.T和Place，A.R.，eds.)、Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1995和Thermophilic Bacteria(Kristjansson，J.K.，ed.)CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，1992。
C.真细菌DNA聚合酶：
有三类真细菌DNA聚合酶，即pol I、II和III。Pol I DNA聚合酶家族的酶具有5′到3′外切核酸酶活性，某些成员还表现出3′到5′外切核酸酶活性。PolII DNA聚合酶天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性，但表现出3′到5′外切核酸酶活性。Pol III DNA聚合酶代表细胞的主要复制型DNA聚合酶，由多个亚基组成。pol III催化亚基缺乏5′到3′外切核酸酶活性，但有些情况下3′到5′外切核酸酶活性位于同一多肽上。
没有商业来源的真细菌pol II和pol III DNA聚合酶。有多种可商购获得的Pol I DNA聚合酶，其中一些已被修饰，减少或消除了5′到3′外切核酸酶活性。用于消除pol I DNA聚合酶中5′到3′外切核酸酶活性的方法包括：
-诱变(例如Xu等人，1997，J.MoI.Biol.，268：284和Kim等人，1997，MoI. Cells.7：468描述)。
-蛋白水解消化催化的N-截短(例如Klenow等人，1971，Eur.J.Biochem.，22：371描述)，或
-克隆和表达C-末端片段进行N-截短(Lawyer等人，1993，PCR Methods Appl..2：275描述)。
至于古细菌来源，测定温度要求决定了哪种真细菌用做可用于本发明的DNA聚合酶的来源(例如嗜常温菌、嗜热菌、超嗜热菌)。
1.嗜常温/不耐热(可用于37℃测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自中温真细菌例如大肠杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、分支杆菌(结核、麻风)的pol II或pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从上文列出的中温真细菌分离出用于N-截短或诱变的Pol I DNA聚合酶(Ci)。可商购获得的真细菌DNA聚合酶pol I片段是Klenow片段(N-截短的大肠杆菌pol I；Stratagene)。
2.热稳定(可用于非PCR测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自嗜热真细菌例如芽孢杆菌(例如嗜热脂肪芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、caldovelox)的pol II或pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从上文列出的嗜热真细菌例如芽孢杆菌分离出用于N-截短或诱变的适宜pol I DNA聚合酶。可商购获得以商品名Bst DNA聚合酶I大片段(Bio-Rad)和等温DNA聚合酶(Epicentre)销售的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶pol I的热稳定N-截短片段。热坚芽孢杆菌pol I的C-末端片段可从Panvera(以商品名Ladderman销售)获得。
3.热稳定(可用于PCR测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自栖热菌(水生栖热菌、嗜热栖热菌、黄栖热菌、红栖热菌、caldophilus、filiformis、brokianus)或来自海栖热袍菌的pol II或pol III催化亚基。Yi-Ping等人，1999，J.MoI.Evol.，48：756和McHenry等人，1997，J.MoI.Biol.，272：178描述了来自嗜热栖热菌和水生栖热菌的pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从许多嗜热真细菌包括栖热菌属和海栖热袍菌(参看上文)分离出用于N-截短或诱变的适宜pol I DNA聚合酶。可商购获得以商品名KlenTaql(Ab Peptides)、Stoffel片段(Perkin-Elmer)和ThermoSequenase(Amersham)进行销售的水生栖热菌DNA聚合酶pol I(Taq)的热稳定片段。除了C-末端片段外，5′到3′外切核酸酶-Taq突变体也可商购获得，例如TaqFS(Hoffman-LaRoche)。除了5′到3′外切核酸酶-形式的Taq，还可商购获得海栖热袍菌DNA聚合酶I的N-截短形式(商品名UlTma，Perkin-Elmer)。
Thermophilic Bacteria(Kristjansson，J.K.，ed.)CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，1992描述了与上文列出的真细菌相关的其他真细菌。
D.真核5′到3′外切核酸酶-DNA聚合酶(可用于37℃测定)
已从真核生物鉴定出几种DNA聚合酶，包括DNA polα(复制/修饰)、δ(复制)、ε(复制)、β(修复)和γ(线粒体复制)。真核生物DNA聚合酶没有5′到3′外切核酸酶活性，因为这一活性由不同的多肽(例如哺乳动物FEN-1或酵母RAD2)编码。可从许多真核生物(包括但不限于酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、果蝇)和真核病毒(例如EBV、腺病毒)分离出适宜的热稳定DNA聚合酶。
除了缺乏5′到3′外切核酸酶活性以外还缺乏3′-5′外切核酸酶(校正)活性的DNA聚合酶突变体可能在基于FEN的检测策略中表现出改进的性能。例如，降低或消除内在的3′到5′外切核酸酶活性可通过减少标记探针的非特异外切核酸降解来降低背景信号。已鉴定出三种3′到5′外切核酸酶基序，已表明这些区域的突变可消除Klenow、Φ29、T4、T7和Vent DNA聚合酶、酵母Polα、Polβ和Polγ和枯草杆菌Pol III的3′到5′外切核酸酶活性(Derbeyshire等人，1995，Methods.Enzymol.262：363综述)。制备3′到5′外切核酸酶活性降低或消除的其他DNA聚合酶突变体的方法为本领域熟知。
同时缺乏5′到3′和3′到5′外切核酸酶活性的可商购获得的酶包括测序酶(exo-T7；USB)、Pfu exo-(Stratagene)、exo-Vent(New England BioLabs)、exo-Deep Vent(New England BioLabs)、exo-Klenow片段(Stratagene)、Bst(Bio-Rad)、Isotherm(Epicentre)、Ladderman(Panvera)、KlenTaql(Ab Peptides)、Stoffel片段(Perkin-Elmer)、ThermoSequenase(USB)和TaqFS(Hoffman-LaRoche)。
如果使用了不同于Pfu的聚合酶，选择缓冲液和延伸温度，以允许可用于本发明的特定聚合酶发挥最佳活性。可用于本发明聚合酶的缓冲液和延伸温度为本领域知晓，还可由销售商的说明书来确定。
E.RNA聚合酶
可用于本发明的RNA聚合酶包括DNA依赖的RNA聚合酶和RNA依赖的RNA聚合酶。RNA依赖的RNA聚合酶被表征为其能够从引发模板(primedtemplate)、从非引发模板(unprimed template)或从引发模板或非引发模板合成新的RNA链。已经鉴定到RNA聚合酶识别单链RNA模板并在缺乏引物的情况下从单链RNA模板合成RNA。此类引发机制的一个实例是丙型肝炎病毒(HCV)的RNA聚合酶，即NS5B。NS5B被表征为是负责HCV RNA基因组复制的RNA聚合酶。已经证实NS5B通过自身引发、延伸已有的引物催化RNA合成延伸或者是启动RNA从头合成，见Luo et al.，J.Virol.，2000，74(2)：851-853。
还发现RNA聚合酶可识别引发的单链RNA模板并从其合成RNA。一些文献详细描述了可用于本发明的此类RNA聚合酶，例如，Schiebel et al.，J.Biol.Chem.，1993，268(16)：11858-11867，Tang et al.，Genes and Dev.，2003，17(1)：49-63，或美国专利申请No.11/217,972，申请日为2005年8月31日(通过引用将其全文并入本文)。在这些文献中，RNA聚合酶可用于选择性扩增RNA靶群体。
″RNA依赖的RNA聚合酶″从RNA合成多个拷贝的RNA。表3列举了一些非排他性的RNA依赖的RNA聚合酶，它们可用于实施本发明。这些聚合酶和使用它们扩增靶的方法可参见美国专利申请No.11/217,972，申请日为2005年8月31日(通过引用将其全文并入本文)。
表3
″DNA依赖的RNA聚合酶″从具有(通常双链)启动子序列的双链或部分双链DNA分子合成多个拷贝的RNA。应该注意，本发明包括单链启动子以及识别它们的RNA聚合酶。DNA依赖的RNA聚合酶的实例是来自大肠杆菌和噬菌体T7、T3和SP6的DNA依赖的RNA聚合酶。可用于本发明的DNA依赖的RNA聚合酶可以是商品化的。
在一个实施方式中，DNA依赖的RNA聚合酶具有热稳定性。热稳定的RNA聚合酶已经自嗜热栖热菌中得到例证。
RNA聚合酶可得自天然来源或重组来源。例如，可自感染病毒的宿主细胞分离天然的病毒RNA聚合酶。实例包括感染honey血清型1脊髓灰质炎病毒的HeLa细胞，使用的病毒滴度和感染方法见Pfeiffer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(12)：7289-7294。细胞的RNA聚合酶可得自表达天然RNA聚合酶的细胞，其中培养细胞并收集RNA聚合酶，例如见Schiebel et al(1993)。合适的RNA依赖的RNA聚合酶可以是商品化的。
F.反转录酶
在本发明中，术语″反转录酶(RT)″指的是经本文所述的方法或本领域已知的方法测定展现出反转录活性的任何酶。本发明的″反转录酶″因此包括来自反转录病毒、其他病毒和细菌的反转录酶以及展现出反转录酶活性的DNA聚合酶，例如Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、Tne DNA聚合酶、Tma DNA聚合酶等等。来自反转录病毒的RT包括，但不限于，Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)RT、人类免疫缺陷病毒(HIV)RT、禽类造白细胞组织增生肉瘤病毒(ASLV)RT、劳斯肉瘤病毒(RSV)RT、禽髓母细胞白血病病毒(AMV)RT、禽成红细胞增生病毒(AEV)辅助病毒MCAV RT、禽髓细胞瘤病病毒MC29辅助病毒MCAV RT、禽网状内皮组织增生病毒(REV-T)辅助病毒REV-A RT、禽肉瘤病毒UR2辅助病毒UR2AV RT、禽肉瘤病毒Y73辅助病毒YAV RT、劳斯相关病毒(RAV)RT、和禽白血病病毒(MAV)RT，参见美国专利申请2003/0198944(通过引用将其全部内容并入本文)。综述见Levin，1997，Cell，88：5-8；Brosius et al，1995，Virus Genes 11：163-79。
在本发明中，术语″反转录酶活性″可互换地用于指酶(例如，反转录酶或DNA聚合酶)使用RNA链作为模板合成DNA链(即，cDNA)的能力。本文给出了测定RT活性的方法，这些方法是本领域已知的。例如，Quan-T-RT测定系统可购自Amersham(Arlington Heights，111.)，并可参见Bosworth，et al.，Nature 1989，341：167-168。
在某些实施方式中，反转录酶的RNase H活性(即，RNase H-酶)降低。例如，RNase H活性可低于野生型或″RNase H+″酶例如野生型M-MLV或AMV反转录酶的RNase H活性的20％，更优选地低于15％、10％或5％，更优选地低于2％。可通过多种测定法确定任何酶的RNase H活性，例如参见，美国专利No.5,244,797；5,405,776；5,668,005；和6,063,608；Kotewicz，M.L.et al.，Nucl.Acids Res.16：265(1988)和Gerard，G.F.，et al.，FOCUS 14(5)：91(1992)，通过引用将它们的全部内容并入本文。
用于本发明的RNase H-反转录酶包括，但不限于，M-MLV H-反转录酶、RSV H-反转录酶、AMV H-反转录酶、RAV H-反转录酶、MAV H-反转录酶和HIV H-反转录酶，如前所述(见美国专利No.5,244,797；5,405,776；5,668,005和6,063,608；和WO 98/47912，通过引用将其全部内容并入本文)。
本发明可使用商品化的反转录酶，例如，来自Invitrogen，Inc.(Carlsbad，Calif.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)，Sigma(Saint Louis，Mo.)或RocheMolecular System (Pleasanton，Calif.)。或者，具有反转录酶活性的多肽可分离自它们的天然病毒或细菌来源，其方法为本领域人员所熟知的用于分离和纯化天然蛋白质的标准方法(见，例如，Houts，G.E.，et al.，J.Virol.29：517(1979))。此外，可采用本领域人员熟悉的重组DNA技术制备反转录酶(见，例如，Kotewicz，M.L.，et al.，Nucl.Acids Res.16：265(1988)；Soltis，D.A.，and Skalka，A.M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3372-3376(1988))。通过引用将其全部内容并入本文。
可采用本领域已知的方法获得RNase H活性降低的酶，例如，通过突变感兴趣的反转录酶的RNase H结构域，优选地通过一或多个点突变、一或多个缺失突变、和/或一或多个插入突变，例如，参见美国专利No.6,063,608，通过引用将其全部内容并入本文。
III.核酸
A.可用于本发明的核酸序列
本发明提供检测或测定靶核酸的方法；还使用用于形成本发明的切割结构的寡核苷酸、引物和探针，以及用于扩增模板核酸序列的引物。
在本发明中，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指的是引物、探针(上游寡核苷酸和下游寡核苷酸)和待检测的寡聚体片段，而且作为总称泛指多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其他类型的多核苷酸，后者是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)。没有打算区分术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”的长度，这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的初级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA以及单链和双链RNA。
在本发明中，核酸序列互补体指的是与核酸序列“反平行结合”的寡核苷酸，当核酸序列互补体与核酸序列比对时，使得其中一条序列的5’末端与另一条序列的3’末端配对。
寡核苷酸不一定物理上源自任何现有或天然序列，而是可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录或它们的组合。术语“寡核苷酸”或“核酸”意指基因组DNA或RNA、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其中因其合成来源或操纵，该多核苷酸：(1)不与其天然结合的多核苷酸的全部或一部分结合；和/或(2)连接到不同于与其天然连接的多核苷酸的多核苷酸上。
因为单核苷酸之间发生反应产生寡核苷酸的方式可使一个单核苷酸的戊糖环的5′磷酸连接到磷酸二酯键方向上的邻近戊糖环的3′氧，如果其5′磷酸没有连接到单核苷酸戊糖环的3′氧，则寡核苷酸的端头称为“5′端”；如果其3′氧没有连接到随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸，则寡核苷酸的端头称为″3′端″。在本发明中，核酸序列既便是位于更大的寡核苷酸内部，仍可以说它具有5′端和3′端。
当两个不同的非重叠寡核苷酸退火到相同的线性互补核酸序列的不同区域上，并且一个寡核苷酸的3′端朝向另一个的5′端，前者可称为“上游”寡核苷酸，而后者可称为“下游”寡核苷酸。
本发明所述核酸可包含天然核酸中不常见的某些碱基，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。无需完全互补；稳定的双链体可含有错配碱基对或不配对碱基。通过考虑许多变量，包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成、寡核苷酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率，核酸技术领域的技术人员可凭经验确定双链体的稳定性。
核酸双链体的稳定性由解链温度或″Tm″来衡量。特定核酸双链体在特定条件下的Tm是指一半的碱基对发生解离时的温度。
B.可用于本发明的引物和探针
本发明提供寡核苷酸引物和探针，它们用于检测或测定核酸、扩增模板核酸序列、和形成本发明的切割结构。
术语“引物”可指一个以上的引物，且指的是寡核苷酸，不论其是例如在纯化的限制酶切消化中天然产生的寡核苷酸还是合成的寡核苷酸，其中当寡核苷酸置于催化合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，它可作为沿互补链合成的起始点。此类条件包括存在四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或反转录酶、适宜缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的取代物)、和适宜的温度。引物优选是单链的，以实现扩增的最大效率。
可用于本发明的寡核苷酸引物是可与模板核酸序列杂交并引发第二核酸链的酶促合成的单链DNA或RNA分子。引物与核酸分子库中的靶分子的一部分互补。预见到，通过化学合成方法或酶促合成方法制备本发明的寡核苷酸。或者，这类分子或其片段是天然的，可从其天然来源分离或从供货商购买。寡核苷酸引物的长度是5-100个核苷酸，理想地为17-40个核苷酸，不过可以使用不同长度的引物。用于扩增的引物优选地大约17-25个核苷酸。用于产生本发明的切割结构的引物优选地为大约17-45个核苷酸。还可通过解链温度估算方法，设计可用于本发明的引物，使其具有特定的解链温度(Tm)。商业程序如OligoTM、Primer Design和互联网上提供的程序如Primer3和OligoCalculator可用于计算可用于本发明的核酸序列的Tm。优选情况下，按照例如Oligo Calculator计算，可用于本发明的扩增引物的Tm优选为约45℃到65℃，更优选为约50℃到60℃。优选地，可用于本发明的探针的Tm比相应的扩增引物的Tm高70℃。
本发明的引物和探针可被标记并用于制备标记的切割结构。单链DNA引物对、DNA引物和探针、或探针可退火至靶核酸内的序列。在特定的实施方式中，引物可用于引发扩增DNA合成靶核酸。
典型地，当两个核酸序列基本互补时(在一段至少具有14至25个核苷酸的长度上至少约65％互补，优选至少约75％互补，更优选至少约90％互补)，发生选择性杂交。参看Kanehisa，M.，1984，Nucleic Acids Res.12：203，其通过引用纳入本文。因此，预计可容忍引发位点处的一定程度的错配。这类错配可很小，例如单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸。或者，错配区域可包括环，其被定义为存在不间断的连续4个或更多核苷酸错配的区域。
许多因素影响引物与第二核酸分子杂交的效率和选择性。这些因素包括引物长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成和需要引物与其杂交的区域的可能位阻，设计本发明的寡核苷酸引物时将考虑到这些因素。
引物长度与引物退火结合靶序列的效率和精确性存在正相关。具体而言，更长的序列比更短序列具有更高的解链温度(Tm)，更不可能在给定的靶序列内重复，从而尽量减少了混乱杂交(promiscuous hybridization)。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列往往发生自身杂交，其靶向位点也是如此，因为溶液一般有利于单分子杂交动力学，而非双分子杂交动力学。但是，设计含有充足数目的G-C核苷酸配对的引物同样是重要的，因为每个G-C配对由三个氢键连接，而不是A、T碱基配对结合到靶序列时的两个氢键，因此形成更紧密更强的键。杂交温度与引物退火效率呈反比，引发反应或杂交混合物中可能包含的有机溶剂例如甲酰胺的浓度同样与与引物退火效率呈反比，而增加盐浓度则促进结合。在严格的退火条件下，更长的杂交探针或合成引物比更短的杂交探针或合成引物的杂交效率更高，而后者足以用于更宽容的条件下。优选地，严格性杂交在合适的缓冲液(例如，1X哨兵分子信标(SentinelMolecular beacon)PCR核心缓冲液，Stratagene目录号#600500；1X Pfu缓冲液，Stratagene目录号#200536；或1X克隆Pfu缓冲液，Stratagene目录号#200532)中，在允许核酸序列与寡核苷酸引物和/或探针杂交的条件下(例如，95℃)进行。根据寡核苷酸引物和/或探针的长度和/或核酸组成的不同，严格性杂交条件可变化(例如盐浓度低于大约1M，更常见低于大约500mM，且优选地低于大约200mM)，且杂交温度可有一定的范围(例如，从低至0℃到高于22℃，高于大约30℃，且(最常见地)超过大约37℃)。更长的片段需要更高的杂交温度以便实现特异性杂交。由于多种因素影响杂交的严格性，因此不同参数的组合比单个因素的绝对尺度更加重要。
可将这些因素纳入考虑范围来设计并根据如下方法合成寡核苷酸引物。
1.寡核苷酸引物的设计策略
用于测序或PCR的本发明的特定寡核苷酸的设计包括选择可识别靶序列但具有最小预测二级结构的序列。寡核苷酸序列可仅结合靶核酸内的单一部位或不仅结合靶核酸的单一部位。此外，分析该寡核苷酸的长度和GC含量，优化该寡核苷酸的Tm。而且，设计可用于基因组DNA扩增的PCR引物时，选择的引物序列没有表现出与GenBank数据库(或其他可用数据库)中的序列明显的匹配性。
使用容易获取的计算机程序可简化用于本发明的引物的设计，其中这些计算机程序开发用于辅助评估上述的几个参数和优化引物序列。这类程序的实例是DNAStarTM软件包(DNAStar，Inc.；Madison，WI)中的“PrimerSelect”、OLIGO 4.0(National Biosciences，Inc.)、PRIMER、Oligonucleotide SelectionProgram、PGEN和AMPLIFY(Ausubel等人，1995，Short Protocols in MolecularBiology，3rd Edition，John Wiley&Sons描述)。在一个实施方式中，引物经设计具有可作为其他引物的靶的序列，以产生两端具有已知序列的PCR产物，其中已知序列可作为进一步扩增的靶(例如测定PCR产物的序列)。如果以具有共同“尾随序列”的特异引物来扩增许多不同的核酸序列，来自这些不同基因的PCR产物可随后用单组引物进行测序。或者，为了便于扩增序列的随后克隆，引物经设计具有连接到其5′端的限制性内切酶位点序列。因此，引物的所有核苷酸均源自靶核酸序列或邻近靶核酸序列的序列，除了形成限制性内切酶位点所需的少数核苷酸以外。这类酶和位点为本领域所熟知。如果靶核酸的基因组序列和靶核酸的开放阅读框序列是已知的，特定引物的设计完全是本领域的常规技术。
本领域人员熟知，可合成具有特定化学和/或捕获部分(包括上述捕获元件)的寡核苷酸，使得它们能够偶联至固相支持物并结合于如上所述的结合部分或标签。合适的捕获元件包括，但不限于，核酸结合蛋白或核苷酸序列。合适的捕获元件包括，但不限于，生物素、半抗原、蛋白质、或化学反应性部分。此类寡核苷酸可先在溶液中使用，然后捕获于固相支持物上，或者先附着于固相支持物，然后用于检测反应中。后者的实例可以是将下游探针分子偶联至固相支持物，使得下游探针的5’末端分子包含荧光猝灭剂。同一个下游探针分子在一位置上还可包含荧光团，使得FEN核酸酶切割将猝灭剂与荧光团物理性分开。例如，靶核酸可与固相下游探针寡核苷酸杂交，而液相上游引物也可与靶分子杂交，使得FEN切割反应在固相支持物上发生，并从复合体上释放5’猝灭剂部分。这将导致结合于固相支持物的荧光团被检测到，并由此揭示在适当标记或标示的固相支持物上存在切割事件。不同下游探针分子可结合于阵列的不同位置。阵列的位置将标示出探针分子，并表明存在探针分子可与之杂交的模板。
2.合成
使用本领域同样熟知的技术合成引物。制备具有特定序列的寡核苷酸的方法为本领域知晓，包括例如适宜序列的克隆和限制酶切消化分析以及直接化学合成。设计完成后，可通过适宜的化学合成方法，包括，例如Narang等人，1979，Methods in Enzymology，68：90描述的磷酸三酯方法、Brown等人，1979，Methods in Enzymology，68：109公开的磷酸二酯方法、Beaucage等人，1981，Tetrahedron Letters，22：1859公开的二乙基氨基磷酸酯方法和美国专利4,458,066公开的固相载体方法或通过其他的化学方法，采用商用自动化寡核苷酸合成仪(可商购获得)或VLSIPSTM技术制备寡核苷酸。
C.探针
本发明提供用于形成本发明的切割结构或标记的切割结构的探针。制备本发明的标记的切割结构的方法见下文标题为″切割结构″的部分。
在本发明中，术语″探针″指的是因其中至少一个序列与靶区域内的序列具有互补性而与靶核酸内的序列形成双链体的探针。在某些实施方式中，探针具有二级结构。本发明的探针可以被标记。优选地，探针不含有与引物延伸中所用的序列互补的序列。通常，探针的3’末端会被“封闭”，以防止探针被掺入到引物延伸产物中去。标记本发明的探针的方法以及合适的标记物见下文标题为″切割结构″的部分。
本发明的探针的总体设计见标题为″可用于本发明的引物和探针″的部分。典型地，本发明的探针包括靶核酸结合序列，其长度为大约7-140个核苷酸，优选地为大约10-140个核苷酸(图4C)。在一个实施方式中，本发明的探针还包括在此定义的两个互补核酸序列区(图4，b和b’)，它们彼此互补，并在缺乏靶核酸时彼此结合以形成二级结构区域。区域b和b’的长度为3-25个核苷酸，优选地4-15个核苷酸，且更优选地5-11个核苷酸。实际长度的选取可参考靶核酸结合序列，使得探针的二级结构优选地在如下温度下当探针未结合于靶核酸时是稳定的，所述温度是对包含结合于靶核酸的探针的切割结构进行切割的温度。
在某些实施方式中，本发明的探针能够形成本文所述的二级结构(包括茎环、发夹、内环、凸环、分叉结构和假结)或多个二级结构、三叶草型结构或任何上述的三维结构。
例如，根据本发明的一个实施方式，探针可以是具有二级结构的寡核苷酸，所述二级结构为例如为发夹或茎环，且包括，但不限于，分子信标、别针、蝎型和sunrise/amplifluor探针。
分子信标探针包含发夹或茎环结构，所述结构具有一对产生相互作用信号的标记部分(例如荧光团和猝灭剂)，当信标探针没有与靶核酸杂交时，这对标记部分的定位可有效猝灭可检测信号的生成。环包含与靶核酸互补的区域。环的两侧是5′区域和3′区域(“臂”)，当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，5′区域和3′区域将通过互补核酸序列发生可逆相互作用。或者，环的两侧是5′区域和3′区域(“臂”)，当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，5′区域和3′区域将通过所连接的亲和对成员发生可逆相互作用，形成二级结构。在本发明中，“臂”指的是分子信标探针的区域，a)当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，这些区域通过互补核酸序列发生可逆相互作用，或b)当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，探针区域将通过所连接的亲和对成员发生可逆相互作用，形成二级结构。当分子信标探针没有与靶杂交时，这些臂相互杂交，形成茎杂交体，后者有时称为“茎双链体”。这种结构是闭合构象。当分子信标探针与其靶杂交时，探针的“臂”被分离。这种结构是开放构象。在开放构象中，臂也可与靶杂交。这类探针可游离在溶液中，或者它们可被固定到固相表面上。当臂发生杂交时(例如形成茎)，猝灭剂离荧光团很近，可有效猝灭或抑制其荧光，使得探针不发光。美国专利5,925,517和美国专利6,037,130描述了这类探针。
在本发明中，分子信标探针也可以是本文所述的″等位基因区分″探针。
分子信标探针具有附着于一个臂的荧光团和附着于另一个臂的猝灭剂。荧光团和猝灭剂，例如，四甲基罗丹明和DABCYL，不一定是FRET对。
对于可用于本发明的茎环探针，根据使用探针的测定条件，设计与靶互补的探针序列的长度、当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时通过互补核酸序列彼此发生可逆相互作用的探针区域(例如茎杂交体)的长度和二者的关系。可根据本领域知晓的方法估算用于特定测定条件的靶互补序列的长度和茎杂交体序列的长度。当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，通过互补核酸序列发生可逆相互作用的每个探针区域具有6至100个核苷酸，优选具有8至50个核苷酸，最优选具有8至25个核苷酸。与靶互补的探针序列的长度优选是17-40个核苷酸，更优选是17-30个核苷酸，更优选是17-25个核苷酸。
根据本发明而修饰的分子信标探针的寡核苷酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或其组合。可引入修饰的核苷酸，例如，基于硝基吡咯(nitropyrole)的核苷酸或2’-O-甲基核糖核苷酸。还可引入修饰的连键，例如，硫代磷酸酯。还可在本发明的波长漂移引物(wavelength-shifting primer)掺入修饰的核苷酸和修饰的连键。
用于本发明的别针探针要求：″通用″发夹探针1(图9，b171 SEQ IDNO：31)，其包括发夹结构，在发夹的5’臂具有荧光团(FAM)，在3’臂具有猝灭剂(Dabcyl)；以及探针2(图9，SP170a SEQ ID NO：32)，其包括包含两个结构域的茎环：探针2(SEQ ID NO：34)的5’三分之二，其具有与发夹探针1互补的(通用)序列和可终止DNA聚合酶的核苷酸，和探针2的3’三分之一，其作为靶特异性引物。当聚合酶从反向引物(即探针2的3’三分之一)引发合成上游链(SEQ ID NO：33)时，探针2的5’末端将被置换并5’外切核酸酶活性降解，直至达到″终止核苷酸″。此时，剩余的探针2打开或解折叠，并作为发夹探针1(SEQ ID NO：31)的靶，由此将荧光团与猝灭剂分开(图9)。
用于本发明的蝎型探针包括3’引物和5’延伸的探针尾，后者包含具有荧光团/猝灭剂对的发夹结构。通过引入六聚乙二醇(hexethlyene glycol，HEG)而″保护″探针尾以防发生5’→3’方向上的复制，HEG防止聚合酶复制探针。在第一轮扩增中，3’靶特异性引物退火至靶并被延伸，使得蝎型掺入至新合成的链中，后者具有新合成的用于5’探针的靶区域。在下一轮的变性和退火过程中，蝎型发夹环的探针区域与靶杂交，由此将荧光团与猝灭剂分开，并产生可测量信号。此类探针描述于Whitcombe et al.，Nature Biotechnology 17：804-807(1999)，以及图10。
可用于本发明的其他寡核苷酸探针是sunrise/amplifluor探针。sunrise/amplifluor探针的结构类似于蝎型探针，不同之处在于其缺乏HEG单体以阻断发夹探针区域的5’→3’复制。因此，在第一轮扩增中，sunrise/amplifluor探针的3’靶特异性引物退火至靶并被延伸，使得发夹探针掺入至新合成的链(sunrise链)中。在下一轮的变性和退火过程中，第二个非标记的引物退火至sunrise链的3’末端(图11，循环2)。不过，当聚合酶达到发夹的5’末端时，由于缺乏HEG终止序列，聚合酶将置换并复制发夹，由此将荧光团与猝灭剂分开，并将线性化的发夹探针掺入至新的链中。此类探针参见Nazarneko et al.，Nucleic Acid Res.25：2516-2521(1997)，和图11。
对于可由于本发明的别针探针、蝎型探针和sunrise/amplifluor探针，根据使用探针的测定条件，设计与靶互补的探针序列的长度、当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时通过互补核酸序列彼此发生可逆相互作用的探针区域(例如茎杂交体)的长度和二者的关系。可根据本领域知晓的方法估算用于特定测定条件的靶互补序列的长度和茎杂交体序列的长度。当与核酸靶序列互补的区域没有结合到靶核酸上时，通过互补核酸序列发生可逆相互作用的每个探针区域具有6至100个核苷酸，优选具有8至50个核苷酸，最优选具有8至25个核苷酸。与靶互补的探针序列的长度优选是17-40个核苷酸，更优选是17-30个核苷酸，更优选是17-25个核苷酸。以常规实验测定通过互补核酸序列发生可逆相互作用的探针区域之间相互作用的稳定性，以实现适宜的功能。除了长度，还可通过改变G-C含量和插入破坏稳定的错配，调节通过互补核酸序列而彼此发生可逆相互作用的探针区域之间相互作用的稳定性。通过互补核酸序列发生可逆相互作用的探针区域中的一个可被设计为与靶部分或完全互补。如果3’臂与靶互补，则探针了用作用于DNA聚合酶的引物。同样，波长漂移分子信标探针可被固定化于固相表面，例如通过束缚(tethering)，或是自由流动的。
在一个实施方式中，探针是本发明的抗切割探针。抗切割探针形成切割结构，当形成非重叠切割结构(非侵入型)时，所述切割结构可被切割剂切割，但当形成重叠结构(侵入型)时，所述切割结构不被切割。通过在探针中被重叠结构所靶向的部分引入一或多个本发明的修饰而实现这种对切割的抗性。
在一个实施方式中，探针易于在+1位上游(例如，非重叠切割结构所靶向的部分)被切割，但可抵抗在+1位下游(例如，重叠结构所靶向的部分)(见图13)。探针上与靶互补并杂交的核苷酸被定义为是+1位直至+X位。+1位被定义为是下游探针的杂交区域的5’末端核苷酸，区域+2被定义为是位于+1位直接下游的核苷酸，依此类推(图13)。
根据本发明的这一实施方式，可用的抗切割探针必须在3’末端的+1位下游或探针的非修饰下游部分的第一个核苷酸的+1位下游被修饰(图13C)。探针的非修饰部分的Tm必须低于引物延伸/切割反应的温度，以便当引物被延伸通过整个修饰部分之后可与靶解离(见图15C)。
抗切割修饰不必存在于探针的整个互补部分(例如，+1位至3’末端)，只要探针的非修饰的且与靶互补的区域的解链温度(Tm)低于进行聚合酶延伸反应的温度即可(图15C)。因此，探针被设计为使得如果探针的整个修饰部分(抗切割部分)从靶上被置换(例如，当上游引物延伸形成重叠结构时)，探针将不再与靶形成双链体(见图15C)。典型的引物延伸反应条件包括：合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，目录号#200536)、各种dNTP、和60-72℃的温育温度。这些因素保证探针不被重叠或侵入型切割结构切割。
例如，23个核苷酸的探针可具有20个核苷酸的靶互补区(核苷酸位置+1至+20)和3个核苷酸的5’活瓣(核苷酸位置-1至-3)(见图13)。非修饰的核苷酸16-20不被切割，因为要靶向这些核苷酸需要引物延伸通过探针的互补部分并置换寡核苷酸1-15。剩余的互补核苷酸(+16-+20)将不再与靶形成稳定的双链体并将解离，而不会将探针切割(图15C)。
不过，探针仅在形成非重叠切割结构之后才能被切割剂切割，例如，在+1位上游被切割(图15A)。
确定互补非修饰区域的Tm的方法是本领域熟知的并在此讨论。类似地，确定为防止侵入型切割而需修饰的探针+1位下游核苷酸的数量的方法是本领域熟知的并在此讨论。
简而言之，可以通过采用FRET测定或荧光猝灭测定进行探针稳定性测定来确定不需要修饰的靶互补核苷酸的最大数量(探针稳定性测定的其他详情见标题为″确定探针二级结构的稳定性″的部分)。在本发明中，荧光猝灭测定可包括FRET测定。将探针的非修饰部分加入至含有靶的反应中。反应在对被用于引物延伸反应的核酸酶/聚合酶来说是可行的且优选是最佳的缓冲液中进行。探针标记上合适的一对相互作用的标记物中的第一成员，而靶标记上该对的第二成员，两个成员可在一段距离例如2个核苷酸的距离内相互作用，或者是可在一段距离例如20个核苷酸的距离内相互作用的非FRET对(例如，四甲基罗丹明和DABCYL)。例如，本发明的这一实施方式的探针的非修饰部分可标记上荧光团，而靶被标记上猝灭剂，然后在不同温度(例如，引物延伸反应温度)测定荧光。当标记物不相互作用且探针的非修饰部分与靶解离时产生最大荧光。如果探针的非修饰部分在延伸温度下未与靶解离，则必须减小非修饰部分的长度。
可使用热循环装置例如Mx3005P QPCR System(Stratagene)进行测定。
在一个实施方式中，修饰是硫代磷酸酯或2’-O-甲氧基。此类修饰是本领域已知的。具有硫代磷酸酯和/或2’-O-甲氧基修饰的寡核苷酸可得自BiosearchTechnologies，Inc.(Novato，CA)。
多种荧光团可用于本发明的探针和引物。可用的荧光团包括香豆素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、荧光黄、罗丹明、BODIPY、四甲基罗丹明、Cy3、Cy5、Cy7、伊红、德克萨斯红和ROX。组合荧光团例如Lee et al.(1997)，Nucleic Acids Research 25：2816描述的荧光素-罗丹明二聚体也是适宜的。可选择荧光团使其在可见光谱内或可见光谱外例如紫外线或红外线范围内吸收和发射。
本领域描述的适宜猝灭剂特别包括DABCYL及其变体，例如DABSYL、DABMI和甲基红。荧光团还可用作猝灭剂，因为它们与其他某些荧光团接触时往往会猝灭荧光。优选的猝灭剂或是发色团例如DABCYL或孔雀绿，或是在探针处于开放构象时的检测范围内不发射荧光的荧光团。
D.核酸的产生
本发明提供用于扩增靶核酸序列和用于形成切割结构的待检测或测量的核酸。
本发明使用的核酸包含RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物。本发明同时包括核酸的有义链和反义链。根据本发明，所述核酸可用化学方式或生物化学方式修饰，或可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。这类修饰包括例如标记物、甲基化、以类似物置换一个或多个天然核苷酸、核苷酸之间的修饰例如不带电的键(甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬置部分(pendent moieties)(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰键(例如α-异头核酸(alpha anomeric nucleic acids)等)。模拟多核苷酸经氢键和其他化学相互作用结合到指定序列的能力的合成分子也包括在内。这类分子为本领域知晓，包括例如分子骨架中的磷酸酯键被替换为肽键的分子。
1.包含DNA的核酸
a.克隆
可通过本领域技术人员熟知的克隆方法从cDNA文库或基因组文库中分离出包含DNA的核酸(Ausubel et al.，见上)。简而言之，包含特定核酸序列的DNA克隆的分离包括筛选重组DNA或cDNA文库和鉴定含有所需序列的克隆。克隆包括下列步骤。特定文库的克隆被涂抹到平板上，转移到适宜的底物上进行筛选，变性，探针检查特定核酸的存在。下文含有对杂交条件和产生标记探针的方法的描述。
优选通过与核酸探针的杂交或通过可被抗体检测到的蛋白表达来鉴定所需克隆。或者，按照下文描述方法，通过由一组特定引物所限定的序列的聚合酶链扩增，鉴定所需克隆。
适宜文库的选择包括鉴定所需序列丰富来源的组织或细胞系。而且，如果目的核酸含有调控序列或内含子序列，则筛选基因组文库(Ausubel等人，同上)。
b.基因组DNA
本发明的核酸序列可从基因组DNA扩增。按照下列方法从组织或细胞分离基因组DNA。
为了便于检测来自特定组织的基因变异形式，分离不含周围正常组织的该组织。为了从哺乳动物组织分离出基因组DNA，切碎组织，液氮冷冻。冷冻组织以预冷的研钵和研杵研磨至细粉末，随后按每100mg组织加入1.2ml消化缓冲液，悬浮于消化缓冲液中(100mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，25mM EDTA，pH 8.0，0.5％(体积/体积)SDS，0.1mg/ml蛋白酶K)。为了从哺乳动物的组织培养细胞中分离基因组DNA，500xg，5分钟离心沉淀细胞，细胞重悬浮在1-10ml的冷PBS中，500xg，5分钟重新离心沉淀细胞，随后细胞重悬浮于1体积的消化缓冲液中。
消化缓冲液中的样品在50℃下温育(振荡)12-18小时，随后加入等体积的苯酚/氯仿/异丙醇进行提取。如果离心步骤(1700xg，10分钟)后，各相没有分离，则又加入1体积的消化缓冲液(无蛋白酶K)，重复离心步骤。如果两相的界面出现明显的白色浓稠物质，重复有机提取步骤。提取上层后，水层转移至新管，加入1/2体积的7.5M乙酸铵和2体积的100％乙醇。1700xg离心2分钟，沉淀核酸，70％乙醇洗涤，通风干燥，最后以1mg/ml重悬浮于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)。样品在37℃下和0.1％SDS和1μg/ml无DNA酶的RNA酶的存在下温育1小时，重复提取和乙醇沉淀步骤，除去残留RNA。根据该方法，基因组DNA的产率预计约为2mgDNA/1g细胞或组织(Ausubel等人，同上)。依据该方法分离的基因组DNA可用于本发明的PCR分析。
c.限制性消化(cDNA或基因组DNA)
鉴定含有特定靶核酸序列的所需cDNA或基因组克隆后，可用限制性内切酶进行消化，从这些克隆分离出本发明的核酸。
限制性内切酶消化的技术为本领域技术人员所熟知(Ausubel等人，同上)。可用于限制性内切酶消化的试剂可容易地从Stratagene等供应商或其他来源获得。
d.PCR
可从基因组DNA或其他天然来源经聚合酶链反应(PCR)扩增本发明的核酸。PCR方法为本领域技术人员所熟知。
PCR提供了一种快速扩增特定DNA序列的方法，其中使用由依赖DNA的热稳定DNA聚合酶催化的DNA复制的多个循环，扩增目的靶序列。PCR需要存在待扩增的靶核酸序列、位于待扩增序列两侧的两条单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和盐。
按照Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335描述的方法实施PCR，该文献通过引用纳入本文。
美国专利4,683,202、4,683,195和4,800,159公开了聚合酶链反应(PCR)技术。最简单形式的PCR是一种使用两个与相反链杂交且位于靶DNA目的区域两侧的寡核苷酸引物进行特异DNA序列酶促合成的体外方法。包括模板变性、引物退火和由DNA聚合酶催化的退火引物延伸的一系列重复步骤导致特异片段的指数性累积，其中特异片段的末端由两个引物的5′端限定。据报道PCR可选择性地富集特异的DNA序列，使其增加109倍。Saiki等人，1985，Science，230：1350也描述了PCR方法。
采用模板DNA(至少1fg，更有用的是1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物进行PCR。典型的反应混合物包括：2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl适宜缓冲液、0.4μl 1.25μM dNTP、2.5单位的Taq DNA聚合酶(Stratagene)和去离子水，总体积25μl。矿物油覆盖于反应混合物表面，使用程序控制的热循环仪进行PCR。
根据实际的严格性要求，调节PCR循环每个步骤的长度和温度以及循环数目。退火温度和时间由引物退火到模板上的预计效率和可容忍的错配程度决定。本领域普通技术人员完全知晓如何优化引物退火条件的严格性。使用30℃和72℃之间的退火温度。正常情况下模板分子的最初变性在92℃和99℃之间进行4分钟，随后是由变性(94-99℃，15秒至1分钟)、退火(上文讨论所决定的温度，1-2分钟)和延伸(72℃，1分钟)组成的20-40个循环。最后的延伸步骤一般在72℃下进行4分钟，随后可能是在4℃下的不确定时间(0-24小时)的步骤。
一般用于标准PCR技术的检测方法在杂交测定中使用标记的引物和扩增的DNA。优选情况下，探针例如以32P、生物素、辣根过氧化物酶(HRP)等进行标记，以允许检测杂交。
其他的检测方法包括使用片段长度多态性(PCR FLP)、与等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针的杂交(Saiki等人，1986，Nature 324：163)，或经双脱氧方法进行直接测序(使用扩增的DNA而非克隆的DNA)。标准PCR技术(基本)如下进行：复制位于两个引物间的DNA序列、提供作为反应主要产物并具有不同长度的DNA序列，其每条链的5’末端均以引物终止。因此，引物间的插入和删除导致不同长度的产物序列，可通过PCR-FLP测定产物大小来检测产物序列。在一个ASO杂交的实例中，扩增DNA被固定在尼龙滤纸(例如通过UV辐射)的一系列“斑点印迹”上，随后使扩增DNA与HRP标记的寡核苷酸探针在严格条件下杂交。洗涤后，加入四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢。HRP氧化过氧化氢，后者随后又将TMB氧化为蓝色沉淀物，从而指示杂交的探针。
用于检测或测定本发明的核酸的PCR测定法见标题为″使用方法″的部分。
2.包含RNA的核酸
本发明还提供了包含RNA的核酸。
可依据本领域熟知的方法(Ausubel等人，同上)纯化包含RNA的核酸。可依据本领域熟知的方法(Ausubel等人，同上)和下文描述的方法从细胞和组织中分离总RNA。
依据下列方法从哺乳动物组织纯化RNA。取出目的组织后，剪得≤2g的组织碎片，随后液氮快速冷冻以防止RNA降解。加入适宜体积的胍溶液(例如每2g组织加入20ml的胍溶液)，在组织匀浆器(tissuemizer)中研磨组织样品，进行两到三次10秒长的破裂(burst)。为了制备组织胍溶液(1L)，将590.8g异硫氰酸胍溶解于约400ml DEPC处理的H2O中。加入25ml 2M Tris-HCl，pH7.5(终浓度0.05M)和20ml Na2EDTA(终浓度0.01M)，过夜搅拌溶液，体积调整为950ml，随后加入50ml的2-ME。
匀浆组织样品在12℃下12,000xg离心10分钟。形成的上清在置于9ml5.7M CsCl溶液(0.1g CsCl/ml)上的0.1体积20％肌氨酰的存在下于65℃温育2分钟，随后113,000xg，22℃过夜离心分离。小心除去上清后，倒转管，沥干液体。管的底部(含有RNA沉淀)置于50ml塑料管中，在3ml组织重悬缓冲液(5mM EDTA，0.5％(体积/体积)肌氨酰，5％(体积/体积)2-ME)的存在下4℃过夜温育，以完全重悬浮RNA沉淀。形成的RNA溶液先后以25∶24∶1的苯酚/氯仿/异丙醇、24∶1的氯仿/异丙醇进行提取，加入3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5体积的100％乙醇进行沉淀，随后重悬浮于DEPC水中(Chirgwin等人，1979，Biochemistry，18：5294)。
或者，依据下列单步方案从哺乳动物组织分离RNA。在玻璃聚四氟乙烯匀浆器中按每100mg组织加入1ml变性液(4M硫代硫酸胍，25mM柠檬酸钠，pH 7.0，0.1M 2-ME，0.5％(重量/体积)N-十二烷基肌氨酸)的比例，匀浆制备目的组织。匀浆物转移至5ml的聚丙烯管后，先后加入0.1ml的2M乙酸钠(pH 4)、1ml水饱和苯酚和0.2ml 49∶1的氯仿/异丙醇。加入每一组分后混合样品，加入所有组分后样品在0-4℃下温育15分钟。10,000xg，4℃离心20分钟分离样品，加入1ml 100％异丙醇进行沉淀，-20℃温育30分钟，10,000xg，4℃离心10分钟沉淀样品。形成的RNA沉淀溶解在0.3ml的变性液中，转移至微量离心管，加入0.3ml的100％异丙醇，-20下放置30分钟进行沉淀，10,000xg，4℃离心10分钟。RNA沉淀以70％乙醇洗涤，干燥后重悬浮于100-200μl DEPC处理水或DEPC处理的0.5％SDS(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal.Biochem，162：156)。
可依据体外转录方法产生包含RNA的核酸。
体外转录的技术为本领域技术人员熟知。简而言之，将目的基因插入到含SP6、T3或T7启动子的载体上。用适宜的限制性内切酶在位于编码序列下游的单个位点处消化载体，使载体线性化。苯酚/氯仿提取后，DNA以乙醇沉淀，随后以70％乙醇洗涤，干燥后重悬浮于无菌水。采用转录缓冲液(200mMTris-HCl，pH 8.0，40mM MgCl2，10mM亚精胺，250NaCl[T7或T3]或200mM Tris-HCl，pH 7.5，30mM MgCl2，10mM亚精胺[SP6])、二硫苏糖醇、RNA酶抑制剂、四种核糖核苷三磷酸的每一种以及SP6、T7或T3RNA聚合酶在37℃下温育线性化DNA 30分钟，进行体外转录反应。为了制备包含RNA的放射性标记的多核苷酸，弃用未标记的UTP，向反应混合物加入35S-UTP。随后以DNA酶I进行温育，除去DNA模板。乙醇沉淀后，以闪烁计数器计算放射性标记的测试量的RNA样品，测定cpm/μl(Ausubel等人，同上)。
或者，通过化学合成技术例如固相亚磷酰胺(下文描述)制备包含RNA的核酸。
3.包含寡核苷酸的核酸
可使用可商购获得的寡核苷酸合成仪器制备包含寡核苷酸的核酸(下文描述)。
IV.切割结构
本发明提供了一种可被核酸酶(例如FEN核酸酶)切割的切割结构，因而教导了制备切割结构的方法。本发明还提供标记的切割结构和制备标记的切割结构的方法。
使用探针制备本发明的切割结构。
A.切割结构的制备
在一个实施方式中，如下形成本发明的切割结构：在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，1-2分钟，随后冷却至大约40-72℃之间)，温育a)上游寡核苷酸引物，b)位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内的寡核苷酸探针，和c)合适的靶核酸，其中靶序列与引物和探针均互补，和d)合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，来自Stratagene(目录号#200536)或适合所使用的特定聚合酶(例如，RT)的缓冲液。最佳温度将取决于具体的探针、引物和聚合酶。在本发明的某些实施方式中，切割结构包含重叠活瓣，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸(例如图4的A)的3’末端与退火至靶核酸的下游寡核苷酸探针(例如图4的C)的一或多个碱基对互补。
在另一实施方式中，如下形成本发明的切割结构：在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，1-2分钟，随后冷却至大约40-60℃之间)，温育a)RNA聚合酶合成的寡核苷酸，b)位于启动子下游不超过5000个核苷酸范围内的寡核苷酸探针，和c)合适的靶核酸，其中靶序列包含启动子区域并与下游探针至少部分互补，和d)合适的缓冲液。最佳温度将取决于具体的探针和RNA聚合酶。在本发明的某些实施方式中，切割结构包含重叠活瓣，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸(例如图4的A)的3’末端与退火至靶核酸的下游寡核苷酸探针(例如图4的C)的一或多个碱基对互补。
在一个实施方式中，如下形成本发明的切割结构：在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃之间)，温育a)上游、优选地3’末端可延伸的、优选地寡核苷酸引物，b)具有本文所述的二级结构并包含结合部分的寡核苷酸探针，所述二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变，所述寡核苷酸探针位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内，和c)合适的靶核酸，其中靶序列与两种引物均互补，和d)合适的缓冲液(例如哨兵分子信标PCR核心缓冲液(目录号#600500)或1X Pfu缓冲液，来自Stratagene(目录号#200536))。最佳温度将取决于具体的探针、引物和聚合酶。在本发明是优选的实施方式中，切割结构包含重叠活瓣，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸(例如图4的A)的3’末端与退火至靶核酸的下游寡核苷酸探针(例如图4的C)的一或多个碱基对互补，且其中一个碱基对重叠位于单链活瓣延伸点的直接下游。
根据这一实施方式，上游寡核苷酸引物3’末端通过本发明的聚合酶的合成活性被延伸，使得新合成的上游寡核苷酸引物的3’末端部分置换下游寡核苷酸探针的5’末端。延伸优选地在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行15秒，72℃。
在本发明的另一实施方式中，如下制备本发明的切割结构：温育靶核酸和与靶核酸部分互补的寡核苷酸探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，使得3’互补区域退火至靶核酸而不退火至靶核酸的非互补5’区域形成5’活瓣。退火优选地在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃之间)和存在合适的缓冲液(例如1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液)的条件下进行。
在本发明的另一实施方式中，如下制备本发明的切割结构：温育靶核酸和能够杂交于靶核酸的上游引物和部分互补寡核苷酸探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，使得3’互补区域退火至靶核酸而不退火至靶核酸的非互补5’区域形成5’活瓣。退火优选地在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃之间)和存在合适的缓冲液(例如1X哨兵分子信标核心缓冲液(Stratagene)或1X Pfu缓冲液(Stratagene))的条件下进行。
在另一实施方式中，本发明提供包含抗切割探针的切割结构，其仅当形成非重叠(非侵入型)切割结构时才被选择性切割。在这一实施方式中，如下形成本发明的切割结构：在允许靶与引物和探针杂交的条件下(例如95℃，1-2分钟，随后冷却至大约40-72℃之间)，温育a)上游引物，b)抗切割探针，所述探针位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内，和c)合适的靶核酸，其中靶序列与引物和探针均互补，和d)合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，来自Stratagene(目录号#200536)或适合所使用的具体聚合酶和核酸酶的缓冲液)。最佳温度将取决于具体的探针、引物和聚合酶。
在本发明的某些实施方式中，将形成包含重叠活瓣的切割结构，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸的3’末端与退火至下游探针的靶(图14B和图15B)的一或多个碱基对互补。当形成这种重叠结构(侵入型)时，抗切割探针不会被核酸酶切割，且因此当形成侵入型切割结构时不产生可检测信号。
在另一实施方式中，引物与抗切割探针不重叠。例如，引物毗邻(在延伸或杂交之后)下游探针的靶互补部分。在这一实施方式中，切割结构是非重叠的，且核酸酶在探针的+1位(例如，肘弯)上游的不抗切割的位置切割探针(图14B和15A)。
B.如何制备标记的切割结构
在这一实施方式中，标记物被附着至寡核苷酸探针。在本发明的一个实施方式中，标记物附着于寡核苷酸探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，其包含切割结构。在另一实施方式中，标记物被附着至不含二级结构的探针。因此可检测被活瓣特异性核酸酶的内切酶活性切割的切割下的单核苷酸或小寡核苷酸。
如下形成本发明的标记的切割结构，在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃)温育a)上游3’末端可延伸的引物，优选地寡核苷酸引物，b)标记的探针，所述探针位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内，和c)合适的靶核酸序列，其中所述靶序列与所述寡核苷酸互补，和d)合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液)。本发明的切割结构还包括重叠活瓣，其中能够与靶核酸序列杂交的上游寡核苷酸(例如图3的A)的3’末端与退火至靶核酸序列的下游寡核苷酸(例如图3的C)的一个碱基对互补，且其中所述一个碱基对重叠位于单链活瓣的延伸点的直接下游。上游引物的3’末端被聚合酶的合成活性(例如，反转录酶)延伸，使得新合成的上游引物3’末端部分置换下游探针的标记的5’末端。延伸优选地在存在1X Pfu缓冲液的情况下进行15秒，72℃。可如下制备本发明的切割结构：温育靶核酸序列和探针，所述探针包含不退火至靶核酸序列而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域和退火至靶核酸序列的互补的3’区域。退火优选地在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃)和存在合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液)的条件下进行。
在一个实施方式中，如下形成本发明的标记的切割结构，在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃)温育a)上游3’末端可延伸的引物，优选地为寡核苷酸引物，b)标记的探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，所述探针位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内，和c)合适的靶核酸，其中所述靶序列与所述寡核苷酸互补，和d)合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液)。本发明的切割结构还包括重叠活瓣，其中能够与靶核酸杂交的上游寡核苷酸(例如图4的A)的3’末端与退火至靶核酸的下游寡核苷酸探针(例如图4的C)的一个碱基对互补，且其中所述一个碱基对重叠位于单链活瓣的延伸点的直接下游，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分。上游引物的3’末端被聚合酶的合成活性延伸，使得新合成的上游引物3’末端部分置换下游探针的标记的5’末端。延伸优选地在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行15秒，72℃。
在另一实施方式中，可如下制备本发明的切割结构：温育靶核酸和探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，且所述探针还包含不退火至靶核酸而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域和退火至靶核酸的互补的3’区域。退火优选地在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃)和存在合适的缓冲液(例如1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液)的条件下进行。
在另一实施方式中，可如下制备本发明的切割结构：温育靶核酸和能够与靶核酸杂交的上游引物以及探针，所述探针具有的如本文所述的二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含结合部分，且所述探针还包含不退火至靶核酸而是形成5’活瓣的非互补的标记的5’区域和退火至靶核酸的互补的3’区域。退火优选地在允许核酸序列与寡核苷酸引物杂交的条件下(例如95℃，2-5分钟，随后冷却至大约50-60℃)和存在合适的缓冲液(例如1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液)的条件下进行。
在另一实施方式中，本发明提供包含标记的抗切割探针的标记的切割结构，其仅当形成非重叠(非侵入型)切割结构时才被选择性切割。在这一实施方式中，如下形成本发明的切割结构：在允许靶与引物和探针杂交的条件下(例如95℃，1-2分钟，随后冷却至大约40-72℃之间)，温育a)上游引物，b)标记的抗切割探针，所述探针位于所述上游引物下游不超过5000个核苷酸范围内，和c)合适的靶核酸，其中靶序列与引物和探针均互补，和d)合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，来自Stratagene(目录号#200536)或适合所使用的具体聚合酶和核酸酶的缓冲液)。最佳温度将取决于具体的探针、引物和聚合酶。
在本发明的某些实施方式中，将形成包含重叠活瓣的切割结构，其中能够与靶核酸(图14B/C)杂交的上游寡核苷酸的3’末端与退火至下游探针的靶(图14B和图15B)的一或多个碱基互补。当形成这种重叠结构(侵入型)时，抗切割探针不会被核酸酶切割，且因此当形成侵入型切割结构时不产生可检测信号。
在另一实施方式中，引物与抗切割探针不重叠。例如，引物毗邻(在延伸或杂交之后)下游探针的靶互补部分(图14B和15A)。在这一实施方式中，切割结构是非重叠的，且核酸酶在探针的+1位(例如，肘弯)上游的不抗切割的位置切割标记的探针(图14B和15A)。随后，可采用任何策略来区分未切割的标记核酸与其被切割的片段。本发明提供用于检测通过结合部分或标签结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获的被切割和释放的核酸片段的量方法。通过这种方式，本发明允许鉴定那些含有靶核酸的样品。
如下所述通过掺入可检测部分而标记寡核苷酸探针，所述部分可通过分光法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、酶法或化学法等手段进行检测。将标记物连接或缀合到寡核苷酸探针的方法当然取决于所使用的标记物的类型和标记物在探针上的位置。可在5’末端、3’末端或在探针的全长标记用于本发明的探针。
适合用于本发明的各种标记物以及将它们加入到探针上的方法为本领域知晓且包括，但不限于，可发生相互作用以增强、改变或降低信号的酶(例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)和酶底物、放射性原子、荧光染料、发色团、化学发光标记物、电化学发光标记物例如OrigenTM(Igen)。当然，如果标记的分子用于以热循环仪器进行的基于PCR的测定，该标记物必须能够经受该自动化过程所需的温度循环。
在放射性原子中，33P或32P是优选的。本领域已知将33P或32P引入核酸的方法，包括，例如，用激酶进行5’标记或通过切口翻译随机插入。″特异性结合配偶体″指的是能够高特异性结合配体分子的蛋白质，例如抗原与其特异性单克隆抗体的情况。其他特异性结合配偶体包括生物素和抗生物素蛋白或生物链菌素、IgG和蛋白A、以及本领域已知的各种各样的受体-配体对。上述说明无意于将各种标记物归类为不同的类型，引物同一种标记物可用于多种不同的模式。例如，125I可用作放射性标记物或电子致密试剂。HRP可用作酶或单克隆抗体的抗原。此外，可以组合各种标记物以产生所需效果。例如，可以生物素标记探针，并以标记125I的抗生物素蛋白或以HRP标记的抗生物素的单克隆抗体检测探针的存在。其他的排列组合和可能性对于本领域人员来说是显而易见的并在本发明的范围内被认为是等同的。
作为标记物用于构建本发明的标记的探针的荧光团包括罗丹明和衍生物(例如德克萨斯红)、荧光素和衍生物(例如5-溴甲基荧光素)、荧光黄、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸酯、7-氨基4-甲基-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘类(pyrenetrisulfonates)例如Cascade Blue、以及monobromorimethyl-ammoniobimane。一般而言，具有宽斯托克斯漂移(Stokes shifts)的荧光团是优选的，以允许使用具有滤光片的荧光计而非单色仪并增加检测效率。
以荧光团标记的探针可容易用于核酸酶(例如FEN-核酸酶)介导的对切割结构的切割，其中切割结构包含本发明的标记的探针。如果标记物位于探针的5′端，则通过本领域熟知的方法从完整的杂交的探针分离出核酸酶(例如FEN-核酸酶)产生的标记的片段。
在本发明的另一实施方式中，可使用例如荧光偏振实现杂交的标记探针的检测，其中荧光偏振是一种基于分子翻滚(molecular tumbling)来区分大分子和小分子的技术。大分子(即完整的标记的探针)在溶液中比小分子翻滚慢得多。荧光部分连接到目的分子的适宜位置后，可根据分子翻滚测量(和区分)该荧光部分，从而区分完整探针和消化的探针。
在一些情况中，抗在单个寡核苷酸探针上使用两种相互作用的标记物(例如，FRET对或非FRET对)或一对产生相互作用信号的部分，其中要适当考虑到标记物在寡核苷酸上维持适当的间距，以便在寡核苷酸探针解折叠(例如，由于探针二级结构的改变)或水解过程中允许标记物分开。抗用于本发明的优选的相互作用的标记物包括，但不限于，罗丹明和衍生物、荧光素和衍生物、德克萨斯红、香豆素和衍生物、结晶紫且包括，但不限于，DABCYL、TAMRA和NTB(nitrothiazole blue)以及任何如本文所述的FRET或非FRET标记物。
然后将所释放的标记物的荧光与仍保持结合于靶的标记物进行比较。如果合成的探针具有的荧光团和猝灭剂被大约20个核苷酸分隔开，那么在存在核酸酶(例如FEN-核酸酶)的情况下进行切割之后，不需要将核酸酶(例如FEN-核酸酶)所产生的片段与仍保持与靶结合的探针分开。或者，猝灭剂放置的位置将使得探针在未与靶核酸杂交时不会发出荧光。这种双标记的探针当在完整时或未与靶核酸杂交时(或者在双分子或多分子探针的情况中，当探针未解离时)将不会发出荧光，因为染料所发出的光会被猝灭剂猝灭。因此，完整探针发射的任何荧光被认为是背景荧光。在一个实施方式中，当标记探针被FEN核酸酶在非侵入型切割反应中切割时，染料和猝灭剂被分开，释放的片段将产生荧光。在一个实施方式中，当标记的探针被FEN核酸酶切割时，染料和猝灭剂被分开，所释放的片段将发光。或者，当标记的探针与靶核酸杂交时，染料和猝灭剂的距离增加，因而荧光水平升高。在一个实施方式中，其中探针是双分子或多分子探针，包含探针的分子的解离导致荧光的增加。荧光的量与样品中存在的核酸靶序列的量呈正比。
在另一实施方式中，使用两种标记的核酸，每一核酸与双链靶序列的不同的链的不同区域互补，但彼此不互补，使得标记的核酸与每一引物的下游退火。例如，存在两种探针抗潜在地将从单一标记物产生的信号的强度加倍，并可进一步用于减少产物链的重退火，后者在PCR扩增过程中是经常出现的。选择的探针使得探针结合于与引物所结合的位置邻近(下游)的位置。
还可在本发明中使用多种探针以获得其他益处。例如，如果要测试样品中的多种病原体，在反应混合物中加入多种探针即可；探针可各自包含不同的标记物以方便检测。
在本发明中使用多种探针也可实现等位基因特异性或物种特异性区分，例如，通过采用具有不同Tm的探针并在仅对一种探针/等位基因双链体具有特异性的温度下进行退火/切割反应。还可通过使用单一探针并检查所产生的切割产物的类型而实现等位基因特异性区分。在本发明的一个实施方式中，探针被设计为至少在5’末端区域与一种等位基因，而非其他等位基因，精确互补。对于其他等位基因，探针在其5’末端区域具有错配，使得所产生的切割产物不同于当探针与精确互补的等位基因杂交时所产生的切割产物。
尽管可选择探针序列以实现重要的益处，但本领域人员通过选择如本文所述的探针标记物和/或标签也可实现重要的优势。可通过多种技术将标记物直接间接附着于寡核苷酸。根据所使用的标记物或标签的具体类型，标记物可位于探针的5’或3’末端、位于探针内部、或附着于不同长度和组成的间隔臂以有助于信号相互作用。使用商品化的亚磷酰胺试剂，本领域人员可通过被适当保护的亚磷酰胺产生在5-或3-末端含有官能团(例如，硫醇或伯胺)的寡聚物，并采用文献所述的方案对其进行标记，例如见，PCR Protocols：A Guideto Methods and Applications，Innis et al.，eds.Academic Press，Ind.，1990。
美国专利4,914,210描述了引入寡核苷酸官能化试剂以向寡核苷酸探针序列(一般是5′端)引入一个或多个巯基、氨基或羟基部分的方法。可使用多核苷酸激酶和γ-32P-ATP或γ-33P-ATP引入作为放射性同位素的5′磷酸基，以提供报道剂。可使合成过程中加入的氨基胸苷残基或6-氨基己基残基与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，向5′端加入生物素。3′端的标记物可使用多核苷酸末端转移酶来添加所需部分，例如蛹虫草菌素35S-dATP和生物素酰化的dUTP。
寡核苷酸衍生物也可用作标记物。例如，亚乙烯基-dA(etheno-dA)和亚乙烯基-A(etheno-A)是可被掺入核酸探针的已知荧光腺嘌呤核苷酸。类似地，亚乙烯基-dC或2-氨基嘌呤脱氧核苷是另一种可用于探针合成的类似物。活瓣特异的核酸酶活性可水解含有这类核苷酸衍生物的探针，释放荧光强得多的单核苷酸。
C.切割切割结构并产生信号
可通过上述标题为″核酸酶″的部分中所述的方法切割本发明的切割结构。
D.探针的选择性靶向
Pfu FEN主要在相对于杂交于靶核酸的上游寡核苷酸(例如，引物)3′端的单个位置处切割下游探针。当上游寡核苷酸(引物)不与下游寡核苷酸的杂交区域(探针)重叠但却毗邻下游寡核苷酸(非重叠切割结构)，使得这两个寡核苷酸之间仅有切口(例如，在上游寡核苷酸和下游寡核苷酸与靶杂交之后或在上游寡核苷酸3’末端延伸之后所产生)时，FEN切割下游寡核苷酸+1位的上游。使用根据本发明的抗切割探针，探针因其切割抗性封闭而不被切割并在引物延伸之后将从靶上被置换。
因此，本领域人员可相对于下游探针的互补部分而选择性地放置上游引物的3’末端，以便靶向下游探针的特定区域。
E.鉴别侵入型切割结构和非侵入型切割结构
确定荧光团/猝灭剂对的位置
正如上文描述，本发明在一个实施方式中预见使用荧光团/猝灭剂对进行双重标记的探针。当标记探针被FEN核酸酶(或本文描述的其他核酸酶)切割时，可将荧光团和猝灭剂分开，余下的片段会产生荧光。本发明预见，可特异选择探针上荧光团和猝灭剂的位置，以区分探针的非重叠(侵入型)切割和重叠(非侵入型)切割。本领域技术人员应理解的是，尽管以荧光团/猝灭剂对为例描述了报道分子的定位，但不限于此具体的报道系统。报道分子的位置还可应用于其他的报道系统例如嵌入染料，其中探针特定位点的切割将导致染料信号的猝灭。还可在任何包含相互作用的报道分子的报道系统中使用位置策略，其中可通过切割探针的非互补部分而打断分子间的相互作用。这类报道系统为本领域知晓并在本文中进行了描述。
因此，如果一对相互作用的标记物的一个成员例如猝灭剂被连接到探针杂交区域的碱基+1上，且荧光团被连接到5′活瓣的碱基上，那么+1位下游处的切割将使得猝灭剂和报道剂仍连接在同一核酸分子上，因此无信号产生。但是，如果切割发生在探针位置+1的上游，位于碱基+1上的猝灭剂则与位于活瓣上的报道剂分开。如果在位置+1的上游发生切割，上游寡核苷酸不与下游探针杂交区域重叠。假如要形成重叠结构(例如侵入型切割结构)，其中上游寡核苷酸具有同时与靶互补和与下游探针的靶互补部分重叠的3′部分，这将导致在+1位下游切割，且位于+1位的猝灭剂与位于5’活瓣的报导基团不会物理分离。根据本发明，重叠(侵入型切割)结构引起的切割事件不会被检测到，而非重叠(非侵入型)切割结构引起的切割事件是可检测的。因此，将猝灭剂分子(例如BHQ)放置在下游探针的杂交/互补部分的+1位允许仅检测非侵入型切割。
因此，本发明的一个实施方式预见猝灭剂(例如BHQ)放置在下游引物互补区域的+1位置处，而荧光团(例如FAM)放置在肘弯上游处。还预见到，可颠倒荧光团/猝灭剂对的定位，使得猝灭剂位于5′活瓣上，而荧光团则位于下游探针互补区域的位置+1。
因此，本发明预见下游探针的使用，其中下游探针具有位于肘弯上游的荧光基团(例如但不限于FAM基团)和位于位置+1的猝灭剂，以仅从非侵入型切割结构产生信号，而不从侵入型切割结构产生信号。
在一些实施方式中，其中相互作用的标记物对被选择性放置的探针是抗切割探针。在该实施方式中，仅当形成非重叠的切割结构时方切割探针。同样，仅当形成和切割非重叠切割结构时方产生可检测信号。
F.检测释放的标记的片段
可通过本领域熟知的各种方法实现标记片段的检测或验证，标记片段的检测或验证可依赖于标记部分或包含标记的切割结构的部分的特点。
在本发明的一个实施方式中，分析包括所释放的标记片段在内的反应产物的大小。确定标记的片段的大小的方法是本领域已知的，包括，例如，凝胶电泳、梯度沉积、凝胶排阻层析法、质谱法和同系层析法。在另一实施方式中，当一对相互作用的标记物分开时产生可检测信号。
在一个实施方式中，通过结合部分结合于附着于固相支持物的捕获元件而捕获释放的标记片段。
1.捕获元件
根据本发明，捕获元件可以是(例如通过形成氢键或通过例如核酸结合蛋白与核酸结合位点之间或互补核酸之间的相互作用)特异性结合结合部分的任何部分，其中所述特异性结合由结合部分和捕获元件之间存在的吸引力引起。
根据本发明，结合部分结合捕获元件的探针区域。本发明的捕获元件可以是与结合部分互补并通过例如形成氢键而与之结合的核酸序列，所述结合部分包含结合捕获元件的探针区域。例如，结合部分是包含如下核酸序列的探针区域：5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQ ID NO：26)，而相应的捕获元件包含核酸序列：5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQ ID NO：27)。
本发明还提供结合部分-捕获元件对或标签-捕获元件对，其中结合部分或标签是DNA结合蛋白，而相应的捕获元件是被DNA结合蛋白识别并结合的DNA序列。本发明还提供结合部分-捕获元件对或标签-捕获元件对，其中捕获元件是DNA结合蛋白，而相应的结合部分或标签是被DNA结合蛋白识别并结合的DNA序列。
可用于本发明的DNA序列/DNA结合蛋白相互作用包括但不限于c-myb、AAF、abd-A、Abd-B、ABF-2、ABF1、ACE2、ACF、AD A2、ADA3、Adf-1、Adf-2a、ADR1、AEF-1、AF-2、AFP1、AGIE-BP1、AhR、AIC3、AIC4、AID2、AIIN3、ALFlB、α-1、α-CP1、α-CP2a、α-CP2b、α-因子、α-PAL、α2uNF1、α2uNF3、αA-CRYBP1、αH2-αH3、αMHCBF1、aMEF-2、AML1、AnCF、ANF、ANF-2、Antp、AP-1、AP-2、AP-3、AP-5、APETALA1、APET ALA3、AR、ARG RI、ARG RII、Arnt、AS-C T3、AS321、ASF-1、ASH-1、ASH-3b、ASP、AT-13P2、ATBFl-A、ATF、ATF-1、ATF-3、ATF-3δZIP、ATF-aδ、ATF-like、Athb-1、Athb-2、Axial、abaA、ABF-1、Ac、ADA-NF1、ADD1、Adf-2b、AF-1、AG、AIC2、AIC5、ALFlA、α-CBF、α-CP2a、α-CP2b、α-IRP、α2uNF2、αHO、AmdR、AMT1、ANF-1、Ap、AP-3、AP-4、APETALA2、aRA、ARGRIII、ARP-1、Ase、ASH-3a、AT-BP1、ATBFl-B、ATF-2、ATF-a、ATF/CREB、Ato、B因子、B″、B-Myc、B-TFIID、带I因子、BAP、Bed、BCFI、Bcl-3、β-1、BETA1、BETA2、BF-1、BGP1、BmFTZ-F1、BP1、BR-C Z1、BR-C Z2、BR-C Z4、Brachyury、BRF1、BrIA、Bm-3a、Brn-4、Brn-5、BUF1、BUF2、B-Myb、BAF1、BAS1、BCFII、β-因子、BETA3、BLyF、BP2、BR-C Z3、brahma、byr3、c-abl、c-Ets-1、c-Ets-2、c-Fos、c-Jun、c-Maf、c-myb、c-Myc、c-Qin、c-Rel、C/EBP、C/EBPα、C/EBPβ、C/EBPδ、C/EBPε、C/EBPγ、C1、CAC-结合蛋白、CACCC-结合因子、Cactus、Cad、CAD1、CAP、CArG盒-结合蛋白、CAUP、CBF、CBP、CBTF、CCAAT-结合因子、CCBF、CCF、CCK-1a、CCK-1b、CD28RC、CDC10、Cdc68、CDF、cdk2、CDP、Cdx-1、Cdx-2、Cdx-3、CEBF、CEH-18、CeMyoD、CF1、Cf1a、CF2-I、CF2-II、CF2-IH、CFF、CG-1、CHOP-10、Chox-2.7、CIIIB1、Clox、Cnc、CoMP1、核心结合因子、CoS、COUP、COUP-TF、CP1、CPlA、CPlB、CP2、CPBP、CPC1、CPE结合蛋白CPRF-1、CPRF-2、CPRF-3、CRE-BP1、CRE-BP2、CRE-BP3、CRE-BPa、CreA、CREB、CREB-2、CREBω、CREMα、CREMβ、CREMδ、CREMε、CREMγ、CREMtauα、CRF、CSBP-1、CTCF、CTF、CUP2、Cut、Cux、Cx、细胞周期蛋白A、CYS3、D-MEF2、Da、DAL82、DAP、DAT1、DBF-A、DBF4、DBP、DBSF、dCREB、dDP、dE2F、DEF、Delilah、δ因子、δCREB、δE1、δEF1、δMax、DENF、DEP、DF-1、Dfd、dFRA、地高辛受体、dJRA、D1、DII、DIx、DM-SSRP1、DMLP1、DP-1、Dpn、DrI、DRTF、DSC1、DSP1、DSXF、DSXM、DTF、E、ElA、E2、E2BP、E2F、E2F-BF、E2F-1、E4、E47、E4BP4、E4F、E4TF2、E7、E74、E75、EBF、EBF1、EBNA、EBP、EBP40、EC、ECF、ECH、EcR、eE-TF、EF-1A、EF-C、EF1、EFγ、Egr、eH-TF、EIIa、EivF、EKLF、EIf-1、EIg、EIk-1、ELP、Elt-2、EmBP-1、胚胎DNA结合蛋白、Emc、EMF、Ems、Emx、En、ENH-结合蛋白、ENKTF-1、εF1、ER、Erg、Esc、ETF、Eve、Evi、Evx、Exd、Ey、f(α-ε)、F-ACT1、f-EBP、F2F、因子1-3、因子B1、因子B2、因子δ、因子I、FBF-A1、Fbf1、FKBP59、Fkh、FIbD、Flh、Fli-1、FLV-1、Fos-B、Fra-2、Fra1、FRG Y1、FRG Y2、FTS、Ftz、Ftz-F1、G因子、G6因子、GA-BF、GABP、GADD 153、GAF、GAGA因子、GAL4、GAL80、γ-因子、γCAAT、γCAC、γOBP、GATA-1、GATA-2、GATA-3、GBF、GC1、GCF、GCF、GCN4、GCR1、GE1、GEBF-1、GF1、GFI、Gfi-1、GFII、GHF-5、GL1、Glass、GLO、GM-PBP-1、GP、GR、GRF-1、Gsb、Gsbn、Gsc、Gt、GT-1、Gtx、H、H16、H1lTF1、H2Babp1、H2RIIBP、H2TF1、H4TF-1、HAC1、HAP1、Hb、HBLF、HBP-1、HCM1、热诱导因子、HEB、HEF-1B、HEF-1T、HEF-4C、HEN1、HES-1、HIF-1、HiNF-A、HIP1、HIV-EP2、HIf、HMBI、HNF-1、HNF-3、Hoxl1、HOXA1、HOXA10、HOXA10PL2、HOXA11、HOXA2、HOXA3、HOXA4、HOXA5、HOXA7、HOXA9、HOXB1、HOXB3、HOXB4、HOXB5、HOXB6、HOXB7、HOXB8、HOXB9、HOXC5、HOXC6、HOXC8、HOXD1、HOXD10、HOXDI1、HOXD12、HOXD13、HOXD4、HOXD8、HOXD9、HP1位点因子、Hp55、Hp65、HrpF、HSE-结合蛋白、HSF1、HSF2、HSF24、HSF3、HSF30、HSF8、hsp56、Hsp90、HST、HSTF、I-POU、IBF、IBP-1、ICER、ICP4、ICSBP、IdI、Id2、Id3、Id4、IE1、EBP1、IEFga、IF1、IF2、IFNEX、IgPE-1、DC-1、IκB、11-1RF、IL-6RE-BP、11-6RF、ILF、ILRF-A、IME1、INO2、INSAF、IPF1、IRBP、IRE-ABP、IREBF-1、IRF-1、ISGF-1、IsI-1、ISRF、ITF、IUF-1、Ixr1、JRF、Jun-D、JunB、JunD、K-2、kappay因子、kBF-A、KBF1、KBF2、KBP-1、KER-1、Ker1、KN1、Kni、Knox3、Kr、kreisler、KRF-1、Krox-20、Krox-24、Ku自身抗原、KUP、Lab、LAC9、LBP、Lc、LCR-F1、LEF-1、LEF-1S、LEU3、LF-A1、LF-B1、LF-C、LF-H3β、LH-2、Lim-1、Lim-3、lin-11、lin-31、lin-32、LIP、LIT-1、LKLF、Lmx-1、LRF-1、LSF、LSIRF-2、LVa、LVb-结合因子、LVc、LyF-1、LyI-1、M因子、M-Twist、M1、m3、Mab-18、MAC1、Mad、MAF、MafB、MafF、MafG、MafK、Ma163、MAPF1、MAPF2、MASH-1、MASH-2、mat-Mc、mat-Pc、MATaI、MATα1、MATα2、MATH-1、MATH-2、Max1、MAZ、MBF-1、MBP-1、MBP-2、MCBF、MCM1、MDBP、MEB-1、Mec-3、MECA、介导因子、MEF-2、MEF-2C、MEF-2D、MEF1、MEP-1、Meso1、MF3、Mi、MIF、MIG1、MLP、MNB1a、MNF1、MOK-2、MP4、MPBF、MR、MRF4、MSN2、MSN4、Msx-1、Msx-2、MTF-1、mtTF1、muEBP-B、muEBP-C2、MUF1、MUF2、Mxi1、Myef-2、Myf-3、Myf-4、Myf-5、Myf-6、Myn、MyoD、肌形成蛋白、MZF-1、N-Myc、N-Oct-2、N-Oct-3、N-Oct-4、N-Oct-5、Nau、NBF、NC1、NeP1、Net、NeuroD、neurogenin、NF III-a、NF-1、NF-4FA、NF-AT、NF-BA1、NF-CLEOa、NF-D、NF-E、NF-EIb、NF-E2、NF-EM5、NF-GMa、NF-H1、NF-IL-2A、NF-InsE1、NF-κB、NF-λ2、NF-MHCIIA、NF-muE1、NF-muNR、NF-S、NF-TNF、NF-U1、NF-W1、NF-X、NF-Y、NF-Zc、NFα1、NFAT-1、NFβA、NFδE3A、NFδE4A、NFe、NFE-6、NFH3-1、NFH3-2、NFH3-3、NFH3-4、NGFI-B、NGFI-C、NHP、Nil-2-a、NIP、NIT2、Nkx-2.5、NLS1、NMH7、NP-III、NP-IV、NP-TCII、NP-Va、NRDI、NRF-1、NRF-2、Nrf1、NrG、NRL、NRSF form1、NTF、NUC-1、Nur77、OBF、OBP、OCA-B、OCSTF、OcM、Oct-10、Oct-11、Oct-2、Oct-2.1、Oct-2.3、Oct-4、Oct-5、Oct-6、Oct-7、Oct-8、Oct-9、Oct-B2、Oct-R、Octa-因子、八聚体-结合因子、Odd、Olf-1、Opaque-2、Otd、Otx1、Otx2、Ovo、P、P1、p107、p130、p28调节物、p300、p38erg、p40x、p45、p49erg、p53、p55、p55erg、p58、p65δ、p67、PAB1、PacC、Pap1、Paraxis、Pax-1、Pax-2、Pax-3、Pax-5、Pax-6、Pax-7、Pax-8、Pb、Pbx-1a、Pbx-1b、PC、PC2、PC4、PC5、Per1、PCRE1、PCT1、PDM-1、PDM-2、PEA1、PEB1、PEBP2、PEBP5、Pep-1、PF1、PGA4、PHD1、PH02、PHO4、PHO80、Phox-2、Pit-1、PO-B、pointedP1、Pou2、PPAR、PPUR、PPYR、PR、PR A、Prd、PrDI-BF1、PREB、Prh蛋白a、蛋白b、蛋白c、蛋白d、PRP、PSE1、PTF、Pu盒结合因子、PU.1、PUB1、PuF、PUF-1、Pur因子、PUT3、pX、qa-1F、QBP、R、R1、R2、RAd-1、RAF、RAP1、RAR、Rb、RBP-Jκ、RBP60、RC1、RC2、REB1、ReIA、ReIB、CAR1表达的阻抑物、REX-1、RF-Y、RF1、RFX、RGM1、RIM1、RLM1、RME1、Ro、RORα、Rox1、RPF1、RPGα、RREB-1、RRF1、RSRFC4、runt、RVF、RXR-α、RXR-β、RXR-β2、RXR-γ、S-CREM、S-CREMβ、S8、SAP-1a、SAP1、SBF、Sc、SCBPα、SCD1/BP、SCM-诱导因子、Scr、Sd、Sdc-1、SEF-1、SF-1、SF-2、SF-3、SF-A、SGC1、SGF-1、SGF-2、SGF-3、SGF4、SIF、SIII、Sim、SIN1、Skn-1、SKO1、Slp1、Sn、SNP1、SNF5、SNAPC43、Sox-18、Sox-2、Sox-4、Sox-5、Sox-9、Sox-LZ、SpI、spE2F、Sph 因子、Spi-B、Sρrm-1、SRB10、SREBP、SRF、SRY、SSDBP-1、ssDBP-2、SSRP1、STAF-50、STAT、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5、STAT6、STC、STD1、Stel1、Stel2、Ste4、STM、Su(f)、SUM-1、SWI1、SWI4、SWI5、SWI6、SWP、T-Ag、t-Pou2、T3R、TAB、包括亚基在内的所有TAF、TaI-1、TAR因子、tat、Tax、TBF1、TBP、TCF、TDEF、TEA1、TEC1、TEF、te1、Tf-LF1、TFE3、所有TFII相关蛋白、TBA1a、TGGCA-结合蛋白、TGT3、ThI、TIF1、TIN-1、TIP、TI1、TMF、TR2、Tra-1、TRAP、TREB-1、TREB-2、TREB-3、TREF1、TREF2、Tsh、TTF-1、TTF-2、Ttk69k、TTP、Ttx、TUBF、Twi、TxREBP、TyBF、UBP-1、Ubx、UCRB、UCRF-L、UF1-H3β、UFA、UFB、UHF-1、UME6、Unc-86、URF、URSF、URTF、USF、USF2、v-ErbA、v-Ets、v-Fos、v-Jun、v-Maf、v-Myb、v-Myc、v-Qin、v-Rel、Vab-3、痘苗病毒DNA-结合蛋白、Vav、VBP、VDR、VETF、vHNF-1、VITF、Vmw65、VpI、Vp16、Whn、WT1、X-盒结合蛋白、X-Twist、X2BP、XBP-1、XBP-2、XBP-3、XF1、XF2、XFD-1、XFD-3、xMEF-2、XPF-1、XrpFI、XW、XX、yan、YB-1、YEB3、YEBP、Yi、YPF1、YY1、ZAP、ZEM1、ZEM2/3、Zen-1、Zen-2、Zeste、ZF1、ZF2、Zfh-1、Zfh-2、Zfp-35、ZID、Zmhoxla、Zta以及所有与这些DNA结合蛋白或活性相关的已表征和未表征的同源物和家族成员和上述DNA结合蛋白所识别的DNA序列。鉴定被DNA结合蛋白所识别的DNA序列的方法是本领域已知的(见例如，U.S.6,139,833)。
本发明还预见了DNA序列/DNA结合蛋白相互作用，包括但不限于，四环素(tet)阻抑物、β-半乳糖苷酶(lac阻抑物)、色氨酸(trp)阻抑物、λ特异性阻抑蛋白、CRO和分解代谢物激活物蛋白、CAP和由这些DNA结合蛋白所识别的DNA序列，这些是本领域已知的。可用于本发明的DNA/DNA结合蛋白相互作用还包括限制性酶和相应的限制性酶切位点，优选地，其中限制性酶的核酸酶活性是被抑制的(U.S.5,985,550，通过引用并入本文)。
可用于本发明的其他DNA：蛋白质相互作用包括：(i)表1和表2列出的DNA蛋白质相互作用，和(ii)细菌、酵母和噬菌体系统例如λOL-OR/CrO(U.S.5,726,014，通过引用并入本文)。任何包含结合特异性识别序列和同种识别序列的蛋白质的对均可用于本发明。
表1
表2
进行使如本文所述的捕获元件和如本文所述的结合部分之间发生特异性结合的方法是本领域已知的(见例如，Sambrook et al.，见上；Ausubel et al.，见上)。本发明的捕获元件也可以是(例如，通过形成共价键或氢键或静电吸引或通过例如蛋白质和配体之间、抗体和抗原之间、蛋白质亚基之间或核酸结合蛋白和核酸结合位点之间的相互作用)特异性结合结合部分或标签的任何部分，其中所述特异性结合由结合部分或标签和捕获元件之间存在的吸引力引起。进行使如本文所述的捕获元件和如本文所述的标签之间发生特异性结合的方法是本领域已知的(见例如，Sambrook et al.，见上；Ausubel et al.，见上)。所述特异性结合仅在包含所述结合部分的探针的二级结构发生本文中所定义的″改变″时才出现。可用于本发明的捕获元件包括但不限于核酸结合蛋白或核苷酸序列、生物素、生物链菌素、半抗原、蛋白质、核苷酸序列或化学反应性部分。
在本发明的一个实施方式中，分析包括所释放的标记片段在内的反应产物的大小。确定标记的片段的大小的方法是本领域已知的，包括，例如，凝胶电泳、梯度沉积、凝胶排阻层析法、质谱法和同系层析法。在另一实施方式中，当一对相互作用的标记物分开时产生可检测信号。
2.固相基材
本发明的固相基材是分子(例如捕获元件)可与之不可逆结合的任何表面，包括但不限于膜、琼脂糖珠、磁珠、组织培养板、基于二氧化硅的基质、基于膜的基质、包含表面的珠包括但不限于苯乙烯、乳胶或基于二氧化硅的材料和其他聚合物例如醋酸纤维素、聚四氟乙烯、聚偏二氟乙烯、尼龙、硝化纤维素、聚酯、碳酸酯、聚砜、金属、沸石、纸、氧化铝、玻璃、聚丙烯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚酰胺、塑料、滤纸、葡聚糖、锗、硅、(聚)四氟乙烯、砷化镓、磷化镓、二氧化硅、硝酸硅及其组合。
可用于本发明的固相基材也可参见：Sambrook et al.，见上，Ausubel et al.，见上，美国专利5,427,779，5,512,439，5,589,586，5,716,854和6,087,102，Southern et al.，1999，Nature Genetics Supplement.21：5and Joos et al.，1997，Analytical Biochemistry，247：96。
将捕获元件附着于固相支持物的方法是本领域已知的，并可参见：Sambrook et al.，见上，Ausubel et al.，见上，美国专利5,427,779，5,512,439，5,589,586，5,716,854和6,087,102，以及Southern et al.，见上，和Joos et al.，见上。将核酸序列固定化于固相支持物的方法由固相支持物的生产商提供，例如，对于膜：Pall Corporation，Schleicher & Schuell，对于磁珠：Dyal，对于培养板：Costar，Nalgenunc，对于根据本发明可用的其他支持物：CPG，Inc。
可在标记片段仍结合于捕获元件时或在标记片段从捕获元件释放后测定与附着于固相支持物的捕获元件相结合的释放的标记片段的量。通过在存在过量的竞争性非标记片段的情况下温育标记片段-捕获元件复合物或通过加入抑制(例如因盐浓度或pH所致)标记片段与捕获元件结合的缓冲液而使得标记的片段从捕获元件上释放。
在扩增过程中或之后，可采用如下方式从例如PCR混合物中分离释放的标记片段：例如，使PCR接触固相提取剂(SPE)。例如，可在PCR混合物中加入能够根据大小、电荷或与核酸碱基的相互作用而与核酸相结合的材料，其中标记的未切割核酸被结合，而短的标记片段不结合。此类SPE材料包括离子交换树脂或珠，例如商品化的结合颗粒Nensorb(DuPont Chemical Co.)、Nucleogen(The Nest Group)、PEI、BakerBondTM PEI、Amicon PAE 1,000、SelectacelTM PEI、具有3’-核糖探针的Boronate SPE、含有与探针3’末端互补的序列的SPE以及羟基磷灰石。在具体实施方式中，如果使用包含由易被核酸酶切割的位点分开的3’生物素标记物和5’标记物的双重标记的寡核苷酸作为信号工具，则可使反应混合物例如PCR扩增的混合物接触含有特异性结合元件(例如抗生物素蛋白或生物链菌素或抗生物素抗体或单克隆抗体)的材料，所述材料结合于固相支持物例如珠和颗粒(包括磁性颗粒)。
在反应混合物例如PCR混合物与SPE接触的步骤之后，可通过过滤、沉降或磁性吸引而除去SPE材料，留下不含未切割的标记寡核苷酸的标记片段用于检测。
3.结合部分
本发明的结合部分指的是探针被核酸酶切割后释放的并(通过与互补核酸形成氢键或通过与结合蛋白相互作用)特异性结合捕获元件的探针区域，其中所述特异性结合由结合部分和捕获元件之间存在的吸引力引起，且其中所述结合部分和捕获元件之间的特异性结合仅在探针的二级结构发生本文中所定义的″改变″时才出现。
″标签″指的是有效地连接于探针5’末端(例如图1的R)并特异性结合捕获元件的部分，其中所述特异性结合由标签和捕获元件之间存在的吸引力引起，且其中所述标签和捕获元件之间的特异性结合仅在探针的二级结构发生改变(例如，使得标签可被捕获元件接近)时才出现。″特异性结合″当涉及″标签″和捕获元件时指的是通过形成共价键或氢键或静电吸引或通过，例如，蛋白质和配体之间、抗体和抗原之间、蛋白质亚基之间或核酸结合蛋白和核酸结合位点之间的相互作用。第二结合部分包括但不限于生物素、生物链菌素、半抗原、蛋白质或化学反应性部分。
根据本发明，结合部分包含结合捕获元件的探针区域。本发明的捕获元件可以是与结合部分互补并通过例如形成氢键而与之结合的核酸序列，所述结合部分包含结合捕获元件的探针区域。例如，结合部分是包含如下核酸序列的探针区域：5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQ ID NO：26)，而相应的捕获元件包含核酸序列：5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQ IDNO：27)。
本发明还提供结合部分-捕获元件对或标签-捕获元件对，其中结合部分或标签是DNA结合蛋白，而相应的捕获元件是被DNA结合蛋白识别并结合的DNA序列。本发明还提供结合部分-捕获元件对或标签-捕获元件对，其中捕获元件是DNA结合蛋白，而相应的结合部分或标签是被DNA结合蛋白识别并结合的DNA序列。
可用于本发明的DNA结合序列/DNA结合蛋白相互作用见前面标题为“检测释放的标记的片段”的部分。
将如本文所述的标签掺入核酸(例如，本发明的探针)的方法是本领域已知的，并可参见Ausubel et al.，见上，Sambrook et al.，见上，和美国专利5,716,854和6,087,102。
IV.确定探针二级结构的稳定性
A.解链温度测定
解链温度测定利用的是双链和单链DNA具有不同吸收特性这一点，也就是说，通过分光光度法测定，双链DNA(双链DNA是这样一部分核酸序列，其自身折叠产生反向平行双链体结构，其中互补序列(碱基对)通过形成氢键而结合)在波长260nm处的光吸收少于单链DNA。
DNA的变性发生在狭窄的温度范围内，变性导致DNA许多物理性质的显著变化。一种特别有用的变化是光密度。核苷酸的杂环在紫外线范围强烈吸收光(最大吸收波长在260nm附近，其对每种碱基均是特征性的)。但是，DNA的吸收比相同组成的游离寡核苷酸混合物低了约40％。这一效应称为增色性，它源自碱基电子系统的相互作用，它们在双螺旋状的平行排列中的堆积可能引起这种相互作用。任何偏离双链体状态的变化立即反映在该效应的下降(即光密度朝游离碱基的特征值方向升高)(图12a)。因此可通过增色性跟踪双链DNA的变性(图12b和12c)。
DNA链发生分离的温度范围中点被称为解链温度，以Tm表示。图12c显示了由吸光度变化测定的解链曲线的实例。该曲线总是采取相同的形式，但其在温标上的绝对位置(即其Tm)同时受DNA碱基组成和使用的变性条件的影响。
DNA分子的解链温度明显取决于其碱基组成。富含GC碱基对的DNA分子的Tm比富含AT碱基对的DNA分子高(图12b)。许多物种DNA的Tm随GC含量呈线性变化，随GC碱基对的比例从20％升高至78％，Tm也随之从77℃升高至100℃。即Tm对碱基组成的依赖性是线性的，G-C含量每增加1％，Tm增加约0.4℃。GC碱基对比AT碱基对更加稳定，因为它们的碱基对由三个氢键连接在一起，而不是两个。此外，邻近的GC碱基对之间的相互作用比邻近的AT碱基对更强。因此，DNA富含AT的区域首先解链。
一种对Tm的主要效应是由溶液离子强度施加的。单价阳离子浓度每增加10倍，Tm增加16.6℃。最常使用的条件是在0.12M磷酸缓冲液中进行DNA操作，其提供0.18M单价Na+浓度和90℃左右Tm。
在存在破坏氢键稳定性的试剂例如甲酰胺的情况下进行反应，可极大地改变Tm。这可使Tm低至40℃，优点是DNA不会发生暴露于高温所产生的损伤(例如链断裂)(Stryer，Biochemistry，1998，3rd Edition，W.H.Freeman and Co.，81-82页和Lewin，Genes II，1985，John Wiley & Sons，63-64页)。
按如下的解链温度测定方法测定本发明的探针二级结构的稳定性。
在足以允许探针变性和重退火的各种温度和时间下和在允许探针变性和重退火的缓冲液中温育含有约0.2μg/ml到100μg/ml探针的样品，在分光光度计中测量石英比色杯(具有适合于使用的分光光度计的光程长度，例如1cm)中样品在温度范围下的吸光度，其中温度范围的下限温度至少比探针的Tm或预测Tm低50℃，而温度范围的上限温度至少比探针的Tm或预测Tm高50℃，制备探针的标准曲线(例如图12c)，其中以吸光度对温度作图。根据本领域熟知的方法(参看Sambrook，同上；Ausubel，同上)，基于碱基对组成预测探针的Tm。使用各种缓冲液(例如1X TNE缓冲液(10X-0.1M Tris碱，10mM EDTA，2.0M NaCl，pH 7.4)、本文描述的FEN核酸酶缓冲液、本文描述的1X克隆Pfu缓冲液、本文描述的1X哨兵分子信标缓冲液)，其中含有可能适合和优选最适合用于切割反应的特定核酸酶的缓冲液，生成和比较标准曲线。随温度升高监测缓冲液的pH，按需要进行调整。
在单光束紫外线到可见光范围(UV-VIS)的分光光度计中进行该测定。优选情况下，通过自动比较含有样品溶液的比色杯和含有空白的参照比色杯(匹配比色杯)，在双光束分光光度计中进行测定以简化测量。空白是等体积的样品缓冲液。
可控制分光光度计的温度，以便在特定的温度下测量样品的吸光度。可用于本发明的分光光度计包括但不限于结合使用MicroTm Analysis Accessory的Beckman Coulter
600/7000分光光度计(Beckman Coulter，Inc.，Columbia，MD)。
探针二级结构在特定温度和缓冲液中的稳定性可通过测量探针在上述特定温度下的吸光度和测定吸光值是否低于由标准曲线所测定的Tm时的吸光值来测定，其中使用与检测温度时使用的相同缓冲液或上述已知可产生类似标准曲线的缓冲液生成该标准曲线，其中缓冲液可能适合和优选最适合用于探针切割反应的核酸酶。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下吸光度水平低于(即至少5％，优选20％，最优选25％或更多)相当于探针Tm的温度时的吸光度水平，则探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的解链温度测定中是“稳定的”(参看图12c和12d)。
B.PRET
FRET测定可用于本发明的两个用途。第一是测定本文定义的探针二级结构是否“稳定”。第二是测定探针结合到靶核酸时探针的二级结构是否发生“改变”。
“FRET”是两个染料分子电子激发态之间距离依赖型的相互作用，其中激发从一个供体分子转移到一个受体分子。FRET是由分隔一个荧光供体基团和一个相互作用的共振能量受体(或是另一个荧光团、发色团或猝灭剂)的距离的变化引起的。供体部分和受体部分的组合被称为“FRET对”。有效的FRET相互作用需要染料对的吸收光谱和发射光谱具有高度的重叠性。
在大多数实施方式中，FRET的供体染料和受体染料是不同的，其中可通过受体敏化荧光的出现和/或通过供体荧光的猝灭来检测FRET。当供体和受体相同时，通过形成的荧光偏振检测FRET。FRET依赖于分子间距离的负6次方(Stryer等人，1978，Ann.Rev.Biochem.，47：819；Selvin，1995，Methods Enzvmol..246：300)。。
本文中所用的术语“供体”指的是在第一波长处吸收并在第二更长波长处发射的荧光团。术语“受体”指的是具有与供体发射光谱重叠的吸收光谱的荧光团、发色团或猝灭剂，当位于供体基团附近时(一般1-100nm之间)，它们可吸收来自供体的部分或大部分发射能量。如果受体是可表现出FRET的荧光团，那么它在第三更长波长处再次发射；如果它是发色团或猝灭剂，那么它将释放吸收自供体的能量，而不发射光子。虽然受体基团与供体基团邻近时受体的吸收光谱与供体的发射光谱重叠，但对于溶液中游离分子的光谱而言，无需这样。因此受体包括表现出FRET或猝灭的荧光团、发色团或猝灭剂，其中当受体位于本发明的探针上的供体附近时，由于探针结合本文定义的靶核酸而发生变化的探针二级结构的存在，受体发生猝灭。受体不包括在a)等于或高于Tm的温度(例如比Tm高5℃，例如6℃、10℃、25℃、50℃或更多)下或在b)靶核酸存在时表现出FRET或猝灭的荧光团、发色团或猝灭剂。
本文提及的“荧光”或“荧光基团”或“荧光团”分别包括发光和发光基团和适宜的发色团。适宜的发光探针包括但不限于以lanthium螯合物加入的铕和铽的发光离子(Heyduk和Heyduk，1997)。镧系元素离子也是将能量转移给荧光基团的良好供体(Selvin，1995)。可使用“开笼”螯合物亚磷酰胺将含有镧系元素离子的发光离子掺入核酸。
本文中所用的术语“猝灭”指的是能量从供体转移到受体，其中伴有供体所显示的荧光强度降低。
供体和受体基团可独立地选自适宜的荧光基团、发色团和猝灭基团。可用于本发明的供体和受体包括但不限于：5-FAM(也称为5-羧基荧光素；也称为Spiro(异苯并呋喃-1(3H)，9′-(9H)占吨)-5-羧酸，3′，6′-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素(isobenzofuran-1(3H)，9′-(9H)xanthene)-5-carboxylic acid，3′，6′-dihydroxy-3-oxo-6-carboxyfluorescein))；5-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰-荧光素基)-6-羧酸])；6-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；5-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；6-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-6-羧酸])；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，4-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基-氨基))；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基氨基))；EDANS(5-((2-氨乙基)氨基)萘-1-磺酸)；1，5-IAEDANS(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)；DABCYL(4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸)Cy5(吲哚二碳菁-5)Cy3(吲哚二碳菁-3)；和BODIPY FL(2，6-二溴-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-二环戊二烯并苯-3-丙酸)(2，6-dibromo-4，4-difluoro-5，7-dimethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene-3-proprionic acid)以及它们的适宜衍生物。
在本发明的某些实施方式中，探针也可标记上两个发色团，并将标记物对的吸收谱的变化用作检测信号，以替代测定荧光的改变。
在本发明的方法中，使用荧光分光光度计或微量滴定板读取仪，根据本领域已知的方法在一或多个波长测定探针的荧光强度。
C.荧光猝灭测定
荧光猝灭测定可用于本发明的两个用途。第一是测定本文定义的探针二级结构是否“稳定”。第二是测定探针结合靶核酸时探针的二级结构是否发生“变化”。
本发明的探针以一对相互作用的标记物或一对产生相互作用信号的部分(例如FRET对或非FRET对)标记，其中该对中的一个成员是荧光团，另一个成员是猝灭剂。例如，本发明的探针以荧光团和猝灭剂标记，可在没有靶核酸的情况下，在一定温度范围内测定荧光，其中该温度范围的下限温度比探针Tm或预测Tm至少低50℃，该温度范围的上限温度至少比探针Tm或预测Tm至少高50℃。
D.稳定性
如下确定本发明的探针的二级结构的″稳定性″。探针标记上一对相互作用的标记物(例如，四甲基罗丹明和DABCYL，或本文所述的任何相互作用的标记物(FRET对或非FRET对均可))，标记方法是本领域所熟知的(例如参见Glazer和Mathies，1997，Curr.Opin.Biotechnol..8：94；Ju等人，1995，Analytical Biochemistry，231：131)。这对相互作用的标记物在探针的位置可使得探针结合到靶核酸后探针的二级结构发生变化时，标记物被分开。
将含有配于1X解链缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM MgCl2)或配于5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA或配于其他适宜缓冲液中一般为125nM探针的样品温育一段足以允许探针变性和重退火的时间，制备探针的标准曲线(例如图12e)，其中以荧光对温度进行作图一般情况下使用每分钟发生1℃变化的荧光计或分光光度计在一定温度范围内测量荧光计的荧光或扫描荧光分光光度计，生成标准曲线，其中该温度范围的下限温度比探针Tm或预测Tm至少低50℃，而该温度范围的上限温度比探针Tm或预测Tm至少高50℃)。根据本领域熟知的方法(参看Sambrook，同上；Ausubel，同上)，基于碱基对组成预测探针的Tm。
使用各种缓冲液(例如1X TNE缓冲液(10X-0.1M Tris碱，10mM EDTA，2.0M NaCl，pH 7.4)、本文描述的FEN核酸酶缓冲液、本文描述的1X克隆Pfu缓冲液)，其中含有可能适合和优选最适合用于切割反应的特定核酸酶的缓冲液，生成和比较标准曲线。随温度升高监测缓冲液的pH，按需要进行调整。
可控制荧光计或分光光度计的温度，以便在特定的温度下测量样品的荧光。例如可使用结合可调温的水浴器(例如可从Fisher Scientific获得)的Perkin-Elmer LS50B发光分光光度计，测量荧光。
探针二级结构在特定温度下的稳定性可通过测量探针在上述特定温度下的荧光和测定荧光值是否低于标准曲线所测定的Tm处的荧光值来测定。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下荧光水平发生变化(即相对于探针Tm的温度时的荧光水平至少多于或少于5％，优选20％，最优选25％)，探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的FRET测定中是“稳定的”。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下荧光水平发生变化(即相对于探针Tm的温度时的荧光水平至少多于或少于5％，优选20％，最优选25％)，探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的荧光猝灭测定中是“稳定的”(见图12f和12g)。
或者，可修改Gelfand等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：6113，通过引用并入本文)的方法，测定以一对相互作用的标记物标记的探针在上文描述的温度范围内的荧光，从而测定探针二级结构的稳定性。
V.检测二级结构
如上所述(参看图12e)，可通过在FRET测定或荧光猝灭测定中针对包含一对相互作用的标记物的探针，生成荧光与温度的标准曲线，检测本发明的二级结构。表现出与温度变化呈相关性的荧光变化的探针(参看图12e)(例如荧光随FRET反应温度的升高而升高)可形成二级结构。
VI.测定二级结构的改变
可在FRET测定或荧光猝灭测定中和上述低于探针Tm的特定温度下(例如切割温度)，在存在或不存在100nM到10μM靶核酸(一般靶核酸比探针浓度过量2-4摩尔，即使用250-500nm的靶核酸)的情况下，分析包含一对相互作用的标记物的探针，来检测本发明的二级结构的改变。
或者，可修改Gelfand等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：6113，通过引用并入本文)的方法，在存在或不存在上文描述的靶核酸的情况下，测定以一对相互作用标记物标记的探针的荧光，从而测定探针二级结构的改变。
通过测定荧光的增加来测定当本发明的探针结合到靶核酸时所发生的二级结构的“改变”，使得探针在低于探针Tm的温度下结合到靶核酸后的荧光水平高于(例如至少5％，优选5-20％，更优选25％或更多)靶核酸序列不存在时观察到的荧光水平(参看图12g)。
VII.使用方法
本发明提供产生表明样品中存在靶核酸的信号的方法，步骤包括：通过温育靶核酸和探针形成标记的切割结构和用核酸酶(例如FEN核酸酶)切割所述切割结构。本发明的方法可用于如下所述的基于PCR的测定法。
按照标题为″切割结构″的部分所述形成标记的切割结构，其包含上游寡核苷酸引物(例如图4的A)、5’末端被标记的下游寡核苷酸探针提及靶核酸(例如图4的B)。在某些实施方式中，下游探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(例如图4的C)。简而言之，在如下条件下形成并切割切割结构：存在靶核酸，存在或不存在上游引物(例如图4的A)，如本文所述的标记的下游探针(例如图4的C)，任选地特异于靶核酸的扩增引物，核酸聚合酶活性(例如，DNA聚合酶)，核酸酶(例如FEN核酸酶)和合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，目录号#200536)，使用的PCR反应具有以下热循环参数：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒(变性步骤)；60℃，60秒(退火步骤)；和72℃，15秒(延伸步骤)。在该反应过程中，上游寡核苷酸(例如图4的A)被延伸，使得寡核苷酸A部分置换本发明的下游寡核苷酸探针的标记的5’末端(例如图4的寡核苷酸C)，并用本发明的核酸酶(例如，FEN核酸酶)切割所得到的标记的结构。或者，可使用的下游探针包含如本文所述的二级结构(包括茎环、发夹、内环、凸环、分叉结构和假结)或多个二级结构、三叶草型结构、或任何如本文所述的三维结构。也可使用如本文所述的双分子或多分子探针。根据本领域熟知的方法(见Sambrook et al.，见上，和Ausubelet al.，见上)，通过结合部分特异性结合于固相支持物上的捕获元件而捕获释放的标记片段。或者，直接检测释放的标记片段或切割的下游探针(例如，在一对相互作用的产生信号的部分之间切割下游探针)。
按照标题为″切割结构″的部分所述标记的切割结构，其包含上游寡核苷酸引物(例如图14的A)、具有一对相互作用的标记物的下游抗切割探针(例如图14的B)和靶核酸。简而言之，在如下条件下形成并切割切割结构：存在靶核酸，上游引物(例如图14的A)，具有一对相互作用的标记物下游抗切割探针(例如图14的B)，任选地特异于靶核酸的额外的扩增引物(例如，正向引物和反向引物，用于扩增靶)，核酸聚合酶活性(例如，DNA聚合酶)，核酸酶(例如FEN核酸酶)和合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，目录号#200536)，反应具有以下热循环参数：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒(变性步骤)；60℃，60秒(退火步骤)；和72℃，15秒(延伸/切割步骤)。反应过程中，上游引物(例如图14的A)被延伸，使得寡核苷酸的延伸的3’末端邻近(例如，毗邻)本发明的下游抗切割探针的5’互补区域(图14B)，由此形成非重叠(例如，非侵入型)切割结构。用本发明的核酸酶(例如，FEN核酸酶)在易于被切割的位置(例如，+1位的上游)切割所得到的标记的结构。直接检测释放的标记片段或切割的下游探针(例如，在一对相互作用的产生信号的部分之间切割下游探针)。
在另一实施方式中，在反应中进一步加入上游寡核苷酸，其中所述上游寡核苷酸的3’末端具有一或多个非互补核苷酸。因此，反应含有两种不同上游寡核苷酸的混合物，即所述具有非互补3’末端的上游寡核苷酸和所述引物。在一个实施方式中，所述引物和上游寡核苷酸均与靶的相同的通用区域互补，这样当其中之一发生退火时可排除另一个发生退火。在另一实施方式中，上游寡核苷酸位于引物的下游，但位于抗切割探针的上游。在这一实施方式中，上游寡核苷酸与引物和探针之间的部分杂交。上游寡核苷酸形成非侵入型切割结构，其可促成切割所述下游抗切割探针，而所述引物促成所述靶的扩增。
引物经聚合酶延伸后可形成侵入型切割结构。不过，引物的延伸指向在不易被切割的修饰的区域(图14B/C)切割抗切割探针。
在另一实施方式中，抗切割探针用于非基于PCR的方法。在这一实施方式中，按照标题为″切割结构″的部分所述形成标记的切割结构，其包含上游寡核苷酸和具有一对相互作用的标记物的下游抗切割探针和靶核酸。简而言之，在如下条件下形成并切割切割结构：存在靶核酸，上游寡核苷酸，具有一对相互作用的标记物的下游抗切割探针，核酸酶(例如FEN核酸酶)和合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，目录号#200536)，反应具有以下热循环参数：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒(变性步骤)；60℃，60秒(退火/切割)。在这一实施方式中，上游寡核苷酸不被聚合酶延伸(例如，封闭的上游寡核苷酸，不存在聚合酶，无dNTP)，但上游寡核苷酸与下游寡核苷酸足够接近(例如，毗邻)，由此形成非重叠切割结构。所得到的标记的结构在易于被切割的位置(例如，+1位的上游)被本发明的核酸酶(例如，FEN核酸酶)切割。直接检测释放的标记片段或切割的下游探针(例如，在一对相互作用的产生信号的部分之间切割下游探针)。
本发明的方法还可用于非基于PCR的用途来检测靶核酸，其中此类靶可被固定化于固相支持物。将核酸序列固定化于固相支持物上的方法是本领域已知的，例如参见Ausubel FM et al.Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Inc，并且生产商也给出了方案，例如对于膜：PallCorporation，Schleicher & Schuell，对于磁珠：Dynal，对于培养板：Costar，Nalgenunc，对于其他可用于本发明的支持物，CPG，Inc。可用于本发明的固相支持物包括但不限于基于二氧化硅的基质、基于膜的基质和包含表面的珠，包括但不限于，标题为″切割结构″的部分所述的任何固相支持物，包括苯乙烯、乳胶或基于二氧化硅的材料以及其他聚合物。磁珠也可用于本发明。可从上述生产商或其他知名生产商获得固相支持物。
本发明还提供非基于PCR的测定法来检测溶液中的靶核酸。本发明的方法可用于检测溶液中的天然存在的靶核酸，包括但不限于分离和纯化自细胞、组织、单细胞生物体、细菌或病毒的RNA和DNA。本发明的方法可用于检测溶液中的合成的靶，包括但不限于RNA或DNA寡核苷酸和肽核酸(PNA)。非PCR测定法包括但不限于涉及等温线性或指数扩增的检测测定法，其中由3′-5′合成活性合成的核酸的量呈线性增长或指数增长，并使用核酸酶(例如FEN核酸酶)切割在合成过程中被置换的链。一种这样的实例采用滚环扩增。
在本发明的一个实施方式中，可通过温育固定化的核酸靶序列或溶液中的靶核酸以及与靶核酸互补的上游寡核苷酸引物(例如图4的A)和下游寡核苷酸探针、核酸酶(例如FEN核酸酶)和具有或缺乏5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶，来检测固定化的或溶液中的核酸靶序列，所述探针具有的二级结构在结合于靶核酸后发生改变且所述探针包含与靶核酸互补的结合部分(例如图4的C)。下游探针是在5’或3’末端被末端标记的或是在内部标记的。或者，可使用的下游探针包含如本文所述的二级结构(包括茎环、发夹、内环、凸环、分叉结构和假结)或如本文所述的多个二级结构、三叶草型结构、或任何三维结构。还可使用双分子或多分子探针。检测通过结合部分结合于捕获元件而被捕获的释放的标记片段可使用同位素、酶促或比色等适合于被引入探针的具体标记物的本领域已知的方法(例如，Sambrook et al.，见上，Ausubel et al.，见上)。标题为″切割结构″的部分描述了可用于本发明的标记物和用于检测可用于本发明的标记物的方法。或者，下游探针还包含一对产生相互作用信号的标记部分(例如染料和猝灭剂)，它们放置的位置使得当探针是完整的时，可检测信号的产生被猝灭，且其中所述一对产生相互作用信号的部分被核酸酶切割位点(例如FEN核酸酶切割位点)分开。在另一个实施方式中，下游探针还包括一对产生相互作用信号的标记部分(例如染料和猝灭剂)，它们放置的位置使得当探针未与靶核酸杂交时，可检测信号的产生被猝灭。被核酸酶(例如FEN核酸酶)切割后，两个信号产生部分彼此分开并产生可检测信号。存在如上所述的一对产生相互作用信号的标记部分允许区分可结合于捕获元件的退火的、未切割探针和结合于捕获元件的释放的标记片段。可根据本发明的方法用于检测固定化的核酸靶序列或溶液中的核酸靶序列的核酸聚合酶包括缺乏5’至3’外切核酸酶活性的嗜常温性、嗜热性、或超嗜热性DNA聚合酶(参见标题为″核酸聚合酶″的部分)。任何具有5’至3’外切核酸酶活性的核酸聚合酶同样可用于本发明。
根据这一非基于PCR的方法，可检测到的靶核酸的量为优选地大约1pg至μg级，更优选地大约1pg至10ng，更优选地大约1pg至10pg。或者，这种非基于PCR的方法可测定或检测优选地大约1个分子至1020个分子，更优选地大约100个分子至1017个分子，更优选地大约1000个分子至1014个分子。
本发明还提供用于检测样品中的靶核酸的方法，其中按照标题为″切割结构″的部分所述形成切割结构，并通过非基于PCR的方法扩增靶核酸，这些方法包括但不限于等温方法如滚环、自我持续序列复制扩增(3SR)、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)以及非等温方法例如连接链反应(LCR)。用于非PCR扩增方法的核酸酶(例如，FEN核酸酶)在适合于所使用的具体扩增方法的温度范围内具有活性。
在如下所述的扩增方案，为了定量靶而需要进行处理的样品包括：样品、非模板对照、以及用于制备标准曲线的反应(含有稀释6个数量级的含有确定量的靶的溶液)。
链置换扩增(SDA)基于限制性酶能够切开其识别位点的半硫代磷酸酯(hemiphosphorothioate)形式的非修饰链。合适的DNA聚合酶将在该切口处起始复制，并置换下游非模板链(Walker，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：392和PCR Methods and Applications 3：1-6，1993)。能够用于本发明的SDA方法的聚合酶(Bca和Bst)也可用于本发明的核酸酶(例如FEN核酸酶)指导的切割。根据本发明的方法，分子信标被在42℃具有活性的核酸酶(例如，FEN核酸酶)和可切割探针取代，所述探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构且还包含结合部分，并包含本发明的切割结构。
分子信标(Mb)是荧光探针，其在溶液中形成茎环结构。典型地：附着于5’-茎区域(5-7nt)的5’-荧光染料(例如FAM)、环区域(与靶互补，20至30nt)、3’-茎区域(与5’-茎区域互补)、和猝灭剂(例如DABCYL)。当不存在靶时，MB形成它的茎，后者使得染料和猝灭剂靠近，因此不发出荧光。当MB结合于其靶时，茎打开，染料在空间上与猝灭剂分开，探针因此发出荧光(Tyagi S andKramer FR，Nature Biotechnology 14：303-308(1996)和美国专利5,925,517)。
链置换扩增(SDA)基本上按照Spargo et al.，Molecular and Cellular Probes10：247-256(1996)所述进行。所用的酶包括限制性内切酶BsoB1(New EnglandBiolabs)、DNA聚合酶5’-exo-Bca(Pan Vera Corporation)。靶是在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)基因组中发现的插入样元件(IS6110)。所用引物是B1：cgatcgagcaagcca(SEQ ID NO：35)、B2：cgagccgctcgctg(SEQ IDNO：36)、S1：accgcatcgaatgcatgtctcgggtaaggcgtactcgacc(SEQ ID NO：37)和S2：cgattccgctccagacttctcgggtgtactgagatcccctaccgcatcgaatgcatgtctcgggtaaggcgtactcgacc(SEQ ID NO：38)。结核分枝杆菌基因组DNA在人胎盘DNA中系列稀释。SDA在50μl如下样品中进行，样品含有：0至1000Mtb基因组等价物，500ng人胎盘DNA，160单位BsoB 1，8单位的5’-exo-Bca，1.4mM各种dCTPαS，TTP，dGTP，dATP，35mM K2PO4，pH 7.6 0.1mg/ml乙酰化牛血清白蛋白(BSA)，3mM Tris-HCl，10mM MgCl2，11mM NaCl，0.3mM DTT，4mM KCl，4％甘油，0.008mM EDTA，500nM引物S1和S2以及50nM引物B1和B2(KCl，甘油和EDTA由BsoB1储存液提供)。在沸水浴中加热样品(35μl)3分钟，然后加入15μl的New England Biolabs Buffer 2(20mM Tris-HCl pH 7.9，10mM MgCl2，50mM NaCl，1mM DTT)中的BsoB 1和5’-exo Bca(10.7单位/1μ BsoB 1和0.53单位/μl 5’-exo Bca)。在60℃温育15分钟，随后沸水浴5分钟。
取5μl各样品一式两份用于检测。各反应含有1X克隆Pfu缓冲液，3.0mM MgCl2，200μM的各种dNTP，5单位exo-Pfu，23ng Pfu FEN-1，1ng PEF，300nM各种上游引物：aaggcgtactcgacctgaaa(SEQ ID NO：39)和荧光探针(例如FAM-DABCYL)：accatacggataggggatctc(SEQ ID NO：40)。在热循环仪中进行一个循环的反应：2分钟，95℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃。在荧光板读取仪上测定荧光，例如Stratagene的FluorTracker或PE Biosystem的7700Sequence Detection System(Plate-Read Mode)。本发明的方法也可使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶和标题为″核酸酶″的部分所述的任何核酸酶。
根据基于核酸序列的扩增方法(NASBA)，使用分子信标在实时分析中定量NASBA RNA扩增子(Leone，et al.，1998.Nulceic Acids Res.26：2150)。根据本发明的方法，可进行NASBA，其中分子信标探针被核酸酶(例如FEN核酸酶)可切割的探针取代，所述可切割的探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分，且还包含本发明的切割结构和在41℃具有活性的核酸酶(例如FEN核酸酶)。
NASBA扩增基本上按照Leone G，et al.，Nucleic Acids Res.26：2150-2155(1998)所述进行。使用如下引物从马铃薯卷叶病毒(PLRV)扩增基因组RNA：PD415或PD416(反义)和PD417(有义)引物，这些引物的详情见Leone G et al.，J.Virol.Methods 66：19-27(1997)。各NASBA反应含有以下组分的预混合物：6μl的无菌水，4μl的5X NASBA缓冲液(5X NASBA缓冲液is 200mMTris-HCl，pH 8.5，60mM MgCl2，350mM KCl，2.5mM DTT，5mM各种dNTP，10mM各种ATP，UTP和CTP，7.5mM GTP和2.5mM ITP)，4μl的5X引物混合物(75％DMSO和1μM各种反义和有义引物)。预混合物被分为14μl的测试量样品，向其中加入1μl的PLRV靶。温育5分钟，65℃，冷却至41℃，5分钟，加入5μl的酶混合物(每一反应375mM山梨醇，2.1μg BSA，0.08单位的RNase H(Pharmacia)，32单位的T7RNA聚合酶(Pharmacia)和6.4单位的AMV-RT(Seigakaku))。扩增进行90分钟，41℃。
在一个实施方式中，取5μl的各样品一式两份用于反应。各反应含有1X克隆Pfu缓冲液，3.0mM MgCl2，200μM的各种dNTP，5单位exo-Pfu，23ngPfu FEN-1，1ng PEF，300nM各种上游引物PD415或PD416和荧光探针(例如FAM-DABCYL)：gcaaagtatcatccctccag(SEQ ID NO：41)。在热循环仪中进行一个循环的反应：2分钟，95℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃。在荧光板读取仪中测定荧光，例如Stratagene的FluorTracker或PE Biosystem的7700Sequence Detection System(Plate-Read Mode)。
在一个替代性实施方式中，通过将荧光探针和Pfu FEN-1核酸酶直接加入到非基于PCR的扩增(例如，NASBA)反应混合物中进行检测反应。荧光探针被设计为与启动子区域下游的靶区域互补。RNA聚合酶结合于启动子区域并合成RNA。当这两种寡核苷酸足够靠近时，合成的RNA 3’末端将与下游探针形成切割结构。因此，在这种方法中，扩增和切割同时发生。可使用Stratagene的Mx3005P QPCR System测定荧光。
在本发明的另一方法中，按照前面标题为″切割结构″的部分所述形成标记的切割结构，其包括上游寡核苷酸(例如，RNA聚合酶合成的RNA)(例如图4的A)、标记的下游寡核苷酸探针和靶核酸(例如图4的B)。在某些实施方式中，下游探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(例如图4的C)。简而言之，在如下条件下形成并切割切割结构：存在靶核酸，存在或不存在上游引物(例如图4的A)(取决于RNA聚合酶使用启动子还是引物来起始RNA合成)，如本文所述的标记的下游探针(例如图4的C)，核酸聚合酶活性(例如，RNA聚合酶)，核酸酶(例如FEN核酸酶)和合适的缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，目录号#200536)，反应具有以下热循环参数：95℃，1-2分钟，随后冷却至大约40-72℃。反应过程中，上游寡核苷酸(例如图4的A)被RNA聚合酶延伸，使得寡核苷酸A部分置换本发明的下游寡核苷酸探针的5’标记末端(例如图4的寡核苷酸C)，且所得到的标记的结构被本发明的核酸酶(例如，FEN核酸酶)切割。根据本领域熟知的方法(见Sambrooket al.，见上，和Ausubel et al.，见上)，通过结合部分特异性结合于固相支持物上的捕获元件而捕获释放的标记片段。或者，直接检测释放的标记片段或切割的下游探针(例如，在一对相互作用的产生信号的部分之间切割下游探针)。
一般来说，根据这些通过非基于PCR的方法进行扩增的方法，扩增在存在核酸酶(例如FEN核酸酶)的条件下进行，且扩增和核酸酶(例如FEN核酸酶)切割同时发生。按照标题为″切割结构″的部分所述的方式，检测通过结合部分特异性结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获的释放的标记片段，且这种检测可在扩增和切割过程中同时进行(实时)或在扩增和切割过程完成后进行(终点)。
可采用终点测定法定量通过非基于PCR的方法产生的扩增的靶，在所述非基于PCR的方法中在存在核酸酶(例如，FEN核酸酶)(如上所述)的情况下进行扩增。
可使用体外转录反应从存在于反应中的DNA模板合成RNA。此类反应中通常使用T7-型RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶或SP6RNA聚合酶，不过也可使用多种其他RNA聚合酶。通常，从头合成RNA(即，非引发式)，但并非总是如此，且通常，从称为″启动子″或″启动子区域″的被RNA聚合酶所特异性识别的模板序列起始转录，但并非总是如此。在此给出体外转录的方法。
RNA聚合酶已被用于扩增靶序列(Krupp，G.，and Soil，D.FEBS Letters(1987)212：271-275)。这种方法涉及产生靶序列的双链拷贝，插入RNA聚合酶启动子序列，转录所述拷贝并通过杂交测定检测(Kwoh，D.Y.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1989)86：1173-1177)。噬菌体DNA依赖的RNA聚合酶(例如，T3，T7，SP6)此前已被用于从克隆的或合成的寡核苷酸模板体外制备特定RNA序列，本领域人员对其很熟悉(Melton，D.A.，et al.，Nucleic AcidsRes.(1984)12：7035-7056)；Chamberlin，M.and Ryan，T.，(1982)in″TheEnzymes，″Boyer，P.D.，ed.，15：87-108；Martin，C.T.，and Coleman，J.E.，Biochemistry(1987)26：2690-2696)。这些聚合酶具有高度的启动子特异性。已知来自多种T7启动子的DNA序列，已经推测出其共有序列(Oakley，J.L.，andColeman，J.E.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1977)74：4266-4270；Dunn，J.J.，and Studier，F.W.，J.Molec.Biol.(1983)166：477-535)。可改良基于这些RNA聚合酶的方法，使得FEN核酸酶和可检测标记的探针被加入至反应混合物中，以便允许同时进行扩增和检测反应。可检测标记的探针被设计为退火至靶启动子序列的下游。因此，转录之后，下游探针和合成的RNA形成切割结构。随后FEN切割下游寡核苷酸。
在某些实施方式中，通过启动子-引物的形式将启动子加至靶。多种RNA聚合酶启动子可用于启动子-引物的启动子区域。在存在核糖核苷酸和RNA聚合酶以及合适的条件下，合适的启动子区域能够从有效连接的核酸序列起始转录。启动子区域通常包含来自天然存在的RNA聚合酶启动子、共有序列启动子区域、或人工合成的启动子区域的大约15至250个核苷酸，优选地大约17至60个核苷酸，参见Alberts et al.(1989)in Molecular Biology of the Cell，2d ed.(Garland Publishing，Inc.)。特别感兴趣的代表性启动子区域包括T7、T3和SP6，参见Chamberlin and Ryan，The Enzymes(ed.P.Boyer，Academic Press，New York)(1982)pp 87-108。
对于各种DNA依赖的RNA聚合酶，本领域熟知用于最佳转录的实际启动子的序列要求，例如参见美国专利No.5,766,849和5,654,142，也可以经验性地确定。
可采用本领域已知和本文中所描述的任何合适的方法制备上述启动子-引物寡核苷酸，例如，使用例如Applied Biosystems，Inc.(Foster City，Calif.)的自动化DNA合成仪来合成。
在另一方面，本发明提供检测靶核酸的方法，其中使用被RNA聚合酶延伸的上游引物以及下游标记探针。反应通常包括：使靶核酸接触反应混合物，后者包括RNA聚合酶、上游引物和下游探针，并在合适的条件下温育所述混合物一段合适的时间，以产生本文所述的切割结构。申请日为2005年8月31日的美国专利申请No.11/217,972(通过引用将其全部内容并入本文)描述了使用被RNA聚合酶延伸的引物的RNA扩增反应。本发明可采用该RNA扩增反应。例如，在美国专利申请No.11/217,972所述的反应中加入下游标记探针和FEN核酸酶。在这一实例中，RNA聚合酶将延伸杂交的引物，以便与下游探针形成切割结构。
在这一序列-特异性RNA扩增/检测反应，使用与靶RNA序列互补的合适的引物和探针以及FEN核酸酶和能够识别所引发的RNA分子的合适的RNA聚合酶，这些在本文中已有详细描述并且是本领域已知的。然后在温度循环条件允许进行扩增、形成切割结构、和切割所述切割结构。
例如，可在70-95℃温育反应以便使靶变性，随后将反应冷却至35-72℃。温度下降过程中，引物和探针结合于靶RNA上的互补序列。一旦温度达到最佳范围，RNA聚合酶即延伸引物并导致下游探针至少被部分置换，形成切割结构。切割结构随后被核酸酶切割。
终点测定法包括，但不限于，以下形式。
A.连接链反应(LCR)，参见Landegren，et al.，1988，Science，241：1077和Barany，PCR Methods and Applications 1：5-16(1991)。可用于本发明的LCR产物将具有足够的长度，使得上游引物和标记的下游探针被大于8个核苷酸的缺口分开，以允许被核酸酶(例如FEN核酸酶)有效切割。
B.自我持续序列复制扩增(3SR)，参见Fahy，et al.PCR Methods andApplications 1：25-33(1991)。自我持续序列复制扩增(3SR)是类似于NASBA的技术。Ehricht R，et al.，Nucleic Acids Res.25：4697-4699(1997)已经将3SR方法发展为协同式偶联的体外扩增系统(CATCH)。因此，在本发明的一个实施方式中，使用分子信标探针通过CATCH来实时分析RNA扩增子。扩增的合成靶的序列为：cctctgcagactactattacataatacgactcactatagggatctgcacgtattagcctatagtgagtcgtattaataggaaacaccaaagatgatatttcgtcacagcaagaattcagg(SEQ ID NO：42)。3SR反应含有40mM Tris-HCl pH 8.0，5mM KCl，30mM MgCl2，1mM的各种dNTP，1nM的双链靶，2μM P1：cctctgcagactactattac(SEQ ID NO：43)和P2：cctgaattcttgctgtgacg(SEQ ID NO：44)，5mM DTT，2mM亚精胺，6单位/μlHis标记的HIV-1反转录酶，3单位/μl T7-RNA聚合酶和0.16单位/μl大肠杆菌RNase H。温育100μl反应30分钟，42℃。
取5μl的各样品一式两份用于检测。各反应含有1X克隆Pfu缓冲液，3.0mM MgCl2，200μM的各种dNTP，5单位exo-Pfu，23ng Pfu FEN-1，1ngPEF，300nM各种上游引物P1和荧光探针(例如FAM-DABCYL)：taggaaacaccaaagatgatattt(SEQ ID NO：45)。在热循环仪中进行一个循环的反应：2分钟，95℃，1分钟，55℃，1分钟，72℃。然后在荧光板读取仪中测定荧光，例如Stratagene的FluorTracker或PE Biosystem的7700Sequence DetectionSystem (Plate-Read Mode)。3SR方法也可使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶和标题为″核酸酶″的部分所述的任何核酸酶。
C.美国专利5,854,033所述的滚环扩增以及有关的分支延伸扩增方法(Ramification-Extension Amplifcation Method，RAM)(美国专利5,942,391)。以下描述适应用于本发明的滚环扩增。
也可采用实时测定法定量通过非基于PCR的方法产生的扩增的靶，在所述非基于PCR的方法中在存在核酸酶(例如，FEN核酸酶)(如上所述)的情况下进行扩增。改动滚环扩增的方法(美国专利5,854,033)使之包括用于扩增和检测的二级引物，连同核酸酶(例如FEN核酸酶)和可切割的探针，所述探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分，且还包含根据本发明的切割结构，该方法在50-60℃之间的温度进行。通过提供位于距引物5’末端1至15个核苷酸之间的任何位置的单个错配碱基可改变核酸酶(例如FEN核酸酶)的切割方式，其中DNA引物在其他方面是完全退火的。典型地，在完全退火的底物上，核酸酶(例如FEN核酸酶)将以核酸外切的方式切割最5’的核苷酸。不过，从5’末端起15个核苷酸内的单个核苷酸错配促成核酸内切方式的切割。这形成了5’校正过程，其中错配促成了导致将其去除的核酸酶作用。因此，仅因为存在单个错配的碱基对，核酸酶(例如FEN核酸酶)的机制便由主要为核酸外切性切割转变至主要为核酸内切性切割。推测其发生原因为错配导致可产生短活瓣(Rumbaugh et al.，1999，J.Biol.Chem..274：14602)。
本发明的方法可用于产生代表靶核酸中存在序列变异的信号，其中，如下形成包含完全退火的DNA引物的标记的切割结构：温育靶核酸和探针，所述探针具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(如标题为″切割结构″的部分所述)，并以核酸酶(例如FEN核酸酶)切割所述标记的切割结构，其中包含内切核酸性切割产物的标记片段的释放以及检测到通过结合部分结合于固相支持物上的捕获元件而被捕获的释放片段，代表存在序列变异。按照标题为″切割结构″的部分所述检测释放的标记片段。
在另一实施方式中，本发明的抗切割探针被用于顺序切割反应。顺序切割反应可参见美国专利No.6,893,819(申请日2000年11月11日)、美国公开文本No.2005/0147996(申请日2004年11月15日)、美国申请No.60/750,593(申请日2005年12月15日)和美国申请No.60/794,628(申请日2006年4月24日)，通过引用将其每一篇的全部内容并入本文。
在顺序切割反应中，来自第一切割反应的释放的活瓣成为第二切割反应的上游寡核苷酸。在顺序切割反应中，仅当第一和第二切割反应均为非侵入型时才产生可检测信号。在形成侵入型结构的事件中，不产生可检测信号。
例如，在一个实施方式中，顺序切割反应包括：靶核酸，其从3’至5’方向包含第一区域和第二区域；模板核酸，其从3’至5’方向包含第一区域和第二区域；第一上游寡核苷酸，其与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补；第一抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，而其中所述5’区域不与所述靶核酸互补但与所述模板核酸的所述第一区域至少部分互补；第二抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述模板核酸的所述第二区域至少部分互补，而所述5’区域不与所述模板核酸互补；切割剂；和核酸聚合酶。
在反应条件下混合反应物，所述条件允许：在所述靶核酸与所述第一上游寡核苷酸和所述第一抗切割探针中的每一个之间形成双链体，其中第一抗切割探针的所述5’区域形成第一切割结构的第一活瓣；通过所述切割剂切割第一活瓣，由此允许释放第一活瓣；所释放的第一活瓣、所述模板核酸和所述第二抗切割探针形成第二双链体，其中所述第二抗切割探针的所述5’区域形成第二切割结构的第二活瓣；并用所述切割剂切割第二活瓣。
然后检测信号。第二活瓣的切割产生了信号，其中仅在当形成所述第一双链体和所述第二双链体时所述第一上游寡核苷酸与所述第一抗切割探针以及所述释放的活瓣与所述第二抗切割探针至少被切口分开的情况下，才产生所述信号。
V.样品
本发明提供了一种检测或测定如本文所述的样品中的靶核酸的方法。本文中所用的“样品”指的是任何含有或推测含有目的核酸(靶核酸)的物质，或含有或推测含有目的靶核酸序列而本身即是靶核酸序列的任何物质。因此术语“样品”包括靶核酸(基因组DNA、cDNA或RNA)、细胞、生物体、组织、体液或物质的样品，包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑膜液、尿液、泪液、粪便、皮肤外分泌物、呼吸道外分泌物、肠道外分泌物、泌尿生殖道外分泌物、唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织、体外细胞培养成分的样品、自然分离物(例如饮用水、海水、固体材料)、微生物标本和用核酸示踪分子“标记”的物体或标本。
实施例
下列非限制性实施例阐述了本发明，其中使用了下列物质和方法。此后引用的每篇参考文献的全部公开内容均通过引用纳入本文。
实施例1：探针的设计和制备
本发明提供探针，所述探针具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分。
根据本发明的一个实施方式的探针的长度为5-250个核苷酸，理想地为17-40个核苷酸，并具有长度为7至大约140个核苷酸，优选地10至大约140个核苷酸的靶核酸结合序列。探针可还包含非共价结合的或共价结合的亚基。
一个实施方式的探针包含第一互补核酸序列(例如，图4的b)和第二互补核酸序列(例如，图4的b’)。在一个实施方式中，探针单分子的，第一和第二互补核酸序列位于同一分子中。在一个实施方式中，探针标记了荧光团和猝灭剂(例如，四甲基罗丹明和DABCYL，或本文所述的任何荧光团和猝灭剂分子，见标题为″如何制备标记的切割结构″的部分)。本发明的探针标记了一对合适的相互作用的标记物(例如，FRET对或非FRET对)。所述相互作用的标记物在探针上放置的位置使得所述标记物在探针上保持合适的间距，以允许在探针结合于靶核酸之后其二级结构发生改变时，所述标记物被分开。例如，供体和猝灭剂部分在探针上放置的位置可使得当探针未结合于靶核酸时猝灭产生的可检测信号。
探针还包括结合部分(例如图4的ab，包含核酸序列，即5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQ ID NO：26))。在本发明的一个实施方式中，本发明的探针在与靶核酸杂交后形成包含5’活瓣的切割结构(例如，图4的ab)。切割结构的活瓣因此包含所述探针的结合部分。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。杂交的探针被核酸酶切割后，结合部分被释放并特异性结合于捕获元件，后者包含核酸序列5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQID NO：27)。根据这一实施方式，结合部分包含两个区域(例如图4的a和b)。″结合部分″这一区域(例如，图4的a)不是如本文所述的″互补核酸序列″，其长度为1-60个核苷酸，优选地1-25个核苷酸，更优选地1-10个核苷酸。区域b是如本文所述的探针的至少两个互补核酸序列之一，其长度在下文详细描述。
在一个实施方式中，在不存在靶核酸时，探针自身折叠，产生反向平行双链体结构，其中第一和第二互补核酸序列通过形成氢键而退火形成二级结构。通过在不同温度下进行FRET或荧光猝灭测定而检测探针的二级结构，所述温度包括高于和低于本文所述的探针的Tm的温度。荧光的变化与温度的变化相关联(例如，荧光随FRET反应的温度升高的增强)，如果探针荧光的变化超过单纯因温度对荧光团发射效率的热效应所引起的荧光的变化，则该探针具有二级结构。二级结构在检测到最高水平的荧光时(例如，温度升高时荧光不再升高超过该水平)的温度将消失。通过解链温度测定或通过本文所述的FRET或荧光猝灭测定来确定探针二级结构的稳定性。
作为探针二级结构改变的结果，结合部分变得可被核酸酶切割。在存在靶核酸并在根据影响探针与靶核酸杂交的效率和选择性的因素(例如，引物长度、核苷酸序列和/或组成、缓冲液组成，见标题为″可用于本发明的引物和探针″的部分)而选定的允许探针与靶核酸特异性结合的温度条件下，探针结合于靶核酸并发生二级结构的改变。可通过本文所述的FRET或荧光猝灭来确定探针二级结构的改变。
在一个实施方式中，第一和第二互补核酸序列的长度为3-25、优选地4-15、且更优选地5-11个核苷酸。所选的第一和第二互补核酸序列的长度使得探针在未结合靶核酸时，在包含结合于靶核酸的探针的切割结构被切割的温度下，其二级结构是稳定的。如果靶核酸结合序列的大小增加至多达100个核苷酸，互补核酸序列的长度可增加至多达15-25个核苷酸。对于大于100个核苷酸的靶核酸结合序列，互补核酸序列的长度不再增加。
或者，制备具有二级结构并包含结合部分的等位基因区分探针。
在一个实施方式中，本发明的等位基因区分探针优选地包含长度为6至50、优选地7至25个核苷酸的靶核酸结合序列，而互补核酸序列的序列为3至8个核苷酸。在设计短的等位基因区分探针时，要考虑二级结构和探针-靶杂交体的鸟嘌呤核苷-胞嘧啶核苷含量、盐和测定温度，例如镁盐具有强稳定作用。
设计具有长度为接近50个核苷酸这一上限的靶核酸结合序列的等位基因区分探针，使得待辨别的单个核苷酸错配出现在靶核酸结合序列的中间或中间附近。例如，优选地设计包含长度为21个核苷酸的序列的探针，使得错配出现在与位于靶核酸结合序列最中间的14个核苷酸、更优选地最中间的7个核苷酸中的一个相对应的位置。
实施例2：探针的设计和制备
本发明提供探针，所述探针具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分。
根据本发明的一个实施方式的探针的长度为5-250个核苷酸，理想地为17-40个核苷酸，并具有长度为7至大约140个核苷酸，优选地10至大约140个核苷酸的靶核酸结合序列。探针可还包含非共价结合的或共价结合的亚基。
一个实施方式的探针包含第一互补核酸序列(例如，图4的b)和第二互补核酸序列(例如，图4的b’)。在一个实施方式中，探针单分子的，第一和第二互补核酸序列位于同一分子中。在一个实施方式中，探针标记了荧光团和猝灭剂(例如，四甲基罗丹明和DABCYL，或本文所述的任何荧光团和猝灭剂分子，见标题为″如何制备标记的切割结构″的部分)。本发明的探针标记了一对合适的相互作用的标记物(例如，FRET对或非FRET对)。所述相互作用的标记物在探针上放置的位置使得所述标记物在探针上保持合适的间距，以允许在探针结合于靶核酸之后其二级结构发生改变时，所述标记物被分开。例如，供体和猝灭剂部分在探针上放置的位置可使得当探针未结合于靶核酸时猝灭产生的可检测信号。
探针还包括包含lac阻抑蛋白的标签。在本发明的一个实施方式中，探针在与靶核酸杂交后形成包含5’活瓣的切割结构(例如，图4的ab)。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。杂交的探针被核酸酶切割后，lac阻抑蛋白特异性结合于捕获元件，所述捕获元件包含被lac阻抑蛋白识别并特异性结合的双链DNA序列：
AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：4)
TTAACACTCGCCTATTGTTAA(SEQ ID NO：28)。
在一个实施方式中，在不存在靶核酸时，探针自身折叠，产生反向平行双链体结构，其中第一和第二互补核酸序列通过形成氢键而退火形成二级结构。通过在不同温度下进行FRET或荧光猝灭测定而检测探针的二级结构，所述温度包括高于和低于本文所述的探针的Tm的温度。荧光的变化与温度的变化相关联(例如，荧光随FRET反应的温度升高的增强)，如果探针荧光的变化超过单纯因温度对荧光团发射效率的热效应所引起的荧光的变化，则该探针具有二级结构。二级结构在检测到最高水平的荧光时(例如，温度升高时荧光不再升高超过该水平)的温度将消失。通过解链温度测定或通过本文所述的FRET或荧光猝灭测定来确定探针二级结构的稳定性。
作为探针二级结构改变的结果，标签变得可被核酸酶切割。在存在靶核酸并在根据影响探针与靶核酸杂交的效率和选择性的因素(例如，引物长度、核苷酸序列和/或组成、缓冲液组成，见标题为″可用于本发明的引物和探针″的部分)而选定的允许探针与靶核酸特异性结合的温度条件下，探针结合于靶核酸并发生二级结构的改变。可通过本文所述的FRET或荧光猝灭来确定探针二级结构的改变。
在一个实施方式中，第一和第二互补核酸序列的长度为3-25、优选地4-15、且更优选地5-11个核苷酸。所选的第一和第二互补核酸序列的长度使得探针在未结合靶核酸时，在包含结合于靶核酸的探针的切割结构被切割的温度下，其二级结构是稳定的。如果靶核酸结合序列的大小增加至多达100个核苷酸，互补核酸序列的长度可增加至多达15-25个核苷酸。对于大于100个核苷酸的靶核酸结合序列，互补核酸序列的长度不再增加。
或者，制备具有二级结构并包含结合部分的等位基因区分探针。
在一个实施方式中，本发明的等位基因区分探针优选地包含长度为6至50、优选地7至25个核苷酸的靶核酸结合序列，而互补核酸序列的序列为3至8个核苷酸。在设计短的等位基因区分探针时，要考虑二级结构和探针-靶杂交体的鸟嘌呤核苷-胞嘧啶核苷含量、盐和测定温度，例如镁盐具有强稳定作用。
设计具有长度为接近50个核苷酸这一上限的靶核酸结合序列的等位基因区分探针，使得待辨别的单个核苷酸错配出现在靶核酸结合序列的中间或中间附近。例如，优选地设计包含长度为21个核苷酸的序列的探针，使得错配出现在与位于靶核酸结合序列最中间的14个核苷酸、更优选地最中间的7个核苷酸中的一个相对应的位置。
实施例3
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过在95℃加热如下组分5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)上游寡核苷酸(图4的A)，其与靶核酸特异性杂交，和(c)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(例如图4的ab，包含核酸序列5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQ ID NO：26))，其中所述探针与靶核酸上位于寡核苷酸A的杂交区域下游的区域特异性杂交。加入缺乏5’至3’外切核酸酶活性但具有3’至5’DNA合成活性的聚合酶，例如：a)Yaqexo-(通过使用Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit，目录号#200518进行诱变修饰Taq聚合酶(Tabor and Richardson，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1074)而制备)，其为突形式的Taq聚合酶，缺乏5’至3’外切核酸酶活性；b)PfU；或c)缺乏3’至5’外切核酸酶活性的突变形式的Pfu聚合酶(exo-Pfu)，并在允许所述聚合酶延伸寡核苷酸A的情况下温育，使其部分置换寡核苷酸C的5’末端(例如在72℃与1XPfu缓冲液(Stratagene)温育5分钟至1小时。寡核苷酸C被置换的区域形成5’活瓣，当加入FEN核酸酶后其被切割。或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及标题为″核酸酶″的部分提及的任何核酸酶进行延伸。
缺乏5’至3’外切核酸酶活性但具有3’至5’DNA合成活性的突变形式的Taq聚合酶包含以下突变：D144S/F667Y Taq，其中D144S消除5’至3’外切核酸酶活性，而F667Y增加ddNTP掺入。
可根据Xu et al.，1997，J.MoI.Biol..268：284的方法制备PolI聚合酶的Exo-突变体。
使用PfuFEN-1制备物(即克隆的强烈炽热球菌FEN-1，按照实施例9所述制备)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的PfuFEN-1加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液(10X FEN核酸酶缓冲液含有500mM
Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl PfuFEN-1酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。所释放的包含结合部分的标记片段通过结合部分结合于捕获元件而结合于固相支持物上，所述捕获元件包含核酸序列5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQ ID NO：27)。在一个实施方式中，标记的片段通过例如以下方式从捕获元件洗脱，例如，通过降低盐浓度(严格性杂交条件典型地包括的盐浓度为低于大约1M，更通常低于大约500mM，且优选地低于大约200mM)或通过加入过量的未标记的竞争物片段。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例4
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过在95℃加热如下组分5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)上游寡核苷酸(图4的A)，其与靶核酸特异性杂交，和(c)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含lac阻抑蛋白标签，其中所述探针与靶核酸上位于寡核苷酸A的杂交区域下游的区域特异性杂交。加入缺乏5’至3’外切核酸酶活性但具有3’至5’DNA合成活性的聚合酶，例如：a)Yaqexo-(通过使用Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit，目录号#200518进行诱变修饰Taq聚合酶(Tabor and Richardson，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：1074)而制备)，其为突形式的Taq聚合酶，缺乏5’至3’外切核酸酶活性；b)PfU；或c)缺乏3’至5’外切核酸酶活性的突变形式的Pfu聚合酶(exo-Pfu)，并在允许所述聚合酶延伸寡核苷酸A的情况下温育，使其部分置换寡核苷酸C的5’末端(例如在72℃与1XPfu缓冲液(Stratagene)温育5分钟至1小时。寡核苷酸C被置换的区域形成5’活瓣，当加入FEN核酸酶后其被切割。或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及标题为″核酸酶″的部分提及的任何核酸酶进行延伸。
缺乏5’至3’外切核酸酶活性但具有3’至5’DNA合成活性的突变形式的Taq聚合酶包含以下突变：D144S/F667Y Taq，其中D144S消除5’至3’外切核酸酶活性，而F667Y增加ddNTP掺入。
可根据Xu et al.，1997，J.MoI.Biol..268：284的方法制备PolI聚合酶的Exo-突变体。
使用PfuFEN-1制备物(即克隆的强烈炽热球菌FEN-1，按照实施例9所述制备)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的PfuFEN-1加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液(10X FEN核酸酶缓冲液含有500mM
Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl PfuFEN-1酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。所释放的包含lac阻抑蛋白的标记片段通过lac阻抑蛋白结合于捕获元件而结合于固相支持物上，所述捕获元件包含被lac阻抑蛋白识别的双链DNA序列：
AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：4)
TTAACACTCGCCTATTGTTAA(SEQ ID NO：28)。
在一个实施方式中，标记的片段通过例如以下方式从捕获元件洗脱，例如，通过改变盐浓度，即降低盐浓度(严格性杂交条件典型地包括的盐浓度为低于大约1M，更通常低于大约500mM，且优选地低于大约200mM)或通过加入过量的竞争物a)lac阻抑蛋白或b)被lac阻抑蛋白识别的双链DNA序列。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例5
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过使如下组分在95℃退火5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)上游寡核苷酸引物(图4的A)，其与靶核酸特异性杂交，和(c)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(例如图4的ab，包含核酸序列5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQ ID NO：26))，其中所述探针与靶核酸上与寡核苷酸A的杂交区域邻近的区域特异性杂交，且所述探针还包括不与靶核酸杂交而是形成5’活瓣的5’区域。在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行退火。
使用PfuFEN-1制备物(即克隆的强烈炽热球菌FEN-1，按照实施例9所述制备)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的PfuFEN-1加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液(10X FEN核酸酶缓冲液含有500mM
Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl PfuFEN-1酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。所释放的包含结合部分的标记片段通过结合部分结合于捕获元件而结合于固相支持物上，所述捕获元件包含核酸序列5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQ ID NO：27)。在一个实施方式中，标记的片段通过例如以下方式从捕获元件洗脱，例如，通过降低盐浓度(严格性杂交条件典型地包括的盐浓度为低于大约1M，更通常低于大约500mM，且优选地低于大约200mM)或通过加入过量的未标记的竞争物片段。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例6
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过将如下组分在95℃退火5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)上游寡核苷酸引物(图4的A)，其与靶核酸特异性杂交，和(c)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含lac阻抑蛋白标签，其中所述探针与靶核酸上与寡核苷酸A的杂交区域邻近的区域特异性杂交，且所述探针还包括不与靶核酸杂交而是形成5’活瓣的5’区域。在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行退火。
使用PfuFEN-1制备物(即克隆的强烈炽热球菌FEN-1，按照实施例9所述制备)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的PfuFEN-1加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液(10X FEN核酸酶缓冲液含有500mM
Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl PfuFEN-1酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。
杂交的探针被核酸酶切割后，lac阻抑蛋白特异性结合于固相支持物上的捕获元件，所述捕获元件包含被lac阻抑蛋白识别的双链DNA序列：
AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：4)
TTAACACTCGCCTATTGTTAA(SEQ ID NO：28)。
在一个实施方式中，按照实施例4所述从捕获元件洗脱标记的片段。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例7
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过使如下组分在95℃退火5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分(例如图4的ab，包含核酸序列5’AGCTACTGATGCAGTCACGT3’(SEQID NO：26))，其中所述探针与靶核酸上的区域特异性杂交，且所述探针还包括不与靶核酸杂交而是形成5’活瓣的5’区域。在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行退火。
使用能够切割所述切割结构的核酸酶(例如，Taq聚合酶)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的核酸酶加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x核酸酶缓冲液(500mM Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl 核酸酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。所释放的包含结合部分的标记片段通过结合部分结合于捕获元件而结合于固相支持物上，所述捕获元件包含核酸序列5’TCGATGACTACGTCAGTGCA3’(SEQ ID NO：27)。在一个实施方式中，标记的片段通过例如以下方式从捕获元件洗脱，例如，通过降低盐浓度(严格性杂交条件典型地包括的盐浓度为低于大约1M，更通常低于大约500mM，且优选地低于大约200mM)或通过加入过量的未标记的竞争物片段。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例8
可通过如下方法检测和/或测定靶核酸。在加入FEN核酸酶之前，先通过将如下组分在95℃退火5分钟然后冷却至大约50-60℃而形成标记的切割结构，所述组分为：(a)含有靶核酸(图4的B)的样品，(b)下游5’末端标记的寡核苷酸探针，其具有在探针结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含lac阻抑蛋白标签，其中所述探针与靶核酸上的区域特异性杂交，且所述探针还包括不与靶核酸杂交而是形成5’活瓣的5’区域。在存在1X哨兵分子信标核心缓冲液或1X Pfu缓冲液的情况下进行退火。
使用能够切割所述切割结构的核酸酶(例如，Taq聚合酶)切割本发明的标记的切割结构。切割在切割温度下进行，且在切割温度下或低于该温度的温度下所述探针的二级结构在未结合靶核酸时是稳定的。通过将2μl的核酸酶加入至7μl反应混合物中进行切割，该混合物含有：
3μl 切割结构(10ng-10μg)
0.7μl 10x核酸酶缓冲液(500mM Tris-HCl pH 8.0，100mM MgCl2)
2.00μl 核酸酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中温育1小时，50℃。加入2μl的Sequencing Stop染液(Stratagene Cyclist DNA测序试剂盒随附，目录号#200326)，之后样品在99℃加热5分钟。杂交的探针被核酸酶切割后，lac阻抑蛋白特异性结合于固相支持物上的捕获元件，所述捕获元件包含被lac阻抑蛋白识别的双链DNA序列：
AATTGTGAGCGGATAACAATT(SEQ ID NO：4)
TTAACACTCGCCTATTGTTAA(SEQ ID NO：28)。
在一个实施方式中，按照实施例4所述从捕获元件洗脱标记的片段。通过如下文所述的凝胶电泳分析含有洗脱的标记片段的样品。样品上样到11英寸长的手工配制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中(～80℃)干燥2小时。将凝胶暴露于X射线胶片过夜，以检测代表存在的靶核酸的信号。
或者，使用展现出5’至3’外切核酸酶活性的聚合酶以及使用标题为″核酸酶″的部分所提及的任何核酸酶进行延伸。
实施例9
克隆Pfu FEN-1
可依据下列方法制备可用于本发明的热稳定FEN核酸酶。
可依据本领域熟知的PCR克隆方法从源于强烈炽热球菌(ATCC#43587)的基因组DNA分离热稳定FEN核酸酶。可依据本领域熟知方法和下文描述方法在细菌细胞内过表达克隆的Pfu FEN-1。
合成和纯化下列pCAL-n-EK克隆寡核苷酸：
a.
5’GACGACGACAAGATGGGTGTCCCAATTGGTGAGATTATACCAAGAAAAG3’(SEQ ID NO：29)和
b.
5’GGAACAAGACCCGTTTATCTCTTGAACCAACTTTCAAGGGTTGATTGTTTTCCACT3’(SEQ ID NO：30)。
从Stratagene获得蛋白表达和纯化系统，并按照生产商的方案进行使用。
扩增
采用基因特异引物(上文描述的寡核苷酸a和b)经PCR扩增制备插入DNA，其中引物在其5′端含有与pCAL-n-EK载体单链尾互补的12-核苷酸序列和13-核苷酸序列，因而允许定向克隆。通过制备含有下列组分的扩增反应(5个独立的100μl反应)，从源自强烈炽热球菌的基因组DNA扩增FEN-1序列：
50μl 10x cPfu缓冲液(Stratagene)
7.5μl Pfu基因组DNA(约100ng/μl)
7.5μl PfuTurbo(2.5u/μl)，(Stratagene，目录号#600250)
15μl 混合引物对(每个100ng/μl)(上文描述的寡核苷酸a和b)
4μl 100mM dNTP
416μl H2O
500μl 总体积
并使用Stratagene Robocycler 96孔顶部加热热循环仪在下列条件下进行扩增：
Window 1 95℃ 1分钟 1个循环
Window 2 95℃ 1分钟
50℃ 1分钟 30个循环
72℃ 3分钟
来自5个反应的PCR产物合并为1管，使用StrataPrep PCR进行纯化，洗脱在50μl的1mM Tris-HCl pH 8.6中。FEN-1PCR产物在凝胶上分析，测定其具有约1000bp。
通过生成不依赖连接的克隆末端(LIC)，将包含fen-1基因的PCR产物退火到pC ALnEK LIC载体(Stratagene)上，依据下列方法以退火混合物转化细胞，从而将包含fen-1基因的PCR产物克隆到pC ALnEK LIC载体(Stratagene)上。简而言之，PCR扩增后，纯化PCR产物，在dATP(根据ProteinExpression and Purification System手册，Stratagene，目录号#200326)的存在下以Pfu DNA聚合酶处理PCR产物。在没有dTTP、dGTP和dCTP的情况下，Pfu DNA聚合酶的3′到5′外切核酸酶活性除去PCR产物相应的3′端的至少12个核苷酸和13个核苷酸。该活性继续发挥作用，直到遇到第1个腺嘌呤，产生具有与pCAL-n-EK载体单链尾互补的5′-延伸单链尾的DNA片段。
产生LIC末端
制备下列混合物，生成LIC末端：
45μl 纯化的PCR产物(～0.5μg/μl)
2.5μl 10mM dATP
5μl 10x cPfu缓冲液
1μl cPfu(2.5u/μl)
0.5μl H2O
cPfu和cPfu缓冲液可从Stratagene(cPfu，Stratagene目录号#600153和cPfu缓冲液，Stratagene目录号#200532)得到。
样品在72℃温育20分钟，产物冷却至室温。向每份样品加入40ng制备的pCALnEK LIC载体(可以Affinity LIC Cloning and Protein Purification Kit(214405)的形式从Stratagene商购获得制备的载体)。合并载体和插入DNA，室温退火，随后转化高度感受态的细菌宿主细胞(Wyborski等人，1997，Strategies.10：1)。
制备用于产生FEN的细胞
将20ml FEN-1克隆(克隆3)过夜培养物接种到2升的LB-AMP上。生长约11小时，此时细胞的OD600达到0.974。细胞以1mM IPTG过夜诱导(约12小时)。离心收集细胞，形成的细胞糊状物-20℃保存。
纯化标记的FEN-1
细胞重悬浮于20ml的钙结合缓冲液：
CaCl
2
结合缓冲液
50mM Tris-HCl(pH 8.0)
150mM NaCl
1.0mM MgOAc
2mM CaCl2
采用Branson超声波仪以微探头(microtip)超声破碎样品。输出设置为5，工作周期(duty cycle)为90％。超声破碎样品3次，操作间隙样品置于冰上。超声破碎物以26,890xg离心。澄清上清与1ml(于CaCl2结合缓冲液中)洗涤的钙调蛋白琼脂糖(CAM琼脂糖)在50ml的锥形管内混合，室温(40℃)下在缓慢旋转的轮上温育5小时。慢速离心(台式离心机，5000rpm)收集CAM琼脂糖。
除去上清后，CAM琼脂糖以50ml CaCl2结合缓冲液洗涤，转移到一次性的滴加柱(drip column)上。原容器和移液管彻底漂洗，除去残余的琼脂糖。柱以约200ml的CaCl2结合缓冲液漂洗。
采用10ml 50mM NaCl洗脱缓冲液(50mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0，2mM EGTA)进行洗脱。收集0.5ml的组分。采用1M NaCl洗脱缓冲液进行第二次洗脱步骤，其中收集0.5ml的组分。
评估纯化的标记FEN-1
含有洗脱到1M NaCl中CBP标记的Pfu FEN-1组分以SDS煮沸，并以SDS-PAGE在染有Sypro Orange的4-20％凝胶上分析(图5)。
未切割的FEN-1的蛋白浓度测得为大约150ng/微升(下文)。
肠激酶蛋白酶(EK)切割纯化的FEN-1
组分3-9以50mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0和2mM CaCl2在4℃透析过夜。
透析的FEN-1中出现不透光的极细沉淀物。1/20稀释样品时，除去沉淀物。1/3稀释样品时，仍可检测到不溶物。该1/3稀释的物质在37℃加热2分钟，随后与Tween 20混合，终浓度为0.1％。加入Tween 20后，溶液中几乎立刻形成“丝”和更粗糙的固体物，即使溶液调节为1M NaCl，也无法逆转这种现象。
使用1/20稀释的样品以及以1x EK缓冲液漂洗透析袋而制备的稀释样品作为底物，进行EK切割。
加入1μl EK(1u/μl)，室温过夜进行EK切割(约16小时)。
合并100μl CAM琼脂糖和100μl STI琼脂糖以10ml 1xSTI缓冲液(50mMTris-HCl pH 8.0，200mM NaCl，2mM CaCl2，0.1％Tween 20)漂洗两次。NaCl加入到两份EK样品中，使得终浓度为200mM NaCl。合并两份样品，加入到漂洗的琼脂糖。40℃下，样品在轮上缓慢旋转3小时，随后以台式离心机(上述)经慢速离心分离。除去上清，树脂以500μl 1x STI漂洗两次。合并两次漂洗液，与原上清分开保存。样品在4-20％凝胶上以SDS-PAGE进行分析。
与浓度约为50ng/ml的Pfu标准品相比，消化产物的浓度约为23ng/μl。
实施例10：FEN核酸酶活性
可依据标题为″FEN核酸酶″的部分或下文描述的方法测定FEN核酸酶的内切核酸酶活性和实施例2制备的FEN核酸酶的切割结构要求。
简而言之，使用3个模板(图2)评估本发明的FEN核酸酶活性。模板1是具有下列序列的5′33P标记的寡核苷酸(Heltest4)：
5′AAAATAAATAAAAAAAATACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG3′(SEQID NO：1)。
Heltest4的下划线部分代表与M13mp18+互补的区域。切割产物是具有序列AAAATAAATAAAAAAAAT(SEQ ID NO：2)的18个核苷酸的片段。Heltest4结合到M13上，产生互补的双链结构域以及非互补的5′突出端。该双链体形成模板2(图2)。模板3(图2)具有结合到M13上的附加引物(FENAS)，其直接邻近Heltest 4。FENAS的序列是：5′CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA 3′(SEQ ID NO：3)。在模板3的存在下，FEN核酸酶结合到Heltest4的游离5′端，迁移到结合处，切割Heltest4，产生18个核苷酸的片段。形成的切割产物在6％丙烯酰胺/7M尿素测序凝胶上进行分离。
按如下方法制备模板：
模板1 模板2 模板3
Heltest4 14μl 14μl 14μl
M13 ** 14μl 14μl
FENAS ** ** 14μl
H2O 28μl 14μl **
10x Pfu缓冲液 4.6μl 4.6μl 4.6μl
Pfu缓冲液可从Stratagene(目录号#200536)得到。
模板混合物在95℃下加热5分钟，冷却至室温，放置45分钟，随后4℃过夜保存。
酶样品如下：
A.H2O(对照)
B.2μl未稀释未切割的FEN-1(～445ng/μl)
C.2μl未切割FEN-1(～44.5ng/μl)的1/10稀释液
D.2μl肠激酶蛋白酶(EK)切割的FEN-1(～23ng/μl)
四种反应混合物与下列三种模板如下混合：
3μl 模板1、模板2或模板3
0.7μl 10x克隆Pfu缓冲液
0.6μl 100mM MgCl2
2.00μl FEN-1或H2O
0.7μl H2O
7.00μl 总体积
反应在50℃进行30分钟，随后向每份样品加入2μl甲酰胺″测序终止″液终止反应。样品在95℃下加热5分钟，上样到6％丙烯酰胺/7M尿素CastAway凝胶(Stratagene)。
或者，可在下列缓冲液中分析FEN核酸酶活性，其中使用1小时的温育时间。
10x FEN核酸酶缓冲液
500mM Tris-HCl pH 8.0
100mM MgCl2
反应混合物如下：
3μl 模板1、模板2或模板3
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液
2.00μl FEN-1或H2O(A-D，同上)
1.3μl H2O
7.00μl 总体积
样品在Robocyler 96孔顶部加热热循环仪中50℃温育1小时。加入2μl测序终止(95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯蓝，均可从Stratagene获得)染液后，样品在99℃加热5分钟。样品上样到11英寸长的手工配制20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下电泳，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中干燥2小时(～80C)。凝胶暴露于X射线胶片过夜。
图6显示了FEN-1核酸酶测定的放射自显影，其中加入下列组分切割模板1、2和3(按上文描述方法制备)：
A.H2O
B.2μl CBP-标记的Pfu FEN-1
C.2μl CBP-标记的Pfu FEN-1，已稀释(1∶10)
D.2μl EK切割的Pfu FEN-1
泳道如下：泳道1A、1B、1C和1D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板1。泳道2A、2B、2C和2D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板2。泳道3A、3B、3C和3D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板3。
标记的Pfu FEN-1含有N-端CBP亲和力纯化标签。标记FEN-1和未标记FEN-1活性的任何差异是由于蛋白浓度(上文提供了酶样品的浓度)的差异造成的，因为标记FEN-1与未标记FEN-1的量不相当。标记的Pfu FEN-1和未标记的Pfu FEN-1均表现出切割活性。
图6显示了在没有FEN-1的情况下的背景切割水平(泳道1A、2A和3A)。而且，该图显示，相比于模板1，标记的Pfu FEN-1切割了更多的模板2。具体而言，在未稀释的标记Pfu FEN-1的存在下切割了最多的模板2(泳道2B)。模板3的分析显示，未稀释的标记Pfu FEN-1切割了最多的模板3，而稀释的标记Pfu FEN-1切割了最少的模板3。标记探针以40-43个核苷酸的条带迁移。与模板2相比，FEN-1优先切割模板3(其含有上游引物)。切割产物条带是以16-20个核苷酸迁移的主要条带。标记的切割产物的不均一性是标记底物的不均一性引起的，标记底物使用前没有经凝胶纯化。
实施例11：在存在FEN-1核酸酶和缺乏5’至3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶
的情况下PCR扩增和检测β-肌动蛋白
使用PCR测定法检测靶核酸。根据这一测定方法，在存在如下组分的情况下进行PCR反应，所述组分为：探针，其具有在结合于靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分或标签；缺乏5’至3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶(例如Yaq exo-)；热稳定的FEN-1核酸酶(例如Pfu FEN-1，实施例2制备)。荧光标记的片段通过所述结合部分或标签的结合而结合于固相支持物上的捕获元件，检测到所述荧光标记的片段的释放代表存在靶核酸。
一式两份PCR反应含有：1X哨兵分子信标核心缓冲液，3.5mM MgCl2，200μM的各种dNTP，缺乏5’至3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶(～1.45U)，Pfu FEN-1(～23ng)，β-肌动蛋白引物(各300nM)和β-肌动蛋白特异性荧光探针，所述探针具有在探针结合于β-肌动蛋白靶序列后发生改变的二级结构并包含结合部分或标签。10ng的人基因组DNA(Promega)用作各反应的靶核酸。反应在50μl的体积内进行。还制备了各种阴性对照反应，其或仅含有PfuFEN-1，或仅含有缺乏5’至3’外切核酸酶活性的Taq聚合酶，或反应混合物含有除人基因组DNA模板以外的所有组分。也制备了阳性对照反应，其含有2.5单位的Taq 2000。PCR反应过程中，切割结构的形成、β-肌动蛋白靶序列的扩增以及切割结构的切割同时发生。选择的热循环参数使得切割结构在切割温度下被切割，而探针的二级结构在其未结合靶核酸时在所述切割温度下或低于该温度的温度下是稳定的。使用荧光分光光度计热循环仪(ABI 7700)测定反应。热循环参数为：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒；60℃，60秒；和72℃，15秒。在退火步骤过程中询问样品。
释放的荧光标记的片段通过探针上存在的结合部分或标签而结合于固相支持物上的捕获元件。
实施例12：在存在FEN-1核酸酶和缺乏5’至3’核酸酶活性的Pfu聚合酶的情
况下PCR扩增和检测β-肌动蛋白
使用PCR测定法检测靶核酸。根据这一测定方法，在存在如下组分的情况下进行PCR反应，所述组分为：探针，其具有在探针结合于β-肌动蛋白靶核酸后发生改变的二级结构并包含结合部分或标签；Pfu聚合酶(天然缺乏5’至3’外切核酸酶活性)或，此外，还缺乏3’至5’外切核酸酶活性的Pfu聚合酶(例如exo-Pfu)；以及热稳定的FEN-1核酸酶(Pfu FEN-1)。荧光标记的片段通过所述结合部分或标签的结合而结合于固相支持物上的捕获元件，检测到所述荧光标记的片段的释放代表存在靶核酸。
制备一式两份PCR反应，其含有：1X克隆Pfu缓冲液(来自Stratagene，目录号#200532)，3.0mM MgCl2，200μM的各种dNTP，5单位的缺乏3’至5’外切核酸酶活性的Pfu聚合酶，标记的或未标记的Pfu FEN-1(～23ng)，PEF(1ng)(参见WO 98/42860)，β-肌动蛋白引物(各300nM)，和荧光探针，所述探针具有在探针结合于靶β-肌动蛋白靶序列后发生改变的二级结构。10ng的人基因组DNA(Promega)用作各反应的靶核酸。反应在50μl的体积内进行。还制备了各种阴性对照反应，其仅含有同时缺乏5’至3’和3’至5’外切核酸酶活性的Pfu聚合酶，或含有除人基因组DNA模板以外的所有组分。也制备了含有2.5单位的Taq 2000的反应混合物作为阳性对照反应。PCR反应过程中，切割结构的形成、β-肌动蛋白靶序列的扩增以及切割结构的切割同时发生。选择的热循环参数使得切割结构在切割温度下被切割，而探针的二级结构在其未结合靶核酸时在所述切割温度下或低于该温度的温度下是稳定的。使用荧光分光光度计热循环仪(ABI 7700)分析反应。热循环参数为：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒；60℃，60秒；和72℃，15秒。
释放的荧光标记的片段通过探针上存在的结合部分或标签而结合于固相支持物上的捕获元件。
实施例13
使用人鸟氨酸氨甲酰基转移酶基因作为靶，进行本发明的涉及滚环扩增的测定法，其中检测通过标准方法提取自棕黄层(buffy coat)的人DNA中的该基因。靶(400ng)热变性4分钟，97℃，并在连接条件下与两种5’-磷酸化的寡核苷酸、开环探针和一种缺口寡核苷酸一起温育。所述开环探针的序列为：gaggagaataaaagtttctcataagactcgtcatgtctcagcagcttctaacggtcactaatacgactcactataggttctgcctctgggaacac(SEQ ID NO：46)，所述缺口核苷酸对于野生型序列是：tagtgatc。图7和8显示了滚环探针和滚环扩增。反应缓冲液(40μl)含有5单位/μl的T4DNA连接酶(T4 DNA ligase)(New England Biolabs)，10mM Tris-HCl，pH 7.5，0.2M NaCl，10mM MgCl2，4mM ATP，80nM的开环探针和100nM的缺口寡核苷酸。温育25分钟，37℃，之后取25μl，并加入25μl含有如下组分的溶液：50mM Tris-HCl，pH 7.5，10mM MgCl2，1mM DTT，400μM各种dTTP，dATP，dGTP，dCTP，0.2μM滚环复制引物：gctgagacatgacgagtc(SEQ IDNO：47)，phi29DNA聚合酶(160ng/50μl)。样品温育30分钟，30℃。
通过加入补偿缓冲液(compensating buffer)(储存液或浓缩物)，从存在于开环探针内的T7启动子产生RNA，该补偿缓冲液被稀释以达到如下的试剂浓度：35mMTris-HCl，pH 8.2，2mM亚精胺，18mm MgCl2，5mM GMP，1mM的ATP，CTP，GTP，333μM UTP，667μM生物素-16-UTP，0.03％Tween 20，2单位/μl的T7RNA聚合酶。如US 5,858,033所述进行RNA的产生。允许温育进行90分钟，37℃。
取5μl的各样品(实际测试样品，(-)连接酶对照样品，(-)phi29DNA聚合酶对照，和(-)T7RNA聚合酶对照)，一式两份，用于检测。反转录方法如下步骤：A)连接开环，B)合成滚环单链DNA，C)制备RNA(从存在于开环探针内的T7启动子)，D)反转录RNA制备cDNA和E)使用引物和探针进行cDNA的PCR扩增以产生本发明的FEN切割结构检测。对于反转录，使用由Stratagene Sentinel Single-Tube RT-PCR Core Reagent Kit(Cat#600505)提供的试剂和方案，不同之处在于用等量的Yaq DNA聚合酶代替生产商所推荐的Taq 2000DNA聚合酶。各反应含有1X哨兵分子信标RT-PCR核心缓冲液，3.5mM MgCl2，200μM的各种dNTP，5单位exo-Pfu，23ng Pfu FEN-1，1ngPEF，500nM各种上游引物：aagtttctcataagactcgtcat(SEQ ID NO：48)，反向引物：aggcagaacctatagtgagtcgt(SEQ ID NO：49)，和具有如本文所述的二级结构并还包含结合部分的荧光探针(例如标记了FAM-DABCYL)，所述二级结构在探针结合于靶核酸后发生改变。反应混合物温育30分钟，45℃；3分钟，95℃；随后在热循环仪中进行一个循环：2分钟，95℃；1分钟，50℃；1分钟，72℃。然后在荧光板读取仪中测定荧光，例如Stratagene的FluorTracker或PEBiosystem的7700Sequence Detection System(Plate-Read Mode)。
由于滚环扩增RNA产物内掺入了生物素-16-UTP，因此可以对检测效力进行交叉验证。使用固定化的捕获探针将测试量样品的反应混合物捕获于玻片(或者微孔板)上。检测捕获的RNA扩增子的方法详见美国专利5,854,033，通过引用将其并入本文。
实施例14
可进行以下实验来确定修饰是否可使得探针抵抗切割。
靶：
3’-GGCTGTCTTAACTAGGCGTGTCTTACCGGATGGTGCCCGAAGACAGCCAACCC-5’
探针：
5’GCCAAGCGAGAGATGCGCGTCGTAGTTTTTTcTACCACGGGCTTCTGTCGGTTGGG-3’
上游寡核苷酸：
5’-CCGACAGAATTGATCCGCACAGAATGG-3’缺口
5’-CCGACAGAATTGATCCGCACAGAATGGC-3’切口3’C
5’-CCGACAGAATTGATCCGCACAGAATGGCC-3’1 nt重叠
如上所述的寡核苷酸可由于切割反应以确定本发明的修饰是否使得探针的至少一部分可抵抗核酸酶的切割。
探针有效偶联于一对相互作用的标记物(例如，FAM和BHQ)，这些标记物被有效地放置，使得当探针未被切割时可检测信号被猝灭，而当探针被切割时产生可检测信号(FAM位于探针的+1位(探针内的c)，而BHQ位于探针的3’末端)。探针的下划线部分对应于5’活瓣。由于测试的修饰包括在探针上跨越所述一对相互作用的标记物的区域内。如果修饰防止了切割，则无可检测信号产生，而如果修饰可有效防止切割，则将产生可检测信号。
本实施例示例了三种不同的上游寡核苷酸(缺口、切口、重叠)，不过，也可使用其他替代性上游寡核苷酸，只要它们指导在所述一对相互作用的标记物之间切割探针即可。如所显示的那样，当与靶退火时，缺口和切口是非重叠型寡核苷酸，而1nt重叠形成重叠结构。
简而言之，以下试剂可合并至反应混合物中：IX探针缓冲液(15mM的Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO)，100ng的FEN，200nM的探针，200nM的上游寡核苷酸，和200nM的靶。进行反应的总体积为25μl。
在Mx3000P实时PCR装置内进行反应，参数如下：
1个循环的95℃，2分钟，随后40个循环的：
95℃，10秒；
60℃，30秒。
在每一循环的60℃步骤结束时收集荧光数据。如果荧光等于或低于阴性对照(具有已知可防止切割的修饰的探针)，即基线，则修饰可有效地使得探针抵抗切割。
实施例15
以下实验证实2’-O-甲氧基修饰可抑制探针的切割。图16显示了用于本实施例的上游寡核苷酸、靶和修饰的下游探针。
本实验中使用了1Q3F探针。1Q3F探针在+1位核苷酸处具有BHQ，而在3’末端具有FAM，因此仅在形成重叠结构且重叠结构被切割将标记物分开时才产生可检测信号。相互作用的标记物(例如，FAM和BHQ)被有效地放置，使得当探针未被切割时可检测信号被猝灭。探针的下划线部分对应于5’活瓣。如图16所示，1Q3F探针从位置+2至+16包含2’-O-甲氧基修饰的核苷酸。这正是在形成重叠结构之后探针上被切割所靶向的区域。注意，如果上游寡核苷酸被延伸通过+16位，则探针从靶上被置换。因此，探针的+17至3’末端的核苷酸不能被本发明的核酸酶所靶向并切割。
本反应使用了7种不同的上游寡核苷酸，每一个均与靶完全互补。如图16所示，这些上游寡核苷酸下游探针与的互补部分产生了2个碱基的缺口、1个碱基的缺口、切口、1个碱基的重叠、2个碱基的重叠、3个碱基的重叠、或4个碱基的重叠。
简而言之，使用了以下试剂和浓度：
200ng的Pfu FEN核酸酶
1.25U Pfu V93R聚合酶
200nM探针：
1Q3F 2’甲氧基修饰位于+2至+16
200nM Alt B合成的ssDNA靶；和
200nM上游寡聚物：
F-2、F-1、FWD、F+1、F+2、F+3和F+4
在Mx3000P实时PCR装置内进行反应，参数如下：
1个循环的95℃，2分钟，随后50个循环的：
95℃，10秒；
60℃，30秒。
在每一循环的60℃步骤结束时收集荧光数据。没有检测到任何信号。因此，2’-O-甲氧基修饰防止了在形成重叠结构之后探针被切割。
实施例16
以下实验证实使用具有3’末端非互补核苷酸的上游寡核苷酸和具有5’活瓣的下游探针可检测靶核酸。图16显示了用于本实施例的上游寡核苷酸(F-1Amm)、靶和修饰的探针。
本实验中使用了1Q5F探针。1Q3F探针在+1位核苷酸处具有BHQ，而在5’末端具有FAM，仅有非侵入型切割将产生可检测信号(在BHQ之间FAM切割)。相互作用的标记物(例如，FAM和BHQ)被有效地放置，使得当探针未被切割时可检测信号被猝灭。探针的下划线部分对应于5’活瓣。如图16所示，1Q5F探针中的一种从位置+2至+16包括2’-O-甲氧基修饰的核苷酸。其他1Q5F探针不包括任何导致探针抵抗切割的修饰。
在本实施例中，F-1Amm上游寡核苷酸与靶退火，与下游探针的互补部分形成了1个碱基的缺口，并进一步包括不与靶互补的3’末端核苷酸(见图16)。
简而言之，使用了以下试剂和浓度：
200ng的Pfu FEN核酸酶
1.25UPfu V93R聚合酶
200nM探针：
1Q5F
2’甲氧基修饰位于2-16 1Q5F
200nM Alt B合成的ssDNA靶
200nM上游寡聚物：
F-1A错配
在Mx3000P实时PCR装置内进行反应，参数如下：
1个循环的95℃，2分钟，随后50个循环的：
95℃，10秒；
60℃，30秒。
结果证实，使用具有3’错配的上游寡核苷酸，当形成非重叠(非侵入型)切割结构之后，在反应混合物中产生代表存在靶的可检测信号。
其他实施方式
其他实施方式对于本领域人员而言将是显而易见的。应该理解，前面给出的具体描述仅仅是为了透彻地解释本发明，其仅仅是示例性的。本发明的实质和范围并不限于上述实例，而是包括在所附权利要求书的范围内。
Claims (74)
1.一种组合物，其包含聚合酶、切割剂、上游引物和下游抗切割探针，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割。
2.权利要求1的组合物，其中所述抗切割部分包含一或多种修饰，所述修饰造成+1位下游的部分不易被切割。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含一或多种修饰，所述修饰造成+2位下游的部分不易被切割。
4.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段两个或更多个胸苷。
5.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段三个或更多个胸苷。
6.权利要求2的组合物，其中所述修饰是硫代磷酸酯。
7.权利要求2的组合物，其中所述修饰是2’-O-甲氧基。
8.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含不抗切割的靶互补区，且所述靶互补区的Tm低于进行引物延伸的温度。
9.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含至少一种能够产生信号的标记部分。
10.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针包含一对产生相互作用信号的标记部分，所述标记部分被有效地放置以猝灭可检测信号的产生，所述标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点分开。
11.权利要求10的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
12.权利要求10的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便它们在非重叠切割结构被切割后分开。
13.权利要求12的组合物，其中所述一对产生相互作用信号的部分的第一成员有效地偶联于位置+1，且所述一对产生相互作用信号的部分的第二成员有效地偶联于5’活瓣。
14.权利要求1的组合物，还包含上游寡核苷酸，所述上游寡核苷酸和所述引物与所述靶的相同区域互补，且所述上游寡核苷酸包含至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸。
15.权利要求1的组合物，还包含与靶的区域互补的上游寡核苷酸，所述区域位于所述靶的与所述下游抗切割探针互补的区域的上游并与之邻近。
16.权利要求1的组合物，还包含反向引物。
17.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶基本上缺乏5’至3’核酸酶活性。
18.权利要求1的组合物，其中所述切割剂包含5’核酸酶。
19.权利要求4的组合物，其中所述5’核酸酶是FEN-1核酸酶。
20.权利要求5的组合物，其中所述FEN-1核酸酶是活瓣特异性核酸酶。
21.权利要求5的组合物，其中所述FEN-1核酸酶具有热稳定性。
22.权利要求1的组合物，其中所述聚合酶具有热稳定性。
23.权利要求1的组合物，其中所述抗切割探针的3’核苷酸具有封闭基团。
24.一种组合物，其包含聚合酶、切割剂、上游寡核苷酸和下游抗切割探针，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，所述上游寡核苷酸具有至少一个与靶不互补的3’末端核苷酸，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割。
25.权利要求19a的组合物，其中所述上游寡核苷酸与靶的区域互补，所述区域邻近所述靶的与所述下游抗切割探针互补的区域。
26.权利要求19b的组合物，其中上游寡核苷酸和下游抗切割探针的所述靶互补区当与靶核酸杂交时被缺口分开。
27.权利要求19b的组合物，其中上游寡核苷酸和下游抗切割探针的所述靶互补区当与靶核酸杂交时被切口分开。
28.一种试剂盒，其包含权利要求1的组合物及其包装材料。
29.权利要求20的试剂盒，其中所述切割剂包含5’核酸酶。
30.权利要求21的试剂盒，其中所述5’核酸酶是FEN-1核酸酶。
31.权利要求20的试剂盒，其中所述抗切割探针的3’核苷酸具有封闭基团。
32.权利要求20的试剂盒，其中所述抗切割探针包含至少一种能够产生信号的标记部分。
33.权利要求20的试剂盒，其中所述抗切割探针包含一对产生相互作用信号的标记部分。
34.权利要求25的试剂盒，其中所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
35.权利要求25的试剂盒，其中所述一对产生相互作用信号的标记部分的至少一个成员有效地偶联于所述抗切割探针的5’活瓣。
36.权利要求24的试剂盒，其中所述至少一个标记部分有效地偶联于所述抗切割探针的5’活瓣。
37.权利要求1的组合物，还包含靶核酸。
38.权利要求14的试剂盒，还包含上游寡核苷酸，所述上游寡核苷酸和所述引物与所述靶的相同区域互补，且所述上游寡核苷酸包含至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸。
39.权利要求18的试剂盒，还包含与靶的区域互补的上游寡核苷酸，所述区域位于区域的上游并与之邻近29.权利要求18的试剂盒，还包含反向引物。
40.权利要求18的试剂盒，其中所述聚合酶基本上缺乏5’至3’核酸酶活性。
41.一种试剂盒，其包含权利要求24的组合物及其包装材料。
42.一种组合物，其包含：
(i)切割剂；
(ii)靶核酸，其从3’至5’方向包含第一区域、延伸区域和第二区域；
(iii)上游引物，其与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补；
(iv)下游抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸的所述第二区域至少部分互补，且其中所述5’区域不与所述靶核酸互补，所述抗切割探针还包括抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割；和
(v)聚合酶。
43.一种组合物，其包含：
(i)切割剂；
(ii)靶核酸，其从3’至5’方向包含第一区域、延伸区域和第二区域；
(iii)上游寡核苷酸，其与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补并包含至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸；
(iv)下游抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸的所述第二区域至少部分互补，且其中所述5’区域不与所述靶核酸互补，所述抗切割探针还包括抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割；和
(v)聚合酶。
44.产生表明样品中存在靶核酸序列的信号的方法，其包括：通过将包含靶核酸序列的样品与聚合酶、上游引物和抗切割探针一起温育而形成切割结构，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割；并以切割剂在所述探针的易被切割的位置处切割所述切割结构以产生信号，其中产生所述信号表明所述样品中存在靶核酸序列。
45.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针在+1位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针抗切割。
46.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针在+2位的下游包含一或多个修饰，所述修饰使得所述探针抗切割。
47.权利要求42或44的方法，其中所述抗切割探针具有位于肘弯上游并与之相连的一段两个或更多个胸苷。
48.权利要求45的方法，其中所述修饰是硫代磷酸酯。
49.权利要求45的方法，其中所述修饰是2’-O-甲氧基。
50.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针包含易被切割的靶互补区，且所述靶互补区的Tm低于进行引物延伸的温度。
51.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针包含至少一种能够产生信号的标记部分。
52.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针包含一对产生相互作用信号的标记部分，所述标记部分被有效地放置以猝灭可检测信号的产生，所述标记部分被易被FEN核酸酶切割的位点分开。
53.权利要求52的方法，其中所述一对产生相互作用信号的部分包含猝灭剂部分和荧光部分。
54.权利要求52的方法，其中所述一对产生相互作用信号的部分被有效地放置以便它们在非重叠切割结构被切割后分开。
55.权利要求52的方法，其中所述一对产生相互作用信号的部分的第一成员有效地偶联于位置+1，且所述一对产生相互作用信号的部分的第二成员有效地偶联于5’活瓣。
56.权利要求44的方法，其中所述聚合酶具有热稳定性。
57.权利要求44的方法，其中所述切割剂是FEN核酸酶。
58.权利要求57的方法，其中所述FEN核酸酶是活瓣特异性核酸酶。
59.权利要求57的方法，其中所述FEN核酸酶具有热稳定性。
60.权利要求44的方法，其中所述抗切割探针包含至少一种能够产生信号的标记部分。
61.权利要求44的方法，还包含寡核苷酸，所述寡核苷酸和所述引物与所述靶的相同区域互补，其中所述上游寡核苷酸还包括至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸。
62.权利要求44的方法，还包含上游寡核苷酸，所述寡核苷酸与所述靶的区域互补，所述区域位于所述靶的与所述下游抗切割探针互补的区域的上游并与之邻近。
63.权利要求44的方法，还包含反向引物。
64.权利要求44的方法，其中所述聚合酶基本上缺乏5’至3’核酸酶活性。
65.产生表明样品中存在靶核酸序列的信号的方法，其包括：通过将包含靶核酸序列的样品与聚合酶、上游寡核苷酸和抗切割探针一起温育而产生切割结构，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，且所述上游寡核苷酸具有至少一个与靶不互补的3’末端核苷酸，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割；和以切割剂在所述探针的易被切割的位置处切割所述切割结构以产生信号，其中产生所述信号表明所述样品中存在靶核酸序列。
66.一种检测或测定靶核酸序列的方法，其包括：通过将包含靶核酸序列的样品与聚合酶、上游引物和抗切割探针一起温育而形成切割结构；和以切割剂在所述探针的易被切割的位置处切割所述切割结构以释放核酸片段；和检测和/或测定所述片段的释放以作为所述样品中存在靶序列的表示。
67.一种检测样品中的靶核酸序列的方法，其包括：在允许进行以下步骤的条件下混合切割剂、上游引物、下游抗切割探针、聚合酶和靶核酸，其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被所述切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被所述切割剂切割，所述步骤为：(i)将上游引物与下游抗切割探针退火，(ii)延伸上游引物，其中所述聚合酶合成引物延伸产物并与下游抗切割探针形成切割结构，和(iii)以切割剂切割所述切割结构以产生可检测信号，并检测和/或测定所述信号。
68.权利要求67的方法，其中所述下游抗切割探针包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸至少部分互补，而所述5’区域形成活瓣。
69.检测靶核酸的方法，其包括：
(a)提供：
上游引物，其与靶核酸的第一区域至少部分互补，和
下游抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，且其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被切割剂切割；
(b)在允许所述靶核酸与所述上游引物和所述下游抗切割探针的3’区域之间形成双链体的条件下混合所述靶核酸和所述上游引物和下游抗切割探针；
(c)在如下条件下对所述双链体进行聚合酶活性处理，所述条件允许通过聚合与一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补的核酸链而延伸所述上游引物；
(d)在如下条件下提供切割剂，所述条件使得以依赖于所述切割结构形成的方式在位于所述下游抗切割探针内部的位点发生所述切割结构的切割，由此允许所述下游抗切割探针被切割；
(e)检测所述下游抗切割探针的切割。
70.权利要求69的方法，其中所述聚合酶活性聚合核苷酸以与一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补，所述聚合的互补核酸以其3’端邻近双链体内的下游寡核苷酸。
71.权利要求69的方法，其中所述聚合酶活性聚合核苷酸以与一段长度足以形成切割结构的延伸区域互补，所述延伸区域的长度是使得所述延伸区域是完全的双链体核酸的长度。
72.权利要求69的方法，其中所述下游抗切割探针的所述5’区域形成5’活瓣。
73.一种检测靶核酸的方法，其包括：
(a)提供：
上游引物，其与靶核酸的第一区域至少部分互补，
上游寡核苷酸，其与靶核酸的延伸区域至少部分互补并包含至少一个不与所述靶互补的3’末端核苷酸，和
下游抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，且其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被切割剂切割；
(b)在如下条件下混合靶核酸、上游引物、上游寡核苷酸和下游抗切割探针，所述条件允许在靶核酸与上游引物、上游寡核苷酸和下游抗切割探针的3’区域之间形成双链体；
(c)在如下条件下对所述双链体进行聚合酶活性和切割活性处理，所述条件允许上游引物的引物延伸和抗切割探针的切割；和
(e)检测所述下游抗切割探针的切割。
74.一种检测核酸的方法，其包含：
(a)提供：
靶核酸，其从3’至5’方向包含第一区域和第二区域，
模板核酸，其从3’至5’方向包含第一区域和第二区域，
第一上游寡核苷酸，其与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补，
第一抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，而其中所述5’区域不与所述靶核酸互补但与所述模板核酸的所述第一区域至少部分互补，且其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被切割剂切割；
第二抗切割探针，其包含5’区域和3’区域，其中所述3’区域与所述模板核酸的所述第二区域至少部分互补，而所述5’区域不与所述模板核酸互补，且其中所述抗切割探针包含抗切割部分和易切割部分，其中所述抗切割部分在形成重叠结构后不易被切割剂切割，而所述易切割部分在形成非重叠切割结构后易被切割剂切割；
切割剂，和
核酸聚合酶；
(b)在如下反应条件下混合所述靶核酸、所述模板核酸、所述第一上游寡核苷酸、所述第一抗切割探针、所述第二抗切割探针、所述切割剂和所述核酸聚合酶，其中所述反应条件允许：
所述靶核酸与所述第一上游寡核苷酸和所述第一抗切割探针中的每一个形成双链体，其中所述第一抗切割探针的所述5’区域形成第一切割结构的第一活瓣，
以所述切割剂切割第一活瓣，由此允许释放所述第一活瓣，
以所释放的第一活瓣、所述模板核酸和所述第二抗切割探针形成第二双链体，其中所述第二抗切割探针的所述5’区域形成第二切割结构的第二活瓣，和
以所述切割剂切割所述第二活瓣；和
(c)检测由所述第二活瓣切割所产生的信号，所述信号仅在如下情况下产生，所述情况为：当形成所述第一和第二双链体时，所述第一上游寡核苷酸与所述第一抗切割探针和所述释放的活瓣与所述第二抗切割探针至少被切口分开。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20110406 |