KR20090098971A - 절단 내성 프로브를 갖는 절단 구조를 형성함으로써 표적 핵산을 검출하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 절단 내성 프로브를 사용하여 샘플 중의 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
절단 내성 프로브, 표적 핵산, FEN 뉴클레아제, 중합효소, 오버래핑, 비-오버래핑

Description

절단 내성 프로브를 갖는 절단 구조를 형성함으로써 표적 핵산을 검출하는 방법{Methods for Detection of a target nucleic acid By Forming a cleavage structure with a cleavage resistant probe}
본 발명은 절단 내성 프로브를 갖는 절단 구조를 형성함으로써 표적 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다.
DNA 복제, 재조합 및 수선의 충실성은 게놈 안정성을 유지하는데 필수적이고, 또 이들 과정은 모든 생물에 존재하는 5'→3' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 효소에 의존한다. DNA 수선의 경우, 이들 효소는 손상된 단편 절단 및 재조합적 미스매치(mismatch) 정정을 위해 필요하다. 복제의 경우, 이들 뉴클레아제는 지연 가닥(lagging strand) DNA 합성 동안 오카자키(Okazaki) 단편의 효과적인 가공을 위해 중요하다. 대장균(Escherichia coli)에서, 상기 후술한 활성은 DNA 중합효소 I (PolI)에 의해 제공된다; PolI 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인에서 돌연변이를 불활성화하는 대장균 균주는 오카자키(Okazaki) 단편을 가공할 수 없기 때문에 생존할 수 없다. 그러나, 진핵생물 DNA 중합효소는 고유한 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인이 결여되어 있고, 또 이러한 중요한 활성은 다기능성, 구조 특이적 메탈로뉴클레아제(metallonuclease) FEN-1 (5' 엑소뉴클레아제-1 또는 플랩(flap) 엔도뉴클레아 제(endonuclease)-1)에 의해 제공되며, 이것은 5'DNA 플랩에 대한 엔도뉴클레아제로도 작용한다(Reviewed in Hosfield et al., 1998a, 세포, 95:135).
효소가 라벨링된(labelled) 핵산 단편을 생성하는 핵산을 검출 및/또는 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다.
미국 특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 5' 라벨링된 표적 DNA를 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 단리된 DNA 중합효소 (Taq 중합효소) 및 소망하는 절단 점에서 서열에 혼성화될 수 있는 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드와 함께 배양함으로써 표적 DNA 분자를 절단하는 방법을 개시한다. 상기 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드는 Taq 중합효소를, 소망하는 절단 점과 대향하는 3' 연장부를 갖는 듀플렉스를 함유하는 기질 구조의 형성을 통하여 표적 DNA로 보내며, 상기 올리고뉴클레오티드의 비상보적 영역은 3' 아암(arm)을 제공하고 또 기질 분자의 비어닐링(unannealed) 5' 영역은 5' 아암을 제공한다. 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드는 혼성화되지 않을(unhybridized) 때 또는 소망하는 절단 점에서 표적 서열에 혼성화(hybridized)될 때 짧은 헤어핀을 형성할 수 있는 3' 뉴클레오티드 연장부를 포함한다. 라벨링된 단편의 방출은 Taq 중합효소에 의한 절단 이후에 검출된다.
미국 특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 아주 적은 또는 거의 검출되지 않는 합성 활성 및 야생형 열안정성 뉴클레아제 활성을 갖는 돌연변이체 열안정성 DNA 중합효소의 생성을 개시한다. 돌 연변이체 중합효소는 5'→ 3' 합성 활성이 결여되어 있기 때문에 유용한 것으로 말해진다; 따라서 합성 활성은 검출 에세이에서 DN절단 단계와 조합된 바람직하지 않은 부반응이다.
미국특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 야생형 Taq 중합효소 또는 합성 활성이 결여된 돌연변이체 Taq 중합효소가 헤어핀 구조의 3' 아암에 결합되는 프라이머 존재하에서, 열 변성에 이은 냉각에 의해 형성된 5' 말단 라벨링된 헤어핀 구조를 절단하는 것에 의해 라벨링된 단편을 방출할 수 있다고 개시하고 있다. 또한 미국특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 합성 활성이 결여된 돌연변이체 Taq 중합효소가 또한 헤어핀 구조의 3' 아암에 결합되는 프라이머 부재하에서 상기 헤어핀 구조를 절단할 수 있다고 개시한다.
미국특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 또한 합성 활성이 결여된 돌연변이체 Taq 중합효쇼에 의해 헤어핀 구조의 3' 아암에 결합되는 프라이머의 존재하에서 상기 헤어핀 구조의 절단으로 단일 종의 라벨링된 절단 생성물을 얻는 반면에, 야생형 Taq 중합효소는 다수 절단 생성물을 생성하고 또 야생형 Taq 효소의 고도의 합성 활성으로 인하여 헤어핀 구조를 dNTPs의 존재하에서 이중가닥 형태로 전환한다고 개시한다.
미국특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 또한 야생형 Taq 중합효소가 아니라, 감소된 합성 활성을 나타내는 돌연변이체 Taq 중합효소가 5' 말단 라벨링된 표적 핵산 및 상보적 올리고뉴클레오 티드를 포함하는 선형 핵산 기질을 절단함으로써 단일 라벨링된 단편을 방출할 수 있다고 개시하고 있으며, 상기 상보적 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 5' 및 3' 영역이 상기 올리고뉴클레오티드에 어닐링되지 않고 단일 가닥으로 잔존하도록 표적 핵산의 부분에 혼성화된다.
미국특허 5,843,669호, 5,719,028호, 5,837,450호, 5,846,717호 및 5,888,780호는 또한 2차 구조의 천연 산출 영역에서 라벨링된 핵산 기질을 절단하는 방법을 개시한다. 상기 방법에 따르면, 비오틴 라벨링된 DNA 기질을 PCR에 의해 제조하고, 야생형 Taq 중합효소 또는 CleavaseBN (감소된 합성 활성과 야생형 5' → 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 돌연변이체 Taq 중합효소)과 혼합한 다음 95℃에서 5초간 배양하여 기질을 변성시킨 다음 65℃로 급냉시켜 상보적 염기 사이에 가닥내(instra-strand) 수소 결합이 형성되게 하여 DNA가 독특한 2차 구조로 되게 한다. 상기 반응 혼합물을 65℃에서 배양하여 절단이 생겨 비오티닐화(biotinylated)된 절단 생성물이 검출되게 한다.
라벨링된 핵산 단편을 생성하기 위하여 FEN-1 효소가 사용되는 핵산의 검출 및/또는 측정 방법은 이 기술분야에 공지되어 있다.
미국특허 5,843,669호는 감소된 합성 활성을 나타내는 돌연변이체 Taq 중합효소의 존재하 또는 부재하에서 열안정성 FEN-1 뉴클레아제를 사용한 절단 단편 길이 다형성 분석에 의해 다형성을 검출하는 방법을 개시한다. 상기 방법에 따르면, 이중가닥 C형 간염 바이러스(HCV) DNA 단편은 PCR 반응에서 5' 말단 라벨링된 프라이머(TMR 형광 염료에 의해 라벨링된)를 사용하여 라벨링된다. 이 TMR 라벨링된 PCR 생성물은 95℃로 가열하는 것에 의해 변성시키고 또 55℃로 냉각시켜 절단 구조를 생성하였다. 미국 특허 5,843,669호는 절단 구조가 2차 구조를 함유하는 단일 가닥의 핵산 기질 영역을 포함한다고 개시하고 있다. 절단은 CleavaseBN 뉴클레아제, 원시세균(archaebacteria) 메타노코커스 야나쉬(Methanococcus jannaschii)로부터 유도된 FEN-1 뉴클레아제 또는 양쪽 효소의 존재하에서 실시된다. 라벨링된 반응 생성물은 겔 전기영동에 이은 형광영상화(fluoroimaging)에 의해 가시화된다. 미국특허5,843,669호는 CleavaseBN 뉴클레아제 및 메타노코커스 야나쉬 FEN-1 뉴클레아제가 서로 용이하게 구별되는 절단 패턴을 생성하고, 또 양쪽 효소를 함유하는 반응으로부터 얻은 절단 패턴이 각 개별 효소에 의한 절단으로 생성된 패턴 요소를 포함하지만 단순히 각 개별 효소에 의해 생성된 절단 패턴의 복합체인 것은 아니라고 개시한다. 이것은 1개 효소에 의해 절단되지 않은 단편의 일부(상기 효소의 패턴에서 밴드로 나타나는)는 동일 반응 혼합물에서 제2 효소에 의해 절단될 수 있음을 나타낸다.
리아미체브(Lyamichev) 일행은 표적 DNA의 영역에 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)의 오버래핑(오버래핑) 쌍을 표적 DNA와 혼합하여 5' 플랩 영역을 형성할 때, 및 열안정성 FEN-1 뉴클레아제에 의한 라벨링된 하류(downstream) 프로브의 절단이 라벨링된 절단 생성물을 생성할 때 DNA를 검출하는 방법을 개시한다. 리아미체브 등은 또한 절단 신호를 증폭하여 서브아토몰(sub-attomole) 양의 표적 DNA의 정량 검출이 허용되도록 하기 위하여 다수 카피(copy)의 하류 올리고뉴클레오티드 프로브가 온도 주기 부재하에서 단일 표적 서열에 대 해 절단될 수 있는 반응 조건을 개시한다(Lyamichev et al., 1999, Nat . Biotechnol., 17:292).
중합효소 연쇄반응 (PCR) 수법은 미국특허 4,683,202호, 4,683,195호 및 4,800,159호에 기재되어 있다. 가장 간단한 형태로서, PCR은 대향하는 가닥에 혼성화되어 표적 DNA에서 목적하는 영역 측면에 위치하는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 특정 DNA 서열을 효소적으로 합성하는 시험관내 방법이다. 주형 변성, 프라이머 어닐링 및 어닐링된 프라이머의 DNA 중합효소에 의한 연장을 포함하는 일련의 반응 단계를 반복함으로써 그 말단이 프라이머의 5' 말단에 의해 정의된 특정 단편의 지수적 축적을 초래한다. PCR은 특정 DNA 서열을 109 배 정도로 선택적 농축을 생성할 수 있는 것으로 보고되어 있다. PCR 방법은 또한 Saiki et al., 1985, Science, 230:1350에도 기재되어 있다.
PCR 수법은 핵산 서열을 증폭하기 위한 극히 강력한 방법이지만, 증폭된 물질의 검출은 표적 DNA가 존재하는지 여부를 결정하기 위하여 PCR 산물의 부가적 조작과 후속 처리를 필요로 한다. 증폭된 물질의 검출을 위해 현재 필요한 후속 처리 단계의 수를 감소시키는 것이 바람직하다. 신호가 생성되면 표적 서열이 증폭되는 에세이 계는 증폭 단계 동안 신호를 생성하지 않는 PCR 방법에 비하여 증폭된 물질을 검출하기 위한 처리 단계를 덜 필요로 한다.
미국특허 5,210,015호 및 5,487,972호는 증폭할 핵산, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 Taq 중합효소 및 증폭된 영역에 상보적인 영역을 포함하는 5', 3' 또는 5' 및 3' 말단 라벨링된 프로브 및 부가적인 비상보적 5' 테일(tail) 영역의 존재하에서 PCR 반응의 증폭 단계 동안 신호를 생성하는 것을 포함하는 라벨링된 프로브를 방출하기 위한 PCR계 에세이(assay)를 개시한다. 미국특허 5,210,015호 및 5,487,972호는 또한 중합 독립적인 방식으로, 예컨대 dNTP 부재하에서 상류(upstream) 프로브에 의해 Taq 중합효소가 라벨링된 프로브 근처에 위치할 때 PCR계 에세이가 혼성화된 프로브의 5' 라벨링된 말단을 방출할 수 있다고 개시한다.
발명의 요약
본 발명은 표적 핵산 서열을 갖는 샘플을 핵산 중합효소와 함께 배양하는 것에 의해 절단 구조를 형성하고 또 상기 절단 구조를 FEN 뉴클레아제에 의해 절단하여 신호를 생성하는 것을 포함하며 상기 신호의 생성은 샘플 내에 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 것인, 샘플 내에 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법을 제공한다. 샘플 내에서 표적 핵산 서열을 검출하기 위한 비침습적 절단법을 기초로 하는 본 발명의 일 구체예로서, 프로브는 절단 내성 프로브이다. 절단 내성 프로브는 비-오버래핑(non-overlapping) 절단 구조(비침습적)가 형성될 때에만 절단제에 의해 절단될 수 있지만, 오버래핑 구조(침습적)가 형성될 때에는 절단제에 의해 절단될 수 없는 절단 구조를 형성한다. 절단에 대한 프로브의 내성은 변형이 존재하지 않으면 오버래핑 구조 형성시에 절단될 프로브의 부분에 본 발명에 따른 1 이상의 핵산 변형을 포함시키는 것에 의해 달성된다.
절단 내성 프로브를 시용한 방법 및 조성물
일 양태로서, 본 발명은 절단 내성 프로브를 이용하는 비침습적 절단 구조의 형성을 기초로 하여 서열 내에 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비침습적 절단 구조는 표적을 함유하는 샘플을 중합효소, 프라이머 및 절단 내성 프로브와 함께 배양하는 것에 의해 형성한다. 프라이머는 절단 내성 프로브의 표적 상류에 혼성화된다. 중합효소는 표적에 상보적인 핵산 분자를 합성하는 프라이머를 연장시킨다. 이렇게 합성된 가닥(strand)은 절단 내성 프로브와 표적 핵산에 의해 형성된 하이브리드(hybrid)와 동일 영역의 표적 핵산에서 오버랩하지 않는(하이브리드 형성하는) 이중가닥 핵산을 형성한다. 이러한 소위 비-오버래핑 절단 구조는 절단제(예컨대 FEN 뉴클레아제)의 존재하에서 절단되어 절단 결과로서 절단 구조로부터 방출되는 절단 단편을 생성하며 및/또는 샘플 내의 표적 핵산의 존재 및/또는 양을 나타내는 검출가능한 신호를 생성한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 "절단 내성 프로브"는 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조의 형성시 절단제에 의해 절단될 수 있지만, 오버래핑(침습적) 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단될 수 없는 절단 구조를 형성하는 프로브이다. 이러한 절단 내성은 프로브의 일부가 절단 내성인 오버래핑 구조에 의해 표적화되게 하여 1 이상의 변형을 포함하는 것에 의해 달성된다. 따라서, 절단 내성 프로브는 본 발명의 절단제에 의한 절단을 견디는 적어도 한 부분을 갖는다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 프로브가 본 발명의 절단제에 의한 절단을 견디는 프로브가 되도록 +1 및/또는 +2 위치의 하류에서 1 이상의 변형을 포함한다(도 13). 이들 변형은 프로브가 오버래핑(침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 하는 영역에서 절단을 견디게 한다(도 13의 B). 그러나, 절단 내성 프로브는 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 하는 영역에서 절단되기 쉽다(도 13의 A). 적합한 변형은 비제한적으로, 핵산 포스페이트를 티오포스페이트로 치환하는 변형 및/또는 2' 히드록실을 2'-O-메톡시로 치환하는 변형을 포함한다. 다른 적합한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로-β-D-아라비노핵산(2'F-ANA) 뉴클레오티드, 록킹된(locked) 핵산(LNA) 및 ENA: 2'-O,4'-C-에틸렌-브릿지된 핵산을 포함한다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 절단 내성이 아니고 또 프라이머 연장이 실시되는 온도보다 더 낮은 융점(Tm)을 갖는 표적 상보적 영역을 포함한다(도 13의 C).
다른 구체예로서, 절단 내성 프로브는 엘보우(elbow) 상류 및 그와 인접하게 2 이상의 티미딘 스트레치(stretch)를 갖는다. 다른 구체예로서, 절단 내성 프로브는 엘보우 상류 및 그와 인접하게 3 이상의 티미딘 스트레치를 갖는다. 다른 구체예로서, 절단 내성 프로브는 엘보우 상류 및 그와 인접하게 4 이상의 티미딘 스트레치를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "인접하는"은 각 영역(즉 엘보우 및 제1 티미딘)이 다음 영역과 접촉하는 뉴클레오티드에 대하여 직접적인 뉴클레오티드로 존재함을 의미한다. 예컨대, 엘보우 및 제1 상류 티미딘 위치-1)은 다른 부가적인 뉴클레오티드를 사이에 두지 않고 접촉한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "티미딘 스트레치"는 인접하는 2 이상의 티미딘을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "엘보우"는 5' 플랩의 제1 단일 가닥 뉴클레오티드와 제1 이중 가닥(표적 핵산에 대하여 혼성화된; +1 위치) 뉴클레오티드 사이의 포스페이트 결합을 지칭한다.
다른 구체예로서, 중합효소는 열안정성이다. 적합한 중합효소는 바이러스성, 레트로바이러스성(retroviral) 및 세균성 효소이다. 예컨대, 중합효소는 다음과 같다: 대장균 DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소, 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) DNA 중합효소, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 테르모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 중합효소, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 중합효소 및 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 중합효소를 포함한다.
다른 구체예로서, 절단제는 FEN 뉴클레아제이다. FEN은 열안정성일 수 있다.
하류의 절단 내성 프로브는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 1 이상의 라벨링된 부위(moiety)를 포함할 수 있다. 다르게는, 하류 절단 내성 프로브는 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 한 쌍을 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 쌍은 검출가능한 신호의 생성을 중지시키도록 효과적으로 배치된다. 라벨링된 부위는 FEN 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리된다. 다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처(quencher) 부위 및 형광 부위를 포함한다.
다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 비-오버래핑 절단 구조의 절단시 검출가능한 신호를 분리하여 생성하지만 오버래핑 구조의 형성시에는 검출가능한 신호를 분리하지도 생성하지 않도록 효과적으로 배치된다. 예컨대, 형광물질(fluorescer)은 프로브의 위치 +1에 작용가능하게 결합될 수 있고 또 켄처는 프로브의 5' 플랩에 작용가능하게 결합되므로 위치 +1의 상류의 비침습적 절단시 라벨은 분리되고 검출가능한 신호가 생성된다(도 14).
다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드가 또한 반응에 포함되며, 이때 상류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 1 이상의 비상보적 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서, 상기 반응은 2개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드의 혼합물, 상류 올리고뉴클레오티드와 비상보적 3' 말단 및 프라이머를 함유한다. 프라이머 및 상류 올리고뉴클레오티드는 표적의 동일 및 일반적 영역에 상보적이다. 상류 올리고뉴클레오티드는 하류 절단 내성 프로브의 절단을 선호하는 비침습적 절단 구조를 형성하는 반면에, 프라이머는 표적의 증폭을 선호한다. 다른 구체예로서, 상기 반응은 상류 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역과 구별되는 표적의 영역에 상보적인 프라이머 또는 프라이머들, 즉 상류 올리고뉴클레오티드의 표적 상류 부분에 상보적인 정방향(forward) 프라이머 및 상기 표적에 상보적인 핵산 분자에 상보적인 역방향(reverse) 프라이머를 포함한다.
다른 양태로서, 본 발명은 샘플 내에 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법에 관한 것이다. 상류 프라이머, 하류 절단 내성 프로브, 중합효소 및 절단제를 샘플과 혼합한다. 이 혼합물을 상류 프라이머와 하류 절단 내성 프로브가 표적에 어닐링되게 하고, (ii) 상류 프라이머의 연장 및 (iii) 비-오버래핑 절단 구조의 절단을 허용하는 반응 조건에 처리시킨다. 상기 중합효소는 하류 절단 내성 프로브를 갖는 비침습적 절단 구조를 형성하는 프라이머 연장 생성물을 합성한다. 절단제는 절단 구조로부터 라벨링된 단편을 방출하는 비-오버래핑 절단 구조를 절단하여 검출가능한 라벨링된 단편을 생성한다. 이들 라벨링된 단편은 샘플 내에 표적 서열의 존재를 나타내는 것으로 검출되거나 및/또는 측정된다. 다르게는, 표적의 존재는 절단 구조의 절단시 생성된 신호를 검출 및/또는 측정하는 것에 의해 결정된다(예컨대 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍의 분리).
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 프로브가 절단 내성이게 하는 +1 및/또는 +2 위치의 하류에 1 이상의 변형을 포함한다(도 13). 이들 변형은 오버래핑(침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 한 영역에서 프로브를 절단 내성으로 만든다(도 13의 B). 그러나, 절단 내성 프로브는 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 하는 영역에서는 절단되기 쉽다(도 13의 A). 적합한 변형은 핵산 포스페이트를 티오포스페이트로 치환하는 변형 및/또는 2' 히드록실을 2'-O-메톡시로 치환하는 변형을 포함한다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 절단 내성이 아니고 또 프라이머 연장이 실시되는 온도보다 더 낮은 Tm을 갖는 표적 상보적 영역을 포함한다(도 13의 C).
다른 구체예로서, 중합효소는 열안정성이다. 적합한 중합효소는 바이러스성, 레트로바이러스성(retroviral) 및 세균성 효소이다. 예컨대, 중합효소는 다음과 같다: 대장균 DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소, 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) DNA 중합효소, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 테르모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 중합효소, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 중합효소 및 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 중합효소를 포함한다.
다른 구체예로서, 절단제는 FEN 뉴클레아제이다. FEN은 열안정성일 수 있다.
하류의 절단 내성 프로브는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 1 이상의 라벨링된 부위(moiety)를 포함할 수 있다. 다르게는, 하류 절단 내성 프로브는 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 한 쌍을 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 쌍은 검출가능한 신호의 생성을 중지시키도록 효과적으로 배치된다. 라벨링된 부위는 FEN 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리된다. 다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함한다.
다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 비-오버래핑 절단 구조의 절단시 검출가능한 신호를 분리하여 생성하지만 오버래핑 구조의 형성시에는 검출가능한 신호를 분리하지도 생성하지 않도록 효과적으로 배치된다. 예컨대, 형광물질(fluorescer)은 프로브의 위치 +1에 작용가능하게 결합될 수 있고 또 켄처는 프로브의 5' 플랩에 작용가능하게 결합되므로 위치 +1의 상류의 비침습적 절단시 라벨은 분리되고 검출가능한 신호가 생성된다(도 14).
다른 구체예로서, 하류 절단 내성 프로브는 5' 영역 및 3' 영역을 포함하며, 이때 3' 영역은 표적에 대해 상보적이어서 어닐링되고 또 5' 영역은 플랩을 형성한다.
다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드가 또한 반응에 포함되며, 이때 상류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 1 이상의 비상보적 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서, 상기 반응은 2개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드의 혼합물, 상류 올리고뉴클레오티드와 비상보적 3' 말단 및 프라이머를 함유한다. 프라이머 및 상류 올리고뉴클레오티드는 표적의 동일 및 일반적 영역에 상보적이다. 상류 올리고뉴클레오티드는 하류 절단 내성 프로브의 절단을 선호하는 비침습적 절단 구조를 형성하는 반면에, 프라이머는 표적의 증폭을 선호한다.
다른 양태로서, 본 발명은 상류 프라이머 및 하류 절단 내성 프로브가 제공되는 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 상류 프라이머는 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 하류 절단 내성 프로브는 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이다. 표적의 제1 및 제2 영역은 연장 영역에 의해 분리된다. 프로브 및 프라이머를 표적 핵산과 상류 프라이머 및 표적과 하류 절단 내성 프로브의 3' 영역 사이에 듀플렉스의 형성을 허용하는 조건하에서 표적과 혼합된다. 상기 반응은 절단 구조를 형성하기에 충분한 표적의 연장 영역의 길이에 상보적인 DNA 가닥의 중합반응에 의해 상류 프라이머를 연장하는 중합효소 활성을 허용하는 반응 조건에 처리시킨다. 이 반응 조건은 또한 절단제에 의해 비-오버래핑 절단 구조의 절단을 허용한다. 절단 구조는 절단되어 검출되는 하류 절단 내성 프로브의 검출가능한 단편을 방출한다. 다르게는, 표적의 존재는 절단 구조의 절단시 생성되는 신호를 검출 및/또는 측정하는 것에 의해 결정된다(예컨대, 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위의 쌍을 분리).
다른 구체예로서, 절단 내성 프로브는 프로브가 절단 내성이게 하는 +1 및/또는 +2 위치의 하류에 1 이상의 변형을 포함한다(도 13). 이들 변형은 오버래핑(침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 한 영역에서 프로브를 절단 내성으로 만든다(도 13의 B). 그러나, 절단 내성 프로브는 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조에 의한 절단을 표적으로 하는 영역에서는 절단되기 쉽다(도 13의 A). 적합한 변형은 핵산 포스페이트를 티오포스페이트로 치환하는 변형 및/또는 2' 히드록실을 2'-O-메톡시로 치환하는 변형을 포함한다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 절단 내성이 아니고 또 프라이머 연장이 실시되는 온도보다 낮은 Tm을 갖는 표적 상보적 영역을 포함한다.
다른 구체예로서, 중합효소는 열안정성이다. 적합한 중합효소는 바이러스성, 레트로바이러스성(retroviral) 및 세균성 효소이다. 예컨대, 중합효소는 다음과 같다: 대장균 DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소, 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) DNA 중합효소, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 테르모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 중합효소, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 중합효소 및 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 중합효소를 포함한다.
다른 구체예로서, 절단제는 FEN 뉴클레아제이다. FEN은 열안정성일 수 있다.
하류의 절단 내성 프로브는 검출가능한 신호를 제공할 수 있는 1 이상의 라벨링된 부위(moiety)를 포함할 수 있다. 다르게는, 하류 절단 내성 프로브는 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 한 쌍을 포함한다. 다른 구체예로서, 상기 라벨링된 부위를 생성하는 상호작용성 신호 쌍은 검출가능한 신호의 생성을 중지시키도록 효과적으로 배치된다. 라벨링된 부위는 FEN 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리된다. 다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함한다.
다른 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 비-오버래핑 절단 구조의 절단시 검출가능한 신호를 분리하여 생성하지만 오버래핑 구조의 형성시에는 검출가능한 신호를 분리하지도 생성하지 않도록 효과적으로 배치된다. 예컨대, 형광물질(fluorescer)은 프로브의 위치 +1에 작용가능하게 결합될 수 있고 또 켄처는 프로브의 5' 플랩에 작용가능하게 결합되므로 위치 +1의 상류의 비침습적 절단시 라벨은 분리되고 검출가능한 신호가 생성된다(도 14).
일 구체예로서, 중합효소 활성은 절단 구조를 형성하기에 충분한 연장 영역의 길이에 상보적인 뉴클레오티드를 중합시키므로 중합된 상보적인 핵산은 듀플렉스 내에 하류 절단 내성 프로브에 대하여 3' 말단에 인접한다.
다른 구체예로서, 중합효소 활성은 절단 구조를 형성하기에 충분한 연장 영역의 길이에 상보적인 뉴클레오티드를 중합시키므로, 연장 영역은 충분히 듀플렉스화된 핵산이다.
하류 절단 내성 프로브의 5' 영역은 표적에 혼성화되면 5' 플랩을 형성한다.
다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 조성물을 제공한다. 본 발명은 중합효소, 절단제, 프라이머 및 하류 절단 내성 프로브를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구체예로서, 중합효소는 열안정성이다.
다른 구체예로서, 조성물은 표적 핵산을 포함한다. 절단제는 5' 뉴클레아제(예컨대 FEN-1 뉴클레아제)일 수 있다. 뉴클레아제는 열안정성일 수 있다.
다른 구체예로서, 하류 절단 내성 프로브는 3' 말단 뉴클레오티드에 대하여 결합된 차단(blocking) 기를 갖는다. 하류 절단 내성 프로브는 바람직하게는 라벨링된다. 예컨대, 하류 절단 내성 프로브는 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 가질 수 있다. 다르게는, 하류 절단 내성 프로브는 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍(예컨대 켄처 및 형광물질)을 갖는다. 라벨은 하류 절단 내성 프로브의 5' 영역 또는 3' 영역에 작용가능하게 결합될 수 있다. 일부 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 하류 절단 내성 프로브에 작용가능하게 결합되므로 FEN 뉴클레아제에 약한 부위가 라벨을 분리하게 된다.
다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드는 또한 반응에 포함되며, 이때 상류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 1 이상의 비상보적 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서, 상기 반응은 2개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드의 혼합물, 비상보적 3' 말단을 갖는 상류 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 함유한다. 프라이머 및 상류 올리고뉴클레오티드는 표적의 동일한 일반 영역에 대하여 상보적이다. 상류 올리고뉴클레오티드는 하류 절단 내성 프로브의 절단을 선호하는 비침습적 절단 구조를 형성하는 반면에, 프라이머는 표적의 증폭을 선호한다.
다른 양태로서, 본 발명은 3' → 5' 순서로 제1 영역, 연장 영역 및 제2 영역을 갖는 표적 핵산; 표적 핵산의 제1 영역에 대하여 적어도 부분적으로 상보적인 프라이머; 5' 영역 및 3' 영역을 갖고 3' 영역은 표적 핵산의 제2 영역에 대하여 적어도 부분적으로 상보적이고 또 5' 영역은 표적 핵산에 대하여 상보성이 아닌 하류 절단 내성 프로브; 및 절단제를 포함하는 조성물을 제공한다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 절단에 내성인 프로브로 만드는 +1 및/또는 +2 위치 하류에서 1 이상의 변형을 포함한다(도 13). 이들 변형은 프로브가 오버래핑 구조에 의한 절단에 대한 표적으로 되는 영역에서 절단 내성으로 되게한다(도 13의 B). 그러나, 절단 내성 프로브는 비-오버래핑 절단 구조에 의한 절단에 대한 표적으로 되는 영역에서 절단되기 쉽다(도 13의 A). 적합한 변형은 핵산 포스페이트르를 티오포스페이트로 치환하는 변형 및 2'-히드록실을 2'-O-메톡시로 치환하는 변형을 포함한다.
일 구체예로서, 절단 내성 프로브는 절단에 내성이 아니고 또 프라이머가 연장이 실시되는 온도보다 더 낮은 Tm을 갖는 표적 상보적 영역을 포함한다(도 13의 C).
마지막 2개 양태의 일 구체예로서, 절단제는 5' 뉴클레아제 (예컨대 FEN-1 뉴클레아제)이다. 다른 구체예로서, FEN-1 뉴클레아제 및/또는 중합효소는 열안정성이다.
하류 절단 내성 프로브는 3' 말단 뉴클레오티드 상에 차단기를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 절단 내성 프로브는 검출가능하게 라벨링된다. 예컨대, 하류 절단 내성 프로브는 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함할 수 있다. 다르게는, 하류 절단 내성 프로브는 한 쌍의 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위를 포함한다(예컨대, 켄처 및 형광물질).
다른 양태로서, 본 발명은 상기 기재된 조성물 중의 하나를 포함하는 키트를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"는 프로브 중의 적어도 1개의 서열과 표적 영역 중의 서열의 상보성으로 인하여 표적 핵산 중의 서열과 듀플렉스 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 바람직하게는, 프로브는 라벨링된다. 바람직하게는 프로브는 프라이머에 사용된 서열에 대하여 상보적인 서열을 함유하지 않는다. 프로브는 표적 핵산에 대하여 상보적인 영역 또는 영역들을 포함한다(예컨대 표적 핵산 결합 서열)(예컨대 도 4의 C). 일부 구체예로서, 본 발명에 따른 "프로브"는 표적 핵산에 대한 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함한다. 본 발명에 따른 "프로브"는 표적 핵산에 결합하여 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성하며, 이때 상기 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상기 프로브의 2차 구조는 바람직하게는 절단 온도에서 또는 그 이하에서 안정하다. 본 발명에 따른 프로브는 표적 핵산에 결합되기 전에는 본 명세서에 기재된 바와 같이 절단되어 "뉴클레아제"에 의한 신호를 생성할 수 없다. 본 발명의 일 구체예로서, 프로브는 결합될 수 없거나 또는 표적 핵산에 상보적이지 않은 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예로서, 프로브는 표적 핵산에 결합될 때 2차 구조를 가지지 않는다. 일 구체예로서, 프로브는 5' 영역 및 3' 영역을 갖는다. 3' 영역은 표적에 대해 상보적이고 또 5' 영역은 표적에 대해 상보적이거나 상보적이지 않을 수 있다.
절단 내성 프로브
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따른 "절단 내성 프로브"는 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조의 형성시 절단제에 의해 절단될 수 있지만, 오버래핑(침습적) 절단 구조의 형성시 절단제에 의해 절단될 수 없는 절단 구조를 형성하는 프로브이다. 이러한 절단 내성은 오버래핑 구조에 의해 표적화된 프로브의 일부가 절단 내성으로 되게 하는 1 이상의 변형을 포함하는 것에 의해 달성된다. 따라서, 절단 내성 프로브는 본 발명의 절단제에 의한 절단에 내성인 적어도 1개 부분을 갖는다.
일 구체예로서, 프로브는 위치 +1의 상류(비-오버래핑 절단 구조에 의해 표적화된 부분)에서 절단되기 쉽고 또 위치 +1의 하류 또는 위치 +2의 하류(예컨대 오버래핑 구조에 의해 표적화된 부분; 도 13)에서 절단 내성이다.
표적 내성 변형은 변형되지 않고 표적에 상보적인 프로브의 영역이 중합효소 연장 반응이 실시되는 온도보다 낮은 융점(Tm)(예컨대 72℃)을 갖는 한 프로브의 전체 상보적 부분(예컨대 위치 +1 내지 3' 말단)을 통하여 존재할 필요는 없다 (도 13의 C). 따라서, 프로브는 프로브의 전체 변형 부분(절단 내성 부분)이 표적으로부터 치환되면(예컨대 상류 프라이머의 연장시 오버래핑 구조를 형성하면) 상기 프로브는 더 이상 표적과 듀플렉스를 형성하지 않는다(도 15C). 본 발명에 따라 유용한 이러한 비-변형 및 상보적 영역은 절단/연장 반응의 온도보다 낮다(적어도 1℃℃ 및 바람직하게는 10℃). "절단 온도"는 가능하고 또 바람직하게는 절단 반응에 이용된 특정 뉴클레아제에 대해 적절하도록 처음으로 선택된다.
예컨대, 23개 뉴클레오티드 프로브는 20개 뉴클레오티드 표적 상보적 영역 (뉴클레오티드 위치 +1 내지 +20) 및 3개 뉴클레오티드 5' 플랩(뉴클레오티드 위치 -1 내지 -3)을 가질 수 있다. 프로브는 뉴클레오티드 +2 내지 +15가 FEN에 의한 절단에 내성이 되도록 변형될 수 있다 (도 15 참조). 비-변형 뉴클레오티드 16-20은 절단에 대해 표적으로 될 수 없는데 이는 이들 뉴클레오티드의 표적화가 프로브의 상보적 부분을 통한 프라이머의 연장 및 올리고뉴클레오티드 1-15의 치환을 필요로 하기 때문이다. 나머지 상보적 뉴클레오티드 (+16- +20)는 절단/연장 조건(1X Pfu 완충액, 60-72℃)하에서 표적과 안정한 듀플렉스를 형성하지 않을 것이고 또 프로브의 절단없이 분리될 것이다.
유사하게, 43 뉴클레오티드 프로브는 40 뉴클레오티드 표적 상보적 영역 (뉴클레오티드 위치 +1 내지 +40) 및 3 뉴클레오티드 5' 플랩 (뉴클레오티드 위치 -1 내지 -3)를 가질 수 있다. 이 프로브는 뉴클레오티드 +2 내지 +32가 FEN에 의한 절단에 내성이 되도록 변형될 수 있다.(도 15 참조). 비변형 뉴클레오티드 33-40은 절단에 대한 표적일 수가 없는데 그 이유는 이들 뉴클레오티드의 표적화는 프로브의 상보적 부분을 통한 프라이머 연장 및 올리고뉴클레오티드 1-32의 치환을 필요로 할 것이기 때문이다. 나머지 상보적 뉴클레오티드 (+33 내지 +40)는 절단/연장 조건(1X Pfu 완충액, 60-72℃)하에서 표적과 안정한 듀플렉스를 형성하지 않을 것이고 또 프로브의 절단없이 분리될 것이다.
상보적 비-변형 표적 상보적 영역의 Tm을 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 본 명세서에 기재되어 있다. 유사하게, 변형될 필요가 없는 절단 내성 프로브의 표적 상보적 영역의 크기를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 본 명세서에 기재되어 있다(III.C. 프로브 참조).
프로브의 변형 영역이 절단에 대해 내성인지 여부를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 본 명세서에 기재되어 있다. 예컨대, 프로브의 적어도 일부가 절단 내성으로 되도록 변형된 프로브를 사용하여 I.A 부분에 기재된 FEN 엔도뉴클레아제 활성 에세이 또는 실시예 14에 기재된 절단 에세이를 실시할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "변형" 또는 "변형된"은 프로브의 변형된 부분이 본 발명의 뉴클레아제에 의한 절단에 내성이 되도록 하는 핵산 프로브에서 변화를 지칭한다. 이러한 변형은 핵산 포스페이트를 티오포스페이트로 치환하는 변형 및 2' 히드록실을 2'-O-메톡시로 치환하는 변형을 포함한다. 다른 적합한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로-β-D-아라비노핵산(2'F-ANA) 뉴클레오티드, 록킹된 핵산(LNA) 및 ENA: 2'-O, 4'-C-에틸렌-브릿지된 핵산을 포함한다.
록킹된 핵산은 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 WO 99/14226호에 기재된 구조적으로 제한된 뉴클레오티드 유사체 종류를 나타낸다. 록킹된 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Koshkin, A.A., et al., Tetrahedron (1998), 54: 3607-3630) 및 Obika, S. et al., Tetrahedron Lett . (1998), 39: 5401-5404)에 기재되어 있다. 록킹된 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드로 도입하는 것은 상보적 서열에 대한 친화성을 향상시키고 또 융점을 몇도 정도 증가시킨다(Braasch, D.A. and D.R. Corey, Chem . Biol . (2001), 8:1-7). 본 발명은 당해 분야에 공지된, 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 WO 99/14226호 및 Latorra D, et al., 2003. Hum. Mutat. 22: 79-85에 기재된 LNA를 사용하여 실시될 수 있다. LNA 유사체를 사용함으로써 더욱 특이적 결합을 얻을 수 있고 또 더욱 엄격한 세척 조건을 이용할 수 있으며, 배경 잡음의 양이 현저히 감소되는 이점이 있다. LNA-함유 올리고뉴클레오티드는 시중에서 얻을 수 있으며, 예컨대 Proligo, LLP (Boulder, CO)로부터 입수할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "절단 내성" 또는 "내성" 또는 절단 내성 부분"은 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형된 프로브의 일부를 지칭하며, 본 명세서에 기재된 절단 반응 조건(예컨대 1X Pfu 완충액, 60-72℃)하에서 본 발명의 뉴클레아제(예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단될 수 없다. 따라서, 본 발명에 따라 유용하기 위하여, 절단 내성인 프로브의 일부는 절단 반응 조건에 처리될 때 변형없이 동일 프로브의 절단 생성물 양의 10%, 5%, 1%, 0.5%, 0.1% 및 가장 바람직하게는 0% 이하로 생산해야 한다. 프로브가 절단 내성인지 여부를 측정하는 절단 에세이는 당해 분야에 공지되어 있고 또 본 명세서에 기재되어 있다(I.A 부분 및 실시예 10 및 14 참조).
본 명세서에 기재된 바와 같이, 절단 내성 부분은 프로브의 전체 혼성화된 부분(표적 상보적 부분)을 포함할 수 있다. 다르게는, 절단 내성 부분은 프로브의 전체 혼성화된 부분보다 적다. 예컨대, 당업자는 본 명세서에 기재된 바와 같이 상류 프라이머의 연장시 안정한 듀플렉스를 형성하는 프로브의 표적 상보적 영역의 부분만을 변형할 수 있다. 예컨대 표적에 상보적인 40 뉴클레오티드를 갖는 43 뉴클레오티드 프로브는 위치 +2 내지 +32로부터 변형만을 포함할 수 있다. 유사하게, 표적에 상보적인 20 뉴클레오티드를 갖는 23 뉴클레오티드 프로브는 위치 +2 내지 위치 +15로부터 변형만을 포함할 수 있다. 표적 상보적 영역의 크기를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "중합효소 연장 조건"은 핵산 중합효소를 사용한 프라이머의 3' 말단의 연장이 가능하고 바람직하게는 적절한 완충액, 온도 배양 단계 및 시간을 지칭한다. 이러한 반응 조건은 당해 분야에 공지되어 있고, 또 본 명세서에 기재되어 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "듀플렉스"는 2개의 올리고뉴클레오티드(예컨대 표적 핵산 및 프로브)를 포함하는 복합체를 지칭하며, 이때 표적의 상보적 뉴클레오티드 염기의 적어도 일부 및 프로브는 수소 결합의 형성으로 인하여 혼성화된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적에 대해 상보적이고 표적과 혼성화되는 프로브의 뉴클레오티드는 위치 + 내지 위치 +X인 것으로 정의된다. 위치 +1은 하류 프로브의 혼성화된 영역의 5' 말단 뉴클레오티드로서 정의되고, 영역 +2는 위치 +1의 바로 하류인 뉴클레오티드로서 정의된다(도 13 참조). 5' 플랩의 뉴클레오티드는 위치 -1 내지 위치 -X로 정의된다. 위치 -1은 엘보우의 바로 하류인 플랩의 3' 말단 뉴클레오티드로서 정의된다. 위치 -2는 하류-1의 바로 하류인 뉴클레오티드로서 정의된다(도 13 참조).
2차 구조를 갖는 프로브
본 명세서에 기재된 바와 같이, "2차 구조"는 3차원 형태를 지칭한다(예컨대 헤어핀, 스템-루프(stem-loop) 구조, 및 내부 루프, 벌지-루프(bulge-loop), 분기 구조 또는 슈도노트(pseudoknot); 도 1 및 3; 다중 스템 푸르 구조, 클로버잎 유형 구조 또는 다른 3차원 구조). 본 명세서에 기재된 바와 같이, "2차 구조"는 삼차 구조, 4차 구조, ..등을 포함한다. 이러한 3차원 구조를 갖는 프로브는 표적 핵산에 결합하여 절단 온도에서 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성한다. 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 3차원 구조는 바람직하게는 절단 온도 이하에서 안정하다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "2차 구조"는 염기의 제1 단일 가닥 서열(이후 본 명세서에서 "상보적 핵산 서열"(예컨대 도 4의 b)로 지칭)에 이어 동일 분자 내에(예컨대 도 4 중의 b') 또는 프로브를 포함하는 제2 분자 내에 제2 상보적 서열을 포함하는 서열을 의미하며, 그 자체가 접혀져서 반평행(antiparallel) 듀플렉스 구조를 생성하며, 상기 단일 가닥 서열 및 상보적 서열(즉, 상보적 핵산 서열)은 수소 결합 형성에 의해 어닐링된다. 본 발명에 사용된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 프로브는, 비제한적으로, 비이콘(beacon), 안전 핀(도 9), 스코피온 (scorpion) (도 10) 및 썬라이즈/암플리플루오르 (sunrise/amplifluor) 프로브(도 11)을 비롯한 2차 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함하며, 그의 상세한 내용 및 구조는 이후에 및 상응하는 도면에서 기재된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 제1 및 제2 "상보적" 핵산 서열은 서로에 대해 상보적이고 또 상보적 염기 사이에 수소 결합 형성에 의해 어닐링될 수 있다.
2차 구조는 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 친화성 쌍을 포함하는 핵산 분자의 형태를 지칭하며, 이때 친화성 쌍은 친화성 쌍을 포함하는 부위의 쌍 사이에 존재하는 인력(attractive force)의 결과로서 가역적으로 결합된다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 2차 구조는 프로브 상의 결합 부위가 포획 요소에 결합되지 않게 하며, 프로브가 표적 핵산에 대하여 결합된 후 결합된 프로브의 절단시 2차 구조에서의 변화는 결합 부위가 포획 요소에 의해 포획되게 한다.
본 발명에 따른 "프로브"는 단분자일 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, "단분자" 프로브는 표적 핵산에 결합되어 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성하는 단일 분자를 포함하며, 상기 절단은 절단 온도에서 실시되고, 또 "단분자" 프로브의 2차 구조는 표적 핵산에 결합되지 않을 때 바람직하게는 절단 온도 이하에서 안정하다. 본 발명에 따라 유용한 단분자 프로브는 비제한적으로 비이콘 프로브, 헤어핀, 스템-루프, 내부 루프, 벌지 루프 또는 슈도노트 구조를 포함하는 프로브, 스코피온 프로브 및 썬라이즈/암플리플루오르 프로브를 포함한다.
본 발명에 따른 "프로브"는 1 이상의 분자(예컨대 이중분자 또는 삼중 분자)일 수 있다. 이중 분자 또는 삼중분자 프로브를 포함하는 분자의 적어도 1개는 표적 핵산에 결합하여 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성하며, 이때 절단은 절단온도에서 실시되며, 또 프로브 분자의 2차 구조는 표적 핵산에 결합되지 않을 때 절단 온도 이하에서 안정하다. 다분자 프로브를 포함하는 분자는 분자간 결합(예컨대 수소 결합 또는 공유결합)을 통하여 서로에 대하여 결합된다. 예컨대, 이질 루프(도 1 참조), 또는 클로버잎 구조의 1 이상의 루프가 뚜렷한 분자를 포함하고 또 결합되어 클로버잎 구조를 형성하는 분자가 분자간 결합(예컨대 수소 결합 또는 공유결합)을 통하여 결합되어 있는 클로버잎 구조는 본 발명에 따라 유용한 다분자 프로브의 예이다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "분자"는 폴리뉴클레오티드를 지칭하며, 또 부착된 멤버 또는 친화성 쌍의 멤버를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
"프로브" 또는 프로브를 포함하는 "분자"는 길이가 5-10,000 뉴클레오티드이고, 이상적으로는 6-5000, 7-1000, 8-500, 9-250, 10-100 및 17-40 뉴클레오티드 길이이지만, 프로브 또는 상이한 길이의 프로브를 포함하는 분자가 유용하다.
본 발명에 따른 "프로브"는 5 내지 10,000 뉴클레오티드, 바람직하게는 10 내지 약 140 뉴클레오티드인 표적 핵산 결합 서열을 갖는다. 일 구체예로서, 본 발명에 따른 "프로브"는 3-250, 바람직하게는 4 내지 150, 더욱 바람직하게는 5 내지 110, 가장 바람직하게는 6 내지 50 뉴클레오티드 길이인 적어도 제1 및 제2 상보적 핵산 서열을 포함한다. 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 동일한 길이를 가질 수 있거나 또는 상이한 길이를 가질 수 있다. 본 발명은 제1 및 제2 상보적 핵산 서열이 모두 표적 핵산 결합 부위의 상류(5')에 위치하는 프로브를 제공한다. 다르게는, 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 표적 핵산 결합 부위의 하류(3')에 위치할 수 있다. 다른 구체예로서, 본 발명은 제1 상보적 핵산 서열이 표적 핵산 결합 부위의 상류(5')에 위치하고 또 제2 상보적 핵산 서열이 표적 핵산 결합 부위의 하류(3')에 위치하는 프로브를 제공한다. 다른 구체예로서, 본 발명은 제2 상보적 핵산 서열이 표적 핵산 결합 부위의 상류(5')에 있고 또 제1 상보적 핵산 서열이 표적 핵산 결합 부위의 하류(3')에 위치하는 프로브를 제공한다. 실제 길이는 프로브의 2차 구조는 바람직하게는 표적 핵산에 결합된 프로브를 포함하는 절단 구조의 절단이 실시되는 온도에서 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 안정하다. 표적 핵산 결합 서열은 500 뉴클레오티드 크기까지 증가함에 따라서, 상보적 핵산 서열의 길이는 15-125 뉴클레오티드까지 증가할 수 있다. 100 뉴클레오티드 보다 큰 표적 핵산 서열의 경우, 상보적 핵산 서열의 길이는 더 증가될 필요는 없다. 프로브가 대립유전자-구별 프로브이면, 상보적 핵산 서열의 길이는 이하에 논의한 바와 같이 더욱 제한된다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, "표적 핵산 결합 서열"은 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프로브의 영역을 지칭한다.
"헤어핀 구조" 또는 "스템"은 단일 가닥의 RNA 또는 DNA에서 인접, 반전(inverted), 상보적 서열 사이의 염기쌍에 의해 형성된 이중 헬리칼 영역을 지칭한다.
"스템-루프" 구조는 1개 말단에서 쌍을 이루지 않은 염기의 루프를 더 포함하는 헤어핀 구조를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 표적 핵산에 결합되지 않을 때 "안정한" 이차 구조를 갖는 프로브는 프로브를 구성하는 염기쌍의 50% 이상(예컨대 50%, 55%, 75% 또는 100%)가 프로브가 표적 핵산에 혼성화되게 하는 조건하지만 표적 핵산 부재하에서 해리되지 않는 2차 구조를 지칭한다.
핵산 듀플렉스의 "안정성"은 융점 또는 "Tm"에 의해 결정된다. 특정 조건(예컨대 염 농도 및/또는 유기 용매의 존재 또는 부재하)하에서 특정 핵산 듀플렉스의 Tm은 듀플렉스 분자의 염기쌍의 반(50%)이 해리되는(즉, 염기쌍에서 서로 혼성화되지 않는) 온도이다.
표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 이차 구조의 "안정성"은 융점 에세이, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 에세이 또는 형광 켄칭 에세이에서 정의되어 있다(상세한 내용은 이하의 "프로브의 안정성 또는 이차 구조의 측정" 부분에 기재되어 있음).
일부 구체예로서, 본 발명에 유용한 프로브는 바람직하게는 절단 반응의 온도 또는 그 이하에서 표적에 결합되지 않을 때 "안정한" 2차 구조를 가질 것이다. 따라서, 프로브/표적 핵산 하이브리드의 뉴클레아제 절단이 본 발명에 따라 실시되는 온도는 2차 구조의 Tm 보다 낮아야 한다. 프로브의 2차 구조는 절단 반응의 온도 또는 그 이하에서 광 흡수 정도가 프로브의 Tm과 동일하거나 더 높은 온도에서 광 흡수 정도에 비하여 적으면(즉, 적어도 5% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 가장 바람직하게는 25% 미만), 절단 반응(즉, 절단이 실시되는)의 온도 이하의 온도에서의 융점 에세이에서 "안정"하다.
본 발명의 방법에 따르면, 2차 구조의 안정성은 FRET 에세이 또는 형광 켄칭 에세이("프로브의 2차 구조의 안정성의 결정" 부분에 기재됨)에 의해 측정될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 형광 켄칭 에세이는 FRET 에세이를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 프로브는 예컨대 2 뉴클레오티드 거리에 걸쳐 상호작용할 수 있는 상호작용성 라벨의 적합한 쌍(예컨대 FRET 쌍(예컨대 "프로브의 2차 구조의 안정성의 측정" 부분에 기재된 바와 같음, 이하 기재됨) 또는 예컨대 20 뉴클레오티드 거리에 걸쳐 상호작용할 수 있는 비-FRET-쌍(예컨대 테트라메틸로다민 및 DABCYL)에 의해 라벨링된다. 예컨대, 본 발명에 따른 프로브는 형광단 및 켄처에 의해 라벨링되며 또 형광은 표적 핵산 부재하에서 상이한 온도에서 측정된다. Tm은 형광의 정도가 도 12e에 도시된 바와 같이 특정 프로브에 대하여 관찰된 형광의 최대 수준의 50%인 온도이다. 프로브의 핵산 서열이 공지된 특정 프로브의 Tm은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 예측될 수 있다. 따라서 형광은 다양한 범위의 온도, 예컨대 범위의 하한이 본 발명에 따른 프로브에 대한 Tm 또는 예측된 Tm의 적어도 50℃ 미만이고 또 범위의 상한이 본 발명에 따른 프로브에 대한 Tm 또는 예측된 Tm 의 적어도 50℃ 이상에서 측정된다.
2차 구조는 이후 형광의 정도 또는 파장이 프로브의 T메서 관찰된 FRET의 정도 또는 파장과 비교하여 증가하거나 감소(예컨대 적어도 5% 미만, 바람직하게는 20% 미만 및 가장 바람직하게는 25% 미만, 등..,)되면 절단 온도 이하의 온도에서 FRET 에세이에서 "안정한" 것으로 정의된다(도 12e 및 도 12f 참조). 예컨대, FRET에서 증가 또는 감소는 본 발명에 따른 FRET 에세이에서 생길 수 있다. 다른 구체예로서, 새로운, 시프트된 파장에서 증가, 또는 새로운 시프트된 파장에서 감소를 초래하는 파장에서의 시프트는 본 발명에 따른 FRET 에세이에서 생길 수 있다.
본 발명에 따른 2차 구조에서 "변화"는 형광 켄칭 에세이로 측정될 수 있으며, 이때 본 발명에 따른 프로브는 표적 핵산의 부재하에서 또 프로브의 Tm 보다 낮은 온도에서 형광의 켄칭(상술한 바와 같은)이 존재하는 위치에 존재하는 형광단 및 켄처를 포함한다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명에 따른 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 생기는 2차 구조에서의 "변화"는 프로브가 프로브의 Tm보다 낮은 온도에서 표적 핵산에 결합된 후 형광의 정도가 표적 핵산의 부재하에서 관찰된 형광의 정도에 비하여 더 큰(예컨대 적어도 5%, 바람직하게는 5-20% 및 가장 바람직하게는 25% 이상) 에세이로 형광에서의 증가를 지칭한다 (도 12g 참조).
본 발명에 따른 2차 구조는 형광단 및 켄처를 포함하는 프로브를 형광 켄칭 에세이(상술한 바와 같은)에 처리하는 것에 의해 검출될 수 있다. 온도 변화와 관련된 형광에서의 변화를 나타내는 프로브 (도 12e 참조, (예컨대 FRET 반응의 온도가 증가함에 따라 형광이 증가함))는 2차 구조를 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명에 따라 유용한 "절단 온도"는 2차 구조를 갖는 프로브의 Tm보다 낮은 농도이다(적어도 1℃, 바람직하게는 10℃). "절단 농도"는 절단 반응에 사용된 특정 뉴클레아제에 가능하고 최적이도록 선택된다.
바람직하게는 프로브의 3' 말단은 활성 중합효소가 반응에 사용되면 프라이머 연장 생성물에 프로브가 혼입되는 것을 억제하도록 "블로킹"될 수 있다. "블로킹"은 비상보적 염기를 사용함으로써 또는 비오틴 또는 포스페이트 기와 같은 화학적 부위를 마지막 뉴클레오티드의 3' 히드록실에 부가함으로써 달성될 수 있으며, 선택된 부위에 따라서 라벨에 부착된 핵산의 검출 또는 포획을 위한 라벨로서 작용하는 것에 의해 이중 목적으로 사용될 수 있다. 블로킹은 3'-OH를 제거하는 것에 의해 또는 디데옥시뉴클레오티드와 같은 3'-OH를 갖지 않는 뉴클레오티드를 사용하는 것에 의해 달성될 수 있다.
용어 프로브는 대립유전자-구별 프로브를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "대립유전자-구별" 프로브는 상보적 표적 핵산에 완전히 우선적으로 혼성화되며 또 적어도 1개 뉴클레오티드 정도 다양할 수 있는 서열에 대하여 구별된다. 표적 핵산과 비교하여 적어도 1개 뉴클레오티드가 상이한 핵산 서열은 이후 "표적-유사 핵산 서열"로 칭하며, 본 발명에 따른 대립유전자-구별 프로브에 대한 표적 핵산이 아니다. 대립유전자-구별 프로브는 표적 및 적어도 단일한 뉴클레오티드 차이를 갖는 표적-유사 서열 사이를 구별하는 대립유전자-구별 프로브를 허용하는 실험적 최적화에 의해 측정된 특정 온도에서 또는 온도 범위 내에서, 표적 핵산 상보적 서열과 비교하여 1 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 함유하는 표적-유사 핵산 서열에 충분히 혼성화되지 않으므로, 표적-유사 핵산 서열 존재하 및 표적 핵산에 대한 대립유전자-구별 프로브의 혼성화를 지지하는 조건하에서 표적-유사 핵산 서열에 결합시 2차 구조에서의 변화를 거치지 않는다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 "대립전자-구별 프로브"는 표적 핵산으로부터 적어도 1개의 뉴클레오티드 정도 변화되는 표적-유사 핵산 서열에 혼성화하는 프로브를 지칭하며, 이때 변이체 뉴클레오티드는 대립유전자-구별 부위에 위치하지 않는다. 본 발명의 상기 구체예에 따르면, "대립유전자-구별 프로브"는 표적 및 적어도 단일한 뉴클레오티드 차이를 갖는 표적-유사 서열 사이를 구별하는 대립유전자-구별 프로브를 허용하는 실험적 최적화에 의해 측정된 특정 온도에서 또는 온도 범위 내에서 대립유전자-구별 부위에서 적어도 1개의 뉴클레오티드 정도 바뀌는 표적-유사 핵산 서열에 결합될 수 없다. 단일 뉴클레오티드 차이는 표적 또는 표적-유사 핵산 서열에 결합되는 프로브의 %에만 영향을 준다. 예컨대, 본 발명은 표적의 100%가 과량의 프로브 존재하에서 프로브-표적 복합체(예컨대 프로브에 의해 결합됨)로 존재하는 완전하게 매치된(matched) 프로브를 제공한다. 본 발명은 또한 적어도 1-5% 및 바람직하게는 5-10%의 표적-유사 서열이 표적 서열 및 완전히 매치되는 프로브를 포함하는 복합체를 형성하기 위해 사용된 동일 조건하에서 프로브에 의해 결합되는 적어도 단일 염기 미스매치를 포함하는 프로브를 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대립유전자-구별 부위"는 표적 핵산을 포함하는 모든 가능한 대립유전자에서 상응하는 영역과 상이한(즉, 적어도 1개 뉴클레오티드) 표적 핵산 영역을 지칭한다.
본 발명에 따라 유용한 대립유전자-구별 프로브는 또한 표적 서열과 대조하여 표적-유사 서열에 덜 효과적으로 결합되는 프로브를 또한 포함한다. 표적 또는 표적-유사 서열에 대한 프로브의 결합 효능은 표적-유사 서열 또는 표적 서열 존재하에서 프로브의 2차 구조의 tm보다 (적어도 1℃ 및 바람직하게는 10℃ 이상) 아래인 온도에서 실시되는 FRET 에세이로 측정될 수 있다. 표적-유사 서열 존재하 또는 부재하에서 형광 수준의 변화와 비교한 표적 서열의 존재하 또는 부재하에서의 형광 수준에서의 변화는 표적 또는 표적-유사 서열에 대한 프로브의 결합 효능 정도의 효과적인 측정을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에서, 표적 서열에 비교하여 표적-유사 서열에 덜 효과적으로 결합하는 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같은 FRET 또는 형광 켄칭 에세이로 형광을 측정하는 것에 의해 결정되는 바와 같이, 표적 핵산에 비교하여 표적-유사 서열에 혼성화시 2차 구조에서 훨씬 적은 변화를 거칠 것이다(예컨대 표적 핵산에 대한 결합시 형광 변화의 바람직하게는 25-50%, 더욱 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 75-90%). 본 발명에 따른 방법에서, 표적 서열에 비교하여 표적-유사 서열에 덜 효과적으로 결합하는 프로브는 샘플에서 표적-유사 핵산 서열의 존재하를 나타내는 신호를 생성할 것이다. 그러나, 이 신호의 세기는 더 적은 변화에 대해 상기 기재한 바와 같이 표적 서열 존재하에서 생성된 신호의 세기를 변경시킬 것이다(예컨대 표적 핵산에 대한 결합시 형광의 변화값보다 바람직하게는 25-50%, 더욱 바람직하게는 50-75%, 가장 바람직하게는 75-90%).
"표적 핵산" 또는 "표적-유사 핵산 서열"의 존재를 나타내는 "신호"는 표적 핵산 또는 표적-유사 핵산 서열의 1 분자 내지 1020 분자, 더욱 바람직하게는 약 100 분자 내지 1017 분자로부터 생성된 신호와 동일한 신호를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "결합 부위"는 뉴클레아제에 의한 프로브의 절단시 방출되어 결합 부위와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 포획 요소에 특이적으로 결합되며 상기 결합 부위와 포획 요소 사이의 특이적 결합은 본 명세서에 기재된 바와 같이 프로브의 2차 구조가 변화되었을 때에만 생기는 프로브(예컨대 도 4 중의 ab)의 영역을 지칭한다. "특이적으로 결합하는(결합되는)"은 상보적 핵산과의 수소 결합을 통하여 또는 예컨대 결합 부위와 결합 부위의 핵산 서열에 특이적으로 결합될 수 있는 결합 단백질 사이의 상호작용을 통하는 것을 의미한다. "결합 부위"는 표적 핵산에 결합되는 프로브의 능력을 간섭하지 않을 것이다. 결합 부위는 프로브가 그의 천연적 2차 구조 형태일 때 포획 요소에 결합될 수 없고 또 표적 또는 주형 핵산에 결합되면, 2차 구조는 바람직하게는 절단제에 의한 절단 이후에 결합부위를 포획 요소에 결합시키도록 변화된다.
일 구체예로서, 절단되어 결합 부위를 형성하는 프로브의 영역은 표적 핵산에 혼성화될 수 없다. 본 명세서에 기재된 바와 같이 (예컨대 도 4의 A) "상보적 핵산 서열"이 아닌 "결합 부위"의 영역은 1-60 뉴클레오티드, 바람직하게는 1-25 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 1-10 뉴클레오티드 길이다. 본 명세서에 정의된 바와 같이 결합 부위 또는 결합 부위와 포획 요소 사이의 특이적 결합을 검출하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 이하에 기재되어 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 프로브는 "리포터"를 더 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "리포터"는 이하에 정의한 바와 같이 "라벨" 및/또는 이하에 정의된 "태그"를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "라벨" 또는 "신호를 제공할 수 있는 라벨링된 부위"는 검출가능한(바람직하게는 정량가능한) 신호를 제공하도록 사용될 수 있고 또 핵산에 작용가능하게 결합될 수 있는 원자 또는 분자를 지칭한다. 라벨은 형광, 방사능, 비색측정, 중량측정, X-선회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성, 중량 분광계, 결합 친화력, 혼성화 방사능주기, 나노결정 등에 의해 검출가능한 신호를 제공할 수 있다. 본 발명의 방법에 따른 라벨링된 프로브는 5' 말단, 3' 말단 또는 내부적으로 라벨링된다. 라벨은 "직접적", 즉 염료일 수 있거나, 또는 "간접적", 즉 비오틴, 디곡신, 알칼리성 포스파타제(AP), 꽃양배추 퍼옥시다제(HRP) 등일 수 있다. "간접적 라벨"의 검출을 위하여, 라벨링된 항체와 같은 부가적 성분, 또는 포획되고, 방출된 라벨링된 핵산 단편을 가시화하기 위한 효소 기질을 부가할 필요가 있다. 본 발명의 일 구체예로서, 라벨은 본 명세서에 정의된 바와 같이 2차 구조가 변화되지 않는 한 (예컨대 결합 부위가 접근가능한) 검출가능한 신호를 제공할 수 없다.
"결합 부위"는 또한 "태그"를 지칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "태그"는 프로브의 5' 말단에 작용가능하게 연결되고 또 태그와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 포획 요소에 특이적으로 결합되는 부위를 지칭하며, 이때 태그와 포획 요소 사이의 특정 결합은 프로브의 2차 구조가 변화될 때(예컨대 태그가 포획 요소에 접근가능할 때)에만 생긴다. "특이적으로 결합되는" 것은 "태그"를 지칭하며 또 포획 요소는 공유 결합 또는 수소 결합 또는 정전 인력을 통하여 또는 단백질과 리간드, 항체와 항원, 단백질 서브유닛, 또는 핵산 결합 단백질과 핵산 결합 부위 사이의 상호작용을 통하는 것을 의미한다. 태그는 프로브가 표적 핵산에 어닐링되는 능력을 방해하지 않는다. 태그는 비제한적으로 비오틴, 스트렙트애비딘, 애비딘, 항체, 항원, 합텐, 단백질, 또는 화학적 반응성 부위를 포함한다. "태그"는 본 명세서에 정의된 바와 같이 본 명세서에 정의된 바와 같은 "포획 요소"에 결합할 수 있다. 본 발명에 따르면, "태그" 및 "포획 요소"는 결합 쌍으로 작용한다. 예컨대 일 구체예로서, 태그가 비오틴이면, 상응하는 포획 요소는 애비딘이다. 다르게는, 다른 구체예로서, 태그가 항체이면, 상응하는 포획 요소는 항원이다.
본 발명은 결합 부위를 포함하는 "프로브", 본 명세서에 정의된 바와 같은 "태그"를 포함하는 "프로브" 및 뉴클레아제에 의한 프로브의 절단시 방출되는 프로브의 영역(예컨대 포획 요소에 결합되는 핵산 서열)인 결합 부위 및 "태그"를 포함하는 "프로브"를 고려한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포획 요소"는 화학적 교차결합 또는 공유 결합에 의해 고상 기질에 부착되는 기질을 지칭하며, 이때 상기 기질은 (예컨대 수소 결합을 통하여 또는 핵산 결합 단백질과 핵산 결합 부위 사이 또는 상보적 핵산 사이의 상호작용을 통하여) 결합 부위와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 결합 부위에 특이적으로 결합되며, 또 상기 결합 부위와 포획 요소 사이의 특이적 결합은 결합 부위를 포함하는 프로브의 2차 구조가 본 명세서에 정의된 바와 같이 "변화"될 때에만 생긴다. 포획 요소는 비제한적으로 핵사 결합 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포획 요소"는 또한 화학적 교차결합 또는 공유 결합에 의해 고상 기질에 부착되는 기질을 지칭하며, 이때 기질은 (예컨대 공유 결합 또는 수소 결합을 통하여 또는 예컨대 단백질과 리간드, 항체와 항원, 단백질 서브유닛, 핵산 결합 단백질과 핵산 결합 부위 사이 또는 상보적 핵산 사이의 상호작용을 통한 정전기적 인력) 태그와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 태그에 특이적으로 결합되며, 또 태그와 포획 요소 사이의 특이적 결합은 태그를 포함하는 프로브의 2차 구조가 본 명세서에 정의된 바와 같이 변화될 때에만 생긴다. 포획 요소는 비제한적으로 비오틴, 애비딘, 스트렙트애비딘, 항체, 항원, 합텐, 단백질, 또는 화학적 반응성 부위를 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 "태그"는 본 명세서에 정의된 바와 같이 "포획 요소"에 결합할 수 있다. 본 발명에 따르면, "태그" 및 "포획 요소"는 결합 쌍으로 작용한다. 예컨대, 일 구체예로서, 포획 요소가 비오틴이면, 상응하는 태그는 애비딘이다. 다르게는, 다른 구체예로서, 포획 요소가 항체이면, 상응하는 태그는 항원이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "고상 지지체"는 분자(예컨대 포획 요소)가 비가역적으로 결합되는 표면을 의미하며, 비제한적으로 막, 세파로오스 비이드, 자성 비이드, 조직 배양 플레이트, 실리카계 매트릭스, 막 계 매트릭스, 비제한적으로 스티렌, 라텍스 또는 실리카계 물질을 비롯한 비이드 포함 표면 및 기타 중합체, 예컨대 셀룰로오스 아세테이트, 테플론, 폴리비닐리덴, 디플루오라이드, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 카보네이트, 폴리설폰, 금속, 제올라이트, 종이, 알루미나, 유리, 폴리프로필, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 플라스틱, 여과지, 덱스트란, 게르마늄, 실리콘, (폴리)테트라플루오로에틸렌, 갈륨 아르세네이드, 갈륨 포스파이드, 산화 실리콘, 실리콘 니트레이트 및 그의 조합물이다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 요소를 부착하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 이하에 정의되어 있다. 부가적인 고상 지지체는 또한 이후에 논의한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "친화성 쌍"은 부위 사이에 존재하는 인력의 결과로서 가역적으로 결합될 수 있는 부위(예컨대 상보적 핵산 서열, 단백질-리간드, 항체-항원, 단백질 서브유닛, 및 핵산 결합 단백질-결합 부위)의 쌍을 지칭한다. "친화성 쌍"은 결합 부위와 상응하는 포획 요소의 조합, 및 태그와 상응하는 포획 요소의 조합을 포함한다.
친화성 쌍이 서로 가역적으로 상호작용하는 상보적 핵산 영역을 포함하는 구체예에서, 표적 핵산 결합 서열, 및 친화성 쌍을 포함하는 핵산 서열의 길이는 프로젝트된 혼성화 에세이 조건하에서 프로브의 적합한 열역학적 작용에 맞게 선택한다. 혼성화 에세이의 당업자는 적절한 조건이 프로브, 표적 및 용해질 농도, 검출 온도, 변성제 및 부피 배출제(excluder)의 존재, 및 기타 혼성화-영향 인자를 포함함을 잘 알고 있을 것이다. 표적 핵산 결합 서열의 길이는 7 내지 약 10,000 뉴클레오티드, 바람직하게는 8-5000, 9-500, 9-250 및 가장 바람직하게는 10 내지 140 뉴클레오티드이다. 프로브가 또한 대립유전자-구별 프로브이면, 그 길이는 이하에 논의된 바와 같이 더욱 제한될 것이다(이 문장은 결합부위: 포획 요소 개념에서 프로브:표적 개념으로 논리적으로 점프한 것이다).
친화성 쌍이 서로에 대하여 가역적으로 상호작용하는 상보적 핵산 영역을 포함하고 또 표적 핵산에 혼성화되지 않거나 또는 표적 핵산에 상보적이지 않은 구체예에서, 친화성 쌍의 상보적 핵산 영역 서열은 에세이 조건하 및 검출 온도에서 프로브가 표적에 결합되지 않을 때 충분한 길이여야 하고, 프로브의 구조는 프로브의 결합 부위가 포획 요소에 결합되지 않도록 존재하며, 예컨대 상보적 핵산 서열은 결합된다. 이용된 에세이 조건에 따라서, 3-25 뉴클레오티드 길이의 상보적 핵산 서열은 상기 작용을 실시할 수 있다. 중간 범위의 4-15, 더욱 바람직하게는 5-11, 뉴클레오티드가 흔히 적절하다. 실제 길이는 프로브의 2차 구조가 표적 핵산에 결합된 프로브를 포함하는 절단 구조의 절단이 실시되는 온도에서 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조가 안정하도록 표적 핵산 결합 서열에 대하여 선택된다. 표적 핵산 결합 서열이 100 뉴클레오티드까지 증가하면, 상보적 핵산 서열의 길이는 15-25 뉴클레오티드까지 증가할 수 있다. 100 뉴클레오티드보다 큰 표적 핵산 결합 서열의 경우, 상보적 핵산 서열의 길이는 더 이상 증가될 필요가 없다. 프로브가 대립유전자-구별 프로브이면, 상보적 핵산 서열의 길이는 이하에 논의한 바와 같이 더욱 제한된다.
표적 핵산 상보적 서열에 비교하여 1 이상의 뉴클레오티드 미스매치를 함유하는 표적-유사 핵산 서열에 충분히 혼성화되지 않는 대립유전자-구별 프로브는 이용된 에세이 조건하에서 프로브의 2차 구조의 감소 또는 제거 및 표적 핵산과의 혼성화가 표적 핵산 상보적 서열이 특정 반응 조건하에서 완전히 상보적인 표적 서열을 찾을 때에만 효과적으로 생기도록 설계되어야 한다. 특정 반응 조건은 예컨대 대립유전자 구별 프로브가 표적 및 적어도 단일 뉴클레오티드 차이를 갖는 표적-유사 서열 사이를 구별하게 하는 실험적 최적화에 의해 결정된 특정 온도 또는 온도 범위를 포함할 수 있다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 "대립유전자-구별 프로브"는 표적 핵산으로부터 적어도 1개의 뉴클레오티드가 바뀐 표적-유사 핵산 서열에 혼성화되는 프로브를 지칭하며, 상기 변이 뉴클레오티드는 대립유전자-구별 부위에 존재하지 않는다. 본 발명의 구체예에 따르면, "대립유전자-구별 프로브"는 특정 반응 조건하에서 대립유전자-구별 부위에서 적어도 1개의 뉴클레오티드가 바뀐 표적-유사 핵산 서열에 효과적으로 결합할 수 없다. 특정 반응 조건은 예컨대 대립유전자 구별 프로브가 표적 및 적어도 단일 뉴클레오티드 차이를 갖는 표적-유사 서열 사이를 구별하게 하는 실험적 최적화에 의해 결정된 특정 온도 또는 온도 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 본 발명에 따른 대립유전자-구별 프로브는 바람직하게는 6 내지 50 또 바람직하게는 7 내지 25 뉴클레오티드의 표적 핵산 결합 서열, 및 3 내지 8 뉴클레오티드의 상보적 핵산 서열을 포함한다. 2차 구조 및 프로브-표적 하이브리드의 구아노신-시티딘 함량, 염 및 에세이 온도를 고려해야 하고, 예컨대 마그네슘 염은 짧은 대립유전자-구별 프로브를 설계할 때 특히 중요하게 고려해야 하는 강한 안정화 효과를 갖는다.
대립유전자-구별 프로브가 약 50 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 결합 서열을 가져야 한다면, 상기 서열은 구별해야 할 단일 뉴클레오티드 미스매치가 표적 핵산 상보적 서열의 중간에서 또는 그 근처에서 생기도록 설계되어야 한다. 예컨대, 21 뉴클레오티드 길이인 서열을 포함하는 프로브는 바람직하게는 미스매치가 표적 핵산 상보적 서열의 14개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드의 대향하는 것, 가장 바람직하게는 7개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드의 대향하는 것에서 생기도록 설계되어야 한다. 구별되어야하는 미스매치가 표적 핵산 결합 서열/표적-유사 핵산 결합 서열의 중앙에서 또는 중앙 근처에서 생기게 한 프로브를 설계하는 것은 대립유전자-구별 프로브의 성능을 개선시킬 것으로 믿어진다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포획되는"은 포획 요소에 의한 결합 부위의 포획 또는 포획 요소에 의한 태그의 포획을 지칭하며, 수소결합, 공유 결합에 의해 또는 예컨대 단백질과 리간드, 항체와 항원, 단백질 서브유닛, 핵산 결합 단백질 및 핵산 결합 부위 사이, 또는 상보적 핵산 사이의 상호결합을 통하여 특이적으로 결합되는 것을 의미하며, 이때 상호작용 쌍의 1개 구성원(member)은 고상 지지체에 부착된다. 안정한 포획 조건하에서, 결합은 적합한 조건하에서 해리 상수(KD)가 적어도 약 1 x 1O3 M-1, 통상 적어도 1 x 1O4 M-1, 전형적으로 적어도 1 x 1O5 M-1, 바람직하게는 적어도 1 x 1O6 M-1 내지 1 x 1O7 M-1 이상인 헤테로다이머(heterodimer)의 형성을 초래한다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 요소, 및 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 부위 또는 태그 사이의 결합 반응을 실시하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 이하에 기재되어 있다. 본 발명에 따른 포획 요소를 본 명세서에 정의된 바와 같은 고상 지지체에 부착하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 이하에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "야생형"은 천연 산출 공급원으로부터 단리될 때 유전자 또는 유전자 산물의 특징을 갖는 (즉, 유전자에 대한 서열을 갖거나 암호화하거나, 또는 효소에 대한 서열을 보유하거나 또는 효소 활성을 보유하는) 유전자 또는 유전자 산물을 지칭한다.
뉴클레아제 및 절단 구조
본 명세서에 사용된 바와 같이 "뉴클레아제" 또는 "절단제"는 본 발명에 따른 절단 구조에 특이적이고 이를 절단하는 효소를 지칭하며 또 표적 핵산에 혼성화되지 않는 프로브 또는 프라이머, 또는 프로브 또는 프라이머에 혼성화되지 않는 표적 핵산에 특이적이지 않아, 즉 실질적으로 절단하지 않는다. 용어 "뉴클레아제"는 5' 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 효소, 예컨대 DNA 중합효소, 예컨대 대장균으로부터 얻은 DNA 중합효소 I 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermits aquaticus)(Taq), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) (Tth), 및 테르무스 플라부스(Thermus flavus) (TfI)로부터 얻은 DNA 중합효소를 포함한다. 용어 뉴클레아제는 또한 FEN 뉴클레아제이다. 용어 "FEN 뉴클레아제"는 5' 엑소뉴클레아제 및/또는 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 효소를 포함한다. 용어 "FEN 뉴클레아제"는 또한 5' 플랩-특이적 뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에 따른 뉴클레아제 또는 절단제는 비제한적으로 아르케글로부스 풀지두스(Archaeglobus fulgidus), 메타노코커스 야나쉬(Methanococcus jannaschii)로, 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 인간, 마우스 또는 크세노푸스 라애비스(Xenopus laevis)로부터 유도된 FEN 뉴클레아제 효소를 포함한다. 본 발명에 따른 뉴클레아제는 또한 효모 (Saccharomyces cerevisiae) RAD27, 및 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) RAD2, Pol I DNA 중합효소 관련된 5' → 3' 엑소뉴클레아제 도메인, (예컨대 대장균, 테르무스 아쿠아티쿠스(Taq), 테르무스 플라부스(TfI), 바실루스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax (Bca), 스트렙토코커스 뉴모니아애(Streptococcus pneumoniae) 및 FEN의 파아지 작용성 상동체를 포함하지만, T5 5' → 3' 엑소뉴클레아제, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 및 T3 유전자 6 엑소뉴클레아제에 한정되지 않는다. 바람직하게는, Taq, TfI 및 BcFEN 뉴클레아제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인이 사용된다. 용어 "뉴클레아제"는 RNAse H를 포함하지 않는다.
본 발명에 따른 "5' 플랩-특이적 뉴클레아제" ("플랩-특이적 뉴클레아제"로도 지칭됨)는 5' 단일 가닥으로 돌출되는 단일 가닥 플랩을 제거할 수 있는 엔도뉴클레아제이다. 본 발명의 일 구체예로서, 본 발명에 따른 플랩-특이적 뉴클레아제는 슈도-Y 구조를 절단할 수 있다. 본 발명에 따른 플랩-특이적 뉴클레아제의 기질은 표적 핵산 및 표적 핵산에 상보적인 영역 또는 영역들을 포함하는 본 명세서에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함한다. 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 플랩-특이적 뉴클레아제의 기질은 표적 핵산, 표적 핵산에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산에 상보족인 영역 또는 영역들을 포함하는 본 발명에 따른 하류 프로브를 포함한다. 일 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 핵산의 인접 영역에 혼성화된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "인접하는" 것은 20 뉴클레오티드 미만, 예컨대 15 뉴클레오티드, 10 뉴클레오티드, 5 뉴클레오티드, 또는 0 뉴클레오티드에 의해 분리되어 있는 것을 지칭한다.
본 발명에 따른 플랩-특이적 뉴클레아제의 기질은 또한 표적 핵산, 제2 핵산, 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 부분, 및 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 제3 핵산으로부터 프라이머 연장 생성물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "절단 구조"는 플랩, 루프, 단일 가닥 버블, D-루프, 닉(홈) 또는 갭을 포함하는 단일 가닥 영역을 갖는 적어도 듀플렉스 핵산을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조(예컨대 도 1에 도시된 바와 같은)를 지칭한다. 따라서 본 발명에 따른 절단 구조는 분기된 핵산의 플랩 가닥을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이때 5' 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 플랩은 그의 접합부 근처의 위치에서부터 상기 구조의 이중 가닥 부분으로까지 연장되며 또 바람직하게는 상기 플랩은 검출가능한 라벨에 의해 라벨링된다. 본 발명에 따른 절단 구조의 플랩은 바람직하게는 약 1-10,000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 5-25 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 약 10-20 뉴클레오티드이며 또 바람직하게는 분기된 구조의 "엘보우"에 위치한 포스페이트에 위치한 위치에서 또는 플랩 가닥의 엘보우에 인접한 및/또는 말단에 위치한 1 내지 10개 포스페이트 중의 어느 것에서 절단된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "엘보우"는 5' 플랩의 제1 단일 가닥 뉴클레오티드와 제1 이중 가닥(예컨대 표적 핵산에 혼성화된) 뉴클레오티드 사이의 포스페이트 결합을 지칭한다. 일 구체예로서, 절단 구조의 플랩은 표적 핵산에 혼성화될 수 없다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 절단 구조는 상류 올리고뉴클레오티드의 1 이상의 뉴클레오티드 (예컨대 프라이머)가 하류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 프로브)인 동일 영역에 상보적일 때 "오버래핑" 또는 "침습적"이라 칭할 수 있다. 상기 구체예에서, 2개의 올리고뉴클레오티드는 표적의 동일 영역에 대해 경쟁할 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 절단 구조는 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 올리고뉴클레오티드가 표적의 동일 영역에 상보적이지 않을 때 "비-오버래핑" 또는 "비침습적"이라 칭할 수 있다. 상기 구체예에서, 2개 올리고뉴클레오티드가 표적 핵산에 혼성화되면, 상기 2개 올리고뉴클레오티드는 표적에 대한 혼성화에서 경쟁하지 않을 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "갭"은 상류 올리고뉴클레오티드/프라이머의 3' 말단 상보적 뉴클레오티드 및 하류 올리고뉴클레오티드의 가장 5' 상보적인 뉴클레오티드 사이의 적어도 1 뉴클레오티드 (예컨대 0-2 뉴클레오티드, 2-20 뉴클레오티드, 20-50 뉴클레오티드 또는 50 이상의 뉴클레오티드)의 표적의 일부를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "닉(홈)"은 상류 올리고뉴클레오티드/프라이머의 3' 말단 상보적 뉴클레오티드 및 하류 올리고뉴클레오티드의 가장 5' 상보적인 뉴클레오티드가 직접 인접할 때 그 사이의 표적의 일부를 의미한다. 닉(홈)은 올리고뉴클레오티드가 오버랩하지 않을 때 존재하며 또 이들 사이에 1개 미만의 갭, 예컨대 직접 인접하는 0개 뉴클레오티드를 갖는다.
본 발명의 일 구체예에 따른 절단 구조는 바람직하게는 표적 핵산을 포함하며, 또 표적 핵산에 상보적인 영역 또는 영역, 및 혼성화 올리고뉴클레오티드 프로브로부터 연장되는 플랩을 통하여 특이적으로 혼성화되는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예에서, 절단 구조는 표적 핵산 (예컨대 도 4 중의 B), 표적 서열에 대하여 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 4 중의 A), 및 표적 서열에 대하여 상보적인 서열 또는 서열들을 포함하는 본 발명에 따른 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 4 중의 C )를 포함한다. 일 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 인접 영역에 혼성화된다.
본 발명에 따른 절단 구조는 본 발명의 하류 올리고뉴클레오티드로부터 연장되는 플랩을 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조일 수 있고, 이때 플랩은 핵산 중합효소의 합성 활성에 의한 상류 올리고뉴클레오티드의 연장에 이어, 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 부분적 치환에 의해 형성된다. 이러한 절단 구조에서, 하류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 블로킹되어 하류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 연장을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산이 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화하는 것에 의해 형성될 수 있으며, 이때 올리고뉴클레오티드 프로브는 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 변화되는 2차 구조를 갖고, 또 결합 부위 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 영역, 및 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적 영역을 더 포함한다.
절단 구조는 또한 슈도-Y 구조일 수 있고, 이때 슈도-Y 구조는 플랩의 상류 가닥(플랩 인접 가닥 또는 프라이머 가닥으로 지칭)이 존재하지 않고, 또 이중 가닥 DNA 기질이 갭 또는 닉을 함유할 때 형성된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "절단 구조"는 3' 단일 가닥 플랩만을 갖는 이중 가닥 핵산 구조를 포함하지 않는다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "절단 구조"는 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하며 따라서 RNA 또는 DNA일 수 있다.
본 발명에 따른 절단 구조는 오버래핑 플랩일 수 있고, 이때 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단(예컨대 도 4 중의 A)은 표적 핵산에 어닐링되는 본 발명의 하류 올리고뉴클레오티드 프로브(도 4 중의 C)의 1 염기쌍과 동일하고, 또 상기 오버랩은 단일 가닥 플랩의 연장점의 직접적 하류이다.
본 발명의 일 구체예에 따른 절단 구조는,
1. a) 상류 3' 말단, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 상류 프라이머의 10,000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하며 적어도 1개의 검출가능한 라벨을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브, c) 적절한 표적 핵산, 이때 표적 서열은 상류 프라이머 및 하류 프로브 모두에 대해 적어도 부분적으로 상보적임, 및 d) 적절한 완충액을 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드에 혼성화되게 하는 조건하에서 배양하는 단계, 및
2. 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단에 인접하게 되거나 및/또는 그의 적어도 일부를 치환하게 되도록 예컨대 RT에서 중합효소의 합성 활성에 의해 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단을 연장하는 단계에 의해 형성된다. 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명에 따른 특정 핵산 중합효소에 의한 가닥 치환에는 완충액 및 연장 온도가 바람직하다. 바람직하게는, 하류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 블로킹되어 하류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 연장을 방지한다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 적어도 1개의 검출가능한 라벨을 갖고, 또 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적 5' 영역, 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브와 함께 표적 핵산을 배양함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산을 표적 핵산에 대한 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 및 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적 5' 영역 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브, 및 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머와 배양함으로써 제조할 수 있다. 일 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 인접 영역에 혼성화된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 절단 구조는
1. a) 프로모터 영역의 10,000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하며 적어도 1개의 검출가능한 라벨을 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브, b) 적절한 표적 핵산, 이때 표적 서열은 프로모터 영역을 포함하고 또 하류 프로브에 대하여 적어도 부분적으로 상보적임, 및 c) 적절한 완충액을, 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드에 혼성화되게 하고 또 프로모터 영역이 RNA 중합효소에 결합되게 하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 2. 합성된 RNA의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단에 인접하거나 및/또는 적어도 일부(즉, 적어도 1-10 뉴클레오티드) 떨어져 있게 되도록 RNA 중합효소에 의한 합성 활성에 의해 RNA를 합성하는 단계에 의해 형성된다. 본 발명의 방법에 따르면, 적합한 완충액 및 연장 온도는 본 발명에 따른 특정 RNA 중합효소에 의한 가닥 치환에 적합하다. 바람직하게는, 하류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 블로킹되어 하류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 연장을 방지한다.
본 발명의 바람직한 구체예로서, 절단 구조는 라벨링된다. 본 발명의 일 구체예에 따른 라벨링된 절단 구조는 1. a) 상류 연장가능한 3' 말단, 예컨대 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 표적 핵산에 프라이머가 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 바람직하게는 상류 프라이머의 10,000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하고, 더욱 바람직하게는 상류 프라이머의 500 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 결합 부위를 포함하는 라벨링된 프로브, c) 적절한 표적 핵산, 이때 표적 서열은 프라이머 및 라벨링된 프로브 모두에 대해 상보적임, 및 d) 적절한 완충액을, 핵산 서열이 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하에서 배양하는 단계, 및 본 발명의 일 구체예로서, 2. 상류 프라이머의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 프로브의 5' 말단을 부분적으로 치환하게 하도록 중합효소의 합성 활성에 의해 상류 프라이머의 3' 말단을 연장하는 단계에 의해 형성된다. 본 발명의 방법에 따르면, 본 발명에 따른 특정 핵산 중합효소에 의한 가닥 치환에는 완충액 및 연장 온도가 바람직하다. 바람직하게는, 하류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에서 블로킹되어 하류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 연장을 방지한다. 일 구체예로서, 상류 프라이머 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산을 표적 핵산에 대해 프로브가 결합될 때 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 및 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적, 라벨링된 5' 영역 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 프로브와 배양함으로써 제조할 수 있다. 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산을 표적 핵산에 대해 프로브가 결합될 때 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 및 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적, 라벨링된 5' 영역 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 하류 프로브, 및 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머와 배양함으로써 제조할 수 있다. 일 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 인접 영역에 혼성화된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "신호를 생성하는", "검출가능한 신호를 생성하는" 또는 "검출가능한 신호"는 샘플에서 표적 핵산의 존재를 나타내는 것으로 절단 구조로부터 방출된 방출 핵산 단편을 검출 및/또는 측정하는 것을 지칭한다. 일 구체예로서, 신호를 생성하는 것은 또한 결합 부위를 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합시키는 것에 의해 포획된 방출 핵산 단편을 검출 또는 측정하는 것을 지칭한다. 다른 구체예로서, "신호를 생성하는", "검출가능한 신호를 생성하는" 또는 "검출가능한 신호"는 또한 라벨링된 프로브(예컨대 하류 절단 내성 프로브)의 절단시 형광 신호(예컨대 FRET 에세이에 의해)를 검출 또는 측정하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "검출가능한 신호"는 당업자에게 공지된 표준 통계학적 방법에 의해 측정되는 바와 같이 대조 신호 이상의 신호이다. 가장 바람직하게는, "검출가능한 신호" 배경 신호 이상일 수 있고, 예컨대 적합한 배경 또는 대조 신호의 2배 또는 그 이상일 수 있다. 예컨대, 절단 내성 프로브를 사용하여 반응을 실시할 때, 검출가능한 신호 (예컨대 상호작용성 라벨 쌍 사이의 절단)는 네가티브 대조군의 2배 또는 그 이상의 신호이다(예컨대 라벨이 분리되도록 상호작용성 라벨의 프로브 또는 절단 하류의 절단 없음). 바람직하게는 검출가능한 신호는 대조 신호의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20배 또는 그 이상이다. 본 발명의 검출가능한 신호를 측정하는 방법은 본 명세서에 기재되어 있고 또 FRET 및 형광 켄칭 에세이를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "샘플"은 관심을 갖고 있는 핵산(표적 핵산)을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 추정되는 물질 또는 관심을 갖고 있는 표적 핵산을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 추정되는 핵산 그 자체를 지칭한다. 따라서 용어 "샘플"은 핵산 (게놈 DNA, cDNA, RNA) 샘플, 세포, 생물, 조직, 유체 또는 비제한적으로 예컨대 혈장, 혈청, 척추액, 림프액, 활액, 뇨, 눈물, 변, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨기관의 외부 분비물, 침, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직, 시험관내 세포 배양액 성분의 샘플, 천연 단리물(음용수, 해수, 고상 물질과 같은), 미생물 시편, 및 핵산 트레이서 분자에 의해 마킹된 물품 및 시편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "표적 핵산" 또는 "주형 핵산 서열"은 복제되거나, 증폭되거나 및/또는 검출될 핵산 영역을 지칭한다. 일 구체예로서, "표적 핵산" 또는 "주형 핵산 서열" 은 증폭을 위해 사용되는 2개의 프라이머 서열 사이에 존재한다.
일부 구체예로서, "표적 핵산"은 3'→5' 순서로 제1 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 제1 영역, 연장 영역 및 제2 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적인 제2 영역을 포함한다. 표적 핵산은 단일 가닥 또는 이중가닥의 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "제1 영역"은 표적 핵산을 지칭하는 것으로 상류 올리고뉴클레오티드(예컨대 프라이머)의 혼성화를 허용하기에 충분한 길이의 뉴클레오티드를 의미하며, 이때 상기 "제1 영역"은 본 명세서에 정의된 바와 같이 상류 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. "제1 영역"은 약 6 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이 범위이며, 약 8 내지 30 뉴클레오티드, 및 적합하게는 10 내지 25 뉴클레오티드 길이 범위가 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "연장 영역"은 핵산 중합반응 활성을 통하여 올리고뉴클레오티드 (예컨대 상류 올리고뉴클레오티드)의 연장을 허용하기에 충분한 뉴클레오티드 길이를 지칭한다. "연장 영역"은 약 1 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이 범위이고, 약 1-100 뉴클레오티드 범위가 바람직하고, 더욱 바람직하게는 3 내지 50, 및 적합하게는 5-10 뉴클레오티드 길이 범위이다. "연장 영역"은 상류 프라이머가 연장 영역에 상보적인 핵산의 중합반응을 통하여 연장되어 프라이머의 3' 말단이 절단제에 의해 플랩(하류 올리고뉴클레오티드의 5' 부분)의 절단을 허용하는 하류 올리고뉴클레오티드(즉, 제2 영역에 혼성화되는)에 충분히 가깝게 되지 않는 한 본 발명에 따른 절단제가 하류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 프로브)를 절단하지 않게 하도록 충분한 길이를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "제2 영역"은 표적 핵산을 지칭하는 것으로, 하류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 프로브)의 혼성화를 허용하기에 충분한 뉴클레오티드 길이를 의미하며 이때 "제2 영역"은 본 명세서에 정의된 바와 같이 하류 올리고뉴클레오티드의 적어도 일부에 상보적이다. "제2 영역"은 약 6 뉴클레오티드 내지 약 1000 뉴클레오티드 길이 범위이며, 바람직한 범위는 약 8 내지 30 뉴클레오티드 길이, 적합하게는 10 내지 25 뉴클레오티드 길이 범위이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "핵산 중합효소"는 뉴클레오시드 트리포스페이트의 중합반응을 촉진하는 효소를 지칭한다. 일반적으로, 상기 효소는 표적 서열에 어닐링된 프라이머의 3'-말단에서 합성을 개시할 것이고, 또 주형을 따라 5'-방향으로 진행할 것이며, 5' →3' 뉴클레아제 활성을 보유하면, 개재된 어닐링된 프로브를 가수분해하여 라벨링된 프로브 단편 및 라벨링되지 않은 프로브 단편을 합성이 종료될 때까지 방출한다. 공지된 DNA 중합효소는 예컨대, 대장균 E. coli DNA 중합효소 I, T7 DNA 중합효소, 테르무스 테르모필릭(Thermus thermophilic) (Tth) DNA 중합효소, 바실루스 스테아로테르모필루스(Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 테르모코커스 리토랄리스(Thermococcus litoralis) DNA 중합효소, 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq) DNA 중합효소 및 키로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)(Pfu) DNA 중합효소를 포함한다. 용어 "핵산 중합효소"는 또한 RNA 중합효소를 포함한다. 핵산 주형이 RNA이면, "핵산 중합효소"는 RNA-의존적 중합 활성, 예컨대 역전사 효소를 지칭한다.
공지된 역전사 효소는 예컨대 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus) (M-MLV) RT, 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus) (HIV) RT, 조류 육종 백혈구증 바이러스(Avian Sarcoma-Leukosis Virus) (ASLV) RT, 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus) (RSV) RT, 조류 골수아구증 바이러스(Avian Myeloblastosis Virus) (AMV) RT, 조류 적아구증 바이러스(Avian Erythroblastosis Virus) (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 골수구종증 바이러스(Avian Myelocytomatosis Virus) MC29 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 세망내피증 바이러스(Avian Reticuloendotheliosis Virus) (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A RT, 조류 육종 바이러스(Avian Sarcoma Virus) UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV RT, 조류 육종 바이러스(Avian Sarcoma Virus) Y73 헬퍼 바이러스 YAV RT, 라우스 관련된 바이러스(Rous Associated Virus) (RAV) RT, 및 골수아구증 관련 바이러스(Myeloblastosis Associated Virus) (MAV) RT를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "RNA 중합효소"는 RNA 분자의 중합반응을 촉진하는 효소를 지칭한다. RNA 중합효소는 DNA 의존적 RNA 중합효소 뿐만 아니라 RNA 의존적 RNA 중합효소를 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 RNA 중합효소는 박테리오파아지 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소(holoenzyme), 대장균(E. coli) RNA 중합효소 코어 효소 및 인간 RNA 중합효소 I, II, III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 (HCV)로부터 얻은 NS5B RNA 중합효소를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "5' 에서 3' 엑소뉴클레아제 활성" 또는 "5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성"은 주형-특이적 핵산 중합효소의 활성을 지칭하며, 예컨대 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성은 전통적으로 일부 DNA 중합효소와 관련되어 있고 따라서 일련된 방식으로 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 모노뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드가 제거되거나(즉, 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I은 이러한 활성을 갖는 반면에 클로노(Klenow) (Klenow et al., 1970, Proc . Natl . Acad. Sci. USA, 65:168) 단편은 갖지 않는다(Klenow et al., 1971, Eur . J. Biochem., 22:371)), 또는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 고유하게 존재할 수 있는 엔도뉴클레아제 활성에 의해 5' 말단으로부터 폴리뉴클레오티드가 제거된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 표현 "실질적으로 5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하는" 또는 "실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하는"은 야생형 효소 활성의 10%, 5%, 1%, 0.5%, 또는 0.1 % 미만을 갖는 것을 의미한다. 표현 "5'에서 3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하는" 또는 "5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하는"은 검출될 수 없는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖거나 또는 야생형 효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성의 약 1%, 0.5%, 또는 0.1% 미만을 갖는 것을 의미한다.
구조 특이적 엔도뉴클레아제 활성을 검출하기 위하여, 하류 플랩 올리고뉴클레오티드가 5' 말단에서 방사능라벨링된 플랩 구조로 구성된 DNA 주형이 이용된다. 이 반응은 dNTP (상류 프라이머를 연장하기 위한) 존재하에서 DNA 중합효소를 이용하여 실시한다. 방사능라벨링된 절단 산물은 겔 전기영동(Lyamichev et al., 1993, Science 260: 778)에 의해 가시화된다.
다르게는, DNA 중합효소의 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성은 닉(홈)을 갖는 균일하게 라벨링된 이중가닥의 DNA를 사용하여 에세이한다. dNTP의 부재하 및 존재하에서 DNA 중합효소에 의한 방사능활성의 방출(TCA 용해성 cpms)을 측정한다. 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 비-프루프리딩(non-proofreading) DNA 중합효소는 dNTP 존재하에서 생기는 동시적 중합반응에 의해 10배 이상 자극된다(dNTP의 존재하에서 방출된 cp메서의 증가). 3'-5' 엑소 활성을 갖는 프루프리딩(proofreading) DNA 중합효소는 dNTP 존재하에서 생기는 동시적 중합반응에 의해 완전히 억제된다 (dNTP 존재하에서 방출된 cpms의 감소)(미국 특허 5,352,778호).
본 발명에 유용한 뉴클레아제는 5' 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 효소, 예컨대 DNA 중합효소, 예컨대 대장균으로부터 얻은 DNA 중합효소 I 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq), 테르무스 테르모필릭(Thermus thermophilic) (Tth), 및 테르무스 플라부스(Thermus flavus) (TfI)로부터 얻은 DNA 중합효소를 포함한다. 본 발명에 유용한 뉴클레아제는 또한 비제한적으로 진정세균성(eubacterial) DNA 중합효소 I, 예컨대 테르무스(Thermus) 종으로부터 얻은 효소(Taq, TfI, Tth, Tea (caldophilus) Tbr (brockianus)), 바실루스로부터 얻은 효소(바실루스(Bacillus) 종 (Bst, Bca, Magenta (전장(full 길이) 중합효소, NOT N-절단된(truncated) 버젼)), 테르모토가(Thermotoga) 종으로부터 얻은 효소(Tma (maritima, Tne (neopolitana)) 및 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I를 비롯한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 포함한다. 용어 뉴클레아제는 또한 FEN 뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에 유용한 부가적 핵산 중합효소는 "핵산 중합효소" 제목으로 이하에 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "절단"은 절단 구조를 효소적으로 분리하여 뚜렷한(즉, 다른 단편 Ehms 핵산에 포스포디에스테르 결합에 의해 물리적으로 연결되지 않은) 단편 또는 뉴클레오티드 및 절단구조로부터 방출된 단편을 지칭한다. 예컨대, 라벨링된 절단 구조를 절단하는 것은 본 발명에 따른 라벨링되고 이하에 정의된 바와 같은 절단 구조를 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드로부터 유도된 단편을 비롯한 뚜렷한 단편으로 분리하는 것을 지칭하며, 상기 뚜렷한 단편의 하나는 표적 핵산으로부터 유도되거나 및/또는 라벨링된 단편에 존재하는 라벨링된 부위를 검출하기에 적합한 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법에 의해 검출되고 및/또는 측정될 수 있는 표적 핵산과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드로부터 유도된 라벨링된 핵산 단편이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "엔도뉴클레아제"는 핵산 분자 내의 결합, 바람직하게는 포스포디에스테르 결합을 분해하는 효소를 지칭한다. 본 발명에 따른 엔도뉴클레아제는 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 또는 RNA에 특이적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "엑소뉴클레아제"는 뉴클레오티드 사이의 결합, 바람직하게는 포스포디에스테르 결합을 폴리뉴클레오티드의 말단으로부터 한번에 1개씩 절단하는 효소를 지칭한다. 본 발명에 따른 엑소뉴클레아제는 DNA 또는 RNA 분자의 5' 또는 3' 말단에 대해 특이적일 수 있고, 또 여기서는 5' 엑소뉴클레아제 또는 3' 엑소뉴클레아제라 칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "절단 수단"은 절단제, 바람직하게는 본 발명에 따른 절단 구조에 특이적인, 즉 본 발명에 따른 절단 구조를 절단하는 효소를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이 "플랩"은 이중가닥 핵산 분자로부터 연장되는 단일가닥 DNA의 영역을 지칭한다. 본 발명에 따른 플랩은 바람직하게는 약 1-10,000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 5-25 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 약 10-20 뉴클레오티드이다.
바람직한 구체예로서, 결합 부위는 태그이다.
다른 바람직한 구체예로서, 결합 부위는 포획 요소에 결합되는 핵산 서열이다.
본 발명은 표적 핵산을 함유하는 샘플을 표적 핵산에 프로브가 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 프로브와 배양하는 것에 의해 절단 구조를 형성하는 단계; 상기 절단 구조를 뉴클레아제로 절단하여 핵산 단편을 방출하는 단계, 이때 상기 절단은 절단 온도에서 실시되고 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하며; 및 결합 부위를 고체 지지체 상의 포획 요소에 결합시키는 것에 의해 포획된 단편의 양을 샘플 중의 표적 서열의 존재하는 나타내는 표시로서 검출 및/또는 측정하는 단계를 포함하는, 표적 핵산을 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "표적 핵산을 검출" 또는 "표적 핵산을 측정"하는 것은 샘플 중에 표적 핵산이 존재하는 표시로서 샘플 중의 특정 표적 핵산의 존재를 결정하는 것 또는 샘플 중의 특정 표적 핵산의 양을 결정하는 것을 지칭한다. 측정되거나 검출될 수 있는 표적 핵산의 양은 바람직하게는 약 1 분자 내지 1020 분자, 더욱 바람직하게는 약 100 분자 내지 1017 분자 및 가장 바람직하게는 약 1000 분자 내지 1014 분자이다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 검출된 핵산은 본 발명에 따른 절단 구조의 하류 프로브 (예컨대 도 4 중의 C)의 라벨링된 5' 말단으로부터 유도되며 , 즉 본 발명에 따른 절단 구조의 상류 프로브 (예컨대 도 4의 A)의 3' 연장에 의해 표적 핵산으로부터 치환된다. 본 발명에 따르면, 라벨은 본 발명에 따른 절단 구조를 포함하는 하류 프로브(예컨대 도 4의 C)의 5' 말단에 부착된다. 다르게는, 라벨은 하류 프로브의 3' 말단에 부착되고 또 켄처는 하류 프로브의 5' 플랩에 부착된다. 본 발명에 따르면, 라벨은 본 발명에 따른 절단 구조를 포함하는 하류 프로브 (예컨대 도 4의 C)의 3' 말단에 부착될 수 있다.
본 발명에 따르면, 하류 프로브 (예컨대 도 4의 C)는 내부적으로 라벨링될 수 있다. 바람직한 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산을 표적 핵산에 프로브가 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 표적 핵산에 어닐링되지 않고 5' 플랩을 형성하는 비상보적, 라벨링된 5' 영역 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 프로브와 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 본 발명의 상기 구체예에 따르면, 검출된 핵산은 프로브의 라벨링된 5' 플랩으로부터 유도된다. 바람직하게는, 표적핵산의 양과 절단되고 검출된 핵산에 의해 생성된 신호 사이에는 직접적인 관련이 있다.
다른 구체예로서, 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브의 언폴딩(unfolding) (예컨대 프로브의 2차 구조에서의 변화에 기인한) 또는 가수분해 동안 라벨의 분리를 허용하도록 위치한 상호작용성 라벨의 쌍(예컨대 FRET 또는 비-FRET 쌍)에 의해 라벨링된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "고상 지치에 상에서 포획 요소에 의해 포획된 단편의 양을 검출하는 것" 또는 "고상 지지체 상에서 포획 요소에 의해 포획된 단편의 양을 측정하는 것" 또는 "고상 지치에 상에서 포획 요소에 의해 포획된 단편의 양을 검출하는 것" 또는 "고상 지지체 상에서 포획 요소에 의해 포획된 단편의 양을 측정하는 것"은 샘플 중의 라벨링되거나 라벨링되지 않은 단편의 존재의 측정 또는 샘플 중의 라벨링되거나 라벨링되지 않은 단편 양의 측정을 지칭한다. 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합된 라벨링된 또는 라벨링되지 않은 단편의 방출을 검출하거나 측정하기 위해서, 또는 고상 지지체 상의 포획 요소로부터 라벨링된 또는 라벨링되지 않은 단편의 방출 이후에, 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 바와 같은 방법이 이용될 수 있다. 본 발명에 기재된 검출 방법은 단편을 검출하도록 작용하며, 이때 단편의 양은 반응에서 생성된 단편이 소량 또는 다량인지 여부를 검출한다. 라벨링된 단편의 방출을 검출하거나 측정하는 방법은 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합된 라벨링된 단편 상에 존재하는 라벨링된 부위를 측정 또는 검출하기에 적합할 것이다. 라벨링되지 않은 단편의 방출을 검출 또는 측정하는 방법은 예컨대 당해 분야에 잘 공지된 방법에 따라서 겔 전기영동 또는 가수분해를 포함한다. 본 명세서에 기재된 검출 방법은 1 또는 2분자 (및 1 또는 2백만 이하, 예컨대 10, 100, 1000, 10,000, 1 백만)의 방출 단편이 검출될 때 작용가능하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "라벨링된 단편"은 절단된 모노뉴클레오티드 또는 소형 올리고뉴클레오티드 또는 본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조로부터 유도된 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 이때 절단된 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 약 1-1000 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 5-50 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 약 16-18 뉴클레오티드로서, 뉴클레아제에 의해 절단구조로부터 절단되어서 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 방법에 의해 검출될 수 있다. 일 구체예로서, 프로브는 비분자성 또는 다분자성 프로브이며, 이때 프로브를 포함하는 제1 분자는 형광단에 의해 라벨링되고 또 프로브를 포함하는 제2 분자는 켄처에 의해 라벨링된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "서브프로브" 및 "서브켄처"는 형광단으로 라벨링된 본 발명에 따른 이분자 또는 다분자성 프로브의 제1 분자 및 켄처로 라벨링된 본 발명에 따른 이분자 또는 다분자성 프로브의 제2 분자를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 이분자 또는 다분자성 프로브를 표적 핵산에 결합시킨 다음 뉴클레아제에 의해 절단하면, 서브프로브와 서브켄처가 서로 해리되며(즉, 서브프로브와 서브켄처 사이의 거리가 증가한다) 또 이 해리의 결과로서 신호가 생성된 다음 서브프로브와 서브켄처가 분리된다.
바람직한 구체예로서, 결합 부위는 태그이다.
다른 바람직한 구체예로서, 결합 부위는 포획 요소에 결합되는 핵산 서열이다. 바람직한 구체예로서, 상기 방법은 핵산 중합효소를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 절단 구조는 5' 플랩을 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 절단 구조는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 2차 구조는 스템-루프 구조, 헤어핀 구조, 내부 루프, 벌지 루프, 분기된 구조, 슈도노트 구조 또는 클로버잎 구조로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 바람직한 구체예로서, 뉴클레아제는 FEN 뉴클레아제이다.
다른 바람직한 구체예로서, FEN 뉴클레아제는 아르케글로부스 풀지두스(Archaeglobus fulgidus), 메타노코커스 야나쉬(Methanococcus jannaschii), 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 인간, 마우스 또는 크세노푸스 라애비스(Xenopus laevis)로부터 유도된 FEN 뉴클레아제 효소를 포함한다. 본 발명에 따른 FEN 뉴클레아제는 또한 효모(Saccharomyces cerevisiae) RAD27, 및 시조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) RAD2, Pol I DNA 중합효소 관련된 5' → 3' 엑소뉴클레아제 도메인, (예컨대 대장균, 테르무스 아쿠아티쿠스(Taq), 테르무스 플라부스(TfI), 바실루스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax (Bca), 스트렙토코커스 뉴모니아애(Streptococcus pneumoniae) 및 FEN의 파아지 작용성 상동체를 포함하지만, T4, T5 5' → 3' 엑소뉴클레아제, T7 유전자 6 엑소뉴클레아제 및 T3 유전자 6 엑소뉴클레아제에 한정되지 않는다.
바람직하게는, Taq, TfI 및 BcFEN 뉴클레아제의 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인이 사용된다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브는 리포터를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 리포터는 태그를 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 단편은 태그를 포획 요소에 결합시키는 것에 의해 포획된다.
다른 바람직한 구체예로서, 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 절단 구조가 형성된다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브가 표적 핵산에 결합되지 않을 때 검출가능한 신호의 생성을 켄치하는 프로브 상에서 효과적으로 배치된 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함하는 절단 구조가 형성된다.
다른 바람직한 구체예로서, 라벨링된 부위는 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리되므로, 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성이 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에서 절단하는 것에 의해 제2 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위로부터 제1 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위를 분리하게 하여, 검출가능한 신호를 생성하게 된다.
상술한 바와 같은 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위 쌍의 존재는 포획 요소에 결합될 수 있는 어닐링된, 미절단 프로브와 포획 요소에 결합된 라벨링된 방출 단편 사이를 구별할 수 있게 한다.
다른 바람직한 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함한다.
본 발명은 또한 샘플에서 표적 핵산을 검출하기 위한 중합효소 연쇄반응 방법을 제공한다. 이 방법은 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 프로브, 제1 프라이머가 표적 핵산의 1개 가닥의 영역에 상보적인 서열을 함유하고 또 상보적 DNA 가닥의 합성을 개시하며, 또 제2 프라이머는 표적 핵산의 제2 가닥 중의 영역에 상보적인 서열을 함유하며 상보적 DNA 가닥의 합성을 개시하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 포함하는 절단 구조를 제공하는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 (i) 증폭에 필요한 프라이머가 표적 핵산 내에 함유된 주형 핵산 서열에 어닐링되게 하고, (ii) 프라이머를 연장하여 핵산 중합효소가 프라이머 연장 산물을 합성하게 하고 또 (iii) 절단구조로부터 라벨링된 단편을 방출하기 위한 절단제로서 뉴클레아제를 이용하여 절단구조를 절단하여 검출가능한 라벨링된 단편을 생성하게 하는 PCR 주기 단계를 허용하는 조건하에서 주형-의존적 중합제로서 핵산 중합효소를 이용하여 표적 핵산을 증폭시키는 것을 포함한다. 상기 방법에 따르면, 절단은 절단 온도에서 실시되고 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 제2 프라이머의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 고체 지지체 상의 포획 요소에 결합 부위를 결합시키는 것에 의해 포획된 라벨링된 단편의 방출량은 샘플 중의 표적 서열의 존재에 대한 표시로서 검출되고 및/또는 측정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "올리고뉴클레오티드 프라이머"는 핵산 주형에 혼성화되는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자로서 제2 핵산 가닥의 효소적 합성을 개시한다. 본 발명에 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 약 6 내지 100 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 17-50 뉴클레오티드 길이 및 더욱 바람직하게는 약 17-45 뉴클레오티드 길이이다. 본 발명에 따른 절단 구조의 형성에 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브는 약 17-40 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 약 17-30 뉴클레오티드 길이, 더욱 바람직하게는 약 17-25 뉴클레오티드 길이이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "주형 의존적 중합반응제"는 본 명세서에 기재된 바와 같은 적당량의 4개 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP) 또는 그 유사체의 존재하에, 적합한 염, 금속 양이온, 적합한 안정화제 및 pH 완충 계를 포함하는 반응 배지에서 올리고뉴클레오티드 프라이머를 연장할 수 있는 효소를 지칭한다. 주형 의존적 중합반응제는 프라이머- 및 주형-의존적 DNA 합성을 촉진하는 것으로 공지되고 또 5'→3' 뉴클레아제 활성을 보유하는 효소이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 주형 의존적 중합반응제는 5'→3' 뉴클레아제 활성이 결여된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "증폭하는"은 중합효소 연쇄반응 방법을 비롯하여 핵산 서열의 부가적 카피를 생성하는 것을 지칭한다.
바람직한 구체예로서, 뉴클레아제는 FEN 뉴클레아제이다.
바람직한 구체예로서, 결합 부위는 태그이다.
다른 바람직한 구체예로서, 결합 부위는 포힉 요소에 결합되는 핵산 서열이다.
다른 바람직한 구체예로서, 단계 b의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머는 절단 구조의 상류에 위치하고 또 역방향 프라이머는 절단 구조의 하류에 위치하도록 배치되어 있다.
다른 바람직한 구체예로서, 핵산 중합효소는 가닥 치환 활성을 갖는다.
가닥 치환 활성을 나타내고 본 발명에 따라 유용한 핵산 중합효소는 비제한적으로 "온도 활성화된" 가닥 치환 활성을 갖는 아르카엘(archaeal) DNA 중합효소 (exo plus 및 exo minus 버젼의 Vent, Deep Vent, Pfu, JDF-3, KOD (LTI's tradename Pfx), Pwo, 9 degrees North, 테르모코커스 아그레간스(Thermococcus aggregans), 테르모코커스 고르고나리우스(Thermococcus gorgonarius)), 및 가닥 치환 활성을 갖는 진정세균성 DNA 중합효소(exo minus Bst, exo minus Bca, Genta, 클레노(Klenow) 단편, exo minus 클레노 단편 exo minus T7 DNA 중합효소 (시퀀나제(Sequenase))를 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 핵산 중합효소는 열안정성이다.
다른 바람직한 구체예로서, 뉴클레아제는 열안정성이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "열안정성"은 예컨대 유사한 활성을 갖는 효소의 비-열안정성 형태와 비교하여 가열되는 약 90-100℃ 사이, 더욱 바람직하게는 약 70-98℃의 온도에서 안정하고 활성인 효소를 지칭한다. 예컨대, 열안정성 핵산 중합효소 또는 피. 푸리오수스(P. furiosus), 엠. 야나쉬(M. jannaschii), 에이. 풀지두스(A. fulgidus) 또는 피. 호리코시(P. horikoshii)와 같은 호열성(thermophilic) 생물로부터 유도된 FEN 뉴클레아제는 대장균 또는 포유류 FEN 효소로부터 얻은 핵산 중합효소와 비교하여 승온에서 안정하고 활성이다. 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) (Taq)로부터 분리된 대표적인 열안정성 핵산 중합효소는 미국 특허 4,889,818호에 기재되어 있고 또 이것을 통상적인 PCR에 사용하는 방법은 Saiki et al., 1988, Science 239:487에 기재되어 있다. 피. 푸리오수스(P. furiosus)(Pfu)로부터 분리된 다른 대표적인 열안정성 핵산 중합효소는 Lundberg et al., 1991, Gene. 108:1-6에 기재되어 있다. 다른 대표적인 온도 안정성 중합효소는 예컨대 호열성 세균 테르무스 플라부스(Thermus flavus), 테르무스 루베르(Thermus ruber), 테르무스 써모필루스(Thermus thermophilus), 바실루스 스테아로써로필루스(Bacillus stearothermophilus) (다른 수록된 것보다 약간 낮은 최적 온도를 가짐), 테르무스 락테우스(Thermus lacteus), 테르무스 루벤스(Thermus rubens), 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 추출된 중합효소, 또는 호열성 아르카에아(archaea ) 테르모코커스 리토랄리스( Thermococcus litoralis), 및 메타노테르무스 페르비두스(Methanothermus fervidus)로부터 추출된 중합효소를 포함한다.
온도 안정성 중합효소 및 FEN 뉴클레아제는 PCR 주기 동안 이중 가닥 핵산이 고온 (약 95℃)에 노출되는 것에 의해 변성되는 열주기 방법에 바람직하다.
다른 바람직한 구체예로서, 뉴클레아제는 플랩-특이적 뉴클레아제이다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브는 리포터를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 리포터는 태그를 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 단편은 포획 요소에 상기 태그가 결합되는 것에 의해 포획된다.
다른 바람직한 구체예로서, 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 절단 구조가 형성된다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브가 표적 핵산에 결합되지 않을 때 검출가능한 신호의 생성을 켄치하는 프로브 상에서 효과적으로 배치된 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함하는 절단 구조가 형성된다.
다른 바람직한 구체예로서, 라벨링된 부위는 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리되므로, 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성이 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에서 절단하는 것에 의해 제2 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위로부터 제1 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위를 분리하게 하여, 검출가능한 신호를 생성하게 된다.
다른 바람직한 구체예로서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 핵산 중합효소는 Taq 중합효소 및 Pfu 중합효소로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 표적 핵산의 증폭과 검출이 동시에 생기는 중합효소 연쇄반응 방법을 제공한다. 본 발명은 표적 핵산의 증폭이 표적 핵산의 검출 이전에 생기는(즉 종점 검출) 중합효소 연쇄반응 방법을 제공한다.
본 발명은 절단 구조의 형성, 샘플 중의 표적 핵산 서열의 증폭 및 절단 구조의 절단을 동시에 하기 위한 중합효소 연쇄반응 방법을 제공한다. 이 방법은 (a) 표적 핵산의 제1 가닥에 있는 제1 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머, 표적 핵산의 동일 가닥에 있는 제2 영역에 상보적인 하류 라벨링된 프로브, 이때 상기 하류 라벨링된 프로브는 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 변화되는 2차 구조를 형성할 수 있고 또 결합 부위를 더 포함함, 및 표적 핵산의 제2 가닥에 있는 영역에 상보적인 하류 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제공하는 단계를 포함한다. 상기 방법 단계에 따르면, 상류 프라이머는 상보적 DNA 가닥의 합성을 개시하고, 또 하류 프라이머는 상보적 DNA 가닥의 합성을 개시한다. 상기 방법은 또한 (b) 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합 부위가 결합되는 것에 의해 생성되고 포획된 핵산을 검출하는 단계를 포함한다. 검출되는 핵산은 표적 핵산의 증폭과 절단을 포함하는 반응에서 생성되며, 이때 핵산 중합효소는 (i) 프라이머를 표적 핵산에 어닐링하고, (ii) 단계(a)의 프라이머를 연장하여, 핵산 중합효소는 프라이머 연장 생성물을 합성하고, 또 단계(a)의 상류 프라이머의 프라이머 연장 생성물은 단계(a)의 하류 프로브를 치환하여 절단 구조를 형성하는 PCR 주기 단계를 허용하는 조건하에서 주형-의존적 중합반응제이다. 상기 조건은 또한 (iii) 절단구조로부터 검출가능한 라벨링된 단편을 방출하기 위한 절단제로서 뉴클레아제를 이용하여 절단구조를 절단하는 것도 허용한다. 이 절단은 절단 온도에서 실시되며 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다.
바람직한 구체예로서, 절단 구조는 5' 플랩을 더 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 표적핵산을 제공하는 단계, (b) 표적 핵산에 상보적인 상류 프라이머를 제공하는 단계, (c) 프로브가 표적 핵산에 결합할 때 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 하류 프로브를 제공하는 단계; 및 (d) 표적 핵산, 상류 프라이머 및 하류 프라이머를 어닐링하는 단계를 포함하는 절단 구조를 형성하는 방법을 제공한다. 이 절단 구조는 절단 온도에서 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있다. 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다.
바람직한 구체예로서, 절단 구조는 5' 플랩을 포함한다.
본 발명은 또한 표적 핵산, 프로브가 표적 핵산에 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 프로브, 및 뉴클레아제를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물의 프로브 및 표적 핵산은 결합하여 절단 온도에서 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성할 수 있다. 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다.
바람직한 구체예로서, 상기 조성물은 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브 및 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다.
본 발명은 프로브가 표적 핵산에 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 프로브, 및 뉴클레아제를 포함하는, 샘플 중의 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 키트를 제공한다. 상기 키트의 프로브는 표적 핵산에 결합하여 절단 온도에서 뉴클레아제에 의해 절단될 수 있는 절단 구조를 형성할 수 있다. 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다.
바람직한 구체예로서, 키트는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 더 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 뉴클레아제는 FEN 뉴클레아제이다.
다른 바람직한 구체예로서, 상기 프로브는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 프로브는 프로브가 표적 핵산에 결합되지 않을 때 검출가능한 신호의 생성을 중지하도록 효과적으로 배치된 산호작용 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함한다.
다른 바람직한 구체예로서, 라벨링된 부위는 뉴클레아제의 뉴클레아제 활성 이 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에서 절단에 의해 제2 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위로부터 제1 상호작용 신호 생성 라벨링된 부위를 분리하게 함으로써 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리된다.
다른 바람직한 구체예로서, 상호작용 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광물질 부위를 포함한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음과 같다. 청구된 본 발명은 표적 핵산을 검출 및/또는 측정하는 신호를 생성하는 방법을 제공하며, 이때 신호의 생성은 샘플 중에서 표적 핵산의 존재를 나타낸다. 특허청구된 본 발명의 방법은 다수 단계를 필요로 하지 않는다. 본 발명은 표적 핵산의 존재 표시로서 신호를 생성하는 것을 포함하는 표적 핵산을 검출 및/또는 측정하는 PCR계 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 또한 표적 핵산의 증폭과 검출 및/또는 측정을 동시에 허용한다. 본 발명은 또한 5'→ 3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 핵산 중합효소의 부재시 신호를 생성하는 것을 포함하는 표적 핵산을 검출 및/또는 측정하는 PCR계 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 이후에 기재한 구체예의 설명 및 도면 그리고 특허청구범위로부터 명백할 것이다.
상세한 설명
본 발명은 샘플 중의 표적 핵산의 존재를 검출하기 위한 신호를 생성하는 방법을 제공하는 것으로, 이때 핵산은 핵산 중합효소 및 뉴클레아제 (예컨대, FEN 뉴클레아제)의 조합으로 처리된다. 본 발명은 샘플 중의 표적 핵산 서열의 동시적 증폭, 절단 및 검출을 허용하는 핵산을 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다.
일 양태로서, 상기 프로브는 본 발명에 따른 절단 내성 프로브이다. 절단 내성 프로브는 비-오버래핑 절단구조(비침습적)가 형성될 때 절단제에 의해 절단될 수 있지만, 오버래핑 구조(침습적)가 형성될 때에는 절단될 수 없는 절단 구조를 형성한다. 이러한 절단 내성은 오버래핑 구조에 의해 표적화된 프로브의 일부에서 본 발명에 따른 1 이상의 변형을 포함시키는 것에 의해 달성된다.
본 발명의 실시는 특별히 다르게 지시하지 않는 한, 당해 분야의 기술에 속하는, 분자 생성물, 미생물학 및 재조합 DNA 수법의 통상적인 수법을 이용할 수 있다. 예컨대 Sambrook, Fritsch & Maniatis, 1989, Molecular 클로닝: A La보라tory Manual. Second Edition; Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait, ed., 1984); Nucleic acid 혼성화 (B.D. Harnes & SJ. Higgins, eds., 1984); A Practical Guide to Molecular 클로닝 (B. Perbal, 1984); 및 Methods in Enzymology 시리즈 (Academic Press, Inc.); Short Protocols In Molecular Biology. (Ausubel et al., ed., 1995) 참조. 상기 및 이후에 본 명세서에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 공보는 참고문헌에 포함된다.
I. 뉴클레아제
본 발명에 따라 유용한 뉴클레아제는 DNA 중합효소와 같이 5' 엔도뉴클레아제 활성을 보유하는 효소, 예컨대 대장균으로부터 얻은 DNA 중합효소 I 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)(Taq), 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) (Tth) 및 테르무스 플라부스(Thermus flavus) (TfI)로부터 얻은 DNA 중합효소를 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 뉴클레아제는 또한 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 포함하며, 비제한적으로 진정세균성 DNA 중합효소 I, 예컨대 테르무스(Thermus) 종으로부터 얻은 효소(Taq, TfI, Tth, Tea (caldophilus) Tbr (brockianus)), 바실루스로부터 얻은 효소(바실루스(Bacillus) 종 (Bst, Bca, Magenta (전장(full 길이) 중합효소, NOT N-절단된(truncated) 버젼)), 테르모토가(Thermotoga) 종으로부터 얻은 효소(Tma (maritima, Tne (neopolitana)) 및 대장균(E. coli) DNA 중합효소 I를 포함한다. 용어 뉴클레아제는 또한 FEN 뉴클레아제를 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 뉴클레아제는 표적 핵산에 혼성화되지 않는 프로브 또는 프라이머를 절단할 수 없거나 또는 프로브 또는 프라이머에 혼성화되지 않는 표적 핵산을 절단할 수 없다.
FEN-1은 ~40 kDa 이가 금속 이온-의존적 엑소- 및 엔도뉴클레오티드 분해제이며 5' 단일 가닥 플랩 가닥의 주쇄를 특이적으로 인식하여 상기 아암을 따라서 듀플렉스 DNA의 2개 가닥이 단일 가닥 아암을 결합하는 접합부에 위치하는 절단 부위로 까지 내려간다. 엔도- 및 엔소뉴클레오티드 분해 활성은 플랩 또는 닉에서 가장 5' 위치에 있는 염기에 대하여 거의 감도를 갖지 않는다. FEN-1 엔도- 및 엑소뉴클레오티드분해 기질 결합 및 절단은 상류 올리고뉴클레오티드 (가닥 또는 프라이머에 인접한 플랩)에 의해 자극된다. 이것은 대장균 Pol I의 경우에서도 적용된다. 이 효소의 엔도뉴클레아제 활성은 5' 플랩 길이와 무관하며, 1개 뉴클레오티드처럼 작은 5' 플랩도 절단한다. 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 활성은 기질의 화학적 성질에 무관하며, DNA 및 RNA 모두를 절단한다.
엔도- 및 엑소뉴클레아제 활성은 생리적 범위의 염 농도에 의해 억제된다. 엑소뉴클레아제 활성은 0 mM NaCl에 비하여 50 mM NaCl에서 50배 억제된다. 엔도뉴클레아제 활성은 50 mM NaCl에서 7배만 억제된다(Reviewed in Lieber 1997, 상동).
5'-OH 말단은 5' 플랩 구조에 FEN-1을 로딩하기에 좋은 기질이지만, 이것은 닉의 일부가 이중 가닥 DNA 구조에서 발견될 때 아주 불량한 기질이다. 말단 포스페이트에 의한 정전 반발력은 기질을 슈도-플랩 구조에 넣기에 바람직하여, FEN-1에 대한 기질의 활성 형태를 제공한다. 이러한 설명은 닉의 플랩 또는 슈도-플랩 구조의 5' ssDNA 말단에 FEN-1을 로딩하기 위한 단일 메카니즘 및 단일 활성 부위를 나타낼 것이다. 상기 모델과 일치하는 내용은 닉에서 최적 활성이 가장 낮은 Mg2 + 와 일가 염 농도를 필요로 할 때 관찰되며, 이는 염기쌍을 불안정화시키고 또 닉이 플랩으로 들어가는 것을 선호할 것이다. 더 높은 Mg2 + 와 일가 염 농도는 브리딩을 싫어할 것이고 플랩으로 전환되도록 브리딩을 필요로 하는 닉처리된(nicked) 또는 갭화된 구조의 절단을 억제한다. 안정한 플랩 구조의 절단은 적절한 Mg2 + 수주에서 최적이며 증가하는 Mg2 + 농도를 감소시키지 않을 것이다. 이것은 플랩 기질이 그의 구조를 달성하기 위하여 염기 쌍을 용융시키지 않아도 되기 때문이다; 따라서 Mg2 + 에 완전히 둔감하다. 엔도뉴클레아제 활성은 일가 염에 의해 감소되지만, 이러한 감소는 엑소뉴클레아제 활성에서 관찰된 것 만큼 예리하지 않다. 또한, 1개 뉴클레오티드 플랩이 효과적인 기질이라는 것도 이미 밝혀진 바 있다. 이들 관찰 전부는 FEN-1이 엑소뉴클레아제로서 작용하는 것으로 이해되는 사실과 일치하며, 분해 생성물의 크기는 1 내지 몇 개의 뉴클레오티드 길이로 다양하다. 다양한 길이의 플렙에 닉을 포함시키는 것은 국소적 서열 변경이 필요할 것으로 예상되며, G/C 함량에 따라 다를 것이다. 요컨대, 일시적 플랩을 형성하기 위한 닉 혼입은 FEN-1의 엑소뉴클레아제 활성이 엔도뉴클레아제 활성과 동일하다는 것을 의미한다 (Reviewed in Lieber, 1997, 상동).
FEN-1의 엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제 활성은 액서사리(accessory) 단백질의 필요없이 DNA 및 RNA를 모두 절단한다. 그러나, 복제 포크에서, FEN-1은 DNA 헬리카아제 및 증식 세포 핵 항원 (PCNA), DNA 중합효소 δ 및ε에 대한 가공 인자 및 PCNA를 비롯한 다른 단백질과 상호작용한다. PCNA는 FEN-1 엔도- 및 엑소뉴클레아제 활성을 현저히 증가시킨다.
FEN-1 효소는 T5 5' 엑소뉴클레아제 및 T4 RNase H와 같은 몇 개의 소형 박테리오파아지 5'→3' 엑소뉴클레아제뿐만 아니라 산화적 염기 손상의 전사-결합된 수선에서 작용하는 XPG와 같은 대형의 진핵생물 뉴클레오티드 절단 수선 효소와 기능적으로 관련된다. 대장균 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)와 같은 진정세균에서, 오카자키 가공은 5'→3' 엑소뉴클레아제 도메인에 의해 제공된다. 이들 세균 및 파아지 효소는 FEN-1과 제한된 서열 상동성인 2개 영역, N (N-말단) 및 I (중간체)를 공유하며, 잔기 유사성은 7개의 보존된 산성 잔기에 집중된다. T4 RNase H 및 T5 엑소뉴클레아제의 결정 구조뿐만 아니라 돌연변이 데이터를 기본으로 하여, 이들 잔기는 DNA 가수분해에 영향을 주는데 필요한 2개의 Mg2 + 이온에 결합되는 것으로 제안되었다; 그러나, 각 금속은 각 효소마다 약간 상이한 촉매적 주기에 관여하며, 잘 알려져 있다(Reviewed in Hosfield et al., 1998b, 상동).
본 발명에 유용한 FEN-1 효소를 암호화하는 fen-1 유전자는 뮤린(murine) fen-1, 인간 fen-1, 래트 fen-1, 크세노푸스 라애비스(Xenopus laevis) fen-1, 및 4개의 원시세균 아르케글로부스 풀지두스(Archaeglobus fulgidus), 메타노코커스 야나쉬(Methanococcus jannaschii)로, 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus), 및 피로코커스 호리코쉬(Pyrococcus horikoshii)로부터 유도된 fen-1을 포함한다. FEN-1 효소 암호화 cDNA 클론은 인간 (GenBank Accession Nos.: NM 004111 and L37374), 마우스 (GenBank Accession No.: L26320), 래트 (GenBank Accession No.: AA819793), 크세노 라애비스(Xenopus laevis) (GenBank Accession Nos.: U68141 and U64563), 및 피. 푸리오수스(P. furiosus) (GenBank Accession No.: AF013497)로부터 단리하였다. 피. 호리코쉬(P. horikoshii) 플랩 엔도뉴클레아제에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열도 또한 결정되었다(GenBank Accession No.: AB005215). FEN-1 패밀리는 또한 사카로마이세스 세레비시아애(Saccharomyces cerevisiae) RAD27 유전자 (GenBank Accession No.: Z28113 Y13137) 및 사카로마이세스 폼베 (Saccharomyces pombe) RAD2 유전자 (GenBank Accession No.: X77041)를 포함한다. 메타노박테륨 테르마우토트로피쿨룸 (Methanobacterium thermautotrophiculum)의 원시세균 게놈도 또한 서열결정되었다. FEN-1과 원핵생물 및 바이러스성 5' 엑소뉴클레아제 사이의 서열 유사성은 낮지만, 진핵생물 계(kingdom) 내의 FEN-1은 아미노산 수준에서 고도로 보존되며, 인간 및 에스. 세레비시아애(S. cerevisiae) 단백질은 60% 동일하고 또 78% 유사하다. 3개의 원시세균성 FEN-1 단백질은 또한 진핵생물 FEN-1 효소에 대하여 고도로 상동성이다(Reviewed in Matsui et al., 1999., J. Biol . Chem.. 274:18297, Hosfield et al., 1998b, J. Biol . Chem .. 273:27154 and Lieber, 1997, BioEssavs. 19:233).
인간 및 기타 FEN-1 패밀리 멤버 사이의 2개의 보존된 뉴클레아제 도메인(N-말단 또는 N 및 중간체 또는 I 도메인)에서 서열 유사성은 92% (뮤린), 79% (에스. 세레비시아애(S. cerevisiae)), 77% (에스. 폼베(S. pombe)), 72% (에이. 풀지두스(A. fulgidus)), 76% (엠. 야나쉬(M jannaschii)), 및 74% (피. 푸리오수스(P. furiosus))이다.
FEN-1은 5' 단일 가닥 플랩 가닥의 주쇄를 특이적으로 인식하고 이 플랩 아래에서 듀플렉스 DNA와 단일 가닥 아암의 2개 가닥 사이의 접합부에 위치한 절단 부위로 까지 이동한다. 플랩 (때때로 플랩 인접 가닥 또는 프라이머 가닥으로도 불림)의 가닥 상류가 제거되면, 생성한 구조는 슈도-Y(도 1 참조)라 칭한다. 이 구조는 FEN-1에 의해 절단되지만, 20- 내지 100배 낮은 효율이다. FEN-1은 3' 단일 가닥 플랩을 절단하지 않는다. 그러나, 엑소뉴클레아제로서 작용하는 FEN-1은 갭 또는 닉을 함유하는 dsDNA 기질을 가수분해할 것이다(Reviewed in Hosfield et al., 1998a, supra, Hosfield et al., 1999b, 상기 참조 and Lieber 1997, 상기 참조). 엑소뉴클레오티드분해적으로, FEN-1은 dsDNA 상의 갭(gap) 또는 움푹파인(recessed) 5' 말단에서 낮은 효율로 닉에서 작용한다. 갭화된 구조에서, FEN-1 결합 및 절단 효율은 갭 크기가 약 5 뉴클레오티드로 증가함에 따라 감소한 다음 dsDNA 내의 움푹파인 5' 말단 상에서 활성에 상응하는 정도의 절단에서 안정화된다. 블런트(blunt) dsDNA, 움푹파인 3' 말단 및 ssDNA는 절단되지 않는다((Reviewed in Lieber 1997, supra). FEN 효소의 절단 활성은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Yoon et al., 1999, Biochemistry. 38: 4809; Rao, 1998, J. Bacteriol., 180:5406 and Hosfield et al., 1998, Cell, 95:135-146 에 기재되어 있다.
본 발명에 따라 유용한 FEN 뉴클레아제는 인간 (GenBank Accession Nos.: NM_004111 및 L37374), 마우스 (GenBank Accession No.: L26320), 래트(GenBank Accession No.: AA819793), 효모 (GenBank Accession No.: Z28113 Y13137 및 GenBank Accession No.: X77041) 및 크세노푸스 라애비스(xenopus laevis) (GenBank Accession Nos.: U68141 및 U64563)을 비롯한 다양한 생물로부터 단리하였다. 이러한 효소는 당해 분야에 공지된 통상의 수법을 이용하여 클로닝되고 과발현될 수 있다.
본 발명에 따른 FEN 뉴클레아제는 바람직하게는 열안정성이다. 열안정성 FEN 뉴클레아제는 4개의 원시세균을 비롯한 다양한 열안정성 생물로부터 단리되어 특징화되었다. 피. 푸리오수스(P. furiosus) 플랩 엔도뉴클레아제에 대한 cDNA 서열 (GenBank Accession No.: AFOl 3497) 및 아미노산 서열 (Hosfield et al., 1998a, 상기 동일 및 Hosfield et al., 1998b)이 결정되었다. 피. 호리코쉬(P. horikoshii) 플랩 엔도뉴클레아제에 대한 완전한 뉴클레오티드 서열 (GenBank Accession No.: AB005215) 및 아미노산 서열 (Matsui et al., 상기 동일)도 또한 결정하였다. 엠. 야나쉬(M. jannaschii) (Hosfield et al., 1998b 및 Matsui et al., 1999 supra) 및 에이. 풀지두스 (A. fulgidus) (Hosfield et al., 1998b) 플랩 엔도뉴클레아제에 대한 아미노산 서열도 또한 결정하였다.
열안정성 FEN1 효소는 당해 분야에 공지되고 또 Hosfield et al., 1998a, 상기 동일, Hosfield et al., 1998b, Kaiser et al., 1999, J. Biol. Chem., 274: 21387 및 Matusi et al., 상기 동일에 기재되고 또 표제 "Pfu FEN-1 클로닝" 실시예 2에 본 명세서에 기재된 수법을 이용하여 클로닝되고 과발현될 수 있다.
FEN 효소의 엔도뉴클레아제 활성은 하기를 포함한 다양한 방법에 의해 측정될 수 있다.
A. FEN 엔도뉴클레아제 활성 에세이
1. 본 발명에 따른 FEN 뉴클레아제의 활성을 평가하기 위하여 주형(예컨대 도 2에 도시된 바와 같은)을 사용하였다.
주형 1은 다음 서열을 갖는 5' 33P 라벨링된 올리고뉴클레오티드 (Heltest4 )이다:
Figure 112009038784823-PCT00001
(서열번호: 1). Heltest4 의 밑줄친 부분은 M13mpl8+에 상보적인 영역을 나타낸다. 절단 생성물은 서열
Figure 112009038784823-PCT00002
(서열번호: 2)을 갖는 18 뉴클레오티드 단편이다.
Heltest4는 M13에 결합하여 상보적인 이중 가닥 도메인뿐만 아니라 비상보적 5' 오버헹(overhang)을 생성한다. 이 듀플렉스는 주형 2(도 2)를 형성하며, 이것은 또한 M13에 결합된 부가적인 프라이머(FENAS)를 가지며 또 Heltest 4에 직접 인접한다. FENAS의 서열은
Figure 112009038784823-PCT00003
(서열번호: 3)이다. 주형 3의 존재하에서, FEN은 Heltest4의 자유 5' 말단에 결합되어, 접합부로 이동하고 Heltest4를 절단하여 18 뉴클레오티드 단편을 생성한다. 주형 1 및 2는 대조용으로 작용하지만, 주형 2는 주형으로 작용한다.
주형은 이하에 기재한 바와 같이 제조한다:
Figure 112009038784823-PCT00004
IX Pfu 완충액은 Stratagene (카탈로그 # 200536)으로부터 입수할 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, IX Pfu 완충액은 반응이 1x 완충액 존재하에서 실시되도록 희석된다.
M13은 M13mpl8+ 가닥이고 200ng/μL 농도이며, 33P 라벨링된 Heltest4는 거의 0.7ng/㎕ 농도이고, 또 FENAS는 4.3 ng/㎕ 농도이다. 이들 농도를 기초로 하여, Heltest4 및 M13은 거의 동일한 몰량 (5xlO-14)이고 또 FENAS는 거의 10x 몰 과량 (6 x 10-13)으로 존재한다.
주형 혼합물을 95℃에서 5분간 가열하고, 45분 동안 실온으로 냉각시키고 또 40℃에서 철야로 저장하였다.
2㎕의 FEN-1 또는 대조용으로서 H2O를 다음과 같이 3개 주형과 혼합하였다:
3㎕ 주형
0.7㎕ 1Ox 클로닝된 Pfu 완충액
0.56㎕ 10OmM MgCl2
2.00㎕ 효소 또는 H2O
0.74㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
상기 반응은 50℃에서 30분간 지속되며 2 ㎕ 포름아미드 "서열결정(시퀀싱: Sequencing) 중지" 용액을 각 샘플에 부가함으로써 중지시켰다. 샘플을 95℃에서 5분간 가열하고 6% 아크릴아미드, 7M 우레아 캐스트어웨이(CastAway) (Stratagene) 겔 상에 로딩하였다.
다르게는, FEN 활성은 1시간의 배양 시간이 이용되는 이하의 완충액에서 분석될 수 있다:
10x FEN 완충액
50OmM Tris-HCl pH 8.0
10OmM MgCl2
하기 반응 혼합물은 2㎕의 FEN 또는, 대조용으로서, 2㎕의 H2O와 혼합하였다.
3㎕ 주형
0.7㎕ 10x FEN 완충액
2.00㎕ 효소 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 Robocyler 96 핫 탑 써멀 사이클러(hot top hermal cycler)내 5O℃에서 1시간 동안 배양하였다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액을 부가한 후, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 샘플을 11인치 길이, 손으로 부어진, 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔을 브로모페놀 블루가 전체 길이의 약 2/3로 이동할 때까지 20와트에서 실험하였다. 이 겔을 유리 플레이트로부터 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에서 10분간 침지시킨 다음 물에서 10분간 침지시켰다. 이 겔을 와트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열된 진공 겔 건조기에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켰다.
2. FEN 엔도뉴클레아제 활성은 Kaiser et al. (상기 참조)의 방법에 따라 측정할 수 있다. 간단히 말해, 반응은 TaqPol 및 TthPol의 경우 10 mM MOPS, pH 7.5, 0.05% Tween 20, 0.05% Nonidet P-40, lO㎕/ml tRNA 및 200 mM KCl을 함유하거나 또는 다른 효소의 경우 50 mM KCl을 함유하는 10㎕ 부피로 실시한다. 반응 조건은 분석할 절단 구조에 따라 다양할 수 있다. 기질(21M) 및 다양한 양의 효소를 지시된(상기) 반응 완충액과 혼합하고 칠-아웃(Chill-out)(MJ Research) 액체 왁스로 씌운다. 기질은 90℃에서 20초간 변성시키고 또 50℃로 냉각시킨 다음 MgCl2 또는 MnCl2 을 부가함으로써 반응을 시작하고 또 50℃에서 특정 시간 동안 배양한다. 10 mM EDTA 및 0.02% 메틸 바이올렛 (Sigma)을 함유하는 95% 포름아미드 10㎕를 부가함으로써 반응을 중지시킨다. 7M 우레아, 및 45 mM 트리스 보레이트 완충액, pH 8.3, 1.4 mM EDTA가 가해진 20% 변성 아크릴아미드 겔(19:1 교차결합) 상에서 전기영동하기 직전에 샘플을 1분간 90℃로 가열시킨다. 다르게 나타내지 않는 한, 레인당 1㎕의 각 중지된 반응물을 로딩한다. 겔은 505-nm 필터를 이용하여 FMBIO-100 형광 겔 스캐너 (Hitachi) 상에서 스캐닝한다. 절단된 생성물의 분획은 FMBIO 분석 소프트웨어 (버젼 6.0, Hitachi)를 이용하여 비절단 및 절단 기질에 상응하는 밴드의 세기로부터 결정한다. 절단 생성물의 분획은 측정이 거의 초기 절단율로 되도록 20%를 초과해서는 안된다. 절단율은 절단 생성물 농도를 효소 농도 및 반응 시간(분)으로 나눈 것으로 정의된다. 각 효소의 경우 3개 데이터 점을 이용하여 비율과 실험 오차를 결정한다.
3. FEN 엔도뉴클레아제 활성은 Hosfield et al., 1998a, (상기 동일)의 방법에 따라서 측정할 수 있다. 간단히 말해, 13㎕의 최종 부피에서, 동 부피의 중지 용액 (10 mM EDTA, 95% 탈이온화된 포름아미드, 및 0.008% 브로모페놀 블루 및 크실렌 시아놀)으로 반응을 중지시키기 전에, 다양한 양의 FEN 및 1.54 pmol의 라벨링된 절단 기질을 상이한 온도에서 30분간 배양한다. 샘플을 15% 폴리아크릴아미드 겔을 변성시키는 것을 통하여 전기영동처리시키고, 또 MacBAS 영상 분석 소프트웨어가 실시되는 IPLabGel 시스템 (Stratagene)을 이용하여 상대량의 출발 물질 및 생성물을 정량한다. 대부분의 반응은 표준 에세이 완충액(10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl2, 및 50㎍/ml 소 혈청 알부민)에서 실시된다; 그러나 일련의 실험으로 상이한 2가 금속 및 pH 수준의 효과는 표준 완충액을 다양하게 하여 연구한다. 2가 금속의 경우, MgCl2 를 생략하고, 또 상이한 금속 이온을 10 mM의 최종 농도로 사용하였다. pH의 영향을 연구하기 위하여, 상이한 양의 트리스-HCl, 글리신 및 나트륨 아세테이트를 함유하는 완충액을 10 mM의 최종 농도로 사용하여 25℃에서 다양한 범위의 pH를 얻는다.
4. FEN 엔도뉴클레아제 활성은 Matusi et al., 1999 (상기 참조)의 방법에 따라 측정할 수 있다. 간단히 말해, 이 효소 반응은 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM β-머캅토에탄올, 100 ㎍/ml 소 혈청 알부민, 및 0.6 pmol의 라벨링된 절단 구조를 함유하는 15㎕ 반응 혼합물에서 실시한다. 60℃에서 30분간 배양한 후, 10 mM EDTA 및 1 mg/ml 브로모페놀 블루를 함유하는 15㎕의 95% 포름아미드를 부가함으로써 반응을 종료시킨다. 샘플을 95℃에서 10분간 가열한 다음 7M 우레아 및 10 x TBE (89 mM Tris-HCl, 89 mM 붕산, 2 mM EDTA (pH 8.0))을 함유하는 15% 폴리아미드 겔(35 cm x 42.5 cm) 상에 로딩한 다음 2000V에서 2시간 동안 전기영동처리시킨다. 반응 생성물은 Phosphorlmager(Bio-Rad)를 이용하여 가시화하고 정량한다. 사이즈 마커, 올리고뉴클레오티드는 [γ-32P]ATP 및 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 이용하여 5' 말단 라벨링된다.
최적 pH를 측정하기 위하여, 반응은 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM /3-머캅토에탄올, 100㎍/ml 소 혈청 알부민, 및 0.6 pmol의 5' 말단-라벨링된 절단 구조를 하기 완충액 중의 하나의 50 m메 함유하는 에세이 혼합물(15㎕)에서 60℃에서 30분간 실시하였다. 3개의 상이한 50 mM 완충액을 사용하여 이하와 같은 다양한 범위의 pH를 얻는다: 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 4.0-5.5), 포스페이트 완충액 (pH 5.5- 8.0), 및 보레이트 완충액 (pH 8.0-9.4).
B. FEN 엑소뉴클레아제 활성 에세이
본 발명에 따른 FEN 엑소뉴클레아제의 엑소뉴클레아제 활성은 Matsui et al., 1999, (상기 기재되고 요약됨)에 기재된 FEN-1 엔도뉴클레아제 활성을 측정하는 방법에 의해 측정될 수 있다.
다르게는, FEN 효소의 엑소뉴클레아제 활성은 Hosfield et al., 1998b, (상동)에 기재된 방법에 의해 분석될 수 있다. 요컨대 엑소뉴클레아제 활성은 엔도뉴클레아제 에세이(상술함)에 기재된 것과 동일한 조건하에서 FEN의 닉(홈)이 있는 기질을 사용하여 에세이한다.
엑소뉴클레아제 및 엔도뉴클레아제 실험에서 DN절단의 정확한 위치는 클레노 단편의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 이용하여 5' 32P-라벨링된 주형 가닥을 부분 분해하는 것에 의해 얻을 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 절단 구조는 표적 핵산에 어닐링된 올리고뉴클레오티드 프로브의 부분적으로 치환된 5' 말단을 포함한다. 본 발명에 따른 다른 절단 구조는 표적 핵산 (예컨대 도 4의 B), 본 발명에 따른 것으로 표적 서열에 상보적인 영역 또는 영역들을 포함하는 상류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 4의 A), 및 표적 서열에 상보적인 하류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 4의 C)를 포함한다. 본 발명에 따른 절단 구조는 상류 올리고뉴클레오티드와 하류 프로브 사이의 오버랩에 의해, 또는 핵산 중합효소의 합성 활성에 의한 상류 올리고뉴클레오티드의 연장에 의해, 또 이어 하류 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 부분적 치환으로 형성될 수 있다. 상기 유형의 절단 구조는 표제 "절단 구조" 부분에 기재된 방법에 따라 형성한다.
다르게는, 본 발명에 따른 절단 구조는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프로브에 표적 핵산을 어닐링함으로써 형성하며, 이때 올리고뉴클레오티드 프로브는 표적 핵산에 상보적인 영역 또는 영역들, 및 표적 핵산에 어닐링되지 않아 5' 플랩을 형성하는 비상보적 영역을 포함한다. 상기 구체예에 따르면, 절단 구조는 올리고뉴클레오티드의 비상보적 영역에 의해 형성된 5' 플랩을 포함한다.
본 발명에 따른 절단 구조는 또한 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산에 어닐링될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드(예컨대 도 4의 A)의 3' 말단은 표적 핵산에 어닐링된 본 발명에 따른 하류 올리고뉴클레오티드(도 4의 C) 프로브의 1 (또는 그 이상) 염기 쌍에 상보적이고 또 1(또는 그 이상의) 염기 쌍 오버랩은 단일 가닥 플랩의 연장점의 바로 하류에 위치하며 표제 "절단 구조" 부분에 기재된 방법에 따라 형성한다. 일 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 비-오버래핑 영역에 혼성화된다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브는 표적 핵산의 인접 영역에 혼성화된다.
II . 핵산 중합효소
본 발명은 핵산 중합효소를 제공한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 중합효소는 열안정성이다.
본 발명에 따라 유용한 공지된 DNA 중합효소는 예컨대 대장균 DNA 중합효소 I, 테르무스 테르모필루스 (Thermus thermophilus) (Tth) DNA 중합효소, 바실루스 스테아로테르모필루스 (Bacillus stearothermophilus) DNA 중합효소, 테르모코커스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) DNA 중합효소, 테르무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus) (Taq) DNA 중합효소 및 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) (Pfu) DNA 중합효소를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 공지된 RNA 중합효소는 예컨대 박테리오파아지 T7, T3 및 SP6 RNA 중합효소, 대장균(E. coli) RNA 중합효소 홀로효소, 대장균 RNA 중합효소 코어 효소, 및 인간 RNA 중합효소 I, II, III, 인간 미토콘드리아 RNA 중합효소 및 (HCV)로부터 얻은 NS5B RNA 중합효소를 포함한다.
본 발명에 유용한 핵산 중합효소는 또한 역전사효소를 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 공지된 역전사효소는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) RT, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) RT, 조류 육종 백혈구증 바이러스(ASLV) RT, 라우스 육종 바이러스(RSV) RT, 조류 골수아구증 바이러스(AMV) RT, 조류 적아구증 바이러스 (AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 세망내피증 바이러스 (REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A RT, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV RT, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV RT, 라우스 관련된 바이러스 (RAV) RT, 및 골수아구증 관련 바이러스(MAV) RT를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된 핵산 중합효소는 비제한적으로 클레노 및 클레노 엑소- 및 T7 DNA 중합효소 (Sequenase)를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된 열안정성 핵산 중합효소는 비제한적으로 Pfu, exo-Pfu (3'→ 5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu의 돌연변이 형태), Taq의 스토펠(Stoffel) 단편, N-절단(truncated) Bst, N-절단(truncated) Bca, Genta, JdF3 exo-, Vent, Vent exo- (3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Vent의 돌연변이 형태), Deep Vent, Deep Vent exo- (3'→ 5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Deep Vent의 돌연변이 형태), UlTma, ThermoSequenase 및 테르무스 열안정성 RNA 중합효소를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 핵산 중합효소는 천연 중합효소뿐만 아니라 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 중합효소 돌연변이체도 포함한다. 본 발명에 따라 유용한 핵산 중합효소는 상이한 정도의 열안정성을 보유할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산 중합효소는 핵산 프라이머를 연장시킬 수 있는 온도에서 가닥 치환 활성을 나타낸다. 본 발명의 바람직한 구체예로서, 핵산 중합효소는 5'→3' 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한다.
5'→3' 엑소뉴클랑제 활성이 결여되고 상이한 정도의 열안정성을 나타내는 본 발명에 따라 유용한 부가적인 핵산 중합효소는 이하에 수록한다.
A. 박테리오파아지 DNA 중합효소 (37℃ 에세이에 유용함):
박테리오파아지 DNA 중합효소는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하고 있는데, 이는 상기 활성이 별개의 폴리펩티드에 의해 암호화되기 때문이다. 적합한 DNA 중합효소의 예는 T4, T7 및 φ29 DNA 중합효소이다. 시중에서 입수할 수 있는 이들 효소는 다음과 같다: T4 (많은 공급처, 예컨대 Epicentre 로부터 입수가능) 및 T7 (많은 공급처, 예컨대 비변형된 거인 경우 Epicentre 로부터 또 3'→ 5' 엑소 T7 "Sequenase" DNA 중합효소의 경우 USB로부터 입수가능).
B. 원시세균성( Archaeal ) DNA 중합효소:
원시세균에서 확인된 2개 유형의 상이한 DNA 중합효소가 존재한다. 1.패밀리 B/pol α 형 (피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus)로부터 얻은 Pfu의 상동체) 및 2. pol II 형 (피.푸리오수스(P. furiosus) DP1/DP2 2-서브유닛 중합효소의 상동체). 상기 유형의 DNA 중합효소는 관련 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 천연적으로 결여하고 있고 또 3'→5' 엑소뉴클레아제 (프루프리딩) 활성은 보유하는 것으로 밝혀져 있다. 적합한 DNA 중합효소 (pol α 또는 pol II)는 소망하는 에세이 온도와 유사한 최적 생장 온도를 갖는 원시세균(archaea)으로부터 유도될 수 있다. 적합한 원시세균의 예는 비제한적으로 다음을 포함한다:
1. 열불안정성(열불안정) (37℃ 에세이에 유용) - 예컨대 메타노코커스 볼타애(Methanococcus voltae)
2. 열안정성(열안정성) (비-PCR 에세이에 유용) - 예컨대 설폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 설폴로부스 아시도칼다륨(Sulfolobus acidocaldarium), 메타노코커스 야나쉬 (Methanococcus jannaschi), 테르모플라스마 아시도필룸 (Thermoplasma acidophilum). 적합한 원시세균은 < 80-85℃의 최대 생장 온도 또는 < 70-80℃의 최적 생장 온도를 나타내는 것으로 추정된다.
3. 열안정성(열안정성) (PCR 에세이에 유용) - 예컨대 피로코커스(Pyrococcus) 종 푸리오수스(furiosus), GB-D 종, 종 균주 KODl, woesii, abysii, horikoshii), 테르모코커스 종(Thermococcus species) (리토랄리스(litoralis), 종 9°North-7, 종 JDF-3, 고르고나리우스(gorgonarius), 피로딕튬 오쿨툼(Pyrodictium occultum), 및 아르케오글로부스 풀지두스(Archaeoglobus fulgidus). 적합한 원시세균은 > 80-85℃의 최대 생장 온도 또는 > 70-80℃의 최적 생장 온도를 나타내는 것으로 추정된다. 원시세균성 pol α DNA 중합효소 군으로부터의 적합한 PCR 효소는 상업적으로 입수가능하며, KOD (Toyobo), Pfx (Life Technologies, Inc.), Vent (New England BioLabs), Deep Vent (New England BioLabs), 및 Pwo (Boehringer-Mannheim)를 포함한다.
상기 수록된 것과 관련된 부가적인 원시세균은 다음 참고문헌에 기재되어 있다: Archaea : A La보라tory Manual (Robb, F.T. and Place, A.R., eds.), Cold Spring Harbor La보라tory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1995 and Thermophilic Bacteria (Kristjansson, J.K.,ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1992.
C. 진정세균성 DNA 중합효소:
3종류의 진정세균성 DNA 중합효소, pol I, II, 및 III이 있다. Pol I DNA 중합효소 패밀리 중의 효소는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 또 특정 멤버는 3'→ 5' 엑소뉴클레아제 활성을 나타낸다. Pol II DNA 중합효소는 천연적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하고 있지만, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성은 나타낸다. Pol III DNA 중합효소는 세포의 주요 복제성 DNA 중합효소를 나타내며 다수 서브유닛으로 구성된다. pol III 촉매적 서브유닛은 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하고 있지만, 일부 경우에서는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 동일 폴리펩티드에 위치한다.
진정세균성 pol II 및 pol III DNA 중합효소의 시판 공급원은 없다. 시판되는 다양한 Pol I DNA 중합효소가 있고, 그의 일부는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 감소 또는 제거하도록 변형된다. pol I DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 제거하기 위해 이용된 방법은 다음을 포함한다:
- 돌연변이 (Xu et al., 1997, J. MoI. Biol. 268:284 and Kim et al, 1997, Mol. Cells. 7:468에 기재된 바와 같은).
- 단백질분해에 의한 N-절단 (Klenow et al., 1971, Eur . J. Biochem.. 22: 371에 기재된 바와 같은), 또는
- C-말단 단편으로 클로닝 및 발현하는 것에 의한 N-절단 (Lawyer et al., 1993, PCR Methods Appl.. 2:275에 기재된 바와 같은).
원시세균성 공급원으로서는, 에세이-온도 요건은 어떤 진정세균이 본 발명에 따라 유용한 DNA 중합효소의 공급원으로서 사용되어야 하는지 결정한다(예컨대, 중온성균, 호열성균, 초호열성균).
1. 중온성/열불안정성 (37℃에세이용으로 유용)
i. 천연적으로 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소: pol II 또는 pol III 촉매적 서브유닛 중온성 진정세균, 예컨대 대장균, 스트렙토코커스 퓨모니아애(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 미코박테륨 (Mycobacterium) 종 (튜버쿨로시스(tuberculosis), 레프라애(leprae)).
ii. 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 실질적으로 결여된 DNA 중합효소 돌연변이체: N-절단 또는 돌연변이용 Pol I DNA 중합효소는 상기 수록한 (Ci) 중온성 진정세균으로부터 분리될 수 있다. 시판되는 진정세균성 DNA 중합효소 pol I 단편은 클레노 단편 (N-절단된 대장균(E. coli) pol I; Stratagene 제조).
2. 열안정성 (비 PCR 에세이용으로 유용)
i. 천연적으로 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소: 바실루스 종(Bacillus species) (예컨대 스테아로테르모필루스( stearothermophilus), 칼도테낙스(caldotenax), 칼도벨록스(caldovelox))와 같은 호열성 진정세균으로부터 얻은 pol II 또는 pol III 촉매적 서브유닛.
ii. 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소 돌연변이체: N-절단 또는 돌연변이용으로 적합한 Pol I DNA 중합효소는 상기 수록한 바실루스 종(Bacillus species)과 같은 호열성 진정세균으로부터 분리될 수 있다. 비. 스테아로테르모필루스(B. stearothermophilus) DNA 중합효소 pol I의 호열성 N-절단 단편은 상업적으로 입수가능하며 또 상품명 Bst DNA 중합효소 I 대형 단편 (Bio-Rad 및 Isotherm DNA Polymerase (Epicentre))으로 시판되고 있다.
바실루스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax) pol I의 C-말단 단편은 판베라(Panvera)사로부터 입수할 수 있다 (상품명 Ladderman으로 시판).
3. 열안정성 (PCR 에세이용으로 유용)
i. 천연적으로 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소: 테르무스 (Thermus) 종 [아쿠아티쿠스(aquaticus), 테르모필루스 (thermophilus), 플라부스(flavus), 루베르(ruber), 칼도필루스(caldophilus), 필리포르미스(filiformis), 브로키아누스 (brokianus)]로부터 또는 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima)로부터 얻은 Pol II 또는 pol III 촉매적 서브유닛. 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus) 및 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus)로부터 얻은 촉매적 pol III 서브유닛은 Yi-Ping et al., 1999, J. Mol. Evol., 48:756 및 McHenry et al., 1997, J. MoI. Biol., 272:178 에 기재되어 있다.
ii. 실질적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 DNA 중합효소 돌연변이체: N-절단 또는 돌연변이용으로 적합한 pol I DNA 중합효소는 테르무스 (Thermus) 종 및 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima) (상기 참조)를 비롯한 다수의 호열성 진정세균으로부터 분리될 수 있다. 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus) DNA 중합효소 pol I (Taq)의 열안정성 단편은 시중에서 입수할 수 있으며 또 상품명 KlenTaql (Ab Peptides), Stoffel fragment (Perkin-Elmer), 및 ThermoSequenase (Amersham)으로 시판되고 있다. C-말단 단편 이외에, 5'→3' 엑소뉴클레아제' Taq 돌연변이체는 TaqFS (Hoffman-LaRoche)와 같이 시중에서 입수할 수 있다. Taq의 5'→3' 엑소뉴클레아제 버젼 이외에, 테르모토가 마리티마(Thermotoga maritima) DNA 중합효소 I의 N-절단 버젼은 시중에서 입수할 수 있다(상품명 UlTma, Perkin-Elmer).
상기 수록된 것과 관련된 부가적인 진정세균은 호열성(thermophilic) 세균 (Kristjansson, J.K.,ed.) CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1992 에 기재되어 있다.
D. 진핵생물성 5'→3' 엑소뉴클레아제- DNA 중합효소 (37℃ 에세이에 유용함)
DNA pol α(복제/수선), δ(복제), ε (복제), β(수선) 및 γ (미토콘드리아 복제)을 비롯하여 몇 개의 DNA 중합효소가 진핵생물에서 확인되었다. 진핵생물 DNA 중합효소는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성가 결여되어 있는데, 이는 이 활성이 별개의 폴리펩티드(예컨대 포유동물 FEN-1 또는 효모 RAD2)에 의해 암호화되기 때문이다. 적합한 열불안정 DNA 중합효소는 다양한 진핵생물 (비제한적으로 효모, 포유동물 세포, 곤충 세포, 초파리(Drosophila)를 포함) 및 진핵생물 바이러스 (예컨대 EBV, 아데노바이러스)로부터 단리될 수 있다.
5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 이외에 3'→5' 엑소뉴클레아제 (프루프리딩 (proofreading)) 활성이 결여된 DNA 중합효소 돌연변이체는 FEN-계 검출 전략에서 향상된 성능을 나타낼 수 있었다. 예컨대, 고유한 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성 감소 또는 제거는 라벨링된 프로브의 비특이적 엑소뉴클레아제 분해를 감소시키는 것에 의해 배경 신호를 낮출 수 있다. 3개의 3'→5' 엑소뉴클레아제 모티프가 확인되었고, 또 이들 영역에서 돌연변이는 클레노, φ29, T4, T7, 및 Vent DNA 중합효소, 효모 pol α, pol β 및 pol γ, 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) Pol III 에서 3'→ 5' 엑소뉴클레아제 활성을 제거하는 것으로 밝혀졌다(Derbeyshire et al., 1995,.Methods. Enzymol. 262:363에 기재됨). 감소되거나 또는 제거된 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 부가적인 DNA 중합효소 돌연변이체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
5'→3' 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 모두 갖지 않는 시판되는 효소는 Sequenase (exo' T7; USB), Pfu exo- (Stratagene), exo- Vent (New England BioLabs), exo- Deep Vent (New England BioLabs), exo- Klenow 단편 (Stratagene), Bst (Bio-Rad), Isotherm (Epicentre), Ladderman (Panvera), KlenTaql (Ab Peptides), 스토펠(Stoffel) 단편 (Perkin-Elmer), ThermoSequenase (USB), and TaqFS (Hoffman-LaRoche) 이다.
Pfu 이외의 중합효소가 사용되면, 완충액 및 연장 온도는 본 발명에 따라 유용한 특정 중합효소에 의해 최적 활성을 허용하도록 선택한다. 본 발명에 따라 유용한 완충액 및 연장 온도는 당해 분야에 공지되어 있고 또 공급자의 규정으로부터 측정할 수 있다.
E. RNA 중합효소
본 발명에 유용한 RNA 중합효소는 DNA 및 RNA 의존적 RNA 중합효소를 포함한다. RNA 의존적 RNA 중합효소는 프라임처리된 주형으로부터, 프라임되지 않은 주형으로부터 또는 프라임(primed)되거나 또는 프라임되지 않은 주형으로부터 RNA의 새로운 가닥을 합성할 수 있는 것을 특징으로 한다. RNA 중합효소는 프라이머 부재하에서 단일 가닥 RNA 주형으로부터 RNA를 인식하고 합성하는 것으로 확인되었다. 상기 유형의 프라임 메카니즘의 예는 NS5B로 불리는 C형 간염 바이러스(HCV)의 RNA 중합효소이다. NS5B는 HCV RNA 게놈을 복제하는데 관여하는 RNA 중합효소로 특징화된다. NS5B는 자가-프라이밍, 기존의 프라이머를 연장 또는 새로운 RNA 합성을 개시하는 것에 의해 RNA 합성의 연장을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. Luo et al., J. Virol., 2000, 74(2):851-853.
RNA 중합효소는 또한 프라임된 단일 가닥 RNA 주형으로부터 RNA를 인식하고 합성하는 것으로 확인되었다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 RNA 중합효소를 상세하게 나타내는 몇 개 참고문헌은 예컨대 Schiebel et al., J. Biol . Chem ., 1993, 268(16): 11858-11867, Tang et al., Genes and Dev., 2003, 17(l):49-63, 또는 2005년 8월 31일 출원된 미국 특허출원 번호 11/217,972호 (내용 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 포함됨)이다. 이들 경우에서, RNA 중합효소는 RNA의 표적 집단을 선택적으로 증폭하기 위해 사용될 수 있다.
"RNA-의존적 RNA 중합효소"는 RNA로부터 복수의 RNA 카피를 합성하는 효소이다. 표 3은 본 발명을 실시하는데 유용할 수 있는 RNA 의존적 RNA 중합효소의 비제한적 목록을 제공한다. 이들 중합효소 및 표적을 증폭시키기 위하여 이들을 사용하는 방법은 2005년 8월 31일 출원된 미국 특허출원 번호 11/217,972 (내용 전체가 참고문헌으로 본 명세서에 포함됨)에 기재되어 있다.
표 3
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"DNA-의존적 RNA 중합효소"는 (보통 이중 가닥) 프로모터 서열을 갖는 이중 가닥 또는 부분적-이중 가닥 DNA 분자로부터 다수 RNA 카피(copies)를 합성하는 효소이다. 본 발명은 단일 가닥의 프로모터와 함께 이들을 인식하는 RNA 중합효소를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. DNA 의존적 RNA 중합효소의 예는 대장균 및 박테리오파아지 T7, T3, 및 SP6로부터 얻은 DNA-의존적 RNA 중합효소이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 DNA 의존적 RNA 중합효소는 시중에서 입수할 수 있다.
일 구체예로서, DNA 의존적 RNA 중합효소는 열안정성이다. 열안정성 RNA 중합효소는 테르무스 테르모필루스(Thermus thermophilus)로부터 유도된 것을 예시할 수 있다.
RNA 중합효소는 천연 또는 재조합 공급원으로부터 얻을 수 있다. 천연 바이러스 RNA 중합효소는 예컨대 바이러스적으로 감염된 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 그 예는 Pfeiffer et al., Proc . Natl . Acad . Sci . (2003) 100(12): 7289-7294에 기재된 바와 같은 바이러스 역가(titer) 및 감염 방법을 이용하여 벌꿀 혈청형 1 폴리오바이러스에 의한 HeLa 세포의 감염을 포함한다. 세포성 RNA 중합효소는 Schiebel et al (1993)에 기재된 바와 같이 세포가 생장하고 또 RNA 중합효소가 수집되는 천연 RNA 중합효소를 발현하는 세포로부터 단리될 수 있다. 적합한 RNA 의존적 RNA 중합효소는 시중에서 입수할 수 있다.
F. 역전사효소
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "역전사효소 (RT)"는 본 명세서에 기재되거나 당해 분야에 공지된 방법에 의해 측정된 바와 같은 역전사 활성을 나타내는 효소를 지칭한다. 따라서 본 발명의 "역전사효소"는 레트로바이러스, 기타 바이러스, 및 세균으로부터 얻은 역전사효소 뿐만아니라 Tth DNA 중합효소, Taq DNA 중합효소, Tne DNA 중합효소, Tma DNA 중합효소 등과 같은 역전사효소 활성을 나타내는 DNA 중합효소를 포함한다. 레트로바이러스로부터 얻은 RT는 비제한적으로 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 (M-MLV) RT, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) RT, 조류 육종 백혈구증 바이러스(ASLV) RT, 라우스 육종 바이러스 (RSV) RT, 조류 골수아구증 바이러스(AMV) RT, 조류 적아구증 바이러스(AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 골수구종증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV RT, 조류 세망내피증 바이러스(REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A RT, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV RT, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV RT, 라우스 관련된 바이러스 (RAV) RT, 및 골수아구증 관련 바이러스 (MAV) RT 및 미국특허 출원 2003/0198944호(전체 내용이 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다. 예컨대 Levin, 1997, 세포, 88:5-8; Brosius et al, 1995, Virus Genes 11:163-79 참조.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "역전사효소 활성"은 주형으로서 RNA 가닥을 이용하여 DNA 가닥(즉, cDNA)를 합성하는 효소(예컨대 역전사효소 또는 DNA 중합효소)의 능력을 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. RT 활성을 측정하는 방법은 본 명세서에 제공되며 또 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 예컨대, Quan-T-RT 에세이 시스템은 애머샴(Amersham) (Arlington Heights, I11.)으로부터 입수가능하며 또 Bosworth, et al., Nature 1989, 341:167-168에 기재되어 있다.
일부 구체예로서, 역전사효소는 RNase H 활성 (예컨대 RNase H-효소)에서 감소될 수 있다. 예컨대, RNase H 활성에서 감소는 야생형 M-MLV 또는 AMV 역전사효소와 같은 야생형 또는 "RNase H+" 효소의 RNase H 활성의 20% 미만, 더욱 바람직하게는 15%, 10% 또는 5% 미만, 및 가장 바람직하게는 2% 미만이다. 어떤 효소의 RNase H 활성은 다양한 에세이 방법, 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 번호 5, 244,797호; 5,405,776호; 5,668,005호; 및 6,063, 608호; Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988) 및 Gerard, G. F., et al., FOCUS 14(5):91 (1992)에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.
본 발명에 사용할 RNase H-역전사효소는 비제한적으로 M-MLV H-역전사효소, RSV H-역전사효소, AMV H-역전사효소, RAV H-역전사효소, MAV H-역전사효소 및 HIV H-역전사효소를 포함하며, 예컨대 다음에 기재되어 있다(미국특허 번호 5,244,797호; 5,405,776호; 5,668,005호 및 6,063,608호; 및 WO 98/47912호, 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨).
본 발명에 사용할 역전사효소는 예컨대 인비트로겐 인코포레이티드 (Carlsbad, Calif.), 파마시아 (Piscataway, N.J.), 시그마 (Saint Louis, Mo.) 또는 로쉐 몰리큘라 시스템 (Pleasanton, Calif.)으로부터 상업적으로 입수가능하다. 다르게는, 역전사효소 활성을 갖는 폴리펩티드는 당업자에게 잘 공지된 천연 단백질 단리 및 정제를 위한 표준 방법에 따라 천연 바이러스 또는 세균 공급원으로부터 단리할 수 있다(예컨대 Houts, G. E., et al., J. Virol. 29:517 (1979) 참조). 또한 역전사효소는 당업자에게 익숙한 재조합 DNA 수법에 의재 제조할 수 있다(예컨대 Kotewicz, M. L., et al., Nucl. Acids Res. 16:265 (1988); Soltis, D. A. , and Skalka, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3372-3376 (1988) 참조). 상기 참고문헌의 전체 내용은 본 명세서에 포함된다.
RNase H 활성이 감소된 효소는 당해 분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대 역전사 효소 내의 RNase H 도메인을 돌연변이시키는 것에 의해, 바람직하게는 상기 기재한 바와 같이, 예컨대 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 번호 6,063,608호에 기재된 바와 같이 1 이상의 점 돌연변이, 1 이상의 결실 돌연변이 및/또는 1 이상의 삽입 돌연변이에 의해 얻을 수 있다.
III . 핵산
A. 본 발명에 유용한 핵산 서열
본 발명은 표적 핵산을 검출 또는 측정하기 위한 방법을 제공하며; 또 올리고뉴클레오티드, 본 발명에 따른 절단 구조를 형성하기 위한 프라이머 및 프로브 및 주형 핵산 서열을 증폭하기 위한 프라이머를 이용한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 검출할 프라이머, 프로브, 및 올리고머 단편을 지칭하며 또 일반적으로 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보오스 함유), 폴리리보뉴클레오티드(D-리보오스 함유)를 지칭하고 또 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 (어베이직(abasic) 부위 함유)의 N-글리코시드인 다른 유형의 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드" 사이에서 길이 구별을 의도하는 것은 아니며, 이들 용어는 상호교환적으로 이용될 것이다. 이들 용어는 분자의 기본(primary) 구조만을 지칭한다. 따라서, 이들 용어는 이중- 및 단일 가닥 DNA 뿐만 아니라 이중- 및 단일 가닥 RNA를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 핵산 서열의 보체는 1개 서열의 5' 말단이 다른 서열의 3' 말단과 쌍을 이루도록 핵산서열과 정렬될 때 "반평행 결합(antiparallel association)"인 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
올리고뉴클레오티드는 기존 또는 천연 서열로부터 반드시 물리적으로 유도될 필요는 없지만, 화학적 합성, DNA 복제, 역전사 또는 이들의 조합을 비롯한 방식으로 생성될 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 게놈 DNA 또는 RNA, cDNA의 폴리뉴클레오티드 또는 반합성, 또는 합성 기원 또는 조작으로 인하여 (1) 천연적으로 결합된 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 결합되지 않은; 및/또는 (2) 천연으로 연결된 것에 비하여 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
모노뉴클레오티드는 1개 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트가 포스포디에스테르 연결을 통하여 한 방향의 그의 이웃의 3' 산소에 부착되는 방식으로 반응하여 올리고뉴클레오티드를 만들기 때문에, 올리고뉴클레오티드의 1개 말단은 그의 5' 포스페이트가 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 3' 산소에 연결되어 있지 않은 경우 "5' 말단"이라 칭하고 또 그의 3' 산소가 모노뉴클레오티드 펜토오스 고리의 5' 포스페이트에 결합되지 않으면 "3' 말단"으로 칭한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 핵산 서열은 대형 올리고뉴클레오티드에 대하여 내부이더라도, 5' 및 3' 말단을 가질 수 있다.
2개의 상이한 비-오버래핑 올리고뉴클레오티드가 동일한 선형 상보적 핵산 서열의 상이한 영역에 어닐링되고 또 1개 올리고뉴클레오티드의 3' 말단이 다른 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로 향할 때, 전자는 "상류" 올리고뉴클레오티드라 칭하고 또 후자를 "하류" 올리고뉴클레오티드라 칭한다.
천연 핵산에 흔히 발견되지 않는 특정 염기가 본 발명의 핵산에 포함될 수 있고 또 예컨대 이노신 및 7-데아자구아닌을 포함한다. 상보성은 완전할 필요는 없다; 안정한 듀플렉스는 미스매치된 염기쌍 또는 매칭되지 않은 염기를 함유할 수 있다. 핵산 기술의 당업자는 예컨대, 올리고뉴클레오티드의 길이, 염기 조성 및 올리고뉴클레오티드의 서열, 이온 세기, 미스매칭된 염기의 발생빈도를 비롯한 다수의 변수를 고려하여 듀플렉스 안정성을 실험적으로 결정할 수 있다.
핵산 듀플렉스의 안정성은 융점, 또는 "Tm"을 측정함으로써 결정한다. 특정 조건하에서 특정 핵산 듀플렉스의 Tn는 염기 쌍의 절반이 해리되는 온도를 지칭한다.
B. 본 발명에 따라 유용한 프라이머 및 프로브
본 발명은 핵산을 검출 또는 측정하기 위한, 주형 핵산 서열을 증폭하기 위한 및 본 발명에 따른 절단 구조를 형성하기에 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 프로브를 제공한다.
용어 "프라이머"는 1 이상의 프라이머를 지칭할 수 있으며 또 천연적으로 산출되거나, 정제된 제한 분해물이거나, 또는 합성적으로 생성되거나, 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성이 촉진되는 조건하에서 위치할 때 상보적 가닥을 따라 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이러한 조건은 4개의 상이한 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA 중합효소 또는 역전사효소와 같은 중합유도제의 존재, 적합한 완충액 ("완충액"은 보조인자 또는 pH, 이온 세기 등에 영향을 주는 치환을 포함) 중, 및 적합한 온도를 포함한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭에서 최대 효율을 위한 단일 가닥이다.
본 발명에 따라 유용한 올리고뉴클레오티드 프라이머는 주형 핵산 서열에 혼성화되고 또 제2 핵산 가닥의 효소적 합성을 개시시키는 단일 가닥 DNA 또는 RNA 분자이다. 프라이머는 핵산 분자 푸울(pool)에 존재하는 표적 분자의 일부에 상보적이다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머는 합성적 방법, 예컨대 화학적 또는 효소적으로 제조된다. 다르게는, 이러한 분자 또는 그의 단편은 천연 산출성이고 또 천연 공급원으로부터 단리되거나 또는 시중 공급자로부터 구입할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 상이한 길이의 프라이머가 사용될 수 있지만, 5 내지 100 뉴클레오티드 길이, 이상적으로 17 내지 40 뉴클레오티드 길이이다. 증폭용 프라이머는 바람직하게는 약 17-25 뉴클레오티드이다. 본 발명에 따른 절단 구조 생산용 프라이머는 바람직하게는 약 17-45 뉴클레오티드이다. 본 발명에 따라 유용한 프라이머는 융점 측정 방법에 의해 특정 융점 온도(Tm)를 갖도록 설계될 수 있다. 프라이머 3 및 Oligo Calculator를 비롯한 인터넷상에서 입수할 수 있는 OligoTM, 프라이머 디자인 및 프로그램을 비롯한 시판되는 프로그램을 이용하여 본 발명에 따라 유용한 핵산 서열의 Tm을 산출할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 증폭 프라이머의 Tm은, 예컨대 Oligo Calculator에 의해 산출된 바와 같이, 바람직하게는 약 45 내지 65℃ 및 더욱 바람직하게는 약 50 내지 60℃ 이다. 바람직하게는, 본 발명에 따라 유용한 프로브의 Tm은 상응하는 증폭 프라이머의 Tm 보다 70℃ 더 높다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 라벨링될 수 있고 또 라벨링된 절단 구조를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 단일 가닥 DNA 프라이머의 쌍, DNA 프라이머 및 프로브 또는 프로브는 표적 핵산 내의 서열에 어닐링될 수 있다. 특정 구체예에서, 프라이머는 표적 핵산의 DNA 합성의 증폭을 개시하기 위해 사용될 수 있다.
전형적으로, 2개의 핵산 서열이 실질적으로 상보적일 때 (적어도 14 내지 25 뉴클레오티드 스트레치에 대하여 약 65% 상보적, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 상보적) 선택적 혼성화가 생긴다. 참조: Kanehisa, M., 1984, Nucleic Acid Res. 12: 203, 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨. 그 결과, 프라이밍 부위에서 어느 정도의 미스매치는 허용되는 것으로 예상된다. 이러한 미스매치는 모노-, 디- 또는 트리뉴클레오티드와 같이 소형일 수 있다. 다르게는, 미스매치 영역은 연속된 시리즈의 4 이상의 뉴클레오티드에서 미스매치가 존재하는 영역으로서 정의되는 루프를 포함할 수 있다.
다양한 인자들이 프라이머가 제2 핵산 분자에 혼성화되는 효율 및 선택성에 영향을 준다. 프라이머 길이, 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, 혼성화 온도, 완충액 조성 및 프라이머가 혼성화되는데 필요한 영역에서 입체장애에 대한 가능성을 비롯한 이들 인자는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 프라이머를 설계할 때 고려될 수 있다.
프라이머 길이와 프라이머가 표적 서열에 어닐링되는 효율 및 정확성 사이에는 포지티브한 상관관계가 존재한다. 특히 더 긴 서열은 짧은 서열에 비하여 더 높은 융점(Tm)을 가지고, 또 주어진 표적 서열 내에서 덜 반복되므로, 불규칙한 혼성화를 최소화한다. 높은 G-C 함량을 갖거나 또는 팔린드롬(palindromic) 서열을 갖는 프라이머 서열은 목적하는 표적 부위가 그런 것 처럼 자가 혼성화되는 경향이 있는데, 이는 이분자에 비하여 단분자 혼성화 역학이 용액에서 일반적으로 더 선호되기 때문이다. 그러나, 충분한 수의 G-C 뉴클레오티드를 함유하는 프라이머를 설계하는 것이 중요한데, 이는 A 및 T 염기쌍이 표적 서열에 결합될 때 발견되는 2개보다 3개 수소 결합에 의해 각 G-C 쌍이 결합되므로 더 단단하고, 더 강한 결합을 형성하기 때문이다. 혼성화 온도는 반응 또는 혼성화 혼합물을 프라이밍할 때 포함될 수 있는 유기 용매, 예컨대 포름아미드의 농도와 마찬가지로 프라이머 어닐링 효율에 역으로 변화되는 반면에, 염 농도의 증가는 결합을 증진시킨다. 스트린젠트 어닐링 조건하에서, 더 긴 혼성화 프로브, 또는 합성 프라이머는, 더욱 허용적인 조건하에서 충분한 더 짧은 것에 비하여, 더욱 효율적으로 혼성화된다. 바람직하게는, 스트린젠트 혼성화는 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브 (예컨대 95℃)에 혼성화되게 하는 조건하의, 적합한 완충액 (예컨대, IX Sentinel 분자 비이콘 PCR 코어 완충액, Stratagene 카탈로그 #600500; IX Pfu 완충액, Stratagene 카탈로그 #200536; 또는 IX 클로닝된 Pfu 완충액, Stratagene 카탈로그 #200532)에서 실시된다. 스트린젠트 혼성화 조건은 다양할 수 있으며 (예컨대 약 1M 미만, 더욱 흔히 약 500 mM 미만 및 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염 농도) 또 혼성화 온도는 올리고뉴클레오티드 프라이머 및/또는 프로브의 길이 및/또는 핵산 조성에 따라서 다양한 범위일 수 있다 (예컨대, 0℃ 내지 22℃, 약 30℃ 이상, 및 (가장 흔히) 37℃ 초과). 더 긴 단편은 특정 혼성화에 대하여 더 높은 혼성화 온도를 필요로 할 수 있다. 일부 인자는 혼성화의 엄격성에 영향을 줄 수 있으므로, 변수의 조합이 단일 인자의 절대적 정도에 비하여 더 중요하다.
올리고뉴클레오티드 프라이머는 상기한 것들을 토대로 하여 이하의 방법에 따라 합성할 수 있다.
1. 올리고뉴클레오티드 프라이머 디자인 전략
시퀀싱(서열결정) 또는 PCR용의 특정 올리고뉴클레오티드 프라이머의 디자인은 표적 서열을 인식할 수 있는 서열을 선택하는 것을 포함하지만, 최소의 예상된 2차 구조를 갖는다. 올리고뉴클레오티드 서열은 표적 핵산 중의 단일 부위에만 결합되거나 결합되지 않을 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드의 Tm은 올리고뉴클레오티드의 길이 및 GC 함량의 분석에 의해 최적화된다. 또한 게놈 DNA의 증폭에 유용한 PCR 프라이머를 디자인할 때, 선택된 프라이머 서열은 GenBank 데이터베이스 (또는 기타 이용가능한 데이터베이스) 중의 서열에 현저한 매칭을 나타내지 않는다.
본 발명에 따라 유용한 프라이머의 디자인은 상술한 몇몇의 변수의 평가 및 프라이머 서열의 최적화에 도움을 주도록 개발된 용이하게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 촉진된다. 이러한 프로그램의 예는 DNAStarT소프트웨어 팩키지의 "PrimerSelect"(DNAStar, Inc.; Madison, WI), OLIGO 4.0 (National Biosciences, Inc.), PRIMER, Oligonucleotide Selection Program, PGEN and Amplify (Ausubel et al., 1995에 기재됨, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons)이다. 일 구체예로서, 프라이머는 추가의 증폭을 위한 표적으로서 작용하는 말단에 공지된 서열을 갖는 PCR 산물을 생성하는 다른 프라이머에 대한 표적으로 작용하는 서열을 갖도록 디자인된다(PCR 산물을 시퀀싱하기 위해). 공통된 "테일" 서열을 갖는 특정 프라이머를 사용하여 다수의 상이한 표적 핵산이 증폭되면, 이들 뚜렷한 유전자로부터의 PCR 산물은 단일 세트의 프라이머를 사용하여 시퀀싱될 수 있다. 다르게는, 증폭된 서열의 클로닝을 용이하게 하기 위하여, 프라이머는 이들의 5' 말단에 부착된 제한 효소 부위 서열을 갖도록 디자인된다. 따라서, 프라이머의 모든 뉴클레오티드는, 제한효소 부위를 형성하는데 필요한 몇 개의 뉴클레오티드를 제외하고는, 표적 핵산 또는 표적핵산에 인접한 서열로부터 유도된다. 이러한 효소 및 부위는 당해 분야에 공지되어 있다. 표적 핵산의 게놈 서열 및 표적 핵산의 오픈 리딩 프레임의 서열이 공지되면, 특정 프라이머의 디자인은 당해 기술 분야 내에 속한다.
본 명세서에 정의된 바와 같이 고상 지지체에 결합될 수 있고 또 결합 부위 또는 태그에 결합되도록 특정 화학적 및/또는 포획 부위, (본 명세서에 기재된 바와 같은 포획 요소 포함)를 갖는 올리고뉴클레오티드가 합성될 수 있는 것은 당업자에게 공지되어 있다. 적합한 포획 요소는 비제한적으로 핵산 결합 단백질 또는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 적합한 포획 요소는 비제한적으로 비오틴, 합텐, 단백질, 또는 화학적 반응성 부위를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 용액 중에 먼저 사용된 다음 고상 지지체 상에 포획되거나, 또는 고상 지지체 상에 먼저 부착된 다음 검출 반응에 사용된다. 후자의 예는 하류 프로브 분자를 고상 지지체에 커플링시켜 하류 프로브 분자의 5' 말단이 형광 켄처를 포함하도록 하는 것이다. 동일 하류 프로브 분자는 FEN 뉴클레아제 절단이 형광단으로부터 켄처를 물리적으로 분리하도록 하는 위치에 형광단을 포함할 것이다. 예컨대, 표적 핵산은 고상 하류 프로브 올리고뉴클레오티드와 혼성화할 수 있었고, 또 액상 상류 프라이머는 표적 분자와 혼성화될 수 있어서, FEN 절단 반응은 고상 지지체 상에서 생겨서 복합체로부터 5' 켄처를 방출하게된다. 이는 고상 지지체-결합된 형광단이 검출되게 하므로, 적합하게 라벨링된 또는 확인된 고상 지지체에서 절단의 존재를 밝혀준다. 상이한 하류 프로브 분자는 어레이 상의 상이한 위치에 결합될 수 있었다. 어레이 상의 위치는 프로브 분자를 확인시켜 줄 것이므로 프로브 분자가 혼성화될 수 있는 주형의 존재를 나타낸다.
2. 합성
프라이머 자체는 당해 분야에 잘 공지된 수법을 이용하여 합성한다. 특정 서열의 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고, 또 예컨대 적절한 서열의 클로닝 및 제한 분해물 분석 및 직접적 화학적 합성을 포함한다. 일단 설계되면, 올리고뉴클레오티드는 예컨대, Narang et al., 1979, Methods in Enzymology, 68:90에 의해 기재된 포스포트리에스테르 방법, Brown et al., 1979, Methods in Enzymology, 68:109 에 의해 기재된 포스포디에스테르 방법, Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Letters, 22: 1859 에 기재된 디에틸포스포르아미데이트 방법, 및 미국 특허번호 4,458,066호에 기재된 고상 지지체 방법을 포함한 적합한 화학적 합성 방법에 의해 또는 시판되는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성기(시판됨) 또는 VLSIPSTMTM 기술을 이용하는 다른 화학적 방법에 의해 제조된다.
C. 프로브
본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 절단 구조 또는 라벨링된 절단 구조를 형성하기에 유용한 프로브를 제공한다. 본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조의 제조 방법은 이하의 표제 "절단구조" 부분에 제공되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "프로브"는 프로브 중의 적어도 1개의 서열과 표적 영역 중의 서열의 상보성으로 인하여 표적 핵산 중의 서열과 듀플렉스 구조를 형성하는 프로브를 지칭한다. 일부 구체예로서, 프로브는 2차 구조를 갖는다. 본 발명에 따른 프로브는 또한 라벨링될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 프라이머 연장에 사용된 서열(들)에 상보적인 서열을 함유하지 않는다. 일반적으로 프로브의 3' 말단은 블로킹되어서 프로브가 프라이머 연장 생성물에 들어가는 것을 방지할 것이다. 본 발명에 따른 프로브의 라벨링 방법은 및 적합한 라벨은 표제 "절단 구조" 부분에 이하에 기재되어 있다.
본 발명에 따른 프로브의 일반적 디자인은 표제 "본 발명에 따라 유용한 프라이머 및 프로브" 부분에 기재되어 있다. 전형적으로, 본 발명에 따른 프로브는 약 7-140 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 약 10-140 뉴클레오티드 길이인 표적 핵산 결합 서열 (C, 도 4)을 포함한다. 일 구체예로서, 본 발명에 따른 프로브는 상보적이고 또 서로 결합하여 표적 핵산의 부재하에서 2차 구조의 영역을 형성하는 상기 정의한 바와 같은(b 및 b', 도 4) 2개의 상보적 핵산 서열 영역을 포함한다. 영역 b 및 b'는 3-25 뉴클레오티드, 바람직하게는 4-15 뉴클레오티드 및 더욱 바람직하게는 5-11 뉴클레오티드 길이이다. 실제 길이는 프로브의 2차 구조가 프로브가 절단 구조의 절단이 실시되는 온도에서 표적 핵산에 결합되지 않을 때 안정하다.
일부 구체예로서, 본 발명에 따른 프로브는 본 명세서에 정의된 바와 같은 2차 구조 (스템 루프, 헤어핀, 내부 루프, 벌지 루프, 분기 구조 및 슈도노트 포함), 또는 다수의 2차 구조, 클로버잎 형 구조 또는 상기 정의한 바와 같은 3차원 구조를 형성할 수 있다.
예컨대, 본 발명에 따르면, 프로브는 헤어핀 또는 스템 루프와 같은 2차 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드일 수 있지만, 비제한적으로 분자 비이콘, 안전 핀, 스코르피온 및 썬라이즈/암플리플루오르 프로브일 수 있다.
분자 비이콘 프로브는 비이콘 프로브가 표적 핵산에 혼성화되지 않을 때 검출가능한 신호의 생성을 중지시키도록 효과적으로 배치된 라벨링된 부위(예컨대 형광단 및 켄처)를 생성하는 내부 활성 신호 쌍을 보유하는 헤어핀 또는 스템 루프 구조를 포함한다. 루프는 표적 핵산에 상보적인 영역을 포함한다. 루프는 핵산 표적 서열에 상보적인 프로브의 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호반응하는 5' 및 3' 영역("아암")을 측면에 접한다. 다르게는, 루프는 핵산 표적 서열에 상보적인 프로브의 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 2차 구조를 형성하는 친화성 쌍의 부착 멤버에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 5' 및 3' 영역("아암")과 측면을 접한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "아암"은 a) 핵산 표적 서열에 상보적인 프로브의 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 분자 비이콘의 영역 또는 b) 핵산 표적 서열에 상보적인 프로브의 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 2차 구조를 형성하는 친화성 쌍의 부착 멤버에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 프로브의 영역을 지칭한다. 분자 비이콘 프로브가 표적에 혼성화되지 않으면, 아암은 서로 혼성화되어 스템 하이브리드를 형성하며, 이것은 때때로 "스템 듀플렉스"라 칭한다. 이것은 밀폐된 형태(closed conformation)이다. 분자 비이콘 프로브가 표적에 혼성화되면, 프로브의 "아암"은 분리된다. 이것은 개방된 형태(open conformation)이다. 개방 형태에서, 아암은 표적에 혼성화될 수 있다. 이러한 프로브는 용액에서 자유일 수 있거나, 또는 이들은 고상 표면에 구속될 수 있다. 아암이 혼성화되면 (예컨대 스템을 형성하면) 켄처는 형광단에 아주 가깝고 또 그의 형광을 효과적으로 중지하거나 또는 억제하여 프로브를 어둡게 만든다. 이러한 프로브는 미국 특허번호 5,925,517 및 미국 특허번호 6,037,130호에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 분자 비이콘 프로브는 본 명세서에 기재된 바와 같은 "대립유전자-구별" 프로브일 수 있다.
분자 비이콘 프로브는 1개 아암에 부착된 형광단 및 다른 아암에 부착된 켄처를 포함한다. 형광단 및 켄처, 예컨대, 테트라메틸로다민 및 DABCYL은 FRET 쌍일 필요는 없다.
본 발명에 유용한 스템 루프 프로브의 경우, 표적에 상보적인 프로브 서열의 길이, 핵산 표적 서열에 상보적인 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 프로브(예컨대 스템 하이브리드)의 영역의 길이, 및 상기 2개의 상관관계는 프로브가 이용되는 에세이 조건에 따라 설계된다. 특정 에세이 조건에 대한 표적-상보적 서열 및 스템 하이브리드 서열의 길이는 당해 분야에 공지된 것으로부터 산출될 수 있다. 핵산 표적 서열에 상보적인 프로브의 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 상호 가역적으로 상호작용하는 프로브의 영역은 6 내지 100, 바람직하게는 8 내지 50 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 8 내지 25 뉴클레오티드 범위이다. 표적에 상보적인 프로브 서열의 길이는 바람직하게는 17-40 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 17-30 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 17-25 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명에 따른 분자 비이콘 프로브의 올리고뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, cDNA 또는 그의 조합일 수 있다. 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 니트로피롤-계 뉴클레오티드 또는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드가 포함될 수 있다. 변형된 결합, 예컨대 포스포로티오에이트가 포함될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드 및 변형된 결합은 본 발명에 따른 파장-이동 프라이머에 포함될 수 있다.
본 발명에 이용되는 안전 핀 프로브는 헤어핀 구조를 포함하고, 헤어핀의 5' 아암에 형광단(FAM)을 갖고 또 3' 아암에 켄처(Dabcyl)를 포함하는 "유니버셜" 헤어핀 프로브 1(도 9, b171 서열번호: 31), 및 2개 도메인을 포함하는 스템 루프를 포함하고, 프로브 2의 5' 2/3 (서열번호: 34)는 헤어핀 프로브 1에 상보적인 (유니버셜) 서열, 및 DNA 중합효소를 중지시키는 뉴클레오티드 및 표적 특이적 프라이머로 작용하는 프로브 2의 3' 1/3 을 갖는 프로브 2(도 9, SP170a 서열번호: 32)를 필요로 한다. 역방향(reverse) 프라이머로부터 프라임된 중합효소 (즉 프로브 2의 3' 1/3)가 상부 가닥(서열번호: 33)을 합성함에 따라서, 프로브 2의 5' 말단은 "중지 뉴클레오티드"가 도달할 때까지 5' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 치환되고 분해될 것이다. 이때 프로브 2의 나머지 부분은 개방되거나 또는 펼쳐져서 헤어핀 프로브 1(서열 번호: 31)에 대한 표적으로 작용함으로써 켄처로부터 형광단을 분리한다(도 9).
본 발명에 사용되는 스코피온 프로브는 형광단/켄처 쌍을 보유하는 헤어핀 구조를 포함하는 5' 연장된 프로브 테일을 갖는 3' 프라이머를 포함한다. 프로브 테일은 중합효소가 프로브를 복제하는 것을 차단하는 헥사에틸렌 글리콜(HEG)을 혼입시키는 것에 의해 5' →3' 방향으로의 복제로부터 보호된다. 첫 라운드의 증폭 동안, 3' 표적 특이적 프라이머는 표적에 어닐링되고 또 5' 프로브에 대하여 새롭게 합성된 표적 영역을 보유하는 새로이 합성된 가닥에 스코피온이 혼입되도록 연장된다. 다음 라운드의 변성 및 어닐링 동안, 스코피온 헤어핀 루프의 프로브 영역은 표적에 혼성화되어 형광단 및 켄처를 분리하고 또 측정가능한 신호를 생성할 것이다. 이러한 프로브는 Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17: 804-807 (1999) 및 도 10에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 부가적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 썬라이즈/암플리플루오르 프로브이다. 썬라이즈/암플리플루오르 프로브는 헤어핀 프로브 영역의 5'→3' 복제를 차단하는 HEG 모노머를 갖지 않는 것을 제외하고는 스코피온 프로브와 유사한 구조이다. 따라서, 첫 라운드의 증폭에서, 썬라이즈/암플리플루오르의 3' 표적 특이적 프라이머는 표적에 어닐링되고 또 연장되어, 새로이 합성된 가닥(썬라이즈 가닥)에 헤어핀 프로브를 혼입시킨다. 두번째 라운드의 증폭 동안, 두번째 비-라벨링된 프라이머는 썬라이즈 가닥의 3' 말단에 어닐링된다 (도 11의 주기 2). 그러나, 중합효소가 헤어핀의 5' 말단에 도달함에 따라서, HEG 중지 서열의 결핍으로 인하여, 중합효소는 헤어핀을 치환 및 복제하므로, 형광단 및 켄처를 분리하며 또 선형화된 헤어핀 프로브는 새로운 가닥에 혼입된다. 이러한 유형의 프로브는 Nazarneko et al., Nucleic Acid Res . 25: 2516-2521 (1997) 및 도 11에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 안전 핀, 스코피온 및 썬라이즈/암플리플루오르 프로브의 경우, 표적에 상보적인 프로브 서열의 길이, 핵산 표적 서열에 상보적인 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 프로브(예컨대 스템 하이브리드)의 영역의 길이 및 상기 2개의 관계는 이용할 프로브에 대한 에세이 조건에 따라서 설계한다. 특정 에세이 조건에 대한 표적-상보적 서열 및 스템 하이브리드 서열의 길이는 당해 분야에 공지된 것에 따라 추정될 수 있다. 핵산 표적 서열에 상보적인 영역이 표적 핵산에 결합되지 않을 때 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 프로브의 영역은 6 내지 100, 바람직하게는 8 내지 50 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 8 내지 25 뉴클레오티드 범위이다. 표적에 상보적인 프로브 서열의 길이는 바람직하게는 17-40 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 17-30 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 17-25 뉴클레오티드 길이이다. 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 영역 사이의 상호작용의 안정성은 적합한 작용을 달성하기 위한 통상적인 실험에 의해 측정한다. 길이 이외에, 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 영역 사이의 상호작용의 안정성은 G-C 함량을 달리하고 또 불안정화 미스매치를 삽입하는 것에 의해 조절될 수 있다. 상보적 핵산 서열에 의해 서로 가역적으로 상호작용하는 프로브의 영역의 하나는 표적에 대하여 부분적으로 또는 완전히 상보적으로 설계될 수 있다. 3' 아암이 표적에 상보적이면, 프로브는 DNA 중합효소에 대한 프라이머로서 작용할 수 있다. 또한 파장-이동성 분자 비이콘 프로브는 고정화에 의해 또는 자유-유동에 의해 고체 표면에 고정화될 수 있다.
일 구체예로서, 프로브는 본 발명에 따른 절단 내성 프로브이다. 절단 내성 프로브는 비-오버래핑 절단 구조 (비침습적)가 형성될 때 절단제에 의해 절단될 수 있지만, 오버래핑 구조 (침습적)가 형성될 때에는 절단될 수 없는 절단 구조를 형성한다. 이러한 절단 내성은 본 발명에 따른 1 이상의 변형을 오버래핑 구조에 의해 표적화된 프로브 영역의 일부에 혼입시키는 것에 의해 달성된다.
일 구체예로서, 프로브는 위치 +1의 상류(예컨대 비-오버래핑 절단 구조에 의해 표적화된 부분)를 절단하기 쉽고 또 위치 +1 하류 (예컨대 오버래핑 구조에 의해 표적화된 부분)을 절단에는 내성이다 (도 13 참조). 표적에 상보적이어서 혼성화되는 프로브의 뉴클레오티드는 위치 +X를 통하여 위치 +1로 정의된다. 위치 +1은 하류 프로브의 혼성화된 영역의 5' 말단 뉴클레오티드로 정의되고, 영역 +2는 위치 +1의 바로 하류인 뉴클레오티드 등으로 정의된다(도 13).
본 발명에 따라 유용한 절단 내성 프로브는 위치 +1 하류에서부터 3' 말단 또는 위치 +1 하류에서부터 프로브의 비-변형된 하류 부분의 첫 뉴클레오티드까지 변형되어야 한다(도 13의 C). 프로브의 비-변형 부분은, 프라이머가 전체 변형 부분을 통하여 연장되면 표적으로부터 해리되도록, 프라이머 연장/절단 반응의 온도보다 낮은 Tm을 가져야한다(도 15C 참조).
절단 내성 변형은, 비변형되고 또 표적에 상보적인 프로브의 영역이 중합효소 연장 반응이 실시되는 온도보다 낮은 융점(Tm)을 갖는 한, 프로브의 전체 상보적 부분을 통하여 존재할 필요가 없다 (예컨대 위치 +1 내지 3' 말단)(도 15C). 따라서, 프로브가 프로브의 전체 변형된 부분(절단 내성 부분)이 표적으로부터 치환되도록 설계되면(예컨대 상류 프라이머의 연장시 오버래핑 구조 형성), 프로브는 더 이상 표적과 듀플렉스를 형성하지 않는다(도 15C 참조). 전형적인 프라이머 연장 반응 조건은 다음과 같다: 적절한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액, Stratagene, 카탈로그# 200536), dNTP, 및 배양 온도 60-72℃. 이들 고려 사항은 프로브가 오버래핑 또는 침습적 절단 구조에 의해 절단되지 않게 한다.
예컨대, 23 뉴클레오티드 프로브는 20 뉴클레오티드 표적 상보적 영역 (뉴클레오티드 위치 +1 내지 +20) 및 3 뉴클레오티드 5' 플랩 (뉴클레오티드 위치 -1 내지 -3)를 가질 수 있다 (도 13 참조). 비-변형된 뉴클레오티드 16-20은 이들 뉴클레오티드의 표적화가 프로브의 상보적 부분을 통한 프라이머 연장 및 올리고뉴클레오티드 1-15의 치환을 필요로 할 것이기 때문에 절단에 대해 표적화될 수 없다. 나머지 상보적 뉴클레오티드 (+16 - +20)는 프로브의 절단없이 표적과 안정한 듀플렉스를 형성하지 않을 것이다 (도 15C).
그러나, 프로브는 오직 비-오버래핑 절단 구조의 형성시 절단제에 의해 절단될 수 있고, 예컨대 위치 +1의 상류에서 절단된다 (도 15A).
상보적 비-변형된 영역의 Tm을 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 본 명세서에 기재되어 있다. 유사하게, 침습적 절단을 방지하기 위하여 변형될 필요가 있는 프로브 상의 위치 +1의 하류 뉴클레오티드의 수를 측정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 본 명세서에 기재되어 있다.
간단히 말해, FRET 에세이 또는 형광 켄칭 에세이를 이용하는 프로브 안정성 에세이를 실시함으로써 변형될 필요가 없는 표적 상보적 뉴클레오티드의 최대 수를 측정할 수 있다. (프로브 안정성 에세이에 대한 부가적 상세한 내용에 대해서는 표제 "Determining the Stability of the Secondary Structure of 프로브" 부분 참조). 본 명세서에 사용된 바와 같이, 형광 켄칭 에세이는 FRET 에세이를 포함할 수 있다. 프로브의 비-변형 부분은 표적을 갖는 반응에 부가된다. 이 반응은 프라이머 연장 반응에 이용된 뉴클레아제/중합효소에 대해 가능하고 우선적으로 최적인 완충액 내이어야 한다. 프로브는 상호작용성 라벨의 적합한 쌍의 제1 멤버에 의해 라벨링되고 또 표적은 예컨대 2 뉴클레오티드 거리에 걸쳐 상호작용할 수 있는 쌍의 제2 멤버 또는 비-FRET-쌍 (예컨대 테트라메틸로다민 및 DABCYL)의 제2 멤버에 의해 라벨링된다. 예컨대, 본 발명에 따른 프로브의 비-변형 부분은 형광단에 의해 라벨링될 수 있고 또 표적은 켄처에 의해 라벨링되며 또 상이한 온도(예컨대 프라이머 연장 반응의 온도)에서 형광을 측정한다. 최대 형광은 라벨이 상호작용하지 않을 때 생성되며 또 프로브의 비-변형 부분 및 표적은 해리된다. 프로브의 비-변형 부분이 연장 온도에서 표적으로부터 해리되면, 비-변형 부분의 크기는 감소되어야 한다.
이 에세이는 Mx3005P QPCR 시스템 (Stratagene)과 같은 실시간 써모사이클링 장치로 실시될 수 있다.
일 구체예로서, 변형은 티오포스페이트 또는 2'-O-메톡시이다. 이러한 변형은 당해 분야에 공지되어 있다. 티오포스페이트 및/또는 2'-O-메톡시 변형을 갖는 올리고뉴클레오티드는 Biosearch Technologies, Inc. (Novato, CA)로부터 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 프로브 및 프라이머에는 다양한 형광단이 사용될 수 있다. 유용한 형광단은 쿠마린, 플루오레세인, 테트라클로로플루오레세인, 헥사클로로플루오레세인, 루시퍼 옐로우, 로다민, BODIPY, 테트라메틸로다민, Cy3, Cy5, Cy7, 에오신, 텍사스 레드 및 ROX를 포함한다. 예컨대, Lee et al.(1997)에 의해, Nucleic Acid Research 25:2816에 기재된 플루오레세인-로다민 이합체와 같은 조합 형광단이 적합하다. 형광단은 자외선 또는 적외선과 같은 가시 스펙트럼 또는 가시 스페트럼 밖을 흡수하고 방출하도록 선택될 수 있다.
당해 분야에 기재된 적합한 켄처는 특히 DABCYL 및 그의 변이체, 예컨대 DABSYL, DABMI 및 메틸 레드이다. 형광단은 켄처로서도 사용될 수 있는데, 이들은 특정의 다른 형광단과 접촉할 때 형광을 중지시키는 경향이 있기 때문이다. 바람직한 켄처는 DABCYL 또는 말라카이트 그린과 같은 발색단, 프로브가 개방 형태일 때 검출 범위에서 형광을 방출하지 않는 형광단이다.
D. 핵산의 생산
본 발명은 표적 핵산을 증폭하고 또 절단 구조를 형성하기 위한 검출 및 또는 측정될 핵산을 제공한다.
본 발명은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태, 및 혼합된 중합체를 포함하는 핵산을 이용한다. 본 발명은 핵산의 센스 및 안티센스 가닥을 포함한다. 본 발명에 따르면, 핵산은 화학적으로 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나 또는 비-천연 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은 예컨대, 라벨, 메틸화, 천연 산출 뉴클레오티드의 1 이상이 유사체에 의해 치환, 미하전 결합(예컨대 메틸 포스포네이트, 포스포로디티오에이트 등)과 같은 뉴클레오티드 간 변형, 펜던트 부위(예컨대 폴리펩티드), 인터칼레이터 (예컨대 아크리딘, 프소랄렌 등) 킬레이터, 알킬화제 및 변형된 결합 (예컨대 알파 아노메릭 핵산 등)을 포함한다. 설계된 서열에 수소 결합 또는 기타 화학적 상호작용을 통하여 결합하는 능력에서 폴리펩티드와 유사한 합성 분자도 또한 포함된다. 이러한 분자는 당해 분야에 공지되어 있고 또 펩티드 결합이 분자 주쇄 중의 포스페이트 결합을 치환하는 것을 포함한다.
1. DNA를 포함하는 핵산
a. 클로닝
DNA를 포함하는 핵산은 당해 분야에 공지된 클로닝 방법에 의해 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 분리될 수 있다(Ausubel et al., 상기 참조). 간단히 말해, 특정 핵산 서열을 포함하는 DNA 클론의 분리는 재조합 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하고 또 소망하는 서열을 함유하는 클론을 확인하는 것을 포함한다. 클로닝은 다음 단계를 포함할 것이다. 특정 라이브러리의 클론을 플레이트에 뿌리고, 스크리닝을 위한 적합한 기질로 옮기고, 변성시키며 또 특정 핵산의 존재에 대해 프로브처리한다. 혼성화 조건 및 라벨링된 프로브의 생성 방법은 이하에 포함된다.
소망하는 클론은 바람직하게는 핵산 프로브에 혼성화되는 것에 의해 또는 항체에 의해 검출될 수 있는 단백질의 발현에 의해 확인된다. 다르게는, 소망하는 클론은 이하에 기재된 방법에 따른 특정 프라이머 세트에 의해 정의된 서열의 중합효소 사슬 증폭에 의해 확인한다.
적절한 라이브러리의 선택은 소망하는 서열의 풍족한 공급원인 조직 또는 세포주를 확인하는 것을 포함한다. 또한, 목적하는 핵산이 조절 서열 또는 인트론 서열을 함유하면, 게놈 라이브러리를 스크리닝한다 (Ausubel et al., 상기 참조).
b. 게놈 DNA
본 발명의 핵산 서열은 게놈 DNA로부터 증폭한다. 게놈 DNA는 이하의 방법에 따라 조직 또는 세포로부터 분리한다.
특정 조직으로부터 유전자의 변이 형태 검출을 용이하게 하기 위하여, 주변 정상 조직으로부터 조직을 분리한다. 포유동물 조직으로부터 게놈 DNA를 분리하기 위하여, 조직을 잘게 부수고 액체 질소에서 냉동시킨다. 냉동 조직을 미리 냉각된 유발과 유봉을 이용하여 미분말로 분쇄하고, 또 분해 완충액 (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 25 mM EDTA, pH 8.0, 0.5% (w/v) SDS, 0.1 mg/ml 단백질분해효소(proteinase) K)에 조직 100 mg당 1.2 ml 분해 완충액으로 현탁시킨다. 포유 동물 조직 배양 세포로부터 게놈 DNA를 분리하기 위하여, 500 x g에서 5분간 원심분리하는 것에 의해 세포를 펠릿화하고, 1-10 ml 빙냉 PBS에 재현탁시킨 다음 500 x g에서 5분간 재펠릿화시키고 또 1 부피의 분해 완충액에 재현탁시킨다.
분해 완충액 중의 샘플은 50℃에서 12-18시간 동안 배양(진탕하면서)한 다음 동 부피의 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올에 의해 추출한다. 원심분리 단계(1700 x g에서 10분) 이후에 상들이 분리되지 않으면, 다른 부피의 분해 완충액 (단백질분해효소(proteinase) K 없음)을 부가하고 원심분리 단계를 반복한다. 2개 상의 계면에서 뻑뻑한 백색 물질이 분명하면, 유기 추출 단계를 반복한다. 추출 이후 상부의 수성 층을 새로운 튜브로 옮기고, 여기에 1/2 부피의 7.5M 아세트산 암모늄 및 2 부피의 100% 에탄올을 부가한다. 1700 x g에서 2분간 원심분리함으로써 핵산을 펠릿화하고, 70% 에탄올로 세척한 다음 공기 건조시키고 또 TE 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, pH 8.0)에 lmg/ml로 재현탁시킨다. 잔류 RNA는 0.1% SDS 및 l㎍/ml DNase-유리 RNase의 존재하에서 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양하는 것에 의해 제거하며, 또 상기 추출 및 에탄올 석출 단계를 반복한다. 본 발명에 따른 게놈 DNA의 수율은 약 2 mg DNA/1 g 세포 또는 조직일 것으로 예상된다 (Ausubel et al., 상기 참조). 본 발명에 따라 분리된 게놈 DNA는 본 발명에 따라 PCR 분석에 사용될 수 있다.
c. 제한 분해 (cDNA 또는 게놈 DNA의)
소망하는 cDNA 또는 특정 표적 핵산을 함유하는 게놈 클론의 확인에 이어, 본 발명의 핵산은 제한효소를 이용한 분해에 의해 이들 클론으로부터 분리될 수 있다.
제한효소 분해 수법은 당업자에게 공지되어 있다 (Ausubel et al., 상기 참조). 제한효소 분해에 유용한 시약은 Stratagene을 비롯한 시판업자 뿐만 아니라 다른 공급자로부터 용이하게 얻을 수 있다.
d. PCR
본 발명의 핵산은 중합효소 연쇄반응 (PCR)에 의해 게놈 DNA 또는 기타 천연 공급원으로부터 증폭될 수 있다. PCR 법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
PCR은 열안정성, DNA-의존적 DNA 중합효소에 의해 촉진된 DNA 복제의 다수 주기를 이용하는 것에 의해 목적하는 표적 서열을 증폭시키기 위한 특정 DNA 서열을 용이하게 증폭하는 방법을 제공한다. PCR은 증폭할 표적 핵산의 존재, 증폭될 서열 측면에 2개의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프라이머, DNA 중합효소, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 완충액 및 염을 필요로 한다.
PCR은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Mullis and Faloona, 1987, Methods Enzymol., 155: 335에 기재된 바와 같이 실시한다.
중합효소 연쇄반응 (PCR) 수법은 미국 특허번호 4,683,202호, 4,683,195호 및 4,800,159호에 기재되어 있다. 가장 간단한 형태로서, PCR은 표적 DNA 중의 목적하는 영역의 대향 가닥에 혼성화되고 또 그와 측면을 접하는 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 특정 DNA 서열을 효소적으로 합성하기 위한 시험관내 방법이다. 주형 변성, 프라이머 어닐링 및 어닐링된 프라이머의 DNA 중합효소에 의한 연장을 비롯한 일련의 반복되는 반응은 특정 단편의 기하급수적인 축적을 초래하며, 그의 말단은 프라이머의 5' 말단에 의해 정의된다. PCR은 특정 DNA 서열을 109배로 선택적으로 배가시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다. PCR 법은 Saiki et al., 1985. Science 230:1350에 기재되어 있다.
PCR은 주형 DNA (적어도 lfg; 더욱 유용하게는, 1-1000 ng) 및 적어도 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 실시한다. 전형적인 반응 혼합물은 다음을 포함한다: 2㎕의 DNA, 25 pmol의 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2.5㎕의 적합한 완충액, 0.4㎕의 1.25μM dNTP, 2.5 유닛의 Taq DNA 중합효소 (Stratagene) 및 탈이온화된 물을 전체 부피 25 ㎕로 포함. 미네랄 오일을 위에 놓고 또 프로그램가능한 열적 사이클러를 이용하여 PCR을 실시한다.
PCR 주기의 각 단계의 길이 및 온도 뿐만 아니라 주기의 회수는 실제의 스트린젠시 요건에 따라 조절된다. 어닐링 온도 및 타이밍은 프라이머가 주형에 어닐링될 것으로 예상되는 효율 및 용인되는 미스매치의 정도에 의해 결정된다. 프라이머 어닐링 조건의 스트린젠시를 최적화하기 위한 능력은 당업자의 통상의 지식이다. 30℃ 내지 72℃의 어닐링 온도가 이용된다. 주형 분자의 초기 변성은 통상 92℃내지 99℃에서 4분간 실시한 다음 변성 (94-99℃에서 15 초 내지 1분), 어닐링 (상기 논의된 바와 같이 측정된 온도; 1-2분) 및 연장 (72℃에서 1분간)으로 구성된 20-40 주기를 실시한다. 최종 연장 단계는 일반적으로 72℃에서 4분간 실시하며 이어 4℃에서 불명확한 (0-24시간) 단계를 실시한다.
표준 PCR 수법에 일반적으로 적용된 검출 방법은 혼성화 에세이에서 증폭된 DNA에 의해 라벨링된 프로브를 이용한다. 바람직하게는, 프로브는 예컨대 32P, 비오틴, 꽃양배추 퍼옥시다아제 (HRP) 등에 의해 라벨링되어 혼성화의 검출을 허용한다.
다른 검출 수단은 단편 길이 다형태 (PCR FLP), 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 프로브에 대한 혼성화 (Saiki et al., 1986, Nature 324:163), 또는 디데옥시법(클론된 DNA에 비하여 증폭된 DNA 사용)을 이용한 직접적 시퀀싱의 이용을 포함한다. 표준 PCR 수법은 (주로) 2개의 프라이머 사이에 위치한 DNA 서열을 복제하여 각 가닥의 5' 말단에서 불연속 길이의 DNA 서열을 프라이머와 반응시킨 주요 생성물을 제공하는 것에 의해 작용한다. 따라서, 프라이머 사이의 삽입 및 결찰은 상이한 길이의 서열 생성물을 초래하며, 이것은 PCR-FLP에서 생성물을 크기 별로 검출할 수 있다. ASO 혼성화의 예에서, 증폭된 DNA는 "도트 블럿" 시리즈로 나일론 필터(예컨대 UV 조사에 의해)에 고정된 다음 스트린젠트(stringent) 조건하에서 HRP에 의해 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브와 혼성화된다. 세척 후, 테트라메틸벤지딘(TMB) 및 과산화수소를 부가한다: HRP는 과산화 수소를 산화시키고, 다시 TMB를 청색 석출물로 산화시켜서 혼성화된 프로브를 나타낸다. 본 발명에 따른 핵산 에세이를 검출 또는 측정하기 위한 PCR 에세이는 표제 "사용 방법" 부분에 기재되어 있다.
2. RNA를 포함하는 핵산
본 발명은 RNA를 포함하는 핵산을 또한 제공한다. RNA를 포함하는 핵산은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 정제될 수 있다(Ausubel et al., 상기 참조). 전체 RNA는 당해 분야에 공지되고 (Ausubel et al., 상기 참조) 또 이후에 기재된 잘 공지된 방법에 따라서 세포 및 조직으로부터 분리될 수 있다.
RNA는 이하의 방법에 따라서 포유동물 조직으로부터 정제된다. 목적하는 조직을 제거한 후, ≤ 2g의 조직편을 절단하고 액체 질소에 급냉시켜 RNA의 분해를 방지한다. 적합한 부피의 구아니디늄 용액(예컨대 2 g의 조직당 20 ml의 구아니디늄 용액)을 부가하고, 조직 샘플을 2 또는 3회의 10-초 버스트로 조직균질기(tissuemizer)에서 분쇄한다. 조직 구아니듐 용액(1L)을 제조하기 위하여 590.8 g 구아니듐구아니디늄 이소티오시아네이트를 약 400 ml의 DEPC-처리된 H2O에 용해시킨다. 25 ml의 2 M Tris-HCl, pH 7.5 (0.05 M final) 및 20 ml Na2EDTA (0.01 M final)을 부가하고, 그 용액을 철야로 교반하며, 그 부피는 950 ml로 조절하고, 또 50 ml 2-ME를 부가한다.
균질화된 조직 샘플은 12℃에서 12,000 x g으로 10분간 원심분리처리시킨다. 생성한 상층액은 65℃에서 2분간 0.1 부피의 20% 사르코실 존재하에서 배양하고, 그 위에 9 ml의 5.7M CsCl 용액 (O.lg CsCl/ml)을 놓고 또 22℃에서 113,000 x g에서 철야로 원심분리에 의해 분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거한 후, 튜브를 뒤집어서 액체를 빼낸다. 튜브의 바닥에 있는 것(RNA 펠릿 함유)을 50 ml 플라스틱 튜브에 넣고 또 3 ml 조직 재현탁 완충액(5 mM EDTA, 0.5% (v/v) 사르코실, 5% (v/v) 2-ME) 존재하 4℃에서 철야로 (또는 더 오랫동안) 배양하여 RNA 펠릿의 완전한 재현탁을 허용한다. 생성한 RNA 용액은 25:24:1 페놀/클로로포름/이소아밀 알코올에 이어 24:1 클로로포름/이소아밀 알코올을 사용하여 순차적으로 추출하고, 3 M 아세트산 나트륨, pH 5.2 및 2.5 부피의 100% 에탄올을 부가하여 석출시키며, 또 DEPC 수에 재현탁시킨다(Chirgwin et al., 1979, Biochemistry. 18: 5294).
다르게는, RNA는 단일 단계 순서에 따라 포유동물 조직으로부터 분리한다. 관심있는 조직은 100 mg 조직당 1 ml 변성 용액 (4M 구아니디늄 티오설페이트, 25 mM 시트르산 나트륨, pH 7.0, 0.1M 2-ME, 0.5% (w/v) N-라우릴사르코신)이 들어 있는 유리 테플론 균질기에서 균질화시켜 제조한다. 균질물을 5 ml 폴리프로필렌 튜브로 옮긴 후, 0.1 ml의 2 M 아세트산 나트륨, pH 4, 1 ml 물-포화된 페놀, 및 0.2 ml의 49:1 클로로포름/이소아밀 알코올을 순차적으로 부가한다. 각 성분을 부가한 후 상기 샘플을 혼합하고, 또 모든 성분이 부가된 후 0-4℃에서 15분간 배양하였다. 10,000 x g, 4℃에서 20분간 원심분리하는 것에 의해 샘플을 분리하고, 1 ml의 100% 이소프로판올을 부가하여 석출시킨 다음, -20℃에서 30분간 배양하고 또 4℃에서 10,000 x g에서 10분간 원심분리에 의해 펠릿화한다. 생성한 RNA 펠릿은 0.3 ml 변성 용액에 용해시키고, 미량냉장원심분리기(microfuge) 튜브로 옮기고, 0.3 ml의 100% 이소프로판올을 -20℃에서 30분간 부가하여 석출시키고 또 10,000 x g, 4℃에서 10분간 원심분리시킨다. 이 RNA 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고, 건조시키며 또 100-200㎕ DEPC-처리된 물 또는 DEPC-처리된 0.5% SDS에 재현탁시킨다 (Chomczynski and Sacchi, 1987. Anal . Biochem.. 162: 156).
RNA를 포함하는 핵산은 시험관내 전사 방법에 따라 제조될 수 있다.
시험관내 전사 수법은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 간단히 말해, 관심있는 유전자를 SP6, T3 또는 T7 프로모터를 함유하는 벡터에 삽입한다. 이 벡터는 코딩 서열의 하류에 위치하는 단일 부위에서 벡터를 분해하는 적합한 제한효소를 사용하여 선형화시킨다. 페놀/클로로포름 추출 후, 상기 DNA를 에탄올 석출시키고, 70% 에탄올로 세척하며, 건조시키고 또 멸균수에 재현탁시킨다. 시험관내 전사 반응은 상기 선형화된 DNA를 전사 완충액 (200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 40 mM MgCl2, 10 mM 스페르미딘, 250 NaCl [T7 또는 T3] 또는 200 mM Tris-HCl, pH 7.5, 30 mM MgCl2, 10 mM 스페르미딘 [SP6]), 디티오트레이톨, RNase 억제제, 4개의 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 각각, 및 SP6, T7 또는 T3 RNA 중합효소와 함께 37℃에서 30분간 배양한다. RNA를 포함하는 방사능라벨링된 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위하여, 라벨링되지 않은 UTP를 생략하고 또 35S- UTP는 반응 혼합물에 포함될 것이다. DNA 주형은 DNaseI과 배양하는 것에 의해 제거된다. 에탄올 석출 후, 방사능라벨링된 RNA의 등분량은 신틸레이션계수기로 cpm/㎕를 결정한다 (Ausubel et al., 상기 참조).
다르게는, RNA를 포함하는 핵산은 고상 포스포르아미디트 (상기 기재)와 같은 화학적 합성 수법에 의해 제조한다.
3. 올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산
올리고뉴클레오티드를 포함하는 핵산은 시판되는 올리고뉴클레오티드 합성 기기를 이용하여 제조할 수 있다. (상기 기재).
IV . 절단 구조
본 발명은 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단될 수 있는 절단구조를 제공하며, 또 따라서 절단 구조를 제조하는 방법을 개시한다. 본 발명은 라벨링된 절단 구조 및 라벨링된 절단 구조의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명에 따른 절단 구조를 제조하기 위하여 프로브를 사용한다.
A. 절단 구조의 제조
일 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 a) 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 하류에 위치하는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 및 c) 프라이머 및 프로브 모두에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 Stratagene으로부터 입수가능한 IX Pfu 완충액 (카탈로그 #200536) 또는 특정 중합효소와 혼화성인 완충액(예컨대 RT)을 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 95℃에서 1-2분 후 약 40-72℃로 냉각)에 혼성화되게하는 조건하에서, 배양하는 것에 의해 형성한다. 최적 온도는 특정 프로브, 프라이머 및 중합효소에 따라서 다를 것이다. 본 발명의 일부 구체예로서, 절단 구조는 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드(예컨대 도 4의 A)의 3' 말단은 표적 핵산에 어닐링되는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브(예컨대 도 4의 C)의 1 또는 그 이상의 염기 쌍에 상보적이다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 a) RNA 중합효소 합성된 올리고뉴클레오티드, b) 프로모터의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 c) 프로모터 영역을 포함하고 또 적어도 부분적으로 하류 프로브에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액을, 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 1-2 분 이어 약 40-60℃로 냉각)에서 배양하는 것에 의해 형성한다. 최적 온도는 특정 프로브 및 RNA 중합효소에 따라서 다를 것이다. 본 발명의 일부 구체예로서, 절단 구조는 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 4의 A)의 3' 말단은 표적 핵산에 어닐링되는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 4의 C)의 1 또는 그 이상의 염기 쌍에 상보적이다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 a) 상류, 바람직하게는 연장가능한 3' 말단, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 표적 핵산에 결합시 변화되는 상기 정의한 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 결합 부위를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브 및 c) 프라이머에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 센티넬 분자 비이콘 PCR 코어 완충액 (카탈로그 #600500) 또는 Stratagene 으로부터 입수가능한 IX Pfu 완충액을, 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 1-2 분 이어 약 50-60℃로 냉각)에서 배양하는 것에 의해 형성한다. 최적 온도는 특정 프로브, 프라이머 및 중합효소에 따라서 다를 것이다. 본 발명의 바람직한 구체예로서, 절단 구조는 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 4의 A)의 3' 말단은 표적 핵산에 어닐링되는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 4의 C)의 1 또는 그 이상의 염기 쌍에 상보적이며 또 상기 1 염기 쌍 오버랩은 단일 가닥 플랩의 연장점의 바로 하류이다.
상기 구체예에 따르면 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머의 3' 말단은 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단을 부분적으로 치환하도록 본 발명에 따른 중합효소의 합성 활성에 의해 연장된다. 연장은 바람직하게는 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 IX Pfu 완충액 존재하, 72℃에서 15초간 실시된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산에 결합되면 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 핵산을 배양하는 것에 의해 3' 상보적 영역이 표적 핵산에 어닐링되고 또 표적 핵산에 어닐링되지 않는 비상보적 5' 영역이 5' 플랩을 형성하여 제조될 수 있다. 어닐링은 바람직하게는 적합한 완충액 (예컨대 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 IX Pfu 완충액)의 존재하에서 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 2-5 분에 이어 약 50-60℃로 냉각)에서 실시된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산에 결합되면 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브 및 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 프라이머와 함께 표적 핵산을 배양하는 것에 의해 3' 상보적 영역이 표적 핵산에 어닐링되고 또 표적 핵산에 어닐링되지 않는 비상보적 5' 영역이 5' 플랩을 형성하도록 제조될 수 있다. 어닐링은 바람직하게는 적합한 완충액 (예컨대 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 IX Pfu 완충액 (Stratagene))의 존재하에서 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 2-5 분에 이어 약 50-60℃로 냉각)에서 실시된다.
다른 구체예로서, 본 발명은 비-오버래핑(비침습적) 절단구조의 형성시에만 선택적으로 절단되는 절단 내성 프로브를 포함하는 절단 구조를 제공한다. 이 구체예에서, 본 발명에 따른 절단 구조는 a) 상류 프라이머, b) 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 절단 내성 프로브 및 c) 프라이머 및 프로브에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 Stratagene 으로부터 입수가능한 IX Pfu 완충액 (카탈로그 #200536) 또는 특정 중합효소 및 뉴클레아제에 상용성인 완충액)을, 핵산 서열이 프라이머 및 프로브에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 1-2 분 이어 약 40-72℃로 냉각)에서 배양하는 것에 의해 형성한다. 최적 온도는 특정 프로브, 프라이머 및 중합효소에 따라서 다를 것이다.
본 발명의 일부 구체예로서, 절단 구조는 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 표적 핵산에 어닐링되는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 14B 및 도 15B)의 1 또는 그 이상의 염기 쌍에 상보적이다. 상기 오버래핑 구조 (침습적)가 형성되면, 절단 내성 프로브는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않을 것이고, 또 침습적 절단 구조의 형성시에 어떠한 검출가능한 신호도 생성되지 않는다.
다른 구체예로서, 프라이머 및 절단 내성 프로브는 오버랩하지 않는다. 예컨대, 프라이머는 하류 프로브의 표적 상보적 부분과 인접한다(연장시 또는 혼성화시). 이 구체예에서, 절단 구조는 비-오버래핑되고 또 프로브는 + 위치 상류의 절단 내성이 아닌 프로브 위치 (예컨대 엘보우)에서 뉴클레아제에 의해 절단된다(도 14B 및 15A).
B. 라벨링된 절단 구조의 제조방법
이 구체예에서, 라벨은 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된다. 본 발명의 일 구체예로서, 라벨은 표적 핵산에 결합되면 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 절단 구조를 포함하는 올리고뉴클레오티드 프로브에 부착된다. 다른 구체예로서, 라벨은 2차 구조를 갖지 않는 프로브에 부착된다. 따라서, 플랩-특이적 뉴클레아제의 엔도뉴클레아제 활성에 의해 절단되는 절단된 모노뉴클레오티드 또는 소형 올리고뉴클레오티드가 검출될 수 있다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 a) 상류, 연장가능한 3' 말단, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 라벨링된 프로브 및 c) 올리고뉴클레오티드에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액)을, 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 2-5 분 이어 약 50-60℃로 냉각)에서 배양하는 것에 의해 형성한다. 본 발명에 따른 절단 구조는 또한 오버래핑 플랩을 포함하고, 이때 표적 핵산 서열에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단 (예컨대 도 3의 A)은 표적 핵산 서열에 어닐링되는 하류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 3의 C)의 1 염기 쌍에 상보적이며 또 상기 1 염기 쌍 오버랩은 단일 가닥 플랩의 연장점의 바로 하류이다. 상류 프라이머의 3' 말단은 상류 프라이머의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 프로브의 라벨링된 5' 말단을 부분적으로 치환하도록 중합효소(예컨대 역전사효소)의 합성 활성에 의해 연장된다. 연장은 바람직하게는 IX Pfu 완충액 존해하, 72℃에서 15초간 실시한다. 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산 서열에 어닐링되지 않고 5' 플랩을 형성하는 비상보적 라벨링된 5' 영역을 포함하는 프로브와 함께 표적 핵산 서열을 배양함으로써 제조할 수 있다. 어닐링은 바람직하게는 적합한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액) 존재하에서 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 95℃에서 2-5 분에 이어 약 50- 60℃로 냉각)에 혼성화되는 조건하에서 실시한다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 a) 상류 연장가능한 3' 말단, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드 프라이머, b) 표적 핵산에 결합되면 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 결합 부위를 포함하는 라벨링된 프로브, 및 c) 올리고뉴클레오티드에 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액)을, 핵산 서열이 올리고뉴클레오티드 프라이머에 혼성화되는 조건하 (예컨대 95℃에서 2-5 분에 이어 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해)에서 배양함으로써 형성된다. 본 발명에 따른 절단 구조는 또한 오버래핑 플랩을 포함하며, 이때 표적 핵산 (예컨대 도 4의 A)에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 표적 핵산에 결합될 때 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 표적 핵산에 어닐링되는 결합 부위(예컨대 도 4의 C)를 포함하는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브의 1 염기쌍에 상보적이며, 이때 상기 1 염기쌍 오버랩은 단일 가닥 플랩의 연장점의 바로 하류에 위치한다. 상류 프라이머의 3' 말단은 상류 프라이머의 새로이 합성된 3' 말단이 하류 프로브의 라벨링된 5' 말단을 부분적으로 치환하도록 중합효소의 합성 활성에 의해 연장된다. 연장은 바람직하게는 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 1X Pfu 완충액의 존재하, 72℃에서 15초간 실시한다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는, 표적 핵산에 결합되면 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고, 결합 부위를 포함하며 또 표적 핵산에 어닐링되지 않고 5' 플랩을 형성하는 비상보적, 라벨링된 5' 영역 및 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 프로브와 함께 표적 핵산을 배양하는 것에 의해 제조할 수 있다. 어닐링은 바람직하게는 핵산 서열이 적합한 완충액 (예컨대 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 IX Pfu 완충액) 존재하에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 95℃에서 2-5 분에 이어 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해)에 혼성화되게 하는 조건하에서 실시된다.
다른 구체예로서, 본 발명에 따른 절단 구조는 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 프라이머 및 표적 핵산에 결합시 변화되는 상기 정의된 바와 같은 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하며 또 표적 핵산에 어닐링되지 않고 5' 플랩을 형성하는 비상보적인 라벨링된 5' 영역과 표적 핵산에 어닐링되는 상보적 3' 영역을 더 포함하는 프로브와 함께 표적 핵산을 배양함으로써 제조할 수 있다. 어닐링은 바람직하게는 핵산 서열이 적합한 완충액 (예컨대 IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액 또는 IX Pfu 완충액) 존재하에서 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 95℃에서 2-5분에 이어 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해)에 혼성화되게 하는 조건하에서 실시된다.
다른 구체예로서, 본 발명은 비-오버래핑 (비침습적) 절단 구조의 형성시에만 절단되는 라벨링된 절단 내성 프로브를 포함하는 라벨링된 절단 구조를 제공한다. 이 구체예에서, 본 발명에 따른 절단 구조는 a) 상류 프라이머, b) 상류 프라이머의 5000 뉴클레오티드 이하의 하류에 위치하는 라벨링된 절단 내성 프로브, 및 c) 프라이머 및 프로브에 모두 상보적인 적절한 표적 핵산 및 d) 적합한 완충액 (예컨대 Stratagene 으로부터 입수가능한 IX Pfu 완충액 (카탈로그 #200536) 또는 사용된 특정 중합효소 및 뉴클레아제에 상용성인 기타 완충액)을, 표적이 프라이머 및 프로브에 혼성화되게 하는 조건하 (예컨대 95℃에서 1-2분에 이어 약 40-72℃로 냉각시키는 것에 의해)에서 배양하는 것에 의해 형성된다. 최적 온도는 특정 프로브, 프라이머 및 중합효소에 따라 다를 것이다.
본 발명의 일부 구체예로서, 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단(도 14B/C)이 하류 프로브에 어닐링되는 표적의 1 이상의 염기에 상보적인 오버래핑 플랩을 포함하는 절단 구조가 형성될 것이다. 이 오버래핑 구조 (침습적)가 형성되면, 절단 내성 프로브는 뉴클레아제에 의해 절단되지 않을 것이므로, 침습적 절단 구조의 형성시에 검출가능한 신호가 생성되지 않을 것이다.
다른 구체예로서, 프라이머 및 절단 내성 프로브는 오버랩하지 않는다.
예컨대, 프라이머는 하류 르로브의 표적 상보적 부분(도 14B 및 15A)과 접한다(연장시 또는 혼성화시). 이 구체예에서, 절단 구조는 비-오버래핑이며 또 라벨링된 프로브는 절단 내성인 프로브의 위치, +1 위치 상류(예컨대 엘보우)에서 뉴클레아제에 의해 절단된다. 이어, 절단되지 않은 라벨링된 핵산을 그의 절단 단편으로부터 구별하기 위해서는 몇 개의 전략을 이용할 수 있다. 본 발명은 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합 부위 또는 태그가 결합되는 것에 의해 포획되는 절단되고, 방출된 핵산 단편의 양을 검출하기 위한 방법을 제공한다. 이 방식으로, 본 발명은 표적 핵산을 함유하는 샘플의 확인을 허용한다.
올리고뉴클레오티드 프로브는, 이하에 기재된 바와 같이, 분광기적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 효소화학적, 효소적 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 부위를 혼입시키는 것에 의해 라벨링된다. 라벨을 올리고뉴클레오티드 프로브에 연결 또는 결합시키는 방법은 사용된 라벨의 유형 및 프로브 상의 라벨의 위치에 따라 다를 것이다. 본 발명에 따라 유용한 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에서 라벨링되거나 또는 프로브의 길이를 따라 라벨링될 수 있다.
본 발명에 적절히 사용될 수 있는 다양한 라벨 뿐만 아니라 프로브에 혼입시키기 위한 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 비제한적으로, 예컨대 신호를 증강, 변화 또는 감소시키기 위하여 상호작용할 수 있는 효소 (예컨대 알칼리성 포스파타아제 및 꽃양배추 퍼옥시다아제) 및 효소 기질, 방사능활성 원자, 형광 염료, 발색단, 화학발광 라벨, OrigenTM(Igen)과 같은 전기화학발광 라벨을 포함한다. 물론, 라벨링된 분자가 열적 사이클러 기구를 이용하여 실시된 PCR계 에세이에 이용될 수 있으면, 상기 라벨은 상기 자동화 공정에 필요한 온도 주기를 견딜 수 있어야 한다.
방사능활성 원자 중에서, 33P 또는 32P가 바람직하다. 33P 또는 32P을 핵산에 도입하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 예컨대, 키나아제를 사용한 5' 라벨링 또는 닉(nick) 번역에 의한 랜덤 삽입을 포함한다. "특이적 결합 파트너"는 예컨대 항원 및 그에 특이적인 모노클로날 항체의 경우에서와 같이 고 특이성으로 리간드 분자를 결합시킬 수 있는 단백질을 지칭한다. 다른 특이적 결합 파트너는 비오틴 및 애비딘 또는 스트랩트애비딘, IgG 및 단백질 A 그리고 당해 분야에 공지된 수많은 수용체-리간드 커플을 포함한다. 상기 기재는 다양한 라벨을 분명한 종류로 분류하려는 것은 아니며, 동일 라벨은 몇 개의 상이한 모델로서 이용될 수 있다. 예컨대, 125I는 방사능활성 라벨로서 작용할 수 있거나 또는 전자-조밀화 시약으로 작용할 수 있다. HRP는 효소로서 작용하거나 또는 모노클로날 항체에 대한 항원으로 작용할 수 있다. 또한, 소망하는 효과를 위하여 다양한 라벨을 조합할 수 있다. 예컨대 프로브를 비오틴으로 라벨링하고 애비딘 라벨링된 프로브의 존재는 125I을 사용하거나, 또는 HRP로 라벨링된 항-비오틴 모노클로날 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 다른 전돌연변이(permutations) 및 가능성은 당업자에게 분명할 것이며 또 본 발명의 범위내에 등가물로 간주된다.
본 발명의 라벨링된 프로브 작성에서 라벨로서 사용하기 위한 형광단은 로다민 및 유도체(텍사스 레드와 같은), 플루오레세인 및 유도체 (5-브로모메틸 플루오레세인), 루시퍼 옐로우, IAEDANS, 7-Me2N-쿠마린-4-아세테이트, 7-NH2-4-CH3-쿠마린-3-아세테이트 (AMCA), 모노브로모비만, 피렌 트리설포네이트, 예컨대 케스케이드 블루, 및 모노브로모리메틸-암모니오비만을 포함한다. 일반적으로, 모노크로모미터보다 필터를 갖는 플루오리미터를 사용하고 검출 효율을 증가시키는 넓은 스트로크 이동을 갖는 형광단이 바람직하다.
형광단으로 라벨링된 프로브는 본 발명에 따른 라벨링된 프로브를 포함하는 절단 구조의 뉴클레아제 (예컨대 FEN-뉴클레아제) 매개된 절단에 용이하게 사용된다. 라벨이 프로브의 5' 말단에 존재하면, 뉴클레아제 (예컨대 FEN-뉴클레아제) 생성된 라벨링된 단편은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 완전한 혼성화된 프로브로부터 분리된다.
본 발명의 다른 구체예로서, 가수분해된, 라벨링된 프로브의 검출은 형광 분극(형광 polarization), 분자 텀블링(tumbling)을 기본으로 한 대형 및 소형 분자 사이를 구별하는 수법을 이용하여 달성될 수 있다. 용액 중에서 대형 분자(예컨대 완전한(intact) 라벨링된 프로브) 텀블은 소형 분자보다 훨씬 더 느리다. 관심을 두고 있는 분자 상의 적합한 부위에 형광 부위를 결합시키면, 상기 형광 부위는 분자 텀블링을 기준으로 하여 측정(및 구별)될 수 있으므로, 완전한 프로브와 분해된 프로브 사이를 구별한다.
일부 상황에서, 올리고뉴클레오티드 프로브 펼침(unfolding) (예컨대 프로브의 2차 구조에서의 변화에 의해) 또는 가수분해 동안 라벨의 분리를 허용하는 올리고뉴클레오티드 상의 라벨의 적절한 간격을 유지하도록 제시된 내용을 고려하여 단일 올리고뉴클레오티드 프로브 상에서 상호작용성 신호 생성 부위의 쌍 또는 2개의 상호작용성 라벨 (예컨대 FRET 또는 비-FRET 쌍)을 이용할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 바람직한 상호작용성 라벨은 비제한적으로 로다민 및 유도체, 플루오레세인 및 유도체, 텍사스 레드, 쿠마린 및 유도체, 크리스탈 바이올렛을 포함하며 또 비제한적으로 본 명세서에 기재된 FRET 또는 비-FRET 라벨 이외에 DABCYL, TAMRA 및 NTB (니트로티아졸 블루)를 포함한다.
방출된 라벨의 형광은 표적에 결합된 잔류하는 라벨과 비교한다. 단편으로부터 생성한 뉴클레아제(예컨대 FEN-뉴클레아제) 및 약 20개 뉴클레오티드에 의해 분리된 형광단 및 켄처를 갖도록 프로브가 합성되면, 뉴클레아제(예컨대 FEN-뉴클레아제) 존재하에서 절단한 후 표적에 결합되어 있는 프로브를 분리할 필요가 없다. 다르게는, 켄처는 표적 핵산에 혼성화되지 않으면 형광을 내지 않도록 배치된다. 이러한 듀얼 라벨링된 프로브는 완전하거나 또는 표적핵산에 혼성되지 않을 때(또는 프로브가 해리되지 않을 때 이분자- 또는 다분자 프로브의 경우) 형광을 내지 않는데, 이는 염료로부터 발광된 광이 켄처에 의해 켄칭되기 때문이다. 따라서, 완전한 프로브로부터 방출된 형광은 배경(background) 형광으로 간주된다. 일 구체예로서, 프로브가 FEN 뉴클레아제에 의해 절단될 때, 염료 및 켄처는 분리되고 또 방출된 단편은 형광을 낼 것이다. 다르게는, 라벨링된 프로브가 표적 핵산에 혼성화되면, 염료와 켄처 사이의 거리는 증가하고 또 형광의 정도는 증가한다. 일 구체예로서, 프로브가 이분자- 또는 다분자 프로브이면, 프로브를 포함하는 분자의 해리는 형광의 증가를 초래할 것이다. 형광의 양은 샘플에 존재하는 핵산 표적 서열의 양에 비례한다.
다른 구체예로서, 2개의 라벨링된 핵산이 사용되면, 이중 가닥 표적 서열의 개별 가닥의 개별 영역에 대해 각각 상보적이지만 서로에 대해서는 상보적이 아니어서 라벨링된 핵산은 각 프라이머의 하류를 어닐링한다. 예컨대, 2개 프라이머의 존재는 단일 라벨로부터 생성할 신호 세기를 배가시킬 수 있고 또 PCR 증폭동안 흔히 생기는 생성물 가닥 재어닐링을 감소시키는 작용을 한다. 프로브는 프라이머가 결합되는 위치와 인접(하류)하는 위치에 프로브가 결합하도록 선택된다.
다른 이점을 달성하기 위하여 본 발명에서 다중 프로브를 이용할 수 있다. 예컨대, 필요한 가능한 많은 프로브를 반응 혼합물에 단순히 투입하는 것에 의해 샘플에서 병원체의 갯수를 시험할 수 있다; 프로브는 검출을 실시하기 위한 상이한 라벨을 각각 포함할 수 있다.
1개 프로브/대립유전자 듀플렉스에만 특이적인 온도에서 어닐링/절단 반응을 실시하고 또 상이한 TmS를 갖는 프로브를 사용하여 본 발명에서 다중 프로브를 사용하여 대립유전자-특이적 또는 종-특이적 구별을 달성할 수 있다. 단일 프로브 만을 사용하고 또 생성한 절단 생성물 유형을 검사하는 것에 의해 대립유전자 특이적 구별을 달성할 수 있다. 본 발명의 일 구체예로서, 프로브는 다른 대립유전자에 대해서가 아니라 1개의 대립유전자에 대해 정확히 상보적인, 적어도 5' 말단 영역에 상보적이도록 설계된다. 다른 대립유전자에 대하여, 프로브는 프로브의 5' 말단 영역에서 미스매치될 것이므로, 프로브가 정확하게 상보적인 대립유전자에 혼성화될 때, 생성된 절단 생성물에 비교하여 상이한 절단 생성물이 생성될 것이다.
프로브 서열은 중요한 이점을 달성하기 위해 선택될 수 있지만, 본 명세서에 기재된 프로브 라벨 및/또는 태그를 선택하는 것에 의해 중요한 이점을 실현할 수 있다. 라벨은 다양한 수법에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 올리고뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 사용된 라벨 또는 태그의 정확한 유형에 따라서, 라벨은 프로브의 5' 또는 3' 말단에 위치하거나, 프로브 내부에 위치하거나, 또는 신호 상호작용을 용이하게 하기 위하여 다양한 크기와 조성의 스페이서 아암에 부착될 수 있다. 시판되는 포스포르아미디트 시약을 사용하여, 적절하게 보호된 포스포르아미디트를 통하여 5- 또는 3-말단에서 작용기 (예컨대 티올 또는 일급 아민)를 함유하는 올리고머를 생성할 수 있고 또 예컨대, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds. Academic Press, Ind., 1990에 기재된 방법을 이용하여 이들을 라벨링할 수 있다.
1 이상의 설프히드릴, 아미노 또는 히드록실 부위를 올리고뉴클레오티드 프로브 서열, 전형적으로 5' 말단에 도입하기 위해 올리고뉴클레오티드 작용화 시약을 도입하는 방법은 미국 특허번호 4,914,210호에 기재되어 있다. 5' 포스페이트 기는 리포터 기를 제공하는 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 감마-32P-ATP 또는 감마-33P-ATP를 사용하여 방사능동위원소로서 도입될 수 있다. 합성하는 동안 도입된 아미노티미딘 잔기 또는 6-아미노 헥실 잔기를 비오틴의 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시켜 5' 말단에 비오틴을 부가할 수 있다. 3' 말단에 있는 라벨은 예컨대 코르디세핀 35S-dATP, 및 비오티닐화된 dUTP와 같은 소망하는 부위를 부가하기 위해 폴리뉴클레오티드 말단 트랜스퍼라아제(transferase)를 이용할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유도체는 또한 유용한 라벨이다. 예컨대, 에테노-dA 및 에테노-A는 핵산 프로브에 혼입될 수 있는 공지된 형광 아데닌 뉴클레오티드이다. 유사하게, 에테노-dC 또는 2-아미노 퓨린 데옥시리보사이드는 프로브 합성에 사용될 수 있는 다른 유사체이다. 이러한 뉴클레오티드 유도체를 함유하는 프로브는 플랩-특이적 뉴클레아제 활성에 의하여 훨씬 강한 형광 모노뉴클레오티드를 방출하도록 가수분해될 수 있다.
C. 절단 구조의 절단 및 신호의 생성
본 발명에 따른 절단 구조는 표제 "뉴클레아제" 부분에 기재된 방법에 의해 절단될 수 있다.
D. 프로브의 선택적 표적화
Pfu FEN은 표적 핵산에 혼성화되는 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 프라이머)의 3' 말단에 대하여 단일 위치에서 주로 하류 프로브를 절단한다. 상류 올리고뉴클레오티드 (프라이머)가 하류 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 영역(프로브)과 오버랩하지 않고 하류 올리고뉴클레오티드 (비-오버래핑 절단 구조)와 인접하여서, 2개의 올리고뉴클레오티드 (예컨대 표적에 대하여 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 올리고뉴클레오티드의 혼성화시 생성되거나 또는 상류 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 연장시에 생성되는) 사이에 닉(nick)이 존재하게 되면, FEN은 하류 올리고뉴클레오티드 상의 위치 +1의 상류를 절단한다. 본 발명에 따른 절단 내성 프로브를 이용하면, 상기 프로브는 그의 절단 내성 블록에 의해 절단될 수 없고 또 프라이머의 연장시 표적으로부터 치환(displaced)될 것이다.
따라서, 당업자들은 하류 프로브의 특정 영역을 표적화하기 위하여 하류 프로브의 상보적 부분에 대하여 상류 프라이머의 3' 말단을 선택적으로 위치시킬 수 있다.
E. 침습적 및 비침습적 절단 구조의 구별
형광단 / 켄처 쌍의 배치
상기 기재한 바와 같이, 일 구체예로서, 본 발명은 형광단/켄처 쌍으로 이중 라벨링된 프로브의 사용을 고려한다. 라벨링된 프로브가 FEN 뉴클레아제 (또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 기타 뉴클레아제)에 의해 분해되면, 형광단 및 켄처는 분리될 수 있고 또 잔류하는 단편은 형광을 낼 것이다. 프로브 상의 형광단 및 켄처의 위치는 프로브의 비-오버래핑 (침습적) 및 오버래핑 (비침습적) 절단 사이를 구별하도록 특이적으로 선택될 수 있다. 형광단/켄처 쌍의 내용에 기재되어 있지만 리포터 분자의 위치는 특이적 리포터 계에 제한되지 않는 것은 당업자들이 잘 알고 있을 것이다. 리포터 분자의 배치는 인터칼레이팅 염료와 같은 다른 리포터 계에도 적용될 수 있으며, 이때 특정 부위에서 프로브의 절단은 염료 신호의 켄칭을 초래할 것이다. 배치 설계는 상호작용성 리포터 분자를 포함하는 리포터 계에 이용될 수 있으며, 이때 분자의 상호작용성은 프로브의 비상보적 부분의 절단에 의해 중단될 수 있다. 이러한 리포터 계는 당해 분야에 공지되고 또 본 명세서에 기재되어 있다.
따라서, 켄처와 같은 상호작용성 라벨 쌍의 1개 멤버가 프로브의 혼성화된 영역의 염기 +1에 부착되고, 또 형광단이 5' 플랩 내의 염기에 부착되면, 위치 +1의 하류 절단은 첸처를 남길 것이고 또 리포터 기는 동일 핵산 분자에 여전히 부착될 것이므로 어떠한 신호도 생성되지 않을 것이다. 그러나, 프로브의 위치 +1의 상류에서 절단이 생기면, 염기 +1 상에 위치하는 켄처는 플랩 상에 위치하는 리포터로부터 분리될 것이다. 위치 +1의 상류 절단이 있으면, 상류 올리고뉴클레오티드는 하류 프로브의 혼성화된 영역과 오버랩하지 않는다. 상류 올리고뉴클레오티드는 표적에 상보적이고 또 하류 프로브의 표적 상보적 부분과 오버래핑하는 3' 부분을 갖는 오버래핑 구조 (예컨대 침습적 절단 구조)가 형성되면, 위치 +1의 하류 절단을 초래할 것이므로 위치 +1 상에 위치하는 켄처 및 5' 플랩에 위치하는 리포터 기의 물리적 분리는 없다. 본 발명에 따르면, 오버래핑 (침습적 절단) 구조로부터 생기는 절단은 검출될 수 없을 것이며 또 검출되지 않은 채 지나는 반면에, 비-오버래핑 (비침습적) 절단 구조로부터 생긴 절단은 검출성이다. 따라서, 하류 프로브의 혼성화된/상보적 부분의 위치 +1에서 켄처 분자 (BHQ와 같은)의 배치는 비침습적 절단의 검출만을 허용할 것이다.
따라서, 본 발명의 일 구체예는 하류 프라이머의 상보적 영역의 위치 +1에 켄처(예컨대 BHQ) 및 엘보우의 상류에 형광단(예컨대 FAM)의 배치를 고려한다. 형광단/켄처 쌍의 배치는 켄처가 5' 플랩 상에 위치하고 또 형광단이 하류 프로브의 상보적 영역의 위치 +1에 위치하는 것과 같이 역전될 수 있음도 고려된다.
따라서, 본 발명은 엘보우의 상류에 형광단 기(비제한적으로 FAM 기와 같은) 및 침습적 절단 구조로부터가 아니라 비침습적 절단 구조로부터만 신호를 생성하는 위치 +1 상에 켄처를 갖는 하류 프로브의 사용을 고려한다.
일부 구체예로서, 상호작용성 라벨 쌍의 선택적 배치를 갖는 프로브는 절단 내성 프로브이다. 이 구체예에서, 프로브는 비-오버래핑 절단 구조가 형성될 때에만 절단될 수 있다. 유사하게, 검출가능한 신호는 비-오버래핑 절단 구조의 형성 및 절단시에만 생성될 것이다.
F. 방출된 라벨링된 단편의 검출
라벨링된 단편의 검출 또는 확인은 당해 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 달성될 수 있고 또 라벨링된 부위 또는 라벨링된 절단 구조를 포함하는 부위의 특징에 따라 다를 수 있다.
본 발명의 일 구체예로서, 방출된 라벨링된 단편을 비롯한 반응 생성물은 크기 분석 처리될 수 있다. 라벨링된 단편의 크기를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 예컨대 겔 전기영동, 침강 구배, 겔 배제 크로마토그래피, 질량 분광기, 및 호모크로마토그래피를 포함한다. 다른 구체예로서, 검출가능한 신호는 상호작용성 라벨 쌍의 분리시에 생성된다.
일 구체예로서, 방출된 라벨링된 단편은 고상 지지체에 부착된 포획 요소에 결합 부위가 결합됨으로써 포획된다.
1. 포획 요소
본 발명에 따른 포획 요소는 결합 부위와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 결합 부위를 특이적으로 결합(예컨대 수소 결합을 통하여 또는 예컨대 핵산 결합 단백질과 핵산 결합 부위 또는 상보적 핵산 사이의 상호작용을 통하여)시키는 부위일 수 있다.
본 발명에 따르면, 결합 부위는 포획 요소에 결합되는 프로브의 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 포획 요소는 포획 요소에 결합하는 프로브의 영역을 포함하는 결합 부위에 상보적이고 또 예컨대 수소 결합을 통하여 그에 결합되는 핵산 서열일 수 있다. 예컨대, 결합 부위는 핵산 서열
Figure 112009038784823-PCT00006
(서열번호: 26)을 포함하는 프로브의 영역이고 또 상응하는 포획 요소는 핵산 서열
Figure 112009038784823-PCT00007
(서열번호: 27)을 포함한다.
본 발명은 또한 결합 부위-포획 요소 또는 태그-포획 요소 쌍을 제공하며, 이때 결합 부위 또는 태그는 DNA 결합 단백질이고 또 상응하는 포획 요소는 DNA 결합 단백질에 의해 인식되고 결합된 DNA 서열이다. 본 발명은 또한 결합 부위-포획 요소 또는 태그-포획 요소 쌍을 제공하며, 이때 포획 요소는 DNA 결합 단백질이고 또 상응하는 결합 부위 또는 태그는 DNA 결합 단백질에 의해 인식되고 결합된 DNA 서열이다.
본 발명에 따라 유용한 DNA 서열/DNA 결합 단백질 상호작용은 비제한적으로 c-myb, AAF, abd-A, Abd-B, ABF-2, ABFl, ACE2, ACF, AD A2, ADA3, Adf-1, Adf-2a, ADRl, AEF-1, AF-2, AFPl, AGIE-BPl, AhR, AIC3, AIC4, AID2, AIIN3, ALFlB, 알파-1, 알파-CPl, 알파-CP2a, 알파-CP2b, 알파-인자, 알파-PAL, 알파2uNFl, 알파2uNF3, 알파A-CRYBPl, 알파H2- 알파H3, 알파MHCBFl, aMEF-2, AMLl, AnCF, ANF, ANF-2, Antp, AP-1, AP-2, AP-3, AP-5, APETALAl, APET ALA3, AR, ARG RI, ARG RII, Arnt, AS-C T3, AS321, ASF-1, ASH-1, ASH-3b, ASP, AT-13P2, ATBFl-A, ATF, ATF-1, ATF-3, ATF-3델타ZIP, ATF-a델타, ATF-like, Athb-1, Athb-2, Axial, abaA, ABF-I, Ac, ADA-NFl, ADDl, Adf-2b, AF-1, AG, AIC2, AIC5, ALFlA, 알파-CBF, 알파-CP2a, 알파-CP2b, 알파-IRP, 알파2uNF2, 알파HO, AmdR, AMTl, ANF-1, Ap, AP-3, AP-4, APETALA2, aRA, ARG RIII, ARP-1, Ase, ASH-3a, AT-BPl, ATBFl-B, ATF-2, ATF-a, ATF/CREB, Ato, B 인자, B", B-Myc, B-TFIID, band 1 인자, BAP, Bed, BCFI, Bcl-3, 베타-1, 베타l, 베타2, BF-1, BGPl, BmFTZ-Fl, BPl, BR-C Zl, BR-C Z2, BR-C Z4, Brachyury, BRFl, Br1A, Bm-3a, Brn-4, Brn-5, BUFl, BUF2, B-Myb, BAFl, BASl, BCFII, 베타-인자, 베타3, BLyF, BP2, BR-C Z3, brahma, byr3, c-abl, c-Ets-1, c-Ets-2, c-Fos, c-Jun, c-Maf, c-myb, c-Myc, c-Qin, c-Rel, C/EBP, C/EBP알파, C/EBP베타, C/EBP델타, C/EBP입실론, C/EBP감마, Cl, CAC-결합 단백질, CACCC-결합 인자, Cactus, Cad, CADl, CAP, CArG box-결합 단백질, CAUP, CBF, CBP, CBTF, CCAAT-결합 인자, CCBF, CCF, CCK-1a, CCK-1b, CD28RC, CDClO, Cdc68, CDF, cdk2, CDP, Cdx-1, Cdx-2, Cdx-3, CEBF, CEH-18, CeMyoD, CFl, Cf1a, CF2-I, CF2-II, CF2-III, CFF, CG-1, CHOP-10, Chox-2.7, CIIIBl, Clox, Cnc, CoMPl, 코어-결합 인자, CoS, COUP, COUP-TF, CPl, CPlA, CPlB, CP2, CPBP, CPCl, CPE 결합 단백질 CPRF-1, CPRF-2, CPRF-3, CRE-BPl, CRE-BP2, CRE-BP3, CRE-BPa, CreA, CREB, CREB-2, CREB오메가, CREM알파, CREM베타, CREM델타, CREM입실론, CREM감마, CREMtau알파, CRF, CSBP-1, CTCF, CTF, CUP2, Cut, Cux, Cx, cyclin A, CYS3, D-MEF2, Da, DAL82, DAP, DATl, DBF-A, DBF4, DBP, DBSF, dCREB, dDP, dE2F, DEF, Delilah, 델타 인자, 델타CREB, 델타El, 델타EFl, 델타Max, DENF, DEP, DF-1, Dfd, dFRA, 디옥신 수용체, dJRA, Dl, DII, D1x, DM- SSRPl, DMLPl, DP-1, Dpn, Dr1, DRTF, DSCl, DSPl, DSXF, DSXM, DTF, E, ElA, E2, E2BP, E2F, E2F-BF, E2F-I, E4, E47, E4BP4, E4F, E4TF2, E7, E74, E75, EBF, EBFl, EBNA, EBP, EBP40, EC, ECF, ECH, EcR, eE-TF, EF-IA, EF-C, EFl, EF감마, Egr, eH-TF, EIIa, EivF, EKLF, EIf-I, EIg, ELk-1, ELP, Elt-2, EmBP-1, 배아 DNA 결합 단백질, Emc, EMF, Ems, Emx, En, ENH-결합 단백질, ENKTF-I, 입실론Fl, ER, Erg, Esc, ETF, Eve, Evi, Evx, Exd, Ey, f(알파-입실론), F-ACTl, f-EBP, F2F, 인자 1-3, 인자 Bl, 인자 B2, 인자 델타, 인자 I, FBF-Al, Fbfl, FKBP59, Fkh, F1bD, FIh, FIi-1, FLV-1, Fos-B, Fra-2, Fral, FRG Yl, FRG Y2, FTS, Ftz, Ftz-Fl, G 인자, G6 인자, GA-BF, GABP, GADD 153, GAF, GAGA 인자, GAL4, GAL80, 감마-인자, 감마CAAT, 감마CAC, 감마OBP, GATA-1, GATA-2, GATA-3, GBF, GCl, GCF, GCF, GCN4, GCRl, GEl, GEBF-1, GFl, GF1, Gfi-1, GFII, GHF-5, GLl, 유리, GLO, GM-PBP-1, GP, GR, GRF-1, Gsb, Gsbn, Gsc, Gt, GT-1, Gtx, H, H16, H1lTFl, H2Babpl, H2RIIBP, H2TF1, H4TF-1, HACl, HAPl, Hb, HBLF, HBP-1, HCMl, 열-유도된 인자, HEB, HEF-1B, HEF-1T, HEF-4C, HENl, HES-1, HIF-1, HiNF-A, HIPl, HIV-EP2, H1f, HMBI, HNF-1, HNF-3, Hoxl 1, HOXA1, HOXA10, HOXA10PL2, HOXAl1, H0XA2, H0XA3, H0XA4, H0XA5, H0XA7, H0XA9, HOXBl, H0XB3, H0XB4, H0XB5, H0XB6, H0XB7, H0XB8, H0XB9, H0XC5, H0XC6, H0XC8, HOXDl, HOXD10, HOXD1l, HOXD12, H0XD13, H0XD4, H0XD8, H0XD9, HPl 부위 인자, Hp55, Hp65, HrpF, HSE-결합 단백질, HSFl, HSF2, HSF24, HSF3, HSF30, HSF8, hsp56, Hsp90, HST, HSTF, I-POU, IBF, IBP-1, ICER, ICP4, ICSBP, Id1, Id2, Id3, Id4, IE1, EBP1, IEFga, IFl, IF2, IFNEX, IgPE-1, DC-1, IkappaB, I1-1 RF, IL-6 RE-BP, I1-6 RF, ILF, ILRF-A, IMEl, INO2, INSAF, IPFl, IRBP, IRE-ABP, IREBF-I, IRF-1, ISGF-1, IsI-1, ISRF, ITF, IUF-1, Ixrl, JRF, Jun-D, JunB, JunD, K-2, kappay 인자, kBF-A, KBFl, KBF2, KBP-1, KER-1, Kerl, KNl, Kni, Knox3, Kr, 크라이슬러(kreisler), KRF-1, Krox-20, Krox-24, Ku 자기항원, KUP, Lab, LAC9, LBP, Lc, LCR-Fl, LEF-1, LEF-IS, LEU3, LF-Al, LF-Bl, LF-C, LF-H3베타, LH-2, Lim-1, Lim-3, lin-11, lin-31, lin-32, LIP, LIT-I, LKLF, Lmx-1, LRF-1, LSF, LSIRF-2, LVa, LVb-결합 인자, LVc, LyF-1, Ly1-1, M 인자, M-Twist, Ml, m3, Mab-18, MACl, Mad, MAF, MafB, MafF, MafG, MafK, Mal63, MAPFl, MAPF2, MASH-1, MASH-2, mat-Mc, mat-Pc, MATaI, MAT알파l, MAT알파2, MATH-1, MATH-2, Maxl, MAZ, MBF-1, MBP-1, MBP-2, MCBF, MCMl, MDBP, MEB-1, Mec-3, MECA, 매개 인자, MEF-2, MEF-2C, MEF-2D, MEF1, MEP-1, Mesol, MF3, Mi, MIF, MIGl, MLP, MNBIa, MNFl, MOK-2, MP4, MPBF, MR, MRF4, MSN2, MSN4, Msx-1, Msx-2, MTF-1, mtTFl, muEBP-B, muEBP-C2, MUFl, MUF2, Mxil, Myef-2, Myf-3, Myf-4, Myf-5, Myf-6, Myn, MyoD, 미오게닌(myogenin), MZF-1, N-Myc, N-Oct-2, N-Oct-3, N-Oct-4, N-Oct-5, Nau, NBF, NCl, NePl, Net, NeuroD, 뉴로게닌, NF III-a, NF-1, NF-4FA, NF-AT, NF-BAl, NF-CLEOa, NF-D, NF-E, NF-E1b, NF-E2, NF-EM5, NF-GMa, NF-H1, NF-IL-2A, NF-InsE1, NF-카파B, NF-람다2, NF-MHCIIA, NF-muEl, NF-muNR, NF-S, NF-TNF, NF-Ul, NF- Wl, NF-X, NF-Y, NF-Zc, NF알파l, NFAT-1 , NF베타A, NF델타E3A, NF델타E4A, NFe, NFE-6, NFH3-1, NFH3-2, NFH3-3, NFH3-4, NGFI-B, NGFI-C, NHP, Nil-2-a, NIP, NIT2, Nkx-2.5, NLSl, NMH7, NP-III, NP-IV, NP-TCII, NP-Va, NRDI, NRF-1, NRF-2, Nrfl, NrG, NRL, NRSF form 1, NTF, NUC-1, Nur77, OBF, OBP, OCA-B, OCSTF, Oct-1, Oct-10, Oct-11, Oct-2, Oct-2.1, Oct-2.3, Oct-4, Oct-5, Oct-6, Oct-7, Oct- 8, Oct-9, Oct-B2, Oct-R, Octa-인자, 옥타머(octamer)-결합 인자, Odd, Olf-1, 오파크(Opaque)-2, Otd, Otxl, Otx2, Ovo, P, Pl, plO7, pl30, p28 모듈레이터, p300, p38erg, p40x, p45, p49erg, p53, p55, p55erg, p58, p65델타, p67, PABl, PacC, Papl, Paraxis, Pax-1, Pax-2, Pax-3, Pax-5, Pax-6, Pax-7, Pax-8, Pb, Pbx-la, Pbx-lb, PC, PC2, PC4, PC5, Perl, PCREl, PCTl, PDM-1, PDM-2, PEAl, PEBl, PEBP2, PEBP5, Pep-1, PFl, PGA4, PHDl , PH02, PHO4, PHO80, Phox-2, Pit-1 , PO-B, pointedPl, Pou2, PPAR, PPUR, PPYR, PR, PR A, Prd, PrDI-BFl, PREB, Prh 단백질 a, 단백질 b, 단백질 c, 단백질 d, PRP, PSEl, PTF, Pu 박스 결합 인자, PU.l, PUBl, PuF, PUF-I, Pur 인자, PUT3, pX, qa-lF, QBP, R, Rl, R2, RAd-1, RAF, RAPl, RAR, Rb, RBP-J카파, RBP60, RCl, RC2, REBl, Re1A, Re1B, CARl 발현의 리프레서, REX-1, RF-Y, RFl, RFX, RGMl, RIMl, RLMl, RMEl, Ro, ROR알파, Roxl, RPFl, RPG알파, RREB-1, RRFl, RSRFC4, runt, RVF, RXR-알파, RXR-베타, RXR-베타2, RXR-감마, S-CREM, S-CREM베타, S8, SAP-la, SAPl, SBF, Sc, SCBP알파, SCD1/BP, SCM-유도성 인자, Scr, Sd, Sdc-1, SEF-1, SF-1, SF-2, SF-3, SF-A, SGCl, SGF-1, SGF-2, SGF-3, SGF-4, SIF, SIII, Sim, SINl, Skn-1, SKOl, Slpl, Sn, SNPl, SNF5, SNAPC43, Sox-18, Sox-2, Sox-4, Sox-5, Sox-9, Sox-LZ, Sp1, spE2F, Sph 인자, Spi-B, Sprm-1, SRBlO, SREBP, SRF, SRY, SSDBP-1, ssDBP-2, SSRPl, STAF-50, STAT, STATl, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5, STAT6, STC, STDl, Stell, Stel2, Ste4, STM, Su(f), SUM-1, SWIl, SWI4, SWI5, SWI6, SWP, T-Ag, t-Pou2, T3R, TAB, 서브유닛을 포함한 모든 TAF, TaI-1, TAR 인자, tat, Tax, TBFl, TBP, TCF, TDEF, TEAl, TECl, TEF, tel, Tf-LFl, TFE3, 모든 TFII 관련 단백질, TBA1a, TGGCA-결합 단백질, TGT3, Th1, TIFl, TIN-1, TIP, T1l, TMF, TR2, Tra-1, TRAP, TREB-1, TREB-2, TREB-3, TREFl, TREF2, Tsh, TTF-1, TTF-2, Ttk69k, TTP, Ttx, TUBF, Twi, TxREBP, TyBF, UBP-1, Ubx, UCRB, UCRF-L, UF1-H3베타, UFA, UFB, UHF-1, UME6, Unc-86, URF, URSF, URTF, USF, USF2, v-ErbA, v-Ets, v-Fos, v-Jun, v-Maf, v-Myb, v-Myc, v-Qin, v-Rel, Vab-3, 백시니아(vaccinia) 바이러스 DNA-결합 단백질, Vav, VBP, VDR, VETF, vHNF-1, VITF, Vmw65, Vp1, Vpl6, Whn, WTl, X-box 결합 단백질, X-Twist, X2BP, XBP-1, XBP-2, XBP-3, XFl, XF2, XFD-I, XFD-3, xMEF-2, XPF-1, XrpFI, XW, XX, yan, YB-1, YEB3, YEBP, Yi, YPF1, YY1, ZAP, ZEM1, ZEM2/3, Zen-1, Zen-2, Zeste, ZFl, ZF2, Zfh-1, Zfh-2, Zfp-35, ZID, Zmhoxla, Zta 및 모든 관련 특징화되고 특징화되지 않은 상동체 및 이들 DNA 결합 단백질 또는 활성에 관련된 패밀리 멤버, 및 상기 DNA 결합 단백질에 의해 인식되는 DNA 서열을 포함한다. DNA 결합 단백질에 의해 인식되는 DNA 서열을 확인하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다 (참고: 예컨대, U.S. 6,139,833호).
본 발명은 비제한적으로 테트라시클린 (tet) 리프레서, 베타-갈락토시다아제 (lac 리프레서), 트립토판 (trp) 리프레서, 람다 특이적 리프레서 단백질, CRO, 및 대사물질 활성제 단백질, CAP 및 상기 DNA 결합 단백질에 의해 인식되고 당해 분야에 공지된 DNA 서열을 비롯한 DNA 서열/DNA 결합 단백질 상호작용을 고려할 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 DNA/DNA 결합 단백질은 또한 바람직하게는 제한 효소의 뉴클레아제 활성이 억제되는 조건하(본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 5,985,550호)에서 제한효소 및 상응하는 제한 효소 부위를 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 다른 DNA:단백질 상호작용은 (i) 하기 표 1 및 2에 수록된 DNA 단백질 상호작용 및 (ii) 세균, 효모, 및 람다 OL-OR/CrO (본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 번호 5,726,014호)와 같은 파아지 계를 포함한다. 특정 인식 서열 및 동족 인식 서열에 결합되는 단백질을 포함하는 쌍이 본 발명에 유용할 수 있다.
Figure 112009038784823-PCT00008
Figure 112009038784823-PCT00009
Figure 112009038784823-PCT00010
본 명세서에 정의된 바와 같은 포획 요소와 본 명세서에 정의된 바와 같은 결합 부위 사이에 특이적 결합이 생기는 반응을 실시하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예컨대, Sambrook et al., 상기 참조; Ausubel et al., (상기 참조)를 참조한다. 본 발명에 따른 포획 요소는 결합 부위 또는 태그 및 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 결합 부위 또는 태그를 특이적으로 결합시키는(예컨대 공유 결합 또는 수소결합 또는 정전기 인력을 통하여 또는 단백질과 리간드 사이, 항체와 항원 사이, 단백질 서브 유닛, 핵산 결합 단백질 및 핵산 결합 부위 사이의 상호작용을 통하여) 부위일 수 있다. 상기 정의한 바와 같은 포획 요소와 상기 정의한 바와 같은 태그 사이에 특이적 결합이 생기는 반응을 실시하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 예컨대 Sambrook et al., 상기 참조; Ausubel et al., (상기 참조)를 참조한다. 특이적 결합은 결합 부위를 포함하는 2차 구조가 본 명세서에 정의된 바와 같이 변화될 때에만 생긴다. 본 발명에 따라 유용한 포획 요소는 비제한적으로 핵산 결합 단백질 또는 뉴클레오티드 서열, 비오틴, 스트렙트애비딘, 합텐, 단백질, 뉴클레오티드 서열 또는 화학적 반응성 부위를 포함한다.
본 발명의 일 구체예로서, 방출된 라벨링된 단편을 포함한 반응 생성물은 크기 분석된다. 라벨링된 단편의 크기를 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며 또 예컨대, 겔 전기영동, 침강 구배, 겔 배제 크로마토그래피, 질량 분광, 및 호모크로마토그래피를 포함한다.
2. 고상 기질
본 발명에 따른 고상 기질은 분자(예컨대 포획 요소)가 비가역적으로 결합될 수 있는 표면으로서, 비제한적으로 막, 자기 비이드, 조직 배양판, 실리카 계 물질, 막 계 물질, 비제한적으로 스티렌, 라텍스 또는 실리카 계 물질을 비롯한 표면을 포함하는 비이드 및 기타 중합체 예컨대 셀룰로오스 아세테이트, 테플론, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리에스테르, 카보네이트, 폴리설폰, 금속, 제올라이트, 종이, 알루미나, 유리, 폴리프로필, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 플라스틱, 여과지, 덱스트란, 게르마늄, 실리콘, (폴리)테트라플루오로에틸렌, 갈륨 아르세나이드, 갈륨 포스파이드, 산화 실리콘, 실리콘 니트레이트 및 그의 조합물을 포함한다.
본 발명에 따라 유용한 고상 기질은 Sambrook et al., 상기 참조, Ausubel et al., 상기 참조, 미국 특허 5,427,779호, 5,512,439호, 5,589,586호, 5,716,854호 및 6,087,102호, Southern et al., 1999, Nature Genetics Supplement. 21:5 and Joos et al., 1997, Analytical Biochemistry, 247:96 에 기재되어 있다.
포획 요소를 고상 지지체에 부착하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 Sambrook et al., 상기 참조, Ausubel et al., 상기 참조, 미국 특허 5,427,779호, 5,512,439호, 5,589,586호, 5,716,854호 및 6,087,102호 및 Southern et al., 상기 참조 및 Joos et al., 상기 참조에 기재되어 있다. 고상 지지체 상에 핵산 서열을 고정하는 방법은 또한 고상 지지체의 제조자, 예컨대 막의 경우 Pall Corporation, Schleicher & Schuell에 의해, 자기 비이드의 경우 Dyal에 의해, 배양판의 경우 Costar, Nalgenunc에 의해, 또 본 발명에 따른 다른 지지체의 경우 CPG, Inc에 의해 제공된다.
고상 지지체에 부착된 포획 요소에 결합된 방출된 라벨링된 단편의 양은 라벨링된 단편이 포획 요소에 결합된 채로 존재하는 동안 또는 포획 요소로부터 라벨링된 단편이 방출된 후 측정될 수 있다. 포획 요소로부터 라벨링된 단편의 방출은 과량의 경쟁성, 비라벨링된 단편의 존재하에서 라벨링된 단편-포획 요소 복합체를 배양하는 것에 의해, 또는 염 농도 또는 pH의 결과로, 포획 요소에 라벨링된 단편이 결합되는 것을 억제하는 완충액을 부가하는 것에 의해 실시한다.
증폭하는 동안 또는 증폭 후, 예컨대 PCR 혼합물로부터 방출된 라벨링된 단편의 분리는 예컨대 PCR을 고상 추출물(Solid phase extraction:SPE)과 접촉시키는 것에 의해 달성될 수 있다. 예컨대, 라벨링된, 절단되지 않은 핵산은 결합되고 또 짧은 라벨링된 단편은 결합되지 않는 조건하에서, 크기, 전하 또는 핵산 염기와 상호작용을 기초로 핵산에 결합하는 능력을 갖는 물질을 PCR 혼합물에 부가할 수 있다. 이러한 SPE 물질은 이온 교환 수지 또는 비이드를 포함하며, 예컨대 시판되는 결합 입자 Nensorb (DuPont Chemical Co.), Nucleogen (The Nest Group), PEI, BakerBond PEI, Amicon PAE 1,000, SelectacelTM PEI, 3'-리보오스 프로브를 갖는 Boronate SPE, 프로브의 3'-말단에 상보적인 서열을 함유하는 SPE, 및 히드록실아파타이트를 포함한다. 특정 구체예로서, 뉴클레아제 영향을 받는 절단 부위에 의해 5' 라벨로부터 분리된 3' 비오틴 라벨을 포함하는 듀얼 라벨링된 올리고뉴클레오티드가 신호 수단으로서 적용되면, 반응 혼합물, 예컨대 PCR 증폭 혼합물은 애비딘 또는 스트렙트애비딘과 같은 특정 결합 요소를 함유하는 물질 또는 비이드 및 입자, 예컨대 자기 입자와 같은 고상 지지체에 결합된 비오틴에 대한 항체 또는 모노클로날 항체와 접촉될 수 있다.
반응 혼합물, 예컨대 PCR 혼합물이 SPE와 접촉한 단계에 이어, SPE 물질은 여과, 침강, 또는 자기 인력에 의해 제거되어 라벨링된 단편은 미절단 라벨링된 올리고뉴클레오티드를 갖지 않으므로 검출에 유용하다.
3. 결합 부위
본 발명에 따른 결합 부위는 뉴클레아제에 의한 프로브의 절단시 방출되고 또 결합 부위와 포획 요소 사이의 인력의 결과로서 포획 요소에 특이적으로 결합 (상보적 핵산과의 수소 결합을 통하여 또는 결합 단백질과의 상호 작용을 통하여)하는 프로브의 영역을 지칭하며, 이때 상기 결합 부위와 포획 요소 사이의 특이적 결합은 프로브의 2차 구조가 본 명세서에 정의된 바와 같이 변경될 때에만 생긴다.
"태그"는 프로브의 5' 말단에 작용적으로 연결되어 (예컨대 도 1의 R) 태그와 포획 요소 사이에 존재하는 인력의 결과로서 포획 요소에 특이적으로 결합하는 부위를 지칭하며, 또 상기 태그와 포획 요소 사이의 특이적 결합은 프로브의 2차 구조가 변경될 때 (예컨대, 태그가 포획 요소에 접근할 때)에만 생긴다. "특이적으로 결합"하는 것은 태그 및 포획 요소가 공유 결합을 통하여 또는 수소 결합을 통하여 또는 정전인력을 통하여 또는 예컨대 단백질과 리간드 사이의 상호작용, 항체와 항원 사이의 상호작용, 단백질 서브유닛 또는 핵산 결합 단백질 및 핵산 결합 부위 사이의 상호작용을 통한 결합을 의미한다. 제2 결합 부위는 비제한적으로 비오틴, 스트렙트애비딘, 합텐, 단백질, 또는 화학적 반응성 부위를 포함한다.
본 발명에 따르면, 결합 부위는 포획 요소에 결합되는 영역을 포함한다. 본 발명에 따른 포획 요소는 포획 요소에 결합되는 프로브의 영역을 포함하는 결합 부위에 상보적이고 또 에컨대 수소 결합을 통하여 결합되는 핵산 서열일 수 있다. 예컨대 결합 부위는 핵산 서열
Figure 112009038784823-PCT00011
(서열번호: 26) 을 포함하는 프로브의 영역이고 또 상응하는 포획 요소는 핵산 서열
Figure 112009038784823-PCT00012
(서열번호: 27)을 포함한다.
본 발명은 결합 부위-포획 요소 또는 태그-포획 요소 쌍을 제공하며, 이때 결합 부위 또는 태그는 DNA 결합 단백질이고 또 상응하는 포획 요소는 DNA 결합 단백질에 의해 인식되고 결합되는 DNA 서열이다. 본 발명은 결합 부위-포획 요소 또는 태그-포획 요소 쌍을 제공하며, 이때 포획 요소는 DNA 결합 단백질이고 또 상응하는 결합 부위 또는 태그는 DNA 결합 단백질에 의해 인식되고 결합되는 DNA 서열이다.
본 발명에 따라 유용한 DNA 결합 서열/DNA 결합 단백질은 상기 표제 "방출된 라벨링된 단편의 검출" 부분에 기재되어 있다.
상기 정의한 바와 같은 태그를 핵산(예컨대 본 발명에 따른 프로브)에 혼입하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있고 또 Ausubel et al., 상기 참조, Sambrook et al., 상기 참조, 및 미국 특허 5,716,854호 및 6,087,102호에 기재되어 있다.
IV . 프로브의 2차 구조의 안정성의 측정
A. 융점 에세이
융점 에세이는 이중 가닥 및 단일 가닥 DNA의 상이한 흡수 특성의 이점을 이용하며, 즉 이중 가닥 DNA (이중 가닥 DNA는 자체가 접혀져서 반평행 듀플렉스 구조를 생성하는 핵산 서열의 부분이며, 이때 상보적 서열(염기쌍)은 수소 결합을 통하여 결합됨)는 분광광도 측정에 의해 결정된 바와 같이 파장 260 n메서 단일 가닥 DNA에 비하여 적게 광을 흡수한다.
DNA의 변성은 좁은 온도 범위에 걸쳐서 생기며 또 DNA의 다수의 물리적 특성에서 현저한 변화를 초래한다. 특히 유용한 변화는 광학 밀도에서 생긴다. 뉴클레오티드의 헤테로시클릭 고리는 자외선 범위(최대가 각 염기에 대해 특징적인 260 n메 가까움)에서 강하게 광을 흡수한다. 그러나, DNA의 흡수는 동일 조성의 뉴클레오티드를 갖지 않는 혼합물이 나타내는 것에 비하여 거의 40% 적다. 이러한 효과를 흡광증가현상(hyperchromism)이라 불리며 염기의 전자 계 사이의 상호작용으로부터 생기며, 이중 나선의 평행 어레이에서 이들의 스택킹에 의해 제조된다. 듀플렉스 상태로부터 벗어나는 것은 이러한 효과의 감소에 의해 즉시 반영된다 (즉, 광학 밀도에서 증가에 의해 자유 염기의 특징 값으로 향함, 도 12a). 따라서 이중 가닥 DNA의 변성은 이러한 흡광증가현상에 의해 수반될 수 있다(도 12b 및 도 12c).
DNA의 가닥이 분리되는 동안 온도 범위의 중점은 융점이라 하고, Tm으로 표시한다. 광학 흡수에서의 변화에 의해 측정된 융점 곡선의 예는 도 12c에 도시한다. 이 곡선은 동일 형태를 취하지만, 온도 눈금에 대한 절대 위치(즉, 그의 Tm)은 DNA의 염기 조성 및 변성에 이용된 조건에 의해 영향을 받는다.
DNA 분자의 융점은 그의 염기 조성에 따라 달라진다. GC 염기 쌍이 풍부한 DNA 분자는 AT 염기 쌍이 풍부한 분자에 비하여 더 높은 Tm을 갖는다(도 12b). 다수 종으로부터 얻은 DNA의 Tm은 77에서 100℃까지 GC 함량에 대하여 선형적으로 변화되며, GC쌍의 분획은 20%에서 78%로 증가한다. 즉, 염기 조성에 대한 Tm의 의존성은 선형으로서, G-C 함량에서 % 증가에 대하여 약 0.4℃ 증가한다. GC 염기 쌍은 AT 쌍에 비하여 훨씬 안정한데 이는 이들의 염기는 2개보다는 3개의 수소 결합에 의해 함께 유지되기 때문이다. 또한 인접 GC 염기 쌍은 인접 AT 염기 쌍에 비하여 서로 더 강하게 상호작용한다. 따라서, DNA의 AT-풍푸 영역은 먼저 용융된다.
Tm 에 대한 주요 효과는 용액의 이온 세기에 의해 발휘된다. Tm 은 일가 양이온 농도의 10배 증가에 대하여 16.6℃ 증가한다. 가장 흔히 사용되는 조건은 0.12 M 포스페이트 완충액 중에서 DNA 조작을 실시하는 것으로, 0.18M의 일가 Na+ 농도와 90℃ 정도의 Tm을 제공한다.
Tm은 수소 결합을 불안정화시키는 포름아미드와 같은 시약 존재하에서 반응을 실시하는 것에 의해 현저하게 다양화될 수 있다. 이것은 DNA가 고온 노출로부터 기인할 수 있는 손상(가닥 파열과 같은)을 받지 않는 이점을 갖도록 Tm을 40℃ 정도로 감소시킨다. (Stryer, Biochemistry. 1998, 3rd Edition, W.H. Freeman and Co., pp.81-82 and Lewin, Genes II, 1985, John Wiley & Sons, p.63-64).
본 발명에 따른 프로브의 2차 구조의 안정성은 다음과 같이 융점 에세이로 측정한다.
흡수를 온도에 대하여 플러팅한 프로브에 대한 표준 곡선(예컨대 도 12c)은 약 0.2㎍/ml 내지 lOO㎍/ml의 프로브를 포함하는 샘플을 완충액에서 배양함으로써 프로브의 변성을 허용하고 또 다양한 온도에서 프로브의 변성과 재어닐링을 허용하기에 충분한 시간 동안 프로브를 재어닐링하며 또 석영 쿠베트(사용된 분광광도계에 적절한 통로, 예컨대 1-cm) 내의 샘플의 흡수도를 다양한 온도 범위에서 분광광도계로 측정하는 것에 의해 제조하며, 상기 온도의 하한은 적어도 50℃ 미만이고, 또 온도의 상한은 프로브의 Tm 또는 예측된 Tm의 적어도 50℃ 이상이다. 프로브의 Tm은 당해 분야에 잘 공지된 염기 조성을 기본으로 하여 예측한다 (참고, Sambrook, 상기 참조; Ausubel, 상기 참조). 표준 곡선을 생성하고 또 절단 반응에 적용될 특정 뉴클레아제에 가능하고 또 우선적으로 최적인 완충액을 비롯한 다양한 완충액 (예컨대 IX TNE 완충액 (10X-0.1 M Tris 염기, 10 mM EDTA, 2.0 M NaCl , pH 7.4), 본 명세서에 기재된 FEN 뉴클레아제 완충액, 본 명세서에 기재된 IX 클로닝된 Pfu 완충액, 본 명세서에 기재된 IX Sentinel 분자 비이콘 완충액)을 사용하여 비교한다. 완충액의 pH는 온도가 증가함에 따라서 모니터링되며, 또 필요에 따라 조절된다.
상기 에세이는 단일 비임 자외선 내지 가시 범위 (UV-VIS) 분광광도계에서 실시된다. 바람직하게는, 상기 에세이는 샘플 용액을 갖는 쿠베트를 블랭크(blank)를 함유하는 참조 쿠베트(매치된 쿠베트)을 자동으로 비교함으로써 측정을 간단화하는 이중-비임 분광광도계로 실시한다. 상기 블랭크는 동일 부피의 샘플 완충액이다.
분광광도계의 온도는 샘플의 흡수가 특정 온도에서 측정되도록 조절될 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 분광광도계는 비제한적으로 MicroTm Analysis Accessory (Beckman Coulter, Inc., Columbia, MD)와 조합된 Beckman Coulter DU®600/7000 분광광도계를 포함한다.
프로브의 절단 반응에 적용될 뉴클레아제에 가능하고 또 우선적으로 최적인 특정 온도 및 완충액에서 프로브의 2차 구조의 안정성은 상기와 같은 특정 온도에서 프로브의 흡수를 측정하고 또 흡수값이 표준 곡선으로부터 측정되는 바와 같이 T메서 흡수보다 낮은지 결정하는 것에 의해 결정되며, 이때 표준 곡선은 상기 시험 온도에서 사용된 바와 같은 동일 완충액 또는 상기 기재한 바와 같이 필적하는 표준 곡선을 생성하는 것으로 공지된 완충액을 사용하여 생성한다. 프로브의 2차 구조는 절단 반응의 온도 또는 그 이래에서 광 흡수 정도가 프로브의 Tm과 동일한 온도에서 광 흡수 정도보다 낮으면(예컨대 적어도 5%, 바람직하게는 20% 및 가장 바람직하게는 25% 이상) 절단 반응의 온도 또는 그 아래의 온도에서 (예컨대 절단이 실시되는 온도) 융점 에세이에서 안정하다. (도 12c 및 도 12d 참조).
B. FRET
FRET 에세이는 본 발명에서 2개 목적에 대해 유용하다. 그 첫째는 프로브의 2차 구조가 본 명세서에 기재된 바와 같이 "안정한"지 여부를 결정한다. 둘째는 프로브의 2차 구조가 표적 핵산에 프로브 결합시 변화를 거치는지 여부를 결정한다.
"FRET"는 여기가 공여체 분자에서부터 수용체 분자로 전달되는 2개 염료 분자의 전자 여기 상태 사이의 거리-의존적 상호작용이다. FRET는 거리 변화에 의해 유발되어 상호작용성 공명 에너지 수용체로부터 형광 공여체 군인 다른 형광단, 발색단 또는 켄처로부터 분리한다. 공여체 및 수용체 부위의 조합은 "FRET 쌍"으로 공지되어 있다. 효과적인 FRET 상호작용은 염료 쌍의 흡수 및 방출 스펙트럼이 고도의 오버랩을 갖는 것을 필요로 한다.
대부분의 구체예에서, FRET에 대한 공여체 및 수용체 염료는 상이하며, 이때 FRET는 수용체의 감작화된 형광의 출현에 의해 및/또는 공여체 형광의 켄칭에 의해 검출될 수 있다. 공여체 및 수용체가 동일하면, FRET은 생성한 형광 편광소멸(depolarization)에 의해 검출된다. FRET는 분자간 분리의 인버스 식스쓰 파워(inverse sixth power)에 의존한다.(Stryer et al., 1978, Ann. Rev. Biochem., 47:819; Selvin, 1995, Methods Enzvmol.. 246:300).
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "공여체"는 제1 파장에서 흡수하고 또 제2의 더 긴 파장에서 방출하는 형광단을 지칭한다. 용어 "수용체"는 공여체의 방출 스펙트럼과 중복되는 흡수 스펙트럼을 갖고 또 공여체 기 근처에 있을 때 (전형적으로 1-100 nm 사이) 공여체로부터 방출된 에너지의 일부 또는 대부분을 흡수할 수 있는 형광단, 발색단 또는 켄처를 지칭한다. 수용체가 FRET를 나타낼 수 있는 형광단이면, 제3의 여전히 더 긴 파장에서 재방출하며; 수용체가 발색단 또는 켄처이면, 광자를 방출함없이 공여체로부터 흡수된 에너지를 방출한다. 2개의 기가 인접할 때 수용체의 흡수 스펙트럼은 중복되지만, 용액에서 자유로울 때 분자의 스펙트럼에 대한 경우일 필요는 없다. 수용체는 본 명세서에 정의된 바와 같이 프로브가 표적 핵산에 결합되면 변화되는 프로브 2차 구조의 존재로 인하여 본 발명에 따른 프로브 상에서 공여체와 인접하게 배치될 때 FRET 또는 켄칭을 나타내는 형광단, 발색단 또는 켄처를 포함한다. 수용체는 a) Tm과 동일하거나 그 이상인 온도(예컨대 Tm보다 5℃ 이상, 예컨대 Tm보다 6℃, 10℃, 25℃, 50℃ 이상) 또는 b) 표적 핵산의 존재하에서 FRET 또는 켄칭을 나타내는 형광단, 발색단 또는 켄처를 포함한다.
"형광" 또는 "형광기" 또는 "형광단"으로 나타낸 것은 발광, 발광기 및 적합한 발색단을 포함한다. 적합한 발광 프로브는 비제한적으로 란튬 킬레이트로서 도입된 유로퓸 및 테르븀의 발광 이온을 포함한다(Heyduk & Heyduk, 1997). 란타나이드 이온은 또한 형광기에 에너기를 전달하는 좋은 공여체이다 (Selvin 1995). 란타나이드 이온을 함유하는 발광 기는 "오픈 케이지(open cage)" 킬레이터 포스포르아미디트를 이용하는 핵산에 혼입될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "켄칭"은 공여체에 의해 나타낸 형광 세기의 감소와 관련하여 공여체로부터 수용체로의 에너지 전달을 지칭한다.
공여체 및 수용체 기는 적합한 형광기, 발색단 및 켄칭 기로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 본 발명에 유용한 공여체 및 수용체는 비제한적으로 다음을 포함한다: 5 -FAM (5-카르복시플루오레세인으로도 불림; 또한 스피로(이소벤조푸란-1(3H), 9'-(9H)크산텐)-5-카르복시산, 3',6'-디히드록시;-3-옥소-6-카르복시플루오레세인으로도 불림); 5-테트라클로로-플루오레세인 ([4,7,2',7'-테트라클로로-(3',6'-디피발로일플루오레세이닐)-5-카르복시산]); 6-테트라클로로-플루오레세인 ([4,7,2',7'-테트라클로로-(3',6'-디피발로일플루오레세이닐)-6-카르복시산]); 5-TAMRA (S-카르복시테트라메틸로다민 크산틸륨, 9-(2,4-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸-아미노); 6-TAMRA (6-카르복시테트라메틸로다민; 크산틸륨, 9-(2,5-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노); EDANS (5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-설폰산); 1,5-IAEDANS (5-((((2-요도아세틸)아미노)에틸)아미노)나프탈렌-l-설폰산); DABCYL (4-((4-(디메틸아미노)페닐)아조)벤조산) Cy5 (인도디카르보시아닌-5) Cy3 (인도디카르보시아닌-3); 및 BODIPY FL (2,6-디브로모-4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라- 3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산), 뿐만 아니라 그의 적합한 유도체.
본 발명의 특정 구체예로서, 프로브는 2개의 발색단으로 라벨링될 수 있고, 또 형광에서의 변화를 측정하는대신 라벨 상의 흡수 스펙트럼의 변화가 검출 신호로 이용된다.
본 발명의 방법에서, 프로브의 형광 세기는 당해 분야에 공지된 방법에 따라 형광 분광광도계 또는 마이크로티터 플레이트 판독기를 이용하여 1 이상의 파장에서 측정한다.
C. 형광 켄칭 에세이
형광 켄칭 에세이는 2개 목적 면에서 본 발명에 유용하다. 첫 째는 프로브의 2차 구조가 본 명세서에 정의된 바와 같이 "안정"한지 결정하기 위해서이다. 둘 째는 프로브가 표적 핵산에 결합될 때 프로브의 2차 구조가 변화되는지 결정하기 위해서이다.
본 발명에 따른 프로브는 상호작용성 라벨 쌍 또는 내부 활성 신호 생성 부위 쌍 (예컨대 FRET 또는 비-FRET 쌍)에 의해 라벨링되며, 이때 상기 쌍의 1개 멤버는 형광단이고 또 상기 쌍의 다른 멤버는 켄처이다. 예컨대, 본 발명에 따른 프로브는 형광단 및 켄처에 의해 라벨링되며 또 형광은 표적 핵산의 부재하, 예컨대 범위의 하한 온도가 프로브의 Tm 또는 예상된 Tm의 적어도 50℃ 미만이고 또 범위의 상한 온도가 Tm 또는 예상된 Tm의 적어도 50℃ 이상인 다양한 온도 범위에 걸쳐 측정된다.
D. 안정성
본 발명에 따른 프로브의 2차 구조의 안정성은 다음과 같이 측정한다. 프로브는 상호작용성 라벨 쌍(예컨대, 테트라메틸로다민 및 DABCYL), 또는 상호작용성 라벨 (FRET 또는 비-FRET 쌍)에 의해 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 라벨링된다(예컨대 Glazer and Mathies, 1997, Curr . Opin . Biotechnol.. 8:94; Ju et al., 1995, Analytical Biochem., 231:131)에 기재). 프로브 상에서 상호작용성 라벨의 위치는 프로브가 표적 핵산에 결합된 후 프로브의 2차 구조가 변화될 때 라벨이 분리되도록 되어 있다.
형광이 온도에 대하여 플럿된 프로브의 표준 곡선(예컨대 도 12e)는 IX 용융 완충액 (2OmM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM MgCl2) 또는 다르게는 5 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 또는 다른 적절한 완충액에서 전형적으로 125 nM 프로브를 포함하는 샘플을 프로브의 변성과 재어닐링이 허용되기에 충분한 시간 동안 배양함으로써 제조한다. 전형적으로 표준 곡선은 분당 1℃ 변화를 거치는 형광계 또는 분광계를 이용하여 생성되며 또 형광계 또는 주사 형광 분광광도계를 이용하여 형광을 측정하며 이때 온도 하한 범위는 프로브의 Tm 또는 예상된 Tm의 적어도 50℃ 미만이고 또 온도 상한 범위는 프로브의 Tm 또는 예상된 Tm의 적어도 50℃ 이상이다. 프로브의 Tm은 본 발명에 공지된 방법에 따라 염기 쌍 조성을 기초로 예상된다 (참고, Sambrook, 상기 참조; Ausubel, 상기 참조).
표준 곡선은 절단 반응에 적용될 특정 뉴클레아제에 가능하고 또 우선적으로 최적인 완충액을 비롯한 다양한 완충액 (예컨대 IX TNE 완충액 (10X- 0.1M Tris base, 10 mM EDTA, 2.0 M NaCl , pH 7.4), 본 명세서에 기재된 FEN 뉴클레아제 완충액, 본 명세서에 기재된 IX 클로닝된 Pfu 완충액, 본 명세서에 기재된 IX Sentinel 분자 비이콘 완충액)을 사용하여 생성하여 비교한다. 완충액의 pH는 온도가 증가함에 따라서 모니터링하며 또 필요에 따라 조절된다.
형광계 또는 분광광도계의 온도는 샘플의 형광이 특정 온도에서 측정되도록 조절될 수 있다. 형광은 예컨대 온도 조절가능한 수조를 구비한 Perkin-Elmer LS50B Luminescence Spectrometer (예컨대 Fisher Scientific으로부터 구입)을 이용하여 측정될 수 있다.
특정 온도에서 프로브의 2차 구조의 안정성은 상기 기재한 바와 같이 특정 온도에서 프로브의 형광을 측정하고 또 그 형광값이 표준 곡선으로부터 측정한 바와 같은 T메서 형광 미만인지 여부를 결정함으로써 측정한다. 프로브의 2차 구조는 절단반응이 변경(예컨대 적어도 5%, 바람직하게는 20% 및 가장 바람직하게는 25% 이상 또는 이하)되는 온도 또는 그 온도 미만에서 형광의 정도가 프로브의 Tm과 동일한 온도에서 형광의 정도이면 절단반응의 온도 또는 그 미만의 온도에서의 FRET 에세이에서 "안정"하다. 프로브의 2차 구조는 절단반응이 적은(예컨대 적어도 5%, 바람직하게는 20% 및 가장 바람직하게는 25% 이상 또는 이하) 온도 또는 그 온도 미만에서 형광의 정도가 프로브의 Tm과 동일한 온도에서 형광의 정도이면 절단반응의 온도 또는 그 미만의 온도에서의 형광 켄칭 에세이에서 "안정"하다.
다르게는, 프로브의 2차 구조의 안정성은 상기 기재한 바와 같이 다양한 범위의 온도에서 상호작용성 라벨 쌍으로 라벨링된 프로브의 형광을 측정하기 위하여본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Gelfand et al.의 방법 (1999, Proc . Natl . Acad. Sci . USA, 96:6113)을 변형하여 결정한다.
V. 2차 구조의 검출
본 발명에 따른 2차 구조는 상기 기재한 바와 같은 FRET 또는 형광 켄칭 에세이에서 상호작용성 라벨 쌍을 포함하는 프로브에 대하여 형광 대 온도의 표준 곡선을 생성함으로써 검출된다. (참조 도 12e). 온도 변화와 관련된 형광의 변화를 나타내는 프로브(도 12e 참조)(예컨대 FRET 반응의 온도가 증가함에 따라 형광이 증가함)는 2차 구조를 형성할 수 있다.
VI . 2차 구조에서의 변화 측정
본 발명에 따른 2차 구조에서 "변화"는 프로브의 Tm 미만의 특정 온도(예컨대 절단 온도)에서, 상술한 바와 같이 10OnM 내지 lOμM의 표적 핵산 (전형적으로 표적 핵산은 프로브 농도에 대하여 2-4 몰 과량이며, 예컨대 250-500 nM 표적핵산이 사용됨) 존재하 또는 부재하에서, FRET 또는 형광 켄칭 에세이에서 상호작용성 라벨 쌍을 포함하는 프로브를 분석함으로써 검출한다.
다르게는, 프로브의 2차 구조에서의 변화는 상기 기재한 바와 같이 표적 핵산의 존재하 또는 부재하에서 상호작용성 라벨 쌍으로 라벨링된 프로브의 형광을 측정하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 Gelfand et al. (1999, Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 96:6113)의 방법을 변형시켜 측정한다.
본 발명에 따른 프로브가 표적 핵산에 결합할 때 생기는 2차 구조에서의 "변화"는 형광에서의 증가로서 측정되며, 프로브의 Tm 아래의 온도에서 프로브가 표적 핵산에 결합된 후 형광의 정도는 표적 핵산 부재하에서 관찰된 형광 수준보다 더 크다(예컨대 적어도 5%, 바람직하게는 5-20% 및 더욱 바람직하게는 25% 이상 또는 이하)(참조 도 12g).
VII . 사용 방법
본 발명은 표적 핵산을 프로브와 배양하여 라벨링된 절단 구조를 형성하는 단계 및 상기 절단 구조를 뉴클레아제(예컨대 FEN 뉴클레아제)로 절단하는 단계를 포함하는 샘플에서 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 이하에 기재된 바와 같은 PCR 계 에세이에 이용될 수 있다.
상류 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 도 4의 A), 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단 라벨링된 하류 및 표적 핵산 (예컨대 도 4의 B)을 포함하는 라벨링된 절단 구조는 표제 "절단 구조" 부분에서 상기 기재한 바와 같이 형성된다. 일부 구체예로서, 하류 프로브는 표적 핵산에 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 (예컨대 도 4의 C)를 포함한다. 간단히 말해, 절단 구조는 표적 핵산의 존재하, 상류 프라이머 (예컨대 도 4의 A), 상기 정의된 바와 같은 라벨링된 하류 프로브(예컨대 도 4의 C), 경우에 따라 표적 핵산에 특이적인 증폭 프라이머, 핵산 중합효소 활성 (예컨대 DNA 중합효소), 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 및 적절한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액, Stratagene 제조, 카탈로그# 200536)의 존재하 또는 부재하에서 다음 열주기(thermocycling) 변수에 의해 PCR 반응으로 형성되고 절단된다: 95℃ 에서 2분 및 95℃에서 15초의 40 주기 (변성 단계), 60℃에서 60초 (어닐링 단계) 및 72℃에서 15초 (연장 단계). 상기 반응 동안 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 도 4의 A)는 올리고뉴클레오티드 A가 본 발명에 따른 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 올리고뉴클레오티드 C, 도 4)의 5' 라벨링된 말단을 부분적으로 치환하고 또 생성한 라벨링된 구조는 본 발명에 따른 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단되도록 연장된다. 다르게는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 2차 구조(스템 루프, 헤어핀, 내부 루프, 벌지 루프, 분기 구조 및 슈도노트 포함), 또는 다수의 2차 구조, 클로버잎 형 구조 또는 본 명세서에 정의한 바와 같은 3차원 구조를 포함하는 하류 프로브가 또한 사용될 수 있다. 본 명세서에 정의한 바와 같은 이분자- 또는 다분자 프로브가 또한 사용될 수 있다. 방출된 라벨링된 단편은 당해 분야에 공지된 방법에 따라서 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합부위가 특이적으로 결합됨으로써 포획된다 (참조: Sambrook et al., 상기 참조 및 Ausubel et al., 상기 참조). 다르게는, 방출된 라벨링된 단편 또는 절단된 하류 프로브는 직접적으로 검출된다 (예컨대 신호 생성 부위의 내부 활성 쌍 사이의 하류 프로브의 절단).
상류 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 A, 도 14), 상호작용성 라벨 쌍을 갖는 하류 절단 내성 프로브 (예컨대 B, 도 14) 및 표적 핵산을 포함하는 라벨링된 절단 구조는 표제 "절단 구조" 부분에서 상기 기재한 바와 같이 형성한다. 간단히 말해, 절단 구조는 표적 핵산, 상류 프라이머 (예컨대 도 4의 A), 상호작용성 라벨을 갖는 하류 절단 내성 프로브 (예컨대 도 14의 B), 경우에 따라 표적 핵산에 특이적인 증폭 프라이머 (예컨대 표적을 증폭하는 정방향 및 역방향 프라이머), 핵산 중합효소 활성 (예컨대 DNA 중합효소), 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 및 적절한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액, Stratagene 제조, 카탈로그# 200536)의 존재하에서 다음 열주기(thermocycling) 변수에 의해 PCR 반응으로 형성되고 절단된다: 95℃ 에서 2분 및 95℃에서 15초의 40 주기 (변성 단계), 60℃에서 60초 (어닐링 단계) 및 72℃에서 15초 (연장 단계). 상기 반응 동안 상류 프라이머 (예컨대 도 14의 A)는 올리고뉴클레오티드의 연장된 3' 말단이 본 발명에 따르 하류 절단 내성 프로브의 5' 상보적 영역에 인접(예컨대 측면)하도록 연장되어 비-오버래핑 (예컨대 비침습적) 절단 구조를 형성한다. 생성한 라벨링된 구조는 절단되기 쉬운 부위(예컨대 +1 위치의 상류)에서 본 발명에 따른 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단된다. 방출된 라벨링된 단편 또는 절단된 하류 프로브는 직접적으로 검출된다 (예컨대 신호 생성 부위의 내부 활성 쌍 사이의 하류 프로브의 절단).
다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드는 또한 반응에 포함되며, 이때 상류 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 1 이상의 비상보적 뉴클레오티드를 갖는다. 따라서 반응은 2개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드의 혼합물, 비상보적 3' 말단을 갖는 상류 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 함유한다. 일 구체예로서, 프라이머 및 상류 올리고뉴클레오티드는 표적의 동일 일반 영역에 상보적이어서 이들의 어닐링은 다른 것과의 어닐링을 배제한다. 다른 구체예로서, 상류 올리고뉴클레오티드는 프라이머의 하류이지만, 절단 내성 프로브의 상류이다. 이 구체예에서, 상류 올리고뉴클레오티드는 프라이머와 프로브 사이를 혼성화한다. 상류 올리고뉴클레오티드는 절단 내성 프로브의 하류의 절단을 선호하는 반면 프라이머는 표적의 증폭을 선호하는 비침습적 절단 구조를 형성한다.
프라이머는 중합효소에 의한 연장시 침습적 절단 구조를 형성할 수 있다. 그러나, 프라이머의 연장은 절단처리되지 않은 변형 영역에서 절단 내성 프로브의 절단을 지시한다(도 14B/C).
다른 구체예로서, 절단 내성 프로브는 비-PCR 계 방법에 사용된다. 이 구체예에서, 상류 올리고뉴클레오티드 및 상호작용성 라벨 쌍을 갖는 하류 절단 내성 프로브 및 표적 핵산을 포함하는 라벨링된 절단 구조는 표제 "절단 구조" 부분에 상기 기재한 바와 같이 형성된다. 간단히 말해, 절단 구조는 표적 핵산, 상류 올리고뉴클레오티드, 상호활성 라벨 쌍을 갖는 하류 절단 내성 프로브, 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 및 적절한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액, Stratagene 제조, 카탈로그# 200536)의 존재하에서 다음 열주기(thermocycling) 변수에 의해 PCR 반응으로 형성되고 절단된다: 95℃ 에서 2분 및 95℃에서 15초의 40 주기 (변성 단계), 60℃에서 60초 (어닐링 단계) 및 72℃에서 15초 (연장 단계). 이 구체예에서, 상류 올리고뉴클레오티드는 중합효소에 의해 연장되지 않지만(예컨대 차단된 상류 올리고뉴클레오티드, 중합효소 존재하지 않음, dNTP 없음), 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 올리고뉴클레오티드는 비-오버래핑 절단 구조를 형성하도록 충분히 가깝다(예컨대 측면). 생성한 라벨링된 구조는 본 발명에 다른 뉴클레아제(예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단되기 쉬운 부위(예컨대 +1 위치의 상류)에서 절단된다. 방출된 라벨링된 단편 또는 절단된 하류 프로브는 직접적으로 검출된다(예컨대 신호 생성 부위의 상호활성 부위 사이의 하류 프로브의 절단)
본 발명의 방법은 표적 핵산을 검출하기 위한 비-PCR 계 적용에 사용될 수 있고, 이러한 표적은 고상 지지체 상에 고정될 수 있다. 고상 지지체 상에 핵산 서열을 고정화하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있고 또 Ausubel FM et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. 및 제조자에 의해 제공된 순서에 기재되어 있고, 예컨대 막의 경우: Pall Corporation, Schleicher & Schuell, 자기 비이드의 경우: Dynal, for culture plates: Costar, Nalgenunc, 및 본 발명에 따라 유용한 다른 지지체의 경우 CPG, Inc에 기재되어 있다. 본 발명에 따라 유용한 고상 지지체는 비제한적으로 실리카 계 물질, 막 계 물질 및 표제 "절단 구조" 부분에 상기 기재된 고상 지지체를 비롯한 표면을 포함하는 비이드 및 스티렌, 라텍스 또는 실리카 계 물질 및 기타 중합체를 포함한다. 자기 비이드는 본 발명에 따라 유용하다. 고상 지지체는 상기 제조자 및 기타 공지된 제조자로부터 얻을 수 있다.
본 발명은 용액 중의 표적 핵산을 검출하기 위한 비-PCR계 에세이를 제공한다. 본 발명의 방법은 용액 중의 천연 산출 표적 핵산을 검출하기 위해 사용되며, 비제한적으로 세포, 조직, 단일 세포 생물, 세균 또는 바이러스로부터 분리되고 정제된 RNA 및 DNA를 포함한다. 본 발명의 방법은 용액 중의 합성 표적을 검출하기 위해 이용될 수 있으며, 비제한적으로 RNA 또는 DNA 올리고뉴클레오티드, 및 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다. 비-PCR 에세이는 비제한적으로 등온성 선형 또는 지수 증폭을 비롯한 검출 에세이를 포함하며, 이때 3'-5' 합성 활성에 의해 합성된 핵산의 양은 선형적으로 또는 지수적으로 증가하며, 합성하는 동안 치환된 가닥을 절단하기 위해 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)가 사용된다. 이러한 1개 예는 롤링 써클 증폭을 이용한다.
본 발명의 일 구체예로서, 고정화되지 않거나 또는 용액 중의 핵산 표적 서열의 검출은 용액 중의 고정화되지 않은 핵산 표적 서열 또는 표적 핵산을 표적 핵산에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드 프라이머 (예컨대 도 4의 A) 및 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 도 4의 C), 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 및 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 보유하거나 또는 결여된 핵산 중합효소를 배양함으로써 실시될 수 있다. 하류 프로브는 5' 또는 3' 말단에서 말단 라벨링되거나, 또는 내부적으로 라벨링된다. 다르게는, 상기 정의한 바와 같이 2차 구조(스템 루프, 헤어핀, 내부 루프, 벌지 루프, 분기 구조 및 슈도노트 포함), 또는 다수의 2차 구조, 클로버잎 형 구조 또는 상기 정의한 바와 같은 3차원 구조를 갖는 하류 프로브가 사용될 수 있다. 본 명세서에 정의된 바와 같은 이분자- 또는 다분자 프로브가 또한 사용될 수 있다. 포획 요소에 결합 부위의 결합에 의해 포획된 방출된 라벨링된 단편의 검출은 프로브에 혼입된 특정 라벨에 대해 적절하고 당해 분야에 잘 공지된 동위원소적, 효소적, 또는 비색정량적 방법을 포함한다 (예컨대, Sambrook et al., 상기 참조, Ausubel et al., 상기 참조). 본 발명에 따라 유용한 라벨 및 본 발명에 따라 유용한 라벨을 검출하는 방법은 표제 "절단 구조" 부분에 기재되어 있다. 다르게는, 하류 프로브는 또한 프로브가 완전할 때 검출가능한 신호의 생성이 켄칭되고 또 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 뉴클레아제 절단 부위 (예컨대 FEN 뉴클레아제 절단 부위)에 의해 분리되도록 위치한 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍(예컨대 염료 및 켄처)을 더 포함한다. 다른 구체예로서, 하류 프로브는 프로브가 표적 핵산에 혼성화되지 안을 때, 검출가능한 신호의 생성이 켄칭되도록 위치한 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍(예컨대 염료 및 켄처)를 더 포함한다. 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의한 절단시, 2개의 신호 생성 부위는 각각 분리되며 또 검출가능한 신호가 생성된다. 상기 기재한 바와 같은 상호작용성 신호 생성 라벨링된 잔기 쌍의 존재는 포획 요소에 결합될 수 있는 어닐링된, 미절단 프로브와 포획 요소에 결합된 방출된 라벨링된 단편 사이의 구별을 허용한다. 본 발명의 방법에 따라서 용액 중의 고정화되지 않은 핵산 표적 서열 또는 핵산 표적 서열을 검출하는데 유용한 핵산 중합효소는 5' →3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 중온성, 호열성, 초호열성 DNA 중합효소를 포함한다(표제 "핵산 중합효소" 부분에 기재됨). 5'→3'엑소뉴클레아제 활성을 보유한 핵산 중합효소는 본 발명에 따라 유용하다.
상기 비-PCR계 방법에 따르면, 검출될 수 있는 표적 핵산의 양은 바람직하게는 약 lpg 내지 ㎍, 더욱 바람직하게는 약 lpg 내지 10 ng 및 가장 바람직하게는 약 lpg 내지 lO pg이다. 다르게는, 상기 비-PCR계 방법은 바람직하게는 약 1 분자 내지 1020 분자, 더욱 바람직하게는 약 100 분자 내지 1017 분자 및 가장 바람직하게는 약 1000 분자 내지 1014 분자를 측정하거나 검출할 수 있다.
본 발명은 또한 표제 "절단 구조"부분에 기재된 바와 같이 절단 구조가 형성된 샘플 중의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공하며, 상기 표적 핵산은 등온 방법, 예컨대 롤링 써클(rolling circle), 자가-유지된 서열 복제 증폭(3SR), 전사 계 증폭 시스템(TAS), 및 가닥 치환 증폭법 (SDA) 및 비-등온 방법, 예컨대 결찰 사슬 반응(LCR)을 포함한 비-PCR 계 방법에 의해 증폭된다. 비-PCR 증폭 방법에 유용한 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)는 이용된 특정 증폭 방법에 적합한 온도 범위에서 활성일 것이다.
이하에 기재된 증폭 방법에서, 표적을 정량하기 위해 제조될 필요가 있는 샘플은 다음을 포함한다: 샘플, 비-주형 대조군, 및 표준 곡선의 제조를 위한 반응 (정의된 양의 표적을 갖는 용액의 자성의 6승의 범위에 걸친 희석물 함유).
가닥 치환 증폭(Strand Displacement Amplication) (SDA)은 인식 부위의 헤미포스포로티오에이트 형태의 비변형 가닥을 닉(nick)하기 위한 제한 효소능을 기본으로 한다. 적절한 DNA 중합효소는 닉에서 복제를 개시할 것이고 또 비-주형 가닥 하류를 치환할 것이다 (Walker, 1992, Proc . Natl . Acad . Sci . USA. 89: 392, and PCR Methods and Applications 3: 1-6, 1993). SDA의 방법에 따라 사용되는 중합효소 (Bca 및 Bst)는 본 발명에 따른 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 지시된 절단에 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 분자 비이콘은 42℃에서 활성인 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 치환되며 또 절단 프로브는 표적 핵산에 결합될 때 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하며 또 본 발명에 따른 절단 구조를 포함한다.
분자 비이콘 (Mb)은 용액에서 스템-루프 구조를 형성하는 형광성 프로브이다. 전형적으로: 5'-형광 염료 (예컨대 FAM), 5'-스템 영역 (5-7 nt에 부착됨), 루프 영역 (표적에 대해 상보적, 20 내지 30 nt), 3'-스템 영역 (5'-스템 영역에 상보적) 및 켄처 (예컨대 DABCYL). 표적이 존재하지 않으면, MB는 그의 스템을 형성하여 염료 및 켄처를 인접한 곳으로 보내며, 따라서 형광이 방출되지 않는다. MB 가 그의 표적에 결합하면, 스템이 개방되고, 염료는 켄처로부터 공간적으로 분리되므로, 프로브는 형광을 방출한다 (Tyagi S and Kramer FR, Nature Biotechnology 14: 303-308 (1996) 및 미국특허 5,925,517호).
가닥 치환 증폭(Strand Displacement 증폭:SDA)은 Spargo et al., Molecular and Cellular Probes 10: 247-256 (1996)에 의해 기재된 바와 같이 주로 실시된다. 사용된 효소는 제한 엔도뉴클레아제 BsoBI (New England Biolabs), DNA 중합효소 5'-엑소-Bca (Pan Vera Corporation)를 포함한다. 표적은 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis:Mtb) 게놈에서 발견된 삽입-유사 요소(IS6110)이다. 사용된 프라이머는 Bl:
Figure 112009038784823-PCT00013
(서열번호: 35), B2:
Figure 112009038784823-PCT00014
(서열번호: 36), Sl:
Figure 112009038784823-PCT00015
(서열번호: 37) 및 S2:
Figure 112009038784823-PCT00016
(서열번호: 38)이다. 미코박테륨 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis:Mtb) 게놈 DNA는 인간 태반 DNA에서 연속적으로 희석된다. SDA는 0 내지 1000 Mtb 게놈 상당물, 500 ng 인간 태반 DNA, 160 유닛 BsoB 1, 8 유닛의 5'-엑소-Bca, 1.4 mM이 각 dCTP알파S, TTP, dGTP, dATP, 35 mM K2PO4, pH 7.60.1 mg/ml 아실화된 소 혈청 알부민 (BSA), 3 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 11 mM NaCl, 0.3 mM DTT, 4 mM KCl, 4% 글리세롤, 0.008 mM EDTA, 500 nM 프라이머 Sl 및 S2 및 50 nM 프라이머 Bl 및 B2 (KCl, 글리세롤 및 EDTA가 BsoB 1 저장 용액에 의해 분포됨)를 함유하는 50㎕ 샘플에서 실시된다. 15㎕의 뉴 잉글랜드 바이오랩스 완충액 2 (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT) 중의 BsoB 1 및 5'-엑소 Bca (10.7 유닛/l BsoBI 및 0.53 유닛/㎕ 5'-엑소 Bca를 부가하기 전에 비등 수조에서 3분간 샘플 (35㎕)을 가열한다. 60℃에서 15분간 배양한 다음 비등 수조에서 5분간 배양한다.
5 ㎕의 각 샘플을 검출을 위해 2회(duplicate) 제거한다. 각 반응물은 IX 클로닝된 Pfu 완충액, 3.0 mM MgCl2, 200㎕의 각 dNTP, 5 유닛 exo-Pfu, 23 ng Pfu FEN-1, 1 ng PEF, 300 nM 각 상류 프라이머:
Figure 112009038784823-PCT00017
(서열번호: 39) 및 형광 프로브 (예컨대 FAM-DABCYL):
Figure 112009038784823-PCT00018
(서열번호: 40)를 함유한다. 이 반응은 온도 순환장치에서 1주기 처리시킨다: 95℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분. 형광은 형광 플레이트 판독기, 예컨대 Stratagene의 FluorTracker 또는 PE Biosystems의 7700 서열 검출 시스템-플레이트 리드 모드(Detection System in Plate-Read Mode)으로 측정한다. 본 발명의 방법은 5'→3'엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 실시할 수 있다.
핵산 서열 계 증폭(NASBA) 방법에 따르면, 분자 비이콘은 실시간 NASBA RNA 증폭의 정량을 위해 사용될 수 있다 (Leone, et al., 1998. Nucleic Acids Res . 26: 2150). 본 발명의 방법에 따르면, NASBA 분자 비이콘 프로브가 표적 핵산에 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하고 또 본 발명에 따른 절단 구조 및 41℃에서 활성인 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)를 더 포함하는 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 절단성 프로브에 의해 치환된다.
NASBA 증폭은 Leone G, et al., Nucleic Acids Res. 26: 2150-2155 (1998)에 의해 기재된 바와 같이 실질적으로 실시된다. 감자 잎말림 바이러스(potato leafroll virus: PLRV)의 게놈 RNA는 Leone G et al., J. Virol. Methods 66: 19-27 (1997)에 자세하게 기재된 PD415 또는 PD416 (안티센스) 및 PD417 (센스) 프라이머를 사용하여 증폭한다. 각 NASBA 반응은 6㎕의 멸균수, 4㎕의 5 X NASBA 완충액 (5 X NASBA 완충액은 200 mM Tris-HCl, pH 8.5, 60 mM MgCl2, 350 mM KCl, 2.5 mM DTT, 5 mM의 각 dNTP, 10 mM의 각 ATP, UTP 및 CTP, 7.5 mM GTP 및 2.5 mM ITP임), 4㎕의 5 X 프라이머 혼합물 (75% DMSO 및 1㎕의 각 안티센스 및 센스 프라이머)의 프리믹스(premix)를 함유한다. 이 프리믹스를 14 ㎕ 등분량(aliquot)으로 나누고, 여기에 1 ㎕의 PLRV 표적을 부가한다. 65℃에서 5분 배앙하고 5분간 41℃로 냉각시킨 후, 5㎕의 효소 혼합물을 부가한다(반응당 375 mM 소르비톨, 2.1㎕ BSA, 0.08 유닛의 RNase H (Pharmacia), 32 유닛의 T7 RNA 중합효소 (Pharmacia) 및 6.4 유닛의 AMV-RT (Seigakaku)).
일 구체예로서, 5㎕의 각 샘플을 검출을 위해 2회(duplicate) 제거한다. 각 반응물은 1 X 클로닝된 Pfu 완충액, 3.0 mM MgCl2, 200㎕의 각 dNTP, 5 유닛 exo-Pfu, 23 ng Pfu FEN-1, 1 ng PEF, 300 nM의 각 상류 프라이머 PD415 또는 PD416 및 형광성 프로브 (예컨대 FAM-DABCYL):
Figure 112009038784823-PCT00019
(서열번호: 41)를 함유한다. 반응은 온도 순환장치에서 1주기 처리한다: 95℃에서 2분간, 55℃에서 1분간, 72℃에서 1분, 형광은 형광 플레이트 판독기, 예컨대 Stratagene의 FluorTracker 또는 PE Biosystems의 7700 서열 검출 시스템 인 플레이트-리드 모드를 이용하여 측정한다.
다른 구체예로서, 검출 반응은 형광 프로브 및 Pfu FEN-1 뉴클레아제를 비-PCR 계 증폭 (예컨대 NASBA) 반응 혼합물에 직접 부가함으로써 실시한다. 형광 프로브는 프로모터 영역의 표적 하류 영역에 상보적으로 설계된다. RNA 중합효소는 프로모터 영역에 결합되어 RNA를 합성한다. 합성된 RNA의 3' 말단은 2개의 올리고뉴클레오티드가 충분히 가까울 때 하류 프로브를 갖는 절단구조를 형성할 것이다. 따라서 상기 방법에서, 증폭 및 절단이 동시에 생긴다. 형광은 Stratagene의 Mx3005P QPCR System 으로 측정할 수 있다.
본 발명의 다른 방법으로서, 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대 RNA 중합효소에 의해 합성된 RNA) (예컨대 도 4의 A), 라벨링된 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 및 표적 핵산 (예컨대 도 4의 B)를 포함하는 라벨링된 절단 구조는 표제 "절단 구조" 부분에 상기 기재한 바와 같이 형성한다. 일부 구체예로서, 하류 프로브는 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 (예컨대 도 4의 C)를 포함한다. 간단히 말해, 절단 구조는 표적 핵산의 존재하, 상류 프라이머 (예컨대 도 4의 A), 본 명세서에 정의된 바와 같은 라벨링된 하류 프로브 (예컨대 도 4의 C), 핵산 중합효소 활성 (예컨대 RNA 중합효소), 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 및 적절한 완충액 (예컨대 IX Pfu 완충액, Stratagene 제조, 카탈로그 #200536)의 존재하 또는 부재하 ((RNA 중합효소가 RNA 합성을 개시하기 위하여 프로모터 또는 프라이머 를 사용하는지 여부에 따라 다름)에서 다음 열주기 변수를 갖는 반응으로 형성되고 절단된다: 95℃에서 1-2분 후 약 40-72℃로 냉각시킴. 상기 반응 동안 상류 올리고뉴클레오티드 (예컨대, 도 4의 A)는 올리고뉴클레오티드 A가 본 발명에 따른 하류 올리고뉴클레오티드 프로브 (예컨대 올리고뉴클레오티드 C, 도 4)의 5' 라벨링된 말단을 부분적으로 치환되고 또 생성한 라벨링된 구조는 본 발명에 따른 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의해 절단되도록 RNA 중합효소에 의해 연장된다. 방출된 라벨링된 단편은 당해 분야에 공지된 방법에 따라 고상 지지체 위의 포획 요소에 결합 부위가 특이적으로 결합되는 것에 의해 포획될 수 있다. (참고: Sambrook et al., 상기 참조 및 Ausubel et al., 상기 참조). 다르게는, 방출된 라벨링된 단편 또는 절단된 하류 프로브는 직접적으로 검출된다 (예컨대 신호 생성 부위의 상호작용성 쌍 사이에서 하류 프로브의 절단).
일반적으로, 증폭이 비-PCR 계 방법에 의해 생기는 이들 방법에 따르면, 증폭은 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 존재하에서 실시될 수 있으며, 또 증폭 및 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의한 절단은 동시에 생긴다. 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합 부위가 결합됨으로써 포획된 방출된 라벨링된 단편의 검출은 표제 "절단 구조" 부분에 기재한 바와 같이 실시하며 또 증폭 및 절단 과정이 완료되는 것과 동시에(실시간) 또는 후(종점)에 생길 수 있다.
종점 에세이는 비-PCR 계 방법에 의해 생성된 증폭된 표적을 정량하기 위해 사용될 수 있으며, 상기 증폭 단계는 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) (상기 기재) 존재하에서 실시한다.
반응에 존재하는 DNA 주형으로부터 RNA를 합성하는 시험관내 전사 반응을 이용할 수 있다. T7-형 RNA 중합효소, 예컨대 T7 RNA 중합효소, T3 RNA 중합효소 또는 SP6 RNA 중합효소가 이러한 반응에 보통 사용되지만, 다수의 다른 RNA 중합효소도 또한 사용될 수 있다. 반드시 그런 것은 아니나, 통상, RNA의 합성은 신생(de novo)(예컨대 프라이밍되지 않음)이며, 반드시 그런 것은 아니라 흔히, 전사는 "프로모터" 또는 "프로모터 영역"이라 불리는 RNA 중합효소에 의해 특이적으로 인식되는 주형 중의 서열에서 개시된다. 시험관내 전사 방법은 본 명세서에 제시되어 있다.
RNA 중합효소는 표적 서열을 증폭하기 위하여 사용되었다 (Krupp, G., and Soil, D. FEBS Letters (1987) 212:271-275). 이 방법은 표적 서열의 이중 가닥 카피의 생성, RNA 중합효소 프로모터 서열의삽입, 상기 카피(copy)의 전사 및 혼성화 에세이에 의한 검출을 포함한다 (Kwoh, D. Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1989) 86:1173-1177). 박테리오파아지 DNA-의존적 RNA 중합효소 (예컨대 T3, T7, SP6)는 클로닝된 또는 합성 올리고뉴클레오티드 주형으로부터 특정 RNA 서열을 시험관내 제조하는데 이미 이용되었고 또 잘 공지되어 있다 (Melton, D. A., et al., Nucleic Acids Res. (1984) 12:7035-7056); Chamberlin, M. and Ryan, T., (1982) in "The Enzymes," Boyer, P. D., ed., 15:87-108; Martin, C. T., and Coleman, J. E., Biochemistry (1987) 26:2690-2696). 이들 중합효소는 고도로 프로모터 특이적이다. 다양한 T7 프로모터로부터 얻은 DNA 서열이 공지되어 있고 또 콘센서스 서열이 유추되었다(Oakley, J. L., and Coleman, J. E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. (1977) 74:4266-4270; Dunn, J. J., and Studier, F. W., J. Molec. Biol. (1983) 166:477-535). 이들 RNA 중합효소를 기본한 방법은 FEN 뉴클레아제 및 검출가능하게 라벨링된 프로브가 반응 혼합물에 부가되어 증폭과 검출 반응이 동시에 진행되게 하도록 변형될 수 있다. 검출가능한 라벨링된 프로브는 표적 프로모터 서열에 어닐링되게 설계된다. 따라서, 전사시 하류 프로브 및 합성된 RNA는 절단 구조를 형성한다. FEN은 하류 올리고뉴클레오티드를 절단한다.
일부 구체예로서, 프로모터는 프로모터-프라이머를 통하여 표적에 부가된다. 다수의 RNA 중합효소 프로모터는 프로모터-프라이머의 프로모터 영역 대신 사용될 수 있다. 적합한 프로모터 영역은 리보뉴클레오티드 및 RNA 중합효소의 존재하, 적합한 조건하에서 작용가능하게 연결된 핵산 서열로부터 전사를 개시할 수 있다. 프로모터 영역은, Alberts et al. (1989) in Molecular Biology of the Cell, 2d ed. (Garland Publishing, Inc.)에 기재된 바와 같이, 천연 산출 RNA 중합효소 프로모터, 콘센서스 프로모터 영역, 또는 인공 프로모터 영역으로부터의 통상 약 15 내지 250 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 17 내지 60 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 관심을 두고 있는 대표적인 프로모터 영역은, Chamberlin and Ryan, The Enzymes (ed. P. Boyer, Academic Press, New York) (1982) pp 87-108에 기재된 바와 같은 T7, T3 및 SP6을 포함한다.
최적 전사를 위한 실제 프로모터 내에서 서열 요건은 일반적으로 미국 특허번호 5,766,849호 및 5,654,142호와 같은 다양한 DNA 의존적 RNA 중합효소에 대해 앞서 기재한 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있고, 또 실험적으로 결정될 수 있다.
상기 기재된 프로모터-프라이머 올리고뉴클레오티드는 당해 분야에 공지되고 본 명세서에 기재된 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있고, 예컨대, 자동화된 DNA 합성기 (예컨대 Applied Biosystems, Inc. Foster City, Calif.) 상에서 합성될 수 있다.
다른 양태로서, 본 발명은 RNA 중합효소 및 하류 라벨링된 프로브에 의해 연장된 상류 프라이머를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다. 이 반응은 일반적으로 표적 핵산을 RNA 중합효소, 상류 프라이머 및 하류 프로브를 포함하는 반응 혼합물과 접촉시키고 또 상기 혼합물을 적절한 시간 및 적절한 조건하에서 배양하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 절단 구조를 생성하는 것을 포함한다. 2005년 8월 31일 출원된 미국 특허출원 번호 11/217,972호 (내용 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 포함됨)은 RNA 중합효소에 의해 연장된 프라이머를 이용하는 RNA 증폭 반응을 기재한다. 이 RNA 증폭 반응은 본 발명에 사용하기 위하여 채용될 수 있다. 예컨대, 하류 라벨링된 프로브 및 FEN 뉴클레아제는 미국 특허출원 번호 11/217,972호에 기재된 반응물에 부가된다. 이 실시예에서, RNA 중합효소는 혼성화된 프라이머를 연장하여 하류 프로브를 갖는 절단 구조를 형성할 것이다.
이 서열-특이적 RNA 증폭/검출 반응에서, 표적 RNA 서열에 상보적인 적절한 프라이머 및 프로브는 본 명세서에 자세하게 기재되고 또 당해 분야에 공지된 바와 같이 프라이밍된 RNA 분자를 인식할 수 있는 적합한 RNA 중합효소 및 FEN 뉴클레아제와 함께 이용된다. 증폭, 절단 구조의 형성 및 절단 구조의 절단은 온도 주기 조건하에서 진행된다.
예컨대, 상기 반응은 표적을 변성하기 위하여 70-95℃에서 배양한 다음 35-72℃로 냉각된다. 온도 감소 동안, 프라이머 및 프로브는 표적 RNA 상의 보체 서열에 결합한다. 온도가 최적 범위에 도달하면, RNA 중합효소는 프라이머를 연장하고 또 하류 프로브의 적어도 부분적 치환을 유도한 다음 절단 구조를 형성한다. 절단 구조는 뉴클레아제에 의해 절단된다.
종점 에세이는 비제한적으로 다음을 포함한다:
A. Landegren, et al., 1988, Science, 241: 1077 and Barany, PCR Methods and Applications 1: 5-16 (1991)에 기재된 바와 같은 결찰 연쇄 반응(Ligation chain reaction: LCR). 본 발명에 따라 유용한 LCR 생성물은 상류 프라이머 및 라벨링된 하류 프로브가 8 뉴클레오티드보다 큰 갭에 의해 분리되어 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)에 의한 효과적인 절단을 허용하도록 충분히 길 것이다.
B. 자가-유지 서열 복제 증폭 (3SR) Fahy, et al. PCRMethods and Applications 1: 25-33 (1991). 자가-유지 서열 복제 증폭 (3SR)은 NASBA와 유사한 수법이다. Ehricht R, et al., Nucleic Acids Res. 25: 4697-4699 (1997)는 3SR 과정을 협력적으로 커플링된 시험관내 증폭 계(CATCH)로 개발하였다. 따라서, 본 발명의 일 구체예로서, 분자 비이콘 프로브는 CATCH에 의한 RNA 암플리콘의 실시간-분석을 위해 사용된다. 증폭된 합성 표적은 다음 서열을 갖는다:
Figure 112009038784823-PCT00020
(서열번호: 42). 3SR 반응은 40 mM Tris-HCl pH 8.0, 5 mM KCl, 30 mM MgCl2, 1 mM의 각 dNTP, 1 nM 의 이중 가닥 표적, 2μM Pl:
Figure 112009038784823-PCT00021
(서열번호: 43) 및 P2:
Figure 112009038784823-PCT00022
(서열번호: 44), 5 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 6 유닛/ul His 태깅된 HIV-I 역전사효소, 3 유닛/ul T7-RNA 중합효소 및 0.16 유닛/ul 대장균 RNase H를 함유한다. 100 ul 반응물을 42℃에서 30분간 배양한다.
5㎕의 각 샘플을 검출을 위해 2회 제거한다. 각 반응물은 IX 클로닝된 Pfu 완충액, 3.0 mM MgCl2, 200㎕의 각 dNTP, 5 유닛 exo-Pfu, 23 ng Pfu FEN-1, 1 ng PEF, 300 nM의 각 상류 프라이머 Pl 및 형광 프로브(예컨대 FAM-DABCYL):
Figure 112009038784823-PCT00023
(서열번호: 45)를 함유한다. 이 반응물을 온도 순환장치에서 1주기에 처리한다: 95℃에서 2분, 55℃에서 1분, 72℃에서 1분. 이어 Stratagene의 FluorTracker 또는 PE Biosystems의 7700 서열 검출 시스템 인 플레이트-리드 모드와 같은 형광 플레이트 판독기로 형광을 측정한다. 3SR 방법은 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 기재된 바와 같은 뉴클레아제를 사용하여 실시할 수 있다.
C. 롤링 써클 (Rolling circle) 증폭은 미국특허 5,854,033호에 기재되어 있고 또 관련 분기-연장(Ramification-Extension) 증폭 방법(RAM)은 미국특허 5,942,391호에 기재되어 있다. 본 발명에 채용된 롤링 써클 증폭은 이하에 기재한다.
비-PCR 계 방법에 의해 생성된 증폭된 표적을 정량하기 위해 실시간 에세이를 이용할 수 있으며, 이때 증폭 단계는 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) (상기 기재)의 존재하에서 실시된다. 폴링 써클 증폭 방법(미국 특허 5,854,033호)은 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하며 또 절단 구조를 더 포함하는 절단성 프로브 및 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)와 조합된 증폭 및 검출용 2차 프라이머를 포함하도록 적응되고 또 50-60℃ 온도에서 실시된다. 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)의 절단 패턴은 프라이머의 5' 말단으로부터 1 내지 15개 뉴클레오티드에 위치한 단일 미스매치된 염기의 존재로 인하여 변경될 수 있으며, 이때 DNA 프라이머는 충분히 어닐링된다. 전형적으로, 충분히 어닐링된 기질 상에서, 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제)는 가장 5'에 있는 뉴클레오티드를 엑소뉴클레아제 절단시킬 것이다. 그러나, 5' 말단으로부터 15 뉴클레오티드까지의 단일 뉴클레오티드 미스매치는 엔도뉴클레오리틱 절단을 증진시킨다. 이것은 미스매치가 그의 제거를 초래하는 뉴클레아제 활성을 증진시킨다는 5' 프루프리딩 과정을 구성한다. 따라서, 뉴클레아제 (예컨대 FEN 뉴클레아제) 절단의 이러한 메카니즘은 단일 미스매치된 염기 쌍의 존재만으로 주로 엑소뉴클레오리틱 분해를 엔도뉴클레오리틱 분해로 이동시킨다. 아마도 이러한 것은 미스매치가 짧은 플랩이 생성되게 하기 때문에 생기는 것으로 보인다.(Rumbaugh et al., 1999, J. Biol. Chem .. 274:14602).
본 발명의 방법은 표적 핵산에 서열 변이의 존재를 나타내는 신호를 생성하기 위해 사용될 수 있고, 이때 충분히 어닐링된 DNA 프라이머를 포함하는 라벨링된 절단 구조는 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위(표제 "절단 구조" 부분에 기재된 바와 같은)를 포함하는 프로브를 표적 핵산과 배양하고 또 라벨링딘 절단 구조를 뉴클레아제(예컨대 FEN 뉴클레아제)를 사용하여 절단하는 것에 의해 형성되며, 이때 엔도뉴클레오리틱 절단 생성물을 포함하는 라벨링된 단편의 방출 및 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합 부위를 결합시키는 것에 의해 포획된 방출된 단편의 검출이 서열 변이의 존재를 나타낸다. 방출된 라벨링된 단편은 표제 "절단 구조" 부분에 기재된 바와 같이 검출된다.
다른 구체예로서, 본 발명의 절단 내성 프로브는 순차적 절단 반응에 사용된다. 순차적 절단 반응은 2000년 11월 11일 출원된 미국특허 번호 6,893,819호, 2004년 11월 15일 출원된 미국 공개 번호 2005/0147996호, 2005년 12월 15일 출원된 미국 출원 번호 60/750,593호 및 2006년 4월 24일 출원된 미국 출원 번호 60/794,628호에 기재되어 있으며, 이들은 내용 전체가 본 명세서에 참고문헌으로 포함되어 있다.
순차적 절단 반응에서, 제1 절단 반응으로부터 얻은 방출된 플랩은 제2 절단 반응에서 상류 올리고뉴클레오티드로서 작용한다. 순차적 절단 반응에서, 검출가능한 신호는 상기 제1 및 제2 절단 반응이 비침습적일 때에만 생성된다. 침습적 구조가 형성되는 경우, 검출가능한 신호는 생성되지 않는다.
예컨대, 일 구체예로서, 순차적 절단 반응은 다음을 포함한다: 3'→5' 순으로 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 표적 핵산, 3'→5' 순으로 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 주형 핵산, 상기 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 상류 올리고뉴클레오티드, 5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 제1 절단 내성 프로브 (이때, 상기 3' 영역은 상기 표적 핵산의 제2 영역에 상보적이고 또 5' 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않지만, 주형 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적임), 5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 제2 절단 내성 프로브 (이때, 상기 3' 영역 은 주형 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 상기 5' 영역은주형 핵산에 상보적이지 않음), 절단제, 및 핵산 중합효소.
표적 핵산과 각 제1 상류 올리고뉴클레오티드 각각 및 상기 제1 절단 내성 프로브 사이에 듀플렉스를 형성하고, 이때 제1 절단 내성 프로브의 5' 영역은 제1 절단 구조의 제1 플랩을 형성하며; 상기 제1 플랩을 상기 절단제로 절단하여 제1 플랩의 방출을 허용하며; 방출된 제1 플랩, 상기 주형 핵산, 및 상기 제2 절단 내성 프로브 사이의 제2 듀플렉스를 형성하고, 이때 상기 제2 절단 내성 프로브의 5' 영역은 제2 절단 구조의 제2 플랩을 형성하며; 또 상기 제2 플랩을 상기 절단제로 절단하는 것을 허용하는 반응 조건하에서 상기 반응물을 혼합한다.
이어 신호를 검출한다. 신호는 제2 플랩의 절단으로부터 생기며, 상기 플랩은 상기 제1 상류 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 절단 내성 프로브와 상기 방출된 플랩 및 상기 제2 절단 내성 프로브가 제1 및 제2 듀플렉스가 형성될 때에 적어도 1개의 닉(nick)에 의해 분리될 때에만 생성된다.
V. 샘플
본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 샘플 중의 표적 핵산을 검출 또는 측정하기 위한 방법을 제공한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "샘플"은 관심을 두고 있는 핵산(표적 핵산)을 함유하거나 함유하는 것으로 추정되는 물질이거나 또는 관심을 두고 있는 표적 핵산을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 추정되는 표적 핵산 그 자체를 지칭한다. 따라서 용어 "샘플"은 표적 핵산 (게놈 DNA, cDNA 또는 RNA), 세포, 생물, 조직, 유체 또는 물질의 샘플로서, 비제한적으로 예컨대, 혈장, 혈청, 척추액, 림프액, 활액, 뇨, 눈물, 대변, 피부, 호흡기, 장 및 비뇨생식기의 외부 분비물, 타액, 혈액 세포, 종양, 기관, 조직, 시험관내 세포 배양 구성분의 샘플, 천연 분리물(음용수, 해수, 고상 물질과 같은), 미생물 시편, 및 핵산 트레이서 분자에 의해 마킹된 물질 또는 시편을 포함한다.
도 1은 FEN 뉴클레아제 절단 구조를 도시한다.
도 2는 FEN 뉴클레아제 활성을 검출하기 위해 사용될 수 있는 3개의 주형(라벨링된 1, 2 및 3)을 도시한다.
도 3 (A~H)은 2차 구조를 도시한다.
도 4는 본 발명에 따른 신호를 생성하는 합성 및 절단 반응을 도시하는 다이아그램이다.
도 5는 CBP-태그된 PFU FEN-1 단백질을 나타내는 시프로 오렌지(Sypro Orange) 염색된 폴리아크릴아미드 겔이다.
도 6은 FEN-1 뉴클레아제 에세이의 오토라디오그래프이다.
도 7(도 7A 및 도 7B)은 롤링 써클 증폭을 위한 오픈 써클 프로브를 도시한다.
도 8은 롤링 써클 증폭을 도시한다.
도 9는 안전 핀 프로브를 도시한다.
서열
Figure 112009038784823-PCT00024
는 서열번호 31이다.
서열
Figure 112009038784823-PCT00025
는 서열번호 32이다.
서열
Figure 112009038784823-PCT00026
는 서열번호 33이다.
서열
Figure 112009038784823-PCT00027
는 서열번호 34이다.
도 10은 스코피온(scorpion) 프로브를 도시한다.
도 11은 썬라이즈/암플리플루오르 프로브를 도시한다.
도 12a는 이중가닥 대 단일가닥 DNA의 광 흡수의 차이를 도시하는 그래프이다.
도 12b는 DNA 용융 곡선을 도시하는 그래프이다.
도 12c는 DNA의 상대적 광학 흡수의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 12d는 DNA의 상대적 광학 흡수의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 12e는 상호작용 라벨 쌍에 의해 라벨링된 DNA의 형광에 대한 온도의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 12f는 상호작용 라벨 쌍에 의해 라벨링된 DNA의 형광에 대한 온도의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 12g는 상호작용 라벨 쌍에 의해 라벨링된 DNA의 형광에 대한 표적 핵산의 효과를 도시하는 그래프이다.
도 13은 절단 내성 프로브의 일 구체예를 도시한다.
도 14는 절단 내성 프로브를 이용하는 본 발명의 방법의 일 구체예를 도시한다.
도 15는 본 발명의 오버래핑 및 비-오버래핑 구조 및 절단에 대해 표적화된 각 부위를 도시한다.
도 16은 실시예 15 및 16에서 이용된 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 프로브를 도시한다.
본 발명은 이하의 물질 및 방법이 이용된 다음의 비제한저인 실시예에 의해 더 자세하게 설명된다. 본 명세서에서 인용된 각 참고문헌의 전체 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
실시예 1
프로브 디자인 및 제조
본 발명은 프로브가 표적 핵산에 결합되면 변하는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 프로브를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로브는 5-250 뉴클레오티드 길이, 이상적으로 17-40 뉴클레오티드 길이이며 또 7 내지 약 140 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 10 내지 약 140 뉴클레오티드인 표적 핵산 결합 서열을 갖는다. 프로브는 또한 비공유적으로 결합되거나 또는 공유결합적으로 결합된 서브유닛을 포함할 수 있다.
프로브의 일 구체예는 제1 상보적 핵산 서열 (예컨대, 도 4의 b) 및 제2 상보적 핵산 서열 (예컨대, 도 4의 b')을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 단일 분자이고, 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 동일 분자내에 존재한다. 일 구체예로서, 프로브는 형광단 및 켄처(예컨대, 테트라메틸로다민 및 DABCYL, 또는 본 명세서에 기재된 형광단 및 켄처 분자의 어느 것)에 의해 라벨링된다. (표제 "라벨링된 절단 구조를 제조하는 방법" 부분에 기재된 내용 참조)). 본 발명에 따른 프로브는 적합한 상호작용 라벨 (예컨대 FRET 쌍 또는 비-FRET 쌍)에 의해 라벨링된다. 프로브 상의 상호작용 라벨의 위치는 프로브 상에서 라벨의 적절한 간격이 유지되어 표적 핵산에 결합되어 프로브의 2차 구조에서의 변화를 거칠 때 라벨의 분리를 허용하도록 지정된다. 예컨대, 공여제 및 켄처 부위는 프로브가 표적 핵산에 결합하지 않을 때 검출가능한 신호를 생성하도록 프로브 상에 배치된다.
프로브는 또한 결합 부위 (예컨대 도 4의 ab, 핵산 서열 즉
Figure 112009038784823-PCT00028
(서열번호: 26) 포함)를 더 포함한다. 본 발명의 일 구체예로서, 표적 핵산에 혼성화될 때, 본 발명에 따른 프로브는 5' 플랩(예컨대 도 4의 ab)를 포함하는 절단 구조를 형성한다. 이 절단 구조의 플랩은 따라서 프로브의 결합 부위를 포함한다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 뉴클레아제에 의해 혼성화된 프로브를 절단하면, 결합 부위가 방출되어 핵산 서열, 즉
Figure 112009038784823-PCT00029
(서열번호: 27)을 포함하는 포획요소에 특이 적으로 결합한다. 상기 구체예에 따르면, 결합 부위는 2개의 영역 (예컨대 도 4의 a 및 b)을 포함한다. 본 명세서에 정의된 바와 같이 "상보적 핵산 서열"이 아닌 "결합 부위"의 영역 (예컨대 도 4의 a)은 1-60 뉴클레오티드, 바람직하게는 1-25 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 1-10 뉴클레오티드 길이이다. 영역 b는 상기 정의된 바와 같이 프로브의 적어도 2개의 상보적 핵산 서열의 하나이며, 그의 길이는 이하에 기재한다.
일 구체예로서, 표적 핵산의 부재하에서 상기 프로브는 그 자체에서 접혀져서 반평행 듀플렉스 구조를 생성하며, 이때 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 수소결합 형성에 의해 어닐링되어 2차 구조를 형성한다. 프로브의 2차 구조는 본 명세서에 기재된 바와 같이 프로브의 Tm 이상 또는 이하의 온도를 비롯한 상이한 온도에서 FRET 또는 형광 켄칭 에세이에 의해 검출한다. 형광단 방출 효능에 대한 열적 효과로 인하여 단순히 형광에서 변화보다 더 높은 온도에서 변화와 상관관계가 있는 형광에서의 변화를 나타내는 프로브(예컨대 FRET 반응 온도가 증가됨에 따라 형광이 증가함)는 2차 구조를 갖는다. 2차 구조는 최대 수준의 형광이 검출되는(예컨대 형광은 증가된 온도에서 상기 레벨 이상으로 증가하지 않음) 온도에서 제거된다. 프로브의 2차 구조의 안정성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 융점 에세이 또는 FRET 또는 형광 켄칭 에세이에 의해 측정한다.
프로브의 2차 구조에서의 변화의 결과로서, 결합 부위는 뉴클레아제에 의한 절단에 접근가능하게 된다. 표적 핵산의 존재하에서 및 프로브와 표적 핵산의 특이적 결합을 허용하는 표적 핵산에 대한 프로브의 혼성화의 효능 및 선택성에 영향을 주는 인자에 따라 선택되는 온도에서, (예컨대 표제 "본 발명에 따라 유용한 프라이머 및 프로브" 부분에 기재된 바와 같은 프라이머 길이, 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, 완충액 조성), 상기 프로브는 표적 핵산에 결합되어 2차 구조의 변화를 거친다. 프로브의 2차 구조에서의 변화는 본 명세서에 기재된 바와 같이 FRET 또는 형광 켄칭에 의해 결정될 수 있다.
일 구체예로서, 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 3-25, 바람직하게는 4-15 및 더욱 바람직하게는 5-11 뉴클레오티드 길이이다. 제1 및 제2 상보적 핵산 서열의 길이는 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조가, 표적 핵산에 결합된 프로브를 포함하는 절단 구조의 절단이 실시되는 온도에서 안정하도록 선택된다. 표적 핵산 결합 서열이 100 뉴클레오티드까지 증가함에 따라, 상보적 핵산 서열의 길이는 15-25 뉴클레오티드까지 증가할 수 있다. 100 뉴클레오티드보다 큰 표적 핵산 결합 서열의 경우, 상보적 핵산 서열의 길이는 더 이상 증가하지 않는다.
다르게는, 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 대립유전자-구별 프로브를 제조한다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 대립유전자-구별 프로브는 6 내지 50, 바람직하게는 7 내지 25 뉴클레오티드의 표적 핵산 결합 서열 및 3 내지 8개 뉴클레오티드의 상보적 핵산 서열을 포함한다. 2차 구조 및 프로브-표적 하이브리드의 구아노신-시티딘 함량, 염, 및 에세이 온도를 고려하며, 예컨대 마그네슘 염은 짧은 대립유전자-구별 프로브를 설계할 때 강한 안정화 효과를 갖는다.
상한이 50 뉴클레오티드 길이 정도인 표적 핵산 결합 서열을 갖는 대립유전 자-구별 프로브는 표적 핵산 결합 서열의 중간 또는 그 부근에서 구별되는 단일 뉴클레오티드 미스매치가 생기도록 설계된다. 예컨대, 21 뉴클레오티드 길이인 서열을 포함하는 프로브는 바람직하게는 미스매치가 표적 결합 서열의 14개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드 중의 대향 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 7개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드의 대향 뉴클레오티드에서 생기도록 설계된다.
실시예 2
프로브 디자인 및 제조
본 발명은 표적 핵산에 대한 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 프로브를 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따른 프로브는 5-250 뉴클레오티드 길이, 이상적으로 17-40 뉴클레오티드 길이이며 또 7 내지 약 140 뉴클레오티드, 및 바람직하게는 10 내지 약 140 뉴클레오티드인 표적 핵산 결합 서열을 갖는다. 프로브는 또한 비공유적으로 결합되거나 또는 공유결합적으로 결합된 서브유닛을 포함할 수 있다.
프로브의 일 구체예는 제1 상보적 핵산 서열 (예컨대, 도 4의 b) 및 제2 상보적 핵산 서열 (예컨대, 도 4의 b')을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 단일 분자이고, 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 동일 분자 내에 존재한다. 일 구체예로서, 프로브는 형광단 및 켄처(예컨대, 테트라메틸로다민 및 DABCYL, 또는 본 명세서에 기재된 형광단 및 켄처 분자의 어느 것)에 의해 라벨링된다. (표제 "라벨링된 절단 구조를 제조하는 방법" 부분에 기재된 내용 참조). 본 발명에 따른 프로브는 적합한 상호작용 라벨 (예컨대 FRET 쌍 또는 비-FRET 쌍)에 의해 라벨링된다. 프로브 상의 상호작용 라벨의 위치는 프로브 상에서 라벨의 적절한 간격이 유지되어 표적 핵산에 결합되어 프로브의 2차 구조에서의 변화를 거칠 때 라벨의 분리를 허용하도록 지정된다. 예컨대, 공여제 및 켄처 부위는 프로브가 표적 핵산에 결합하지 않을 때 검출가능한 신호를 생성하도록 프로브 상에 배치된다.
프로브는 또한 lac 리프레서(리프레서) 단백질을 포함하는 태그를 더 포함한다. 본 발명의 일 구체예로서, 표적 핵산에 혼성화될 때, 상기 프로브는 5' 플랩(예컨대 도 4의 ab)을 포함하는 절단 구조를 형성한다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 뉴클레아제에 의해 혼성화된 프로브를 절단하면, lac 리프레서 단백질은 리프레서 단백질에 의해 인식되고 특이적으로 결합된 이중 가닥 DNA 서열을 포함하는 포획 요소에 특이적으로 결합된다:
Figure 112009038784823-PCT00030
일 구체예로서, 표적 핵산의 부재하에서 상기 프로브는 그 자체에서 접혀져(fold back)서 반평행 듀플렉스 구조를 생성하며, 이때 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 수소결합 형성에 의해 어닐링되어 2차 구조를 형성한다. 프로브의 2차 구조는 본 명세서에 기재된 바와 같이 프로브의 Tm 이상 또는 이하의 온도를 비롯한 상이한 온도에서 FRET 또는 형광 켄칭 에세이에 의해 검출한다. 형광단 방출 효능에 대한 열적 효과로 인하여 단순히 형광에서 변화보다 더 높은 온도에서 변화와 상관관계가 있는 형광에서의 변화를 나타내는 프로브(예컨대 FRET 반응 온도가 증가됨 에 따라 형광이 증가함)는 2차 구조를 갖는다. 2차 구조는 최대 수준의 형광이 검출되는(예컨대 형광은 증가된 온도에서 상기 레벨 이상으로 증가하지 않음) 온도에서 제거된다. 프로브의 2차 구조의 안정성은 본 명세서에 기재된 바와 같이 융점 에세이 또는 FRET 또는 형광 켄칭 에세이에 의해 측정한다.
프로브의 2차 구조에서의 변화의 결과로서, 태그는 뉴클레아제에 의한 절단에 접근가능하게 된다. 표적 핵산의 존재하에서, 및 프로브와 표적 핵산의 특이적 결합을 허용하는 표적 핵산에 대한 프로브의 혼성화의 효능 및 선택성에 영향을 주는 인자에 따라 선택되는 온도에서, (예컨대 표제 "본 발명에 따라 유용한 프라이머 및 프로브" 부분에 기재된 바와 같은 프라이머 길이, 뉴클레오티드 서열 및/또는 조성, 완충액 조성), 상기 프로브는 표적 핵산에 결합되어 2차 구조의 변화를 거친다. 프로브의 2차 구조에서의 변화는 본 명세서에 기재된 바와 같이 FRET 또는 형광 켄칭에 의해 결정될 수 있다.
일 구체예로서, 제1 및 제2 상보적 핵산 서열은 3-25, 바람직하게는 4-15 및 더욱 바람직하게는 5-11 뉴클레오티드 길이이다. 제1 및 제2 상보적 핵산 서열의 길이는 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조가, 표적 핵산에 결합된 프로브를 포함하는 절단 구조의 절단이 실시되는 온도에서 안정하도록 선택된다. 표적 핵산 결합 서열이 100 뉴클레오티드까지 증가함에 따라, 상보적 핵산 서열의 길이는 15-25 뉴클레오티드까지 증가할 수 있다. 100 뉴클레오티드보다 큰 표적 핵산 결합 서열의 경우, 상보적 핵산 서열의 길이는 더 이상 증가하지 않는다.
다르게는, 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 포함하는 대립유전자-구별 프로 브를 제조한다.
일 구체예로서, 본 발명에 따른 대립유전자-구별 프로브는 6 내지 50, 바람직하게는 7 내지 25 뉴클레오티드의 표적 핵산 결합 서열 및 3 내지 8개 뉴클레오티드의 상보적 핵산 서열을 포함한다. 2차 구조 및 프로브-표적 하이브리드의 구아노신-시티딘 함량, 염, 및 에세이 온도를 고려하며, 예컨대 마그네슘 염은 짧은 대립유전자-구별 프로브를 설계할 때 강한 안정화 효과를 갖는다.
상한이 50 뉴클레오티드 길이 정도인 표적 핵산 결합 서열을 갖는 대립유전자-구별 프로브는 표적 핵산 결합 서열의 중간 또는 그 부근에서 구별되는 단일 뉴클레오티드 미스매치가 생기도록 설계된다. 예컨대, 21 뉴클레오티드 길이인 서열을 포함하는 프로브는 바람직하게는 미스매치가 표적 결합 서열의 14개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드 중의 대향 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 7개의 가장 중앙에 위치한 뉴클레오티드의 대향 뉴클레오티드에서 생기도록 설계된다.
실시예 3
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 상류 올리고뉴클레오티드, (도 4의 A), 및 (c) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 (예컨대 도 4의 ab, 핵산 서열 즉
Figure 112009038784823-PCT00031
(서열번호: 26)을 포함함)를 포함하며 올리고뉴클레오티드 A의 혼성화 영역의 하류인 표적 핵산 영역에 특이적으로 혼성화되는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아 제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성한다. 예컨대 효소 a) 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 Taq 중합효소의 돌연변이 형태인 Yaq exo-, (Taq 중합효소 (Tabor and Richardson, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1074))를 변형하기 위한 Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit, 카탈로그 번호 #200518를 이용하는 돌연변이에 의해 제조), b) Pfu, 또는 c) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 Pfu 중합효소의 돌연변이 형태 (exo-Pfu)와 같이 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되지만 3'→5' DNA 합성 활성을 보유하는 중합효소를 부가하고 또 올리고뉴클레오티드 C의 5' 말단을 부분적으로 치환하도록 (예컨대 1XPfu 완충액(Stratagene) 중 72℃에서) 중합효소가 올리고뉴클레오티드 A를 연장시키게 하는 조건하에서 5분 내지 1시간 배양한다. 올리고뉴클레오티드 C의 치환된 영역은 FEN 뉴클레아제의 부가시 절단되는 5' 플랩을 형성한다. 다르게는, 연장은 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 실시한다.
5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하지만 3'→5' DNA 합성 활성은 보유하는 Taq 중합효소의 돌연변이 형태는 다음 돌연변이를 포함한다: D144S가 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 제거하고 또 F667Y가 ddNTP 혼입을 증진시키는 D144S/F667Y Taq.
PolI 중합효소의 엑소-돌연변이체는 Xu et al., 1997, J. MoI . Biol.. 268: 284의 방법에 따라서 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 PfuFEN-1 (즉 하기 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조한 클로닝된 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) FEN-1)의 제조에 의해 절단된다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x FEN 뉴클레아제 완충액 (1OX FEN 뉴클레아제 완충액은 50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2 를 함유한다)
2.00㎕ PfuFEN-1 효소 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 결합 부위를 포함하는 방출된, 라벨링된 단편은 결합 부위의 결합을 통하여 고상 지지체 상에 핵산 서열, 즉
Figure 112009038784823-PCT00032
(서열번호: 27)를 포함하는 포획 요소에 결합된다. 일 구체예로서, 라벨링된 단편은 염 농도를 감소시키는 것에 의해 (스트린젠트(stringent) 혼성화 조건은 전형적으로 약 1M 미만, 흔히 약 500 mM 미만 및 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염 농도를 포함한다) 또는 과량의 라벨링되지 않은 경쟁자 단편을 부가하는 것에 의해 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 다음과 같이 겔 전기영동에 의해 분석한다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 처리하였다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 겔을 화트만(Whatmann) 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 4
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 상류 올리고뉴클레오티드, (도 4의 A), 및 (c) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 lac 리프레서 단백질 태그를 포함하며 올리고뉴클레오티드 A의 혼성화 영역의 하류인 표적 핵산 영역에 특이적으로 혼성화되는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성하였다. 예컨대 효소 a) 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 Taq 중합 효소의 돌연변이 형태인 Yaq exo-, (Taq 중합효소 (Tabor and Richardson, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 1074))를 변형하기 위한 Stratagene QuikChange Site-Directed Mutagenesis kit, 카탈로그 번호 #200518를 이용하는 돌연변이에 의해 제조), b) Pfu, 또는 c) 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 Pfu 중합효소의 돌연변이 형태 (exo- Pfu)와 같이 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여되지만 3'→5' DNA 합성 활성을 보유하는 중합효소를 부가하고 또 올리고뉴클레오티드 C의 5' 말단을 부분적으로 치환하도록 (예컨대 1XPfu 완충액(Stratagene) 중 72℃에서) 중합효소가 올리고뉴클레오티드 A를 연장시키게 하는 조건하에서 5분 내지 1시간 배양한다. 올리고뉴클레오티드 C의 치환된 영역은 FEN 뉴클레아제의 부가시 절단되는 5' 플랩을 형성한다. 다르게는, 연장은 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 실시한다.
5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여하지만 3'→5' DNA 합성 활성은 보유하는 Taq 중합효소의 돌연변이 형태는 다음 돌연변이를 포함한다: D144S가 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 제거하고 또 F667Y가 ddNTP 혼입을 증진시키는 D144S/F667Y Taq.
PolI 중합효소의 엑소-돌연변이체는 Xu et al., 1997, J. MoI . Biol.. 268: 284의 방법에 따라서 제조할 수 있다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 PfuFEN-1 (즉 하기 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조한 클로닝된 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) FEN-1)의 제조에 의해 절단된다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x FEN 뉴클레아제 완충액 (1OX FEN 뉴클레아제 완충액은 50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2 를 함유한다)
2.00㎕ PfuFEN-1 효소 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. lac 리프레서 단백질을 포함하는 방출된, 라벨링된 단편은 고상 지지체 상에서 lac 리프레서 단백질에 의해 인식되는 이중 가닥 DNA 서열을 포함하는 포획 요소에 lac 리프레서 단백질의 결합을 통하여 결합된다:
Figure 112009038784823-PCT00033
일 구체예로서, 라벨링된 단편은 예컨대 염 농도를 변화시키는 것에 의해, 즉 염 농도를 감소시키는 것에 의해 (스트린젠트(스트린젠트) 혼성화 조건은 전형 적으로 약 1M 미만, 흔히 약 500 mM 미만 및 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염 농도를 포함한다) 또는 과량의 라벨링되지 않은 경쟁자 a) lac 리프레서 단백질 또는 b) lac 리프레서 단백질에 의해 인식되는 이중가닥 DNA 서열을 부가하는 것에 의해 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 다음과 같이 겔 전기영동에 의해 분석한다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 처리하였다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 5
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 상류 올리고뉴클레오티드, (도 4의 A), 및 (c) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 (예컨대 도 4의 ab, 핵산 서열 즉
Figure 112009038784823-PCT00034
(서열번호: 26)을 포함함)를 포함하며 올리고뉴클레오티드 A의 혼성화 영역에 인접하는 표적 핵산 영역에 특이 적으로 혼성화되며 또 표적 핵산에 혼성화되지 않아 5' 플랩을 형성하는 5' 영역을 더 포함하는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성한다. 어닐링은 1X 센티날 몰리큘라 비이콘(Sentinal Moleuclar beacon) 코어 완충액 또는 1X Pfu 완충액의 존재하에서 실시한다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 PfuFEN-1 (즉 하기 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조한 클로닝된 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) FEN-1)의 제조에 의해 절단된다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x FEN 뉴클레아제 완충액 (1OX FEN 뉴클레아제 완충액은 50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2 를 함유한다)
2.00㎕ PfuFEN-1 효소 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함 됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 결합 부위를 포함하는 방출된, 라벨링된 단편은 결합 부위의 결합을 통하여 고상 지지체 상에 핵산 서열, 즉
Figure 112009038784823-PCT00035
(서열번호: 27)를 포함하는 포획 요소에 결합된다. 일 구체예로서, 라벨링된 단편은 염 농도를 감소시키는 것에 의해 (스트린젠트 혼성화 조건은 전형적으로 약 1M 미만, 흔히 약 500 mM 미만 및 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염 농도를 포함한다) 또는 과량의 라벨링되지 않은 경쟁자 단편을 부가하는 것에 의해 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 다음과 같이 겔 전기영동에 의해 분석한다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 처리하였다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 6
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 특이 적으로 혼성화되는 상류 올리고뉴클레오티드, (도 4의 A), 및 (c) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 lac 리프레서 단백질 태그를 포함하며 올리고뉴클레오티드 A의 혼성화 영역에 인접하는 표적 핵산 영역에 특이적으로 혼성화되며 또 표적 핵산에 혼성화되지 않아 5' 플랩을 형성하는 5' 영역을 더 포함하는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성한다. 어닐링은 1X 센티날 몰리큘라 비이콘(Sentinal Moleuclar beacon) 코어 완충액 또는 1X Pfu 완충액의 존재하에서 실시한다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 PfuFEN-1 (즉 하기 실시예 9에 기재된 바와 같이 제조한 클로닝된 피로코커스 푸리오수스(Pyrococcus furiosus) FEN-1)의 제조에 의해 절단된다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x FEN 뉴클레아제 완충액 (1OX FEN 뉴클레아제 완충액은 50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2 를 함유한다)
2.00㎕ PfuFEN-1 효소 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다.
혼성화된 프로브를 뉴클레아제에 의해 분해하면, lac 리프레서 단백질은 고상 지지체 상에 lac 리프레서 단백질에 의해 인식된 이중 가닥 DNA 서열을 포함하는 포획 요소에 특이적으로 결합된다:
Figure 112009038784823-PCT00036
일 구체예로서, 라벨링된 단편은 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 이하와 같이 겔 전기영동에 의해 분석된다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 통과시켰다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 7
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다. 라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 (예컨대 도 4의 ab, 핵산 서열 즉
Figure 112009038784823-PCT00037
(서열번호: 26)을 포함함)를 포함하며 표적 핵산 영역에 특이적으로 혼성화되며 또 표적 핵산에 혼성화되지 않아 5' 플랩을 형성하는 5' 영역을 더 포함하는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성한다. 어닐링은 1X 센티날 몰리큘라 비이콘(Sentinal Moleuclar beacon) 코어 완충액 또는 1X Pfu 완충액의 존재하에서 실시한다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 이 절단 구조를 절단할 수 있는 뉴클레아제(예컨대 Taq 중합효소)에 의해 절단한다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x 뉴클레아제 완충액 (50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2 )
2.00㎕ 뉴클레아제 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 결합 부위를 포함하는 방출된, 라벨링된 단편은 결합 부위의 결합을 통하여 고상 지지체 상에 핵산 서열, 즉
Figure 112009038784823-PCT00038
(서열번호: 27)를 포함하는 포획 요소에 결합된다. 일 구체예로서, 라벨링된 단편은 염 농도를 감소시키는 것에 의해 (스트린젠트 혼성화 조건은 전형적으로 약 1M 미만, 흔히 약 500 mM 미만 및 바람직하게는 약 200 mM 미만의 염 농도를 포함한다) 또는 과량의 라벨링되지 않은 경쟁자 단편을 부가하는 것에 의해 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 다음과 같이 겔 전기영동에 의해 분석한다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 통과시켰다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 8
표적 핵산은 하기 방법에 의해 검출 및/또는 측정될 수 있다.
라벨링된 절단 구조는, (a) 표적 핵산 (도 4의 B)을 함유하는 샘플과 함께 (b) 표적 핵산에 대해 프로브의 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 lac 리프레서 단백질을 포함하는 태그를 포함하며 표적 핵산 영역에 특이적으로 혼성화되며 또 표적 핵산의 영역에 혼성화되지 않아 5' 플랩을 형성하는 5' 영역을 더 포함하는 하류 5' 말단 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로브를, FEN 뉴클레아제를 부가하기 전에, 95℃에서 5분간 가열한 다음 약 50-60℃로 냉각시키는 것에 의해 형성한다. 어닐링은 1X 센티날 몰리큘라 비이콘(Sentinal Moleuclar beacon) 코어 완충액 또는 1X Pfu 완충액의 존재하에서 실시한다.
본 발명에 따른 라벨링된 절단 구조는 절단 구조를 절단할 수 있는 뉴클레아제(예컨대 Taq 중합효소)에 의해 절단된다. 절단은 절단 온도에서 실시되며, 또 표적핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조는 절단 온도 이하에서 안정하다. 절단은 2㎕의 PfuFEN-1을 다음을 함유하는 7㎕의 반응 혼합물에 부가함으로써 실시한다:
3㎕ 절단 구조 (1Ong- 1O㎍)
0.7㎕ 10x 뉴클레아제 완충액 (50OmM Tris-HCl pH 8.0, 10OmM MgCl2)
2.00㎕ 뉴클레아제 또는 H2O
1.3㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 로보사일러(Robocyler) 96 핫 탑(hot top) 써멀 사이클러(thermal cycler) 중 50℃에서 1시간 동안 배양한다. 2㎕의 시퀀싱 중지 염료 용액(Sequencing Stop 염료 용액) (Stratagene Cyclist DNA sequencing kit에 포함됨, 카탈로그 #200326)을 부가한 다음, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 혼성화된 프로브를 뉴클레아제에 의해 분해하면, lac 리프레서 단백질은 고상 지지체 상에 lac 리프레서 단백질에 의해 인식된 이중 가닥 DNA 서열을 포함하는 포획 요소에 특이적으로 결합된다:
Figure 112009038784823-PCT00039
일 구체예로서, 라벨링된 단편은 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 포획 요소로부터 용출된다. 용출된 라벨링된 단편을 함유하는 샘플은 이하와 같이 겔 전기영동에 의해 분석된다. 샘플은 11 인치 길이의 손으로 부어진 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔 상에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3 이동할 때까지 20와트에서 통과시켰다. 유리 판으로부터 겔을 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지 시켰다. 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고, 플라스틱 랩으로 덮은 다음 가열 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켜 표적 핵산의 존재를 나타내는 신호의 존재를 검출하였다.
다르게는, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 중합효소 및 표제 "뉴클레아제" 부분에 포함된 뉴클레아제를 사용하여 연장반응을 실시하였다.
실시예 9
Pfu FEN-1 클로닝
본 발명에 따라 유용한 열안정성 FEN 뉴클레아제 효소는 이하 방법에 따라 제조할 수 있다.
열안정성 FEN 뉴클레아제 유전자는 당해 분야에 공지된 PCR 클로닝 방법에 따라서 피. 푸리오수스(P. furiosus)(ATCC#43587)로부터 유도된 게놈 DNA로부터 단리할 수 있다. 클로닝된 PfuFEN-1은 당해 분야에 공지되고 이하에 기재된 방법에 따라서 세균 세포에서 과발현될 수 있다.
하기 pCAL-n-EK 클로닝 올리고뉴클레오티드가 합성되고 정제되었다:
a.
Figure 112009038784823-PCT00040
(서열번호: 29) 및
b.
Figure 112009038784823-PCT00041
Affinity® Protein Expression and Purification System은 Stratagene 으로부터 얻으며 제조자의 수순에 따라 사용한다.
증폭
삽입 DNA는 pCAL-n-EK 벡터 단일 가닥 테일(tail)에 상보적이어서 디렉셔날 클로닝(directional cloning)을 허용하는 5' 말단에서 12 및 13-뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자-특이적 프라이머(상기 기재한 바와 같은 올리고뉴클레오티드 a 및 b)를 사용한 PCR 증폭에 의해 제조하였다. FEN-1 서열은
50㎕ 1O x cPfu 완충액 (Stratagene)
7.5㎕ Pfu 게놈 DNA (약 1OO ng/㎕)
7.5㎕ PfuTurbo(2.5u/㎕), (Stratagene, 카탈로그 # 600250)
15㎕ 혼합된 프라이머 쌍 (lOOng/㎕ 각각) (올리고뉴클레오티드 a 및 b, 상기 기재됨)
4㎕ 10OmM dNTP
416㎕ H2O
500㎕ 전체
을 함유하고,
Stratagene Robocycler 96 핫 탑 써멀 사이클러(hot top thermal cycler)를 이용하여 다음 조건
Window 1 95℃ 1분 1 주기(cycle)
Window 2 95℃ 1 분
5O℃ 1분 30 주기
72℃ 3분
하에서 증폭 반응을 실시하여 증폭 반응물(5회의 독립적 100 ㎕ 반응)을 제조함으로써 피. 푸리오수스(P.furiosus)로부터 유도된 게놈 DNA로부터 증폭하였다.
상기 5회 반응 각각으로부터 얻은 PCR 생성물을 1개 튜브에 모으고, StrataPrep PCR을 이용하여 정제한 다음 50/il 1 mM Tris-HCl pH 8.6으로 용출시켰다. FEN-1 PCR 생성물을 겔 상에서 분석하여 약 1000 bp인 것으로 측정하였다. fen-1 유전자를 포함하는 PCR 생성물은 결찰 의존적 클로닝 말단(LIC)를 생성하고, fen-1 유전자를 포함하는 PCR 생성물을 pCALnEK LIC 벡터 (Stratagene)에 어닐링하고 또 어닐링 혼합물을 사용하여 이하의 방법에 따라 세포를 형질전환시키는 것에 의해 pC ALnEK LIC 벡터 (Stratagene)에 클로닝하였다. 간단히, PCR 증폭에 이어, PCR 생성물을 정제하고 dATP (Affinity Protein Expression and Purification System, Stratagene, 카탈로그 #200326) 존재하에서 Pfu DNA 중합효소로 처리한다. dTTP, dGTP 및 dCTP 부재하에서, Pfu DNA 중합효소의 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성은 PCR 생성물의 3' 말단에서 적어도 12 및 13 뉴클레오티드를 제거한다. 이 활성은 제1 아데닌이 나타날 때까지 계속되며, pCAL-n-EK 벡터의 단일 가닥 테일에 상보적인 5'-연장된 단일 가닥 테일을 갖는 DNA 단편을 생성한다.
LIC 말단 생성
이하 혼합물을 제조하는 것에 의해 LIC 말단을 생성하였다:
45㎕ 정제된 PCR 생성물 (~ 0.5㎍/㎕)
2.5㎕ 1OmM dATP
5㎕ 1Ox cPfu 완충액
l㎕ cPfu (2.5u/㎕)
0.5㎕ H2O cPfu 및
cPfu 완충액은 Stratagene (cPfu, Stratagene 카탈로그 #600153 및 cPfu 완충액, Stratagene 카탈로그 #200532)으로부터 얻을 수 있다.
샘플을 72℃에서 20분간 배양하고 그 생성물을 실온으로 냉각시켰다. 각 샘플에 40ng의 제조된 pCALnEK LIC 벡터 (제조된 벡터는 Stratagene으로부터 친화성 LIC 클로닝 및 단백질 정제 키트(214405)로 얻을 수 있다)를 부가하였다. 벡터 및 삽입물 DNA를 조합하고, 실온에서 어닐링하고 고 적격성(competent) 세균 숙주 세포로 형질전환시켰다 (Wyborski et al., 1997, Strategies, 10:1).
FEN 의 생성을 위한 세포 제조
2 리터의 LB-AMP에 FEN-1 클론 (클론 3)의 배양물 20 ml를 철야로 접종하였다. 약 11시간 동안 생장시켰고 이때 세포는 OD600 = 0.974에 도달하였다. 세포를 1 mM IPTG와 함께 철야(약 12 시간)로 유도시켰다. 세포는 원심분리에 의해 수집하고 생성한 세포 페이스트를 -20℃에서 저장하였다.
태깅( tagged ) FEN -1의 정제
20 ml의 칼슘 결합 완충액에 세포를 재현탁시켰다.
CaCl 2 결합 완충액
50 mM 트리스-HCl (pH 8.0)
150 mM NaCl
1.0 mM MgOAc
2 mM CaCl2
샘플은 마이크로팁(microtip)을 이용하는 브랜손 소니케이터(Branson Sonicator)에 의해 초음파처리하였다. 출력 세팅은 5이었고 또 듀티 주기(duty cycle)는 90% 이었다. 샘플을 3회 초음파처리하고 또 간격 동안 얼음 상에서 정치시켰다. 초음파물을 26,890 x g에서 원심분리시켰다. 투명한 상층액을 50ml의 원추형 튜브 중의 1 ml의 세척된 (CaCl2 결합 완충액으로) 칼모둘린 아가로오스 (CAM 아가로오스)와 혼합하고 냉각실(4℃) 내의 서서히 회전하는 바퀴 상에서 5시간 동안 배양하였다. CAM 아가로오스는 광 원심분리에 의해 수집하였다(테이블 탑 원심분리로 5000 rpm).
상층액을 제거한 후, CAM 아가로오스를 50ml의 CaCl2 결합 완충액으로 세척하고 또 일회용 드립 칼럼(drip column)으로 옮겼다. 원래의 용기 및 피펫을 완전히 씻어서 잔류하는 아가로오스를 제거하였다. 이 칼럼을 약 200 ml의 CaCl2 결합 완충액으로 헹구었다.
10ml의 5OmM NaCl 용출 완충액 (5OmM NaCl, 5OmM Tris-HCl pH 8.0, 2mM EGTA)을 사용하여 용출을 실시하였다. 0.5ml 분획을 수집하였다. 제2 용출 단계는 1M NaCl 용출 완충액을 사용하여 실시하였고, 이때 0.5 ml 분획도 수집하였다.
정제된 태깅된 FEN -1의 평가
1M NaCl로 용출된 CBP-태깅된 Pfu FEN-1을 함유하는 분획을 SDS에서 끓이고 시프로 오렌지(Sypro Orange)를 사용하여 염색된 4-20% 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. (도 5).
미절단 FEN-1의 단백질 농도는 약 150 ng/마이크로티터인 것으로 밝혀졌다(이하).
정제된 FEN -1의 엔테로키나아제 프로테아제 ( EK ) 절단
정제된 FEN-1 분획 3-9의 엔테로키나아제 프로테아제 (EK) 절단물을 5OmM NaCl, 5OmM Tris-HCl pH 8.0 및 2mM CaCl2 에서 4℃에서 철야로 투석시켰다.
투석된 FEN-1에는 불투명한, 매우 미세한 석출물이 나타났다. 샘플이 1/20로 희석되면, 석출물을 제거하였다. 샘플이 1/3로 희석되면, 불용성 물질은 여전히 검출된다. 1/3 희석 물질을 37℃에서 2분간 가열한 다음 트윈 20과 혼합하여 최종 농도 0.1%를 얻었다. 트윈 20을 부가하면, "실모양"이 거의 즉각적으로 형성되며 또 용액이 1M NaCl로 조절된 후에도 역전될 수 없는 용액에서 더 거친 고체가 형성된다.
EK 절단은 기질로서 1/20 희석된 샘플 뿐만 아니라 투석 백을 1x EK 완충액으로 헹구는 것에 의해 제조한 희석 샘플을 사용하여 실시하였다.
EK 절단은 1 ㎕ EK (1 u/㎕㎍)를 실온에서 철야로 (약 16시간) 부가하는 것에 의해 실시하였다.
100㎕의 CAM 아가로오스와 조합된 100㎕의 STI 아가로오스는 10ml의 1x STI 완충액 (5OmM Tris-HCl pH 8.0, 20OmM NaCl, 2mM CaCl2, 0.1% Tween 20)으로 2회 헹구었다. NaCl을 2개의 EK 샘플에 부가하여 최종 농도를 200 mM NaCl로 만들었다. 2개 샘플을 조합하고 헹궈진 아가로오스에 부가하였다. 이 샘플을 4℃의 휠 상에서 서서히 3시간 동안 회전시키고 또 테이블 탑 원심분리(상기 기재한)로 광 원심분리에 의해 분리하였다. 상층액은 제거하고 수지는 500㎕의 1x STI로 2회 헹구었다. 헹군 2개 물질을 조합하고 원래 상층액으로부터 별개로 저장하였다. 샘플은 4-20% 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
분해된 생성물의 농도는 약 50 ng/ml 노도에서 Pfu 표준과 비교하여 결정된 바와 같이 약 23 ng/㎕이었다.
실시예 10
FEN 뉴클레아제 활성
FEN 뉴클레아제의 엔도뉴클레아제 활성 및 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조된 FEN 뉴클레아제의 절단구조 요건은 표제 "FEN 뉴클레아제" 부분에 기재된 방법에 따라서 결정할 수 있다.
간단히 말해, 3개의 주형 (도 2)을 사용하여 본 발명에 따른 FEN 뉴클레아제의 활성을 평가하였다. 주형 1은 하기 서열을 갖는 5' 33P 라벨링된 올리고뉴클레오 티드 (Heltest4)이다:
Figure 112009038784823-PCT00042
(서열번호: 1).
Heltest4의 밑줄친 부분은 M13mpl8+에 상보적인 영역을 나타낸다. 절단 생성물은 하기 서열을 갖는 18 뉴클레오티드 단편이다:
Figure 112009038784823-PCT00043
(서열번호: 2). Heltest4는 Ml3에 결합하여 상보적 이중 가닥 도메인 뿐만 아니라 비상보적 5' 오버헹을 생성한다. 이 듀플렉스는 주형 2 (도 2)를 형성한다. 주형 3 (도 2)은 프라이머 (FENAS) Heltest 4에 직접 인접한 M13에 결합된 부가적인 프라이머 (FENAS)를 갖는다. FENAS의 서열은 다음과 같다:
Figure 112009038784823-PCT00044
(서열번호: 3). 주형 3의 존재하에서, FEN 뉴클레아제는 Heltest4의 자유 5' 말단에 결합하여, 접합부로 이동하며 Heltest4를 절단하여 18 뉴클레오티드 단편을 생성한다. 생성한 절단 생성물은 6% 아크릴아미드, 7M 우레아 시퀀싱 겔 상에서 분리하였다.
주형들은 이하에 기재한 바와 같이 제조하였다:
Figure 112009038784823-PCT00045
Pfu 완충액은 Stratagene (카탈로그 #200536)으로부터 얻을 수 있다.
이 주형 혼합물을 95℃에서 5분간 가열하고, 45분간 실온으로 냉각시키며 또 4℃에서 철야로 저장하였다. 이 효소는 다음과 같다:
A. H2O (대조용)
B. 2㎕ 희석되지 않은 미절단 FEN-1 (~ 445ng/㎕)
C. 2㎕ 미절단 FEN-1 (~ 44.5ng/㎕)의 1/10 희석
D. 2㎕ 엔테로키나아제 프로테아제 (EK) 절단된 FEN-1 (~ 23ng/㎕)
4개의 반응 혼합물을 다음과 같은 3개 주형과 혼합하였다:
3㎕의 주형 1, 주형 2 또는 주형 3
0.7㎕ 1O x 클로닝된 Pfu 완충액
0.6㎕ 10OmM MgCl2
2.00㎕ FEN-1 또는 H2O
0.7㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
반응은 50℃에서 30분간 진행시키고 또 2 ㎕의 포름아미드 "시퀀싱 중지" 용액을 각 샘플에 부가함으로써 중지시켰다. 샘플을 95℃에서 5분간 가열한 다음 6% 아크릴아미드, 7M 우레아 CastAway 겔(Stratagene) 상에 로딩하였다.
다르게는, FEN 뉴클레아제 활성은 1시간의 배양 시간이 이용된 하기 완충액에서 분석되었다:
10x FEN 뉴클레아제 완충액
50OmM Tris-HCl pH 8.0
10OmM MgCl2
반응 혼합물은 다음과 같다:
3㎕ 주형 1, 주형 2 또는 주형 3
0.7㎕ 1Ox FEN 뉴클레아제 완충액
2.00㎕ FEN-1 또는 H2O (A-D, 상기)
1.3 ㎕ H2O
7.00㎕ 전체 부피
샘플을 50℃에서 1시간 동안 로보사이러 96 핫 탑 온도순환장치에서 배양하였다. 2 ㎕의 시퀀싱 중지(Sequencing Stop) (95% 포름아미드, 2OmM EDTA, 0.05% 브로모페놀 블루, 0.05% 크실렌 시아놀, Stratagene으로부터 입수가능) 염료 용액을 부가한 후, 샘플을 99℃에서 5분간 가열하였다. 샘플을 11인치 길이의, 손으로 부어진, 20% 아크릴아미드/비스아크릴아미드, 7M 우레아 겔에 로딩하였다. 이 겔은 브로모페놀 블루가 전체 거리의 약 2/3로 이동했을 때까지 20 와트에서 통과시켰다. 겔을 유리 플레이트로부터 제거하고 고정액(15% 메탄올, 5% 아세트산)에 10분간 침지시킨 다음 물에 10분간 침지시켰다. 이 겔을 화트만 3 mm 종이에 놓고 플라스틱 랩으로 씌우고 가열된 진공 겔 건조기(~80℃)에서 2시간 동안 건조시켰다. 이 겔을 X-선 필름에 철야로 노출시켰다.
주형 1, 2 및 3 (상기와 같이 제조됨)이 다음을 부가하여 절단되는 FEN-1 뉴클레아제 에세이의 자기방사선상은 도 6에 도시한다:
A. H2O
B. 2㎕의 CBP-태깅된 Pfu FEN-1
C. 2㎕의 CBP-태깅된 Pfu FEN-1 희석(1:10)
D. 2㎕의 EK 절단된 Pfu FEN-1.
레인은 다음과 같다: 레인 IA, IB, 1C 및 ID는 H2O, 미희석 CBP-태깅된 Pfu FEN-1, CBP-태깅된 Pfu FEN-1 1:10 희석 및 EK 절단된 Pfu FEN-1에 의해 각각 절단된 주형 1을 나타낸다. 레인 2A, 2B, 2C 및 2D는 H2O, 미희석 CBP-태깅된 Pfu FEN-1, CBP-태깅된 Pfu FEN-1의 1:10 희석 및 EK 절단된 Pfu FEN-1에 의해 각각 절단된 주형 2를 나타낸다. 레인 3A, 3B, 3C 및 3D는 H2O, 미희석 CBP-태깅된 Pfu FEN-1, CBP- 태깅된 Pfu FEN-1의 1:10 희석 및 EK 절돤된 Pfu FEN-1에 의해 각각 절단된 주형 3을 나타낸다.
태깅된 Pfu FEN-1은 N-말단 CBP 친화성 정제 태그를 함유한다. FEN-1의 태깅된 것과 태깅되지 않은 것의 활성에서의 차이는 태깅되지 않은 FEN-1에 대한 태깅된 FEN-1의 양이 동등하지 않기 때문에 단백질 농도에서의 차이에 기인한다 (효소 샘플의 농도는 상기 제공된다). 태깅된 및 태깅되지 않은 Pfu FEN-1 모두는 절단 활성을 나타낸다.
도 6은 FEN-1 부재하에서 절단의 배경 기술을 도시한다. (레인 IA, 2A 및 3A). 또한 상기 도면은 태깅된 Pfu FEN-1이 주형 1에 비하여 주형 2를 더 많이 절단함을 나타낸다. 특히, 주형 2의 최대량이 미희석, 태깅된 Pfu FEN-1 존재하에서 절단된다 (레인 2B). 주형 3의 분석은 주형 3의 최대량이 미희석, 태깅된 Pfu FEN-1에 의해 절단되고 또 주형 3의 최소량은 희석되고 태깅된 FEN-1에 의해 절단됨을 나타낸다. 라벨링된 프로브는 40-43 뉴클레오티드 밴드로서 이동한다. FEN-1은 주형 2와 비교하여 우선저으로 주형 3(상류 프라이머 포함)을 절단한다. 절단 생성물 밴드는 16-20 뉴클레오티드에서 이동하는 주요 밴드이다. 라벨링된 절단 생성물에서 이질성은 사용하기 전에 겔 정제되지 않은 라벨링된 기질에서의 이질성에 기인한 것이다.
실시예 11
FEN -1 뉴클레아제, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Taq 중합효소의 존재하에서 β- 액틴의 PCR 증폭과 검출
PCR 에세이는 표적 핵산을 검출하기 위해 이용된다. 상기 에세이의 방법에 따르면, PCR 반응은 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 또는 태그, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Taq 중합효소 (예컨대 Yaq exo-), 및 열안정성 FEN-1 뉴클레아제 (예컨대 Pfu FEN-1, 실시예 2에 기재된 바와 같이 제조)를 포함하는 프로브의 존재하에서 실시한다. 결합 부위 또는 태그의 결합을 통하여 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합되는 형광적으로 라벨링된 단편의 방출의 검출은 표적 핵산의 존재를 나타낸다.
IX Sentinel 분자 비이콘 코어 완충액, 3.5mM MgCl2, 200㎕의 각 dNTP, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Taq 중합효소 (~ 1.45U), Pfu FEN-1 (~ 23ng), β-액틴 프라이머 (30OnM 각각) 및 β-액틴 표적 서열에 프로브가 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 또는 태그를 포함하는 β-액틴 특이적 형광 프로브를 함유하는 PCR 반응을 반복한다. 1O ng의 인간 게놈 DNA (Promega)는 각 반응에서 표적 핵산으로 사용된다. 이 반응은 50㎕ 부피로 실시한다. Pfu FEN-1 단독, 5'→3'엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Taq 중합효소 단독 또는 이간 게놈 DNA 주형을 제외한 모든 성분을 함유하는 반응 혼합물을 함유하는 음성 대조군 반응물을 제조한다. 2.5 유닛의 Taq 2000을 포함하는 양성 대조 반응물도 또한 제조하였다. PCR 반응 동안, 동시적으로 절단 구조의 형성, /3-액틴 표적 서열의 증폭 및 절단 구조의 절단이 존재한다. 온도순환 변수는 절단 구조의 절단이 절단 온도에서 실시되고, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조가 절단 온도 이하에서 안정하도록 선택한다. 반응은 분광형광측정 온도순환장치(ABI 7700)로 에세이하였다. 온도순환 변수는 95℃에서 2분간 또 95℃에서 15초, 60℃에서 60초 또 72℃에서 15초의 40 주기이다. 샘플은 어닐링 단계 동안 인테로게이트된다.
방출된, 형광적으로 라벨링된 단편은 프로브 상의 결합 부위 또는 태그를 통하여 고상 지지체 상에 결합된 포획 요소에 결합된다.
실시예 12
FEN -1 뉴클레아제, 및 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu 중합효소의 존재하에서 β- 액틴의 PCR 증폭과 검출
PCR 에세이는 표적 핵산을 검출하기 위해 이용된다. 상기 에세이의 방법에 따르면, PCR 반응은 표적 핵산에 결합시 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 또는 태그, 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu 중합효소 (천연적으로 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성 결여) 또는 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu 중합효소 (예컨대 exo-Pfu) 및 열안정성 FEN-1 뉴클레아제 (Pfu FEN-1)를 포함하는 프로브의 존재하에서 실시한다. 결합 부위 또는 태그의 결합을 통하여 고상 지지체 상의 포획 요소에 결합되는 형광적으로 라벨링된 단편의 방출의 검출은 표적 핵산의 존재를 나타낸다.
IX 클로닝된 Pfu 완충액 (Stratagene으로부터 입수, 카탈로그 #200532), 3.0 mM MgCl2, 200㎕의 각 dNTP, 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu 중합효소 5 유닛, 태깅되거나 태깅되지 안은 Pfu FEN-1 (~23 ng), PEF (1ng)(WO 98/42860호에 기재됨), β-액틴 프라이머 (30OnM 각각) 및 β-액틴 표적 서열에 프로브가 결합되면 변화되는 2차 구조를 갖고 또 결합 부위 또는 태그를 포함하는 β-액틴 특이적 형광 프로브를 함유하는 PCR 반응을 반복한다. 1O ng의 인간 게놈 DNA (Promega)는 각 반응에서 표적 핵산으로 사용된다. 이 반응은 50㎕ 부피로 실시한다. Pfu FEN-1 단독, 5'→3' 및 3'→5' 엑소뉴클레아제 활성이 결여된 Pfu 중합효소 단독 또는 이간 게놈 DNA 주형을 제외한 모든 성분을 함유하는 반응 혼합물을 함유하는 음성 대조군 반응물을 제조한다. 2.5 유닛의 Taq 2000을 포함하는 양성 대조 반응물도 또 한 제조하였다. PCR 반응 동안, 동시적으로 절단 구조의 형성, /3-액틴 표적 서열의 증폭 및 절단 구조의 절단이 존재한다. 온도순환 변수는 절단 구조의 절단이 절단 온도에서 실시되고, 또 표적 핵산에 결합되지 않을 때 프로브의 2차 구조가 절단 온도 이하에서 안정하도록 선택한다. 반응은 분광형광측정 온도순환장치(ABI 7700)로 에세이하였다. 온도순환(thermocycling) 변수는 95℃에서 2분간 또 95℃에서 15초, 60℃에서 60초 또 72℃에서 15초의 40 주기이다.
방출된, 형광적으로 라벨링된 단편은 프로브 상의 결합 부위 또는 태그를 통하여 고상 지지체 상에 결합된 포획 요소에 결합된다.
실시예 13
롤링 써클 증폭을 포함하는 본 발명에 따른 에세이는 표준 방법에 의해 연막(buffy coat)로부터 추출된 인간 DNA에서 검출되는 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 유전자를 표적으로 사용하여 실시한다. 표적 (400 ng)을 97℃에서 4분간 열변성시키고, 또 2개의 5'-포스포릴화된 올리고뉴클레오티드, 오픈 써클 프로브 및 1개의 갭 올리고뉴클레오티드 존재하의 결찰 조건하에서 배양하였다. 오픈 써클 프로브는 다음 서열:
Figure 112009038784823-PCT00046
(서열번호: 46)을 갖고, 야생형 서열에 대한 갭 뉴클레오티드는 다음과 같다:
Figure 112009038784823-PCT00047
도 7 및 도 8은 롤링 써클 프로브 및 롤링 써클 증폭을 도시한다. 반응 완충액 (40㎕)은 5 유닛/㎕의 T4 DNA 리가아제 (New England Biolabs), 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.2 M NaCl, 10 mM MgCl2, 4 mM ATP, 80 nM 오픈 써클 프로브 및 100 nM 갭 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 37℃에서 25분간 배양한 후, 25㎕를 제거하고 또 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM MgCl2 , 1 mM DTT, 400μM의 각 dTTP, dATP, dGTP, dCTP, 0.2μM 롤링 써클 복제 프라이머:
Figure 112009038784823-PCT00048
(서열번호: 47), phi29 DNA 중합효소 (160 ng/50 ㎕)를 함유하는 25㎕의 용액에 부가하였다. 이 샘플을 30℃에서 30분간 배양하였다.
RNA는 다음 시약 농도를 달성하도록 희석된 보상 완충액(스톡 용액 또는 농축액)을 부가함으로써 오픈 써클 프로브내에 존재하는 T7 프로모터로부터 생성하였다: 35 mM Tris-HCl, pH 8.2, 2 mM 스페르미딘, 18 mm MgCl2, 5 mM GMP, 1 mM의 ATP, CTP, GTP, 333 μM UTP, 667 μM 비오틴-16-UTP, 0.03% Tween 20, 2 유닛/㎕의 T7 RNA 중합효소. RNA 생성은 미국특허 5,858,033호에 기재된 바와 같이 실시한다. 배양은 37℃에서 90분간 지속시켰다.
5 ㎕의 각 샘플 (실제 시험 샘플, (-) 리가아제 대조용 샘플, (-) phi29 DNA 중합효소 대조용 및 (-)T7 RNA 중합효소 대조용)을 검출을 위해 2회 제거하였다. 역전사 과정은 A) 오픈 써클을 결찰하는 단계, B) 롤링 써클 단일 가닥 DNA 합성하는 단계, C) RNA 제조 (오픈 써클 프로브에 존재하는 T7 프로모터로부터), D) RNA를 역전사하여 cDNA 만드는 단계, 및 E) 본 발명에 따른 FEN 절단 구조를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브를 사용하여 cDNA의 PCR 증폭을 실시하는 단계를 포함한 다. 역전사를 위하여, 제조자가 추천한 Taq 2000 DNA 중합효소 대신 동량의 Yaq DNA 중합효소로 치환한 이외에는 Stratagene Sentinel Single -Tube RT-PCR 코어 Reagent Kit (Cat# 600505)에 의해 제공된 시약 및 순서를 이용하였다. 각 반응은 1 X Sentinel 분자 비이콘 RT-PCR 코어 완충액, 3.5 mM MgCl2, 200μM의 각 dNTP, 5 유닛 exo-Pfu, 23 ng Pfu FEN-1, 1 ng PEF, 500 nM의 각 상류 프라이머:
Figure 112009038784823-PCT00049
(서열번호: 48), 역방향 프라이머:
Figure 112009038784823-PCT00050
(서열번호: 49), 및 표적 핵산에 결합시 상기 정의된 바와 같이 2차 구조를 갖고 또 결합 부위를 더 포함하는 형광 프로브 (예컨대 FAM-DABCYL으로 라벨링됨)를 함유한다. 이 반응물들을 45℃에서 30분간, 95℃에서 3분간 배양한 다음 온도 순환장치 내에서 95℃에서 2분, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분의 1주기에 처리하였다. Stratagene의 FluorTracker 또는 PE Biosystems의 7700 서열 검출 시스템 인 플레이트-리드 모드(Detection System in Plate- Read Mode)과 같은 형광 플레이트 판독기로 형광을 측정하였다.
롤링 써클 증폭 RNA 생성물에 비오틴-16-UTP의 혼입으로 인하여 검출 효능에 대한 교차체크가 가능하다. 반응물의 등분량은 고정화되지 않은 포획 프로브를 사용하여 유리 슬라이드(또는 다르게는 마이크로웰 플레이트) 상에 포획되었다. 포획된 RNA 암플리콘의 검출은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된 미국특허 5,854,033호에 기재되어 있다.
실시예 14
변형이 프로브를 절단 내성으로 만드는지 여부를 결정하기 위하여 다음 실험을 실시할 수 있다:
Figure 112009038784823-PCT00051
상기 기재된 올리고뉴클레오티드는 본 발명의 변형이 프로브의 적어도 일부를 뉴클레아제에 의한 절단에 내성으로 만드는지 여부를 결정하기 위하여 절단 반응에 사용될 수 있다.
프로브는 프로브가 절단되지 않으면 검출가능한 신호가 중지되고 또 프로브가 절단되면 검출가능한 신호가 생성되도록 효과적으로 배치(프로브의 +1 위치 상의 FAM(프로브의 c) 및 프로브의 3' 말단 상의 BHQ)된 상호작용성 라벨 쌍(예컨대 FAM, BHQ)에 작용가능하도록 커플링되어 있다. 프로브의 밑줄 친 부분은 5' 플랩에 상응한다. 시험의 변형은 상호작용성 라벨 쌍이 걸쳐 있는 프로브 영역에 포함 된다. 상기 변형이 검출가능한 신호가 생성되지 않게 절단을 방지하지만, 변형이 절단 방지에 효과가 없다면, 검출가능한 신호가 생성될 것이다.
3개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드가 본 실시예에 제시되어 있지만(갭, 닉, 오버랩), 상호작용성 라벨 쌍 사이에서 프로브를 직접적으로 절단할 수 있는한 다른 상류 올리고뉴클레오티드도 사용될 수 있다. 제시된 바와 같이 갭과 닉은 비-오버래핑 올리고뉴클레오티드인 반면에, 1 nt 오버헹은 표적에 어닐링될 때 오버래핑 구조를 형성한다.
간단히 말해, 다음 시약이 반응 혼합물에서 사용될 수 있다: IX 프로브 완충액 (15 mM의 Tris-HCL (pH8), 5OmM KCL, 5.5mM MgCl2, 8% 글리세롤, 1% DMSO), lOOng의 FEN, 20OnM의 프로브, 200nm의 상류 올리고뉴클레오티드, 및 20OnM의 표적. 이 반응은 25㎕의 전체 부피로 실시된다.
이 반응은 Mx3000P 실시간 PCR 기기에서 다음 변수하에서 실시한다:
95℃에서 2분간의 1주기, 이어
95℃에서 10초, 60℃에서 30초간의 40주기.
형광 데이터는 각 주기의 60℃ 단계의 말기에 수집한다. 형광이 음성 대조군 (절단을 방지하는 것으로 공지된 변형을 갖는 프로브)의 값, 예컨대 기저선과 동일 또는 그 이하이면, 변형은 프로브를 절단 내성으로 만드는데 효과적이라 할 수 있다.
실시예 15
다음 실험은 2'-O-메톡시 변형에 의한 프로브의 억제를 나타낸다. 도 16은 본 실시예에 사용된 상류 올리고뉴클레오티드, 표적 및 변형된 하류 프로브를 나타낸다.
이 실험에서는 1Q3F 프로브가 사용되었다. 1Q3F 프로브는 +1 뉴클레오티드 상에 BHQ 또 3' 말단 상에 FAM을 가지므로, 오버래핑 구조가 형성되어 절단되어 라벨을 분리할 때에만 검출가능한 신호가 생성된다. 상호작용성 라벨 (예컨대 FAM, BHQ)은 프로브가 절단되지 않을 때 검출가능한 신호가 중지되도록 효과적으로 배치된다. 프로브의 밑줄친 부분은 5' 플랩에 상응한다. 도 16에 도시된 바와 같이, 1Q3F 프로브는 위치 +2 내지 +16에 2'-O-메톡시 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 오버래핑 구조의 형성시 절단되도록 표적화될 수 있는 영역이다. 상류 올리고뉴클레오티드가 위치 +16 지나서 연장되면, 프로브는 표적으로부터 교체되는 것에 주목해야 한다. 따라서 뉴클레오티드 +17 내지 프로브의 3' 말단은 표적화되지 않을 수 있어 본 발명의 뉴클레아제에 의해 절단된다.
7개의 상이한 상류 올리고뉴클레오티드가 본 발명에 사용되었다: 각각은 표적에 대하여 충분히 상보적이다. 도 16에 도시된 바와 같이, 상류 올리고뉴클레오티드는 2 염기 갭, 1 염기 갭, 닉, 1 염기 오버랩, 2 염기 오버랩, 3 염기 오버랩 또는 하류 프로브의 상보적 부분을 갖는 4 염기 오버랩을 생성하였다.
간단히 말해, 다음 시약 및 농도가 이용되었다:
200ng의 Pfu FEN 뉴클레아제
1.25U Pfu V93R 중합효소
20OnM 프로브:
1Q3F 2' 메톡시 변형 +2 내지 +16
20OnM Alt B 합성 ssDNA 표적; 및
20OnM 상류 올리고:
F-2, F-I, FWD F+l, F+2, F+3 및 F+4
이 반응은 Mx3000P 실시간 PCR 기기에서 다음 변수하에서 실시한다:
95℃에서 2분간의 1주기, 이어
95℃에서 10초, 60℃에서 30초간의 50주기.
형광 데이터는 각 주기의 60℃ 단계의 말기에 수집한다. 아무런 신호가 검출되지 않았다. 따라서, 2'-O-메톡시 변형은 오버래핑 구조의 형성시에 프로브의 저단을 방지하였다.
실시예 16
다음 실험은 3' 말단 비상보적 뉴클레오티드를 갖는 상류 올리고뉴클레오티드 및 5' 플랩을 갖는 하류 프로브를 이용하여 표적 핵산을 검출하는 것을 나타낸다. 도 16은 본 실시예에 사용된 상류 올리고뉴클레오티드 (F-lAmm), 표적 및 변형된 프로브를 도시한다.
이 실험에서 1Q5F 프로브가 사용되었다. 1Q5F 프로브는 +1 뉴클레오티드 상에 BHQ 또 5' 말단 상에 FAM을 가지므로, 비침습적 절단만이 검출가능한 신호 (BHQ와 FAM 사이의 절단)를 생성할 것이다. 상호작용성 라벨 (예컨대 FAM, BHQ)은 프로브가 절단되지 않을 때 검출가능한 신호가 중지되도록 효과적으로 배치된다. 프로 브의 밑줄친 부분은 5' 플랩에 상응한다. 도 16에 도시된 바와 같이, 1Q5F 프로브이 1개는 위치 +2 내지 +16의 2'-O-메톡시 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 1Q5F 프로브는 프로브를 절단 내성으로 만드는 어떠한 변형도 포함하지 않았다.
본 실시예에서, F-lAmm 상류 올리고뉴클레오티드는 표적에 어닐링되어서 하류 프로브의 상보적 부분을 갖는 1 염기 갭을 형성하며 또 표적에 비상보적인 3' 말단 뉴클레오티드를 더 포함한다(참조: 도 16).
간단히 말해, 다음 시약 및 농도가 이용되었다:
200ng의 Pfu FEN 뉴클레아제
1.25U Pfu V93R 중합효소
20OnM 프로브:
1Q5F
2-16 1Q5F으로부터 2' 메톡시 변형
20OnM Alt B 합성 ssDNA 표적
20OnM 상류 올리고:
F-IA 미스매치
이 반응은 Mx3000P 실시간 PCR 기기에서 다음 변수하에서 실시한다:
95℃에서 2분간의 1주기, 이어
95℃에서 10초, 60℃에서 30초간의 50주기.
결과는 표적의 존재를 나타내는 검출가능한 신호가 3' 미스매치를 갖는 상류 뉴클레오티드를 이용하는 반응 혼합물에서 비-오버래핑(비침습적) 절단 구조의 형 성시에 생성됨을 나타낸다.
다른 구체예
다른 구체예는 당업자에게 명백할 것이다. 상술한 상세한 기재는 분명히 기재하기 위해 제시된 것으로 예일 뿐임을 알아야 한다. 본 발명의 정신과 범위는 상기 실시예에 한정되지 않고, 이하의 특허청구범위에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Hologic <120> Methods for the Detection of A Target Nucleic Acid by forming a cleavage structure <130> 225436/1665k <140> us 11/607,341 <141> 2006-11-30 <150> 11/106,237 <151> 2005-04-14 <150> 09/430,692 <151> 1999-10-29 <150> 09/650,888 <151> 2000-08-30 <150> 09/728,574 <151> 2000-11-30 <160> 65 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heltest 4 oligonucleotide for FEN endonuclease activity assay <400> 1 aaaataaata aaaaaaatac tgttgggaag ggcgatcggt gcg 43 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cleavage product of oligonucleotide Heltest4 <400> 2 aaaataaata aaaaaaat 18 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FENAS primer <400> 3 ccattcgcca ttcaggctgc gca 23 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(22) <223> Lac repressor binding site <400> 4 aattgtgagc ggataacaat t 21 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Lac repressor binding site <400> 5 ttaacactcg cctattgtta a 21 <210> 6 <211> 16 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Cap DNA binding site <400> 6 tgtgagttag ctcact 16 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Cap DNA binding site <400> 7 acactcaatc gagtga 16 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> lambda repressor DNA binding site <400> 8 tatcaccgcc agaggta 17 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Bacteriophage lambda <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> lambda repressor DNA binding site <400> 9 atagtggcgg tctccat 17 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> GAL4 DNA binding site <400> 10 cggaggactg tcctccg 17 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> GAL4 DNA binding site <400> 11 gcctcctgac aggaggc 17 <210> 12 <211> 9 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> MAT alpha 2 DNA binding site <400> 12 catgtaatt 9 <210> 13 <211> 9 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> MAT alpha 2 DNA binding site <400> 13 gtacattaa 9 <210> 14 <211> 9 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> GCN4 DNA binding site <400> 14 atgactcat 9 <210> 15 <211> 9 <212> DNA <213> Saccharomyces sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> GCN4 DNA binding site <400> 15 tactgagta 9 <210> 16 <211> 10 <212> DNA <213> Drosophila sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Kruppel DNA binding site <400> 16 aacgggttaa 10 <210> 17 <211> 10 <212> DNA <213> Drosophila sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10) <223> Kruppel DNA binding site <400> 17 ttgcccaatt 10 <210> 18 <211> 9 <212> DNA <213> Drosophila sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> bicoid DNA binding site <400> 18 gggattaga 9 <210> 19 <211> 9 <212> DNA <213> Drosophila sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(9) <223> bicoid DNA binding site <400> 19 ccctaatct 9 <210> 20 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> SP1 DNA binding site <400> 20 gggcgg 6 <210> 21 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> SP1 DNA binding site <400> 21 cccgcc 6 <210> 22 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> Oct1 DNA binding site <400> 22 atgcaaat 8 <210> 23 <211> 8 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(8) <223> Oct-1 DNA binding Site <400> 23 tacgttta 8 <210> 24 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> GATA-1 DNA binding site <400> 24 tgatag 6 <210> 25 <211> 6 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(6) <223> GATA-1 DNA binding site <400> 25 actatc 6 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> probe sequence <400> 26 agctactgat gcagtcacgt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> capture element <400> 27 tcgatgacta cgtcagtgca 20 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> lac repressor DNA binding site (complimentary strand) <400> 28 ttaacactcg cctattgtta a 21 <210> 29 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pCAL-n-Ek cloning oligonucleotide <400> 29 gacgacgaca agatgggtgt cccaattggt gagattatac caagaaaag 49 <210> 30 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> pCAL-n-EK cloning oligonucleotide <400> 30 ggaacaagac ccgtttatct cttgaaccaa ctttcaaggg ttgattgttt tccact 56 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequences <220> <223> Universal haripin probe b171 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Universal hairpin probe b171 consists of a 5' terminal T attached to a fluorphor FAM group and a 3' terminal A attached to a quencher Dabcyl group. <400> 31 tcgcagtgtc gacctgcgc 19 <210> 32 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe sp170a <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> probe sp170a consists of two domains: the 5' two thirds have a (universal) sequence compliementary to (SEQ ID NO: 31), and nucleotides that will stop the DNA polymerase, and the 3' one third, which serves as a target specific primer. x: any <400> 32 cagccgtcga tccgcaggtc gacactgccg tcgacggctg 40 <210> 33 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence of top strand synthesized from rerverse primer (3' one third of probe 2, sp170a, SEQ ID NO:32) <400> 33 gcagctgccg ac 12 <210> 34 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' two thirds of probe 2 (SEQ ID NO:32) containing sequences that are complimnetary to the universal hairpin probe 1 (b171, SEQ ID NO: 31) <400> 34 tccgcaggtc gacactgccg tcgacggctg 30 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B1 primer <400> 35 cgatcgagca agcca 15 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer B2 <400> 36 cgagccgctc gctg 14 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S1 <400> 37 accgcatcga atgcatgtct cgggtaaggc gtactcgacc 40 <210> 38 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer S2 <400> 38 cgattccgct ccagacttct cgggtgtact gagatcccct accgcatcga atgcatgtct 60 cgggtaaggc gtactcgacc 80 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Seqeunce <220> <223> primer <400> 39 aaggcgtact cgacctgaaa 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorogenic Probe <400> 40 accatacgga taggggatct c 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 41 gcaaagtatc atccctccag 20 <210> 42 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target Sequence <400> 42 cctctgcaga ctactattac ataatacgac tcactatagg gatctgcacg tattagccta 60 tagtgagtcg tattaatagg aaacaccaaa gatgatattt cgtcacagca agaattcagg 120 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 43 cctctgcaga ctactattac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic DNA <400> 44 cctgaattct tgctgtgacg 20 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorogentic Probe <400> 45 taggaaacac caaagatgat attt 24 <210> 46 <211> 95 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Circular Probe <400> 46 gaggagaata aaagtttctc ataagactcg tcatgtctca gcagcttcta acggtcacta 60 atacgactca ctataggttc tgcctctggg aacac 95 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rolling circle replication primer <400> 47 gctgagacat gacgagtc 18 <210> 48 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> upstream primer <400> 48 aagtttctca taagactcgt cat 23 <210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 49 aggcagaacc tatagtgagt cgt 23 <210> 50 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Target <400> 50 ggctgtctta actaggcgtg tcttaccgga tggtgcccga agacagccaa ccc 53 <210> 51 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe <400> 51 gccaagcgag agatgcgcgt cgtagttttt tctaccacgg gcttctgtcg gttggg 56 <210> 52 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer <400> 52 ccgacagaat tgatccgcac agaatgg 27 <210> 53 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer <400> 53 ccgacagaat tgatccgcac agaatggc 28 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream Primer <400> 54 ccgacagaat tgatccgcac agaatggcc 29 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe <400> 55 accggtgaca tttacctgct caacctggcc 30 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Probe <400> 56 accggtgaca tttacctgct caacctggcc 30 <210> 57 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Target <400> 57 gacgtttttc gacttcacca taggactgta aatggacgag ttggaccggg acgt 54 <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 58 ctgcaaaaag ctgaagtggt atcctgac 28 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 59 ctgcaaaaag ctgaagtggt atcctga 27 <210> 60 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 60 ctgcaaaaag ctgaagtggt atcctg 26 <210> 61 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 61 ctgcaaaaag ctgaagtggt atcct 25 <210> 62 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 62 ctgcaaaaag ctgaagtggt atcc 24 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 63 ctgcaaaaag ctgaagtggt atc 23 <210> 64 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 64 ctgcaaaaag ctgaagtggt ata 23 <210> 65 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 65 ctgcaaaaag ctgaagtggt at 22

Claims (74)

  1. 중합효소, 절단제, 상류 프라이머 및 하류 절단 내성 프로브를 포함하는 조성물로서, 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하고, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬운 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 부분은 +1 위치의 하류 부분이 절단되지 않게 하는 1 이상의 변형을 포함하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 +2 위치의 하류 부분이 절단되지 않게 하는 1 이상의 변형을 포함하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 엘보우의 상류 및 엘보우에 인접하는 2 이상의 티미딘 스트레치를 갖는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 엘보우의 상류 및 엘보우에 인접하는 3 이상의 티미딘 스트레치를 갖는 조성물.
  6. 제 2항에 있어서, 상기 변형이 티오포스페이트인 조성물.
  7. 제 2항에 있어서, 상기 변형이 2'-O-메톡시인 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성이 아닌 표적 상보적 영역을 포함하고 또 프라이머 연장이 실시되는 온도보다 낮은 Tm을 갖는 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 검출가능한 신호의 생성을 중지하도록 효과적으로 위치한 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함하고, 상기 라벨링된 부위는 FEN 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리되는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함하는 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 비-오버래핑 절단 구조의 절단시 분리되도록 효과적으로 배치된 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍의 제1 멤버는 위치 +1에 작용가능하게 커플링되고 또 상기 상호작용성 신호 생성 부위 쌍의 제2 멤버는 5' 플랩에 작용가능하게 커플링되어 있는 조성물.
  14. 제 1항에 있어서, 프라이머인 표적의 동일 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고 또 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, 하류 절단 내성 프로브에 상보적인 표적 영역 상류 및 인접한 표적 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 역방향 프라이머를 더 포함하는 조성물.
  17. 제 1항에 있어서, 중합효소가 실질적으로 5'→3' 뉴클레아제 활성을 결여하는 조성물.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 절단제는 5' 뉴클레아제를 포함하는 조성물.
  19. 제 4항에 있어서, 상기 5' 뉴클레아제는 FEN-1인 조성물.
  20. 제 5항에 있어서, FEN-1 뉴클레아제가 플랩 특이적 뉴클레아제인 조성물.
  21. 제 5항에 있어서, FEN-1 뉴클레아제가 열안정성인 조성물.
  22. 제 1항에 있어서, 상기 중합효소가 열안정성인 조성물.
  23. 제 1항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브의 3' 뉴클레오티드가 차단기를 갖는 조성물.
  24. 중합효소, 절단제, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 절단 내성 프로브를 포함하는 조성물로서, 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하고, 상기 상류 올리고뉴클레오티드는 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 갖고, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬운 조성물.
  25. 제 19항에 있어서, 상기 상류 올리고뉴클레오티드는 하류 절단 내성 프로브에 상보적인 표적 영역에 인접한 표적 영역에 상보적인 조성물.
  26. 제 19항에 있어서, 상기 상류 올리고뉴클레오티드의 표적 상보적 영역 및 하 류 절단 내성 프로브는 표적 핵산에 혼성화된 갭에 의해 분리되는 조성물.
  27. 제 19항에 있어서, 상기 상류 올리고뉴클레오티드의 표적 상보적 영역 및 하류 절단 내성 프로브는 표적 핵산에 혼성화될 때 닉(nick)에 의해 분리되는 조성물.
  28. 제 1항에 따른 조성물 및 팩케이징 물질을 포함하는 키트.
  29. 제 20항에 있어서, 절단제가 5' 뉴클레아제를 포함하는 키트.
  30. 제 21항에 있어서, 5' 뉴클레아제가 FEN-1 뉴클레아제인 키트.
  31. 제 20항에 있어서, 상기 하류 내성 프로브의 3' 뉴클레오티드가 차단기를 갖는 키트.
  32. 제 20항에 있어서, 절단 내성 프로브가 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 키트.
  33. 제 20항에 있어서, 절단 내성 프로브가 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함하는 키트.
  34. 제 25항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍이 켄처 부위 및 형광 부위를 포함하는 키트.
  35. 제 25항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍의 제1 멤버가 절단 내성 프로브의 5' 플랩에 작용가능하게 커플링되어 있는 키트.
  36. 제 24항에 있어서, 적어도 1개의 라벨링된 부위는 절단 내성 프로브의 5' 플랩에 작용가능하게 커플링되어 있는 키트.
  37. 제 1항에 있어서, 표적 핵산을 더 포함하는 조성물.
  38. 제 14항에 있어서, 프라이머인 표적의 동일 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고 또 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 키트.
  39. 제 18항에 있어서, 제29항의 영역의 상류 및 인접한 표적 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 키트. 제 18항에 있어서, 역방향 프라미어를 더 포함하는 키트.
  40. 제 18항에 있어서, 중합효소는 실질적으로 5'→3' 뉴클레아제 활성이 결여된 키트.
  41. 제 24항에 따른 조성물 및 팩케이징 물질을 포함하는 키트.
  42. 다음 성분을 포함하는 조성물:
    (i) 절단제;
    (ii) 3'→5' 순으로 제1 영역, 연장 영역 및 제2 영역을 포함하는 표적 핵산;
    (iii) 상기 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 상류 프라이머;
    (iv) 5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 하류 절단 내성 프로브, 이때 3' 영역은 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 5' 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않고, 상기 절단 내성 프로브는 또한 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움; 및
    (v) 중합효소.
  43. 다음 성분을 포함하는 조성물:
    (i) 절단제;
    (ii) 3'→5' 순으로 제1 영역, 연장 영역 및 제2 영역을 포함하는 표적 핵산;
    (iii) 상기 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 상류 올리고뉴클레오티드;
    (iv) 5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 하류 절단 내성 프로브, 이때 3' 영역은 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 5' 영역은 표적 핵산에 상보적이지 않고, 상기 절단 내성 프로브는 또한 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움; 및
    (v) 중합효소.
  44. 표적 핵산 서열을 포함하는 샘플을 중합효소, 상류 프라이머 및 절단 내성 프로브와 함께 배양하는 것에 의해 절단 구조를 형성하고 또 신호를 생성하기 위하여 절단제로 절단하기 쉬운 프로브 내의 위치에서 상기 절단 구조를 절단하는 것을 포함하며, 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하고, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의 해 절단되기 쉬우며, 상기 신호의 생성은 샘플 중에서 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는, 샘플 중의 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법.
  45. 제 44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 +1 위치의 하류 부분이 절단되지 않게 하는 1 이상의 변형을 포함하는 방법.
  46. 제 44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 +2 위치의 하류 부분이 절단되지 않게 하는 1 이상의 변형을 포함하는 방법.
  47. 제 42항 또는 제44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 엘보우의 상류 및 엘보우에 인접하는 2 이상의 티미딘 스트레치를 갖는 방법.
  48. 제 45항에 있어서, 상기 변형이 티오포스페이트인 방법.
  49. 제 45항에 있어서, 상기 변형이 2'-메톡시인 방법.
  50. 제 44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 절단되기 쉽고 또 프라이머 여장이 실시되는 온도보다 낮은 Tm을 갖는 표적 상보적 영역을 포함하는 방법.
  51. 제 44항에 있어서, 절단 내성 프로브는 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 방법.
  52. 제 44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 검출가능한 신호의 생성을 중지하도록 효과적으로 위치한 상호작용성 신호 생성 라벨링된 부위 쌍을 포함하고, 상기 라벨링된 부위는 FEN 뉴클레아제 절단되기 쉬운 부위에 의해 분리되는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 켄처 부위 및 형광 부위를 포함하는 방법.
  54. 제 52항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍은 비-오버래핑 절단 구조의 절단시 분리되도록 효과적으로 배치된 방법.
  55. 제 52항에 있어서, 상호작용성 신호 생성 부위 쌍의 제1 멤버는 위치 +1에 작용가능하게 커플링되고 또 상기 상호작용성 신호 생성 부위 쌍의 제2 멤버는 5' 플랩에 작용가능하게 커플링되어 있는 방법.
  56. 제 44항에 있어서, 상기 중합효소가 열안정성인 방법.
  57. 제 44항에 있어서, 상기 절단제가 FEN 뉴클레아제인 방법.
  58. 제 57항에 있어서, 상기 FEN 뉴클레아제는 플랩 특이적 뉴클레아제인 방법.
  59. 제 57항에 있어서, 상기 FEN 뉴클레아제는 열안정성인 방법.
  60. 제 44항에 있어서, 상기 절단 내성 프로브는 신호를 제공할 수 있는 적어도 1개의 라벨링된 부위를 포함하는 방법.
  61. 제 44항에 있어서, 표적의 동일 영역에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 더 포함하고, 상기 상류 오리고뉴클레오티드는 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 더 포함하는 방법.
  62. 제 44항에 있어서, 하류 절단 내성 프로브에 상보적인 표적 영역의 상류 및 인접하는 표적 영역에 상보적인 상류 올리고뉴클레오티드를 더 포함하는 방법.
  63. 제 44항에 있어서, 역방향 프라이머를 더 포함하는 방법.
  64. 제 44항에 있어서, 상기 중합효소는 실질적으로 5'→3' 뉴클레아제 활성이 결여되어 있는 방법.
  65. 표적 핵산 서열을 포함하는 샘플을 중합효소, 상류 프라이머 및 절단 내성 프로브와 함께 배양하는 것에 의해 절단 구조를 형성하고 또 신호를 생성하기 위하여 절단제로 절단하기 쉬운 프로브 내의 위치에서 상기 절단 구조를 절단하는 것을 포함하며, 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하고 또 상기 상류 올리고뉴클레오티드는 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 가지며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬우며, 상기 신호의 생성은 샘플 중에서 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는, 샘플 중의 표적 핵산 서열의 존재를 나타내는 신호를 생성하는 방법.
  66. 표적 핵산 서열을 포함하는 샘플을 중합효소, 상류 프라이머 및 절단 내성 프로브와 함께 배양함으로써 절단 구조를 형성하고 또 상기 절단 구조를 절단되기 쉬운 프로브 내의 위치에서 절단제에 의해 절단하여 핵산 단편을 방출하며 또 샘플 중의 표적 서열의 존재를 나타내는 표시로서 단편의 방출을 검출 및/또는 측정하는 것을 포함하는 표적 핵산 서열을 검출 또는 측정하는 방법.
  67. (i) 상류 프라이머와 하류 절단 내성 프로브의 어닐링, (ii) 상류 프라이머의 연장, 이때 중합효소는 프라이머 연장 생성물을 합성하여 하류 절단 내성 프로브를 갖는 절단 구조를 형성함, 및 (iii) 상기 절단 구조를 절단제로 절단하여 검출가능한 신호를 생성하고 또 그 신호를 검출 및/또는 측정하는 단계를 허용하는 조건하에서 절단제, 상류 프라이머, 하류 절단 내성 프로브, 중합효소 및 표적 핵산을 혼합하는 것을 포함하며,
    상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하고, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않고 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬운, 샘플 중의 표적 핵산 서열을 검출하는 방법.
  68. 제 67항에 있어서, 상기 하류 절단 내성 프로브는 5' 영역 및 3' 영역을 포함하며 또 상기 3' 영역은 표적 핵산에 대해 적어도 부분적으로 상보적이고 또 상기 5' 영역은 플랩을 형성하는 방법.
  69. (a) 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 상류 프라이머, 및
    5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 하류 절단 내성 프로브를 제공하며,
    이때 3' 영역은 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분과 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않으며 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움;
    (b) 표적 핵산과 상류 프라이머 및 하류 절단 내성 프로브의 3' 영역 사이에 듀플렉스 형성을 허용하는 조건하에서, 표적 핵산 및 상류 프라이머 및 하류 절단 내성 프로브를 혼합하며;
    (c) 절단 구조를 형성하기에 충분한 연장 영역의 길이에 상보적인 핵산 가닥의 중합반응에 의해 상류 프라이머의 연장을 허용하는 조건하에서, 상기 듀플렉스를 중합효소 활성에 처리시키고;
    (d) 절단 구조의 형성에 의존저인 방식으로 하류 절단 내성 프로브 내에 위치한 부위에서 절단 구조의 절단이 생기게 하는 조건하에서, 절단제를 제공하여 하류 절단 내성 프로브의 절단을 허용하고;
    (e) 하류 절단 내성 프로브의 절단을 검출하는 것을 포함하는,
    표적 핵산을 검출하는 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 중합효소 활성은 절단 구조를 형성하기에 충분한 연장 영역 길이에 상보적인 뉴클레오티드를 중합하고, 중합된 상보적 핵산은 듀플렉스 내에 하류 올리고뉴클레티드에 대하여 3' 말단에 인접하는 방법.
  71. 제 69항에 있어서, 중합효소 활성은 절단 구조를 형성하기에 충분한 연장 영역 길이에 상보적인 뉴클레오티드를 중합하고, 연장 영역의 길이는 연장 영역이 충분히 듀플렉스 핵산으로 존재하게 하는 길이인 방법.
  72. 제 69항에 있어서, 하류 절단 내성 프로브의 5' 영역은 5' 플랩을 형성하는 방법.
  73. (a) 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 상류 프라이머,
    표적 핵산의 연장 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 표적에 비상보적인 적어도 1개의 3' 말단 뉴클레오티드를 포함하는 상류 올리고뉴클레오티드, 및
    5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 하류 절단 내성 프로브를 제공하며,
    이때 3' 영역은 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분과 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않으며 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움;
    (b) 표적 핵산과 상류 프라이머, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 절단 내성 프로브의 3' 영역 사이에 듀플렉스 형성을 허용하는 조건하에서, 표적 핵산, 상류 프라이머, 상류 올리고뉴클레오티드 및 하류 절단 내성 프로브를 혼합하고;
    (c) 상류 프라이머의 연장 및 절단 내성 프로브의 절단을 허용하는 조건하에서, 상기 듀플렉스를 중합효소 활성과 절단 활성 처리시키며; 또
    (e) 하류 절단 내성 프로브의 절단을 검출하는 것을 포함하는,
    표적 핵산을 검출하는 방법.
  74. 다음 단계를 포함하는 표적 핵산을 검출하는 방법:
    (a) 3' → 5' 순으로 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 표적 핵산,
    3'→ 5' 순으로 제1 영역 및 제2 영역을 포함하는 주형 핵산,
    상기 표적 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 제1 상류 올리고뉴클레오티드,
    5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 제1 절단 내성 프로브, 이때 3' 영역은 상기 표적 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 5' 영역은 상기 표적 핵산에 상보적이지 않지만 상기 주형 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또 상기 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않으며 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움;
    5' 영역 및 3' 영역을 포함하는 제2 절단 내성 프로브, 이때 3' 영역은 상기 주형 핵산의 제2 영역에 적어도 부분적으로 상보적이고 또 5' 영역은 상기 표적 핵산에 상보적이지 않지만 상기 주형 핵산의 제1 영역에 적어도 부분적으로 상보적이며, 또 상개 절단 내성 프로브는 절단 내성 부분 및 절단되기 쉬운 부분을 포함하며, 상기 절단 내성 부분은 오버래핑 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되지 않으며 또 상기 절단되기 쉬운 부분은 비-오버래핑 절단 구조의 형성시에 절단제에 의해 절단되기 쉬움;
    절단제, 및
    핵산 중합효소를 제공하고;
    (b) 상기 표적 핵산, 상기 주형 핵산, 상기 제1 상류 올리고뉴클레오티드, 상기 제1 절단 내성 프로브, 상기 제2 절단 내성 프로브, 상기 절단제 및 상기 핵산 중합효소를 상기 반응 조건이 허용하는 반응 조건하에서 혼합하고,
    상기 표적 핵산과 상기 제1 상류 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 절단 내성 프로브 사이에 듀플렉스를 형성하며, 이때 상기 제1 절단 내성 프로브의 5' 영역은 제1 절단 구조의 제1 플랩을 형성하며,
    상기 절단제에 의해 제1 플랩을 절단하여 제1 플랩의 방출을 허용하고,
    방출된 제1 플랩, 상기 주형 핵산, 및 상기 제2 내성 내성 프로브와의 제2 듀플렉스를 형성하며, 이때 상기 제2 절단 내성 프로브의 5' 영역은 제2 절단 구조의 제2 플랩을 형성하며, 또
    상기 절단제에 의해 제2 플랩을 절단하고; 또
    (c) 제2 플랩의 절단으로부터 생성된 신호를 검출하고, 상기 신호는 상기 제1 및 제2 듀플렉스가 형성될 때 적어도 1개의 닉(nick)에 의해 상기 제1 상류 올리고뉴클레오티드 및 상기 제1 절단 내성 프로브 및 상기 방출된 플랩 및 상기 제2 절단 내성 프로브가 분리될 때에만 생성됨.
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