CN101707886A - 以切割反应检测核酸的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了产生指示样品中靶核酸序列存在的信号的方法、组合物和试剂盒，包括以上游和下游寡核苷酸温育包含靶核酸序列的样品形成切割结构和以核酸酶切割该切割结构产生信号。可检测信号的存在指示靶核酸序列和非侵入切割结构的存在。

Description

以切割反应检测核酸的方法和组合物
相关申请
本申请是依据美国专利法35U.S.C.§120要求2005年8月5日递交的美国专利申请11/198,762的优先权的部分继续申请，而美国专利申请11/198,762是2004年11月15日递交的美国专利申请10/981,942的部分继续申请，而美国专利申请10/981,942是2000年11月21日递交的美国专利申请09/717,602的分案。本申请还要求2006年3月17日递交的美国临时申请60/783,633和2005年4月24日递交的美国临时申请60/794,628的权益。以上申请的全部教导内容通过引用纳入本文。
发明背景
DNA复制、重组和修复的保真性对于维持基因组的稳定性是必不可少的，所有这些过程均依赖于存在于所有生物中的5′3′外切核酸酶。对于DNA修复而言，需要这些酶进行受损片段的切除和重组错配的校正。对于复制而言，这些核酸酶对于后随链DNA合成期间冈崎片段的有效加工是至关重要的。在大肠杆菌(Escherichia coli)内，这后一种活性是由DNA聚合酶I(PolI)提供的；具有PolI 5′-3′外切核酸酶结构域失活突变的大肠杆菌菌株由于无法加工冈崎片段不能存活。但真核生物DNA聚合酶缺乏内在的5′→3′外切核酸酶结构域，这一关键的活性是由多功能的结构特异性金属核酸酶(metallonuclease)FEN-1(5′外切核酸酶-1(five′exonuclease-1)或活瓣内切核酸酶-1(flap endonuclease-1))提供的，该酶也可作为5′DNA活瓣结构(5′DNA flap)的内切核酸酶(Hosfield等人，1998a，Cell，95：135综述)。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了一种切割靶DNA分子的方法，其中以自水生栖热菌(Thermus aquaticus)分离的DNA聚合酶(Taq聚合酶)和可与序列在理想切割位点处杂交的部分互补寡核苷酸温育5′标记的靶DNA。通过形成含有具有与理想切割位点相对的3′延伸的双链体的底物结构，该部分互补的寡核苷酸指导Taq聚合酶结合到靶DNA上，其中寡核苷酸的非互补区提供了3′臂，而底物分子未退火的5′区域提供了5′臂。未杂交时或与靶序列在理想切割位点杂交时，该部分互补的寡核苷酸包含可形成短发夹的3′核苷酸延伸部。Taq聚合酶进行切割后，检测到标记片段的释放。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了具有极少或没有可检测的合成活性和具有野生型热稳定核酸酶活性的突变热稳定DNA聚合酶的生成。之所以说突变聚合酶有用，是因为它们缺乏5′到3′的合成活性；在检测法的DNA切割步骤中，这样的合成活性是不良的副反应。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780公开了野生型Taq聚合酶或缺乏合成活性的突变Taq聚合酶，在结合到发夹结构3′臂的引物的存在下，通过切割由先热变性后冷却而形成的5′端标记的发夹结构，可释放标记的片段。而且，美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还教导，缺乏合成活性的突变Taq聚合酶也可在没有结合到发夹结构3′臂的引物的情况下切割该发夹结构。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了在结合到发夹结构3′臂的引物的存在下，缺乏合成活性的突变Taq聚合酶对该发夹结构的切割生成了单一种类的标记切割产物，而由于野生型Taq聚合酶具有高水平的合成活性，野生型Taq聚合酶在dNTP的存在下产生了多种切割产物，并将发夹结构转变为双链形式。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了表现出合成活性下降的突变Taq聚合酶(而非野生型Taq聚合酶)通过切割含有5′端标记靶核酸和互补的寡核苷酸的线性核酸底物可释放单个标记的片段，其中该互补寡核苷酸与靶核酸的一部分杂交，使得该靶核酸的5′区域和3′区域没有退火到寡核苷酸上，仍保持单链状态。
美国专利5,846,717、6,090,543、6,001,567、6,090,606、5,985,557和5,994,069涉及在靶序列上形成核酸切割结构和以位点特异方式切割该核酸切割结构的方法。这些专利还涉及使用各种酶的5′核酸酶活性来切割靶依赖性的切割结构，从而指示特异核酸序列或其变体的存在。
美国专利5,843,669公开了一种使用热稳定的FEN-1核酸酶在表现出合成活性下降的突变Taq聚合酶存在或不存在的情况下通过裂解酶片段长度多态性分析来检测多态性的方法。根据该方法，使用5′端标记的引物(以TMR荧光染料标记)经PCR反应标记双链丙型肝炎病毒(HCV)的DNA片段。TMR标记的PCR产物加热到95℃进行变性，随后冷却到55℃，以生成切割结构。美国专利5,843,669公开了一种包含含有二级结构的单链核酸底物的切割结构。在CleavaseBN核酸酶或源自古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)的FEN-1核酸酶或这两种酶存在的情况下进行切割。标记的反应产物以凝胶电泳和随后的荧光成像进行显示。美国专利5,843,669公开了CleavaseBN核酸酶和詹氏甲烷球菌FEN-1核酸酶产生可轻易相互区分开的切割模式，来自含有这两种酶的反应的切割模式包括每种酶切割所产生的模式成分，但不仅仅是每种酶产生的切割模式的组合。这表明不被一种酶切割的一些片段(在该酶的模式上以条带出现)可在相同的反应混合物中被第二种酶切割。
Lyamichev等人公开了一种检测DNA的方法，其中与靶DNA的区域部分互补的寡核苷酸探针的重叠配对与靶DNA进行混合，形成5′活瓣区域，其中热稳定FEN-1核酸酶对标记的下游探针的切割产生标记的切割产物。Lyamichev等人还公开了反应条件，其中对于单个靶序列，可在没有温度循环的条件下切割多个拷贝的下游寡核苷酸探针，以扩增切割信号和允许在亚阿托摩尔(sub-attomole)水平下定量检测靶DNA(Lyamichev等人，1999，Nat.Biotechnol.，17：292)。
美国专利4,683,202、4,683,195和4,800,159公开了聚合酶链反应(PCR)技术。最简单形式的PCR是一种使用两个与相反链杂交且位于靶DNA目的区域两侧的寡核苷酸引物进行特异DNA序列酶促合成的体外方法。包括模板变性、引物退火和DNA聚合酶所催化的退火引物延伸的一系列重复步骤导致特异片段的指数性累积，其中特异片段的末端由两个引物的5′端限定。据报道PCR可选择性地富集特异的DNA序列，使其增加109倍。Saiki等人，1985，Science，230：1350也描述了PCR方法。
美国专利5,210,015和5,487,972公开了一种用于释放标记探针的基于PCR的检测，其包括在PCR反应的扩增步骤期间在待扩增的核酸、具有5′到3′外切核酸酶活性的Taq聚合酶和5′端或3′端标记的探针或5′端和3′端均标记的探针存在下产生信号，其中该探针包含与扩增区域互补的区域和附加的非互补5′尾区。美国专利5,210,015和5,487,972还公开了当Taq聚合酶被上游探针以不依赖于聚合的方式例如在没有dNTP存在的情况下定位于标记探针附近时，该基于PCR的检测可释放杂交探针的5′标记末端。
美国专利5,843,669、5,719,028、5,837,450、5,846,717和5,888,780还公开了一种在二级结构的天然区域处切割标记核酸底物的方法。根据该方法，以PCR制备生物素标记的DNA底物，其与野生型Taq聚合酶或CleavaseBN(具有降低的合成活性和野生型5′到3′核酸酶活性的突变Taq聚合酶)混合，95℃下温育5秒使底物变性，随后快速冷却至65℃，以允许通过在互补碱基间形成链内氢键使得DNA采取其独特的二级结构。反应混合物在65℃下温育，以便发生切割和检测生物素化的切割产物。
发明内容
本发明提供了产生指示样品中靶核酸序列存在的信号的方法、组合物和试剂盒，包括以上游和下游寡核苷酸温育包含靶核酸序列的样品形成切割结构和以核酸酶切割该切割结构产生信号。可检测信号的存在指示靶核酸序列和非侵入切割结构的存在。选择一对相互作用的标记物(例如荧光团和猝灭剂)在下游寡核苷酸上的选择性放置，以区分侵入切割反应和非侵入切割反应。只有非侵入切割事件是可检测到的。
可用单个切割反应或依次切割反应实施该方法。在单个切割反应中，仅当切割反应是非侵入性时方产生指示靶核酸存在的可检测信号。在依次切割反应中，来自第一切割反应的释放的活瓣在第二切割反应中用作上游寡核苷酸。在依次切割反应中，仅当第一和第二切割反应均是非侵入性时方产生可检测信号。如果形成侵入性结构，则没有信号产生。当上游寡核苷酸与下游寡核苷酸与靶/模板核酸的相同区域互补时，切割结构是侵入性的。
一方面，本发明提供了一种检测依次检测反应中靶核酸的方法。在这方面，仅当第一和第二切割反应均是非侵入性时方产生可检测信号。如果形成侵入切割结构，没有产生或检测到信号。该方法包括提供靶核酸(图1；A′C′)、模板核酸(图1；H′F′)、第一寡核苷酸(图1；A-1)、第二寡核苷酸(图1；FC)、第三寡核苷酸(图；F2H)、切割剂和具有聚合活性的因子。靶核酸和模板核酸从3′到5′方向具有第一区域(A′或F′)和第二区域(C或H′)。第一寡核苷酸与靶核酸的第一区域至少部分互补。第二寡核苷酸的3′区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，且具有与靶核酸不互补但与模板核酸的第一区域至少部分互补的5′区域。第三寡核苷酸的3′区域与模板核酸的第二区域互补，且具有与模板核酸不互补的5′区域。第三寡核苷酸可操纵地连接到一对相互作用的标记物上，当第三寡核苷酸发生非侵入切割(例如在第三寡核苷酸的肘弯(elbow)处切割)使它们分离时，这对标记物会产生信号。如果形成侵入切割结构，没有信号产生，因为第三寡核苷酸在两个标记物的下游发生切割(例如释放的活瓣在侵入性切割反应中被切割)。
在允许形成第一和第二双链体以及第一和第二切割结构的反应条件下混合试剂。这些反应条件允许靶核酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的每一个形成第一双链体(图1)。在一些实施方式中，第一寡核苷酸的3′核苷酸与靶不互补。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上，使得至少由切口将第一寡核苷酸的3′端和第二寡核苷酸的互补部分分开。第二寡核苷酸退火到靶核酸上时形成5′不互补的第一活瓣。但该不互补的活瓣具有与模板核酸的一部分互补的部分。在一些实施方式中，释放的活瓣的3′末端核苷酸不与模板互补。第二寡核苷酸没有被可检测地标记。
当寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的5′非互补区(第一活瓣)形成第一切割结构。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上，使得至少由切口将第一寡核苷酸的靶互补区和第二寡核苷酸的靶互补区分开。可在第二寡核苷酸的肘弯处切割此切割结构，从而允许释放第一活瓣(图1)。
第二寡核苷酸的释放的第一活瓣、模板核酸和第三寡核苷酸形成第二双链体(图1)。第三寡核苷酸退火到模板核酸上时具有5′不互补的第二活瓣。释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到模板上，使得至少由切口将释放的活瓣的模板互补区与第三寡核苷酸的模板互补区分开(图1)。
当寡核苷酸退火到模板上时，释放的活瓣与第三寡核苷酸的5′非互补区(第二活瓣)形成第二切割结构。核酸酶在第三寡核苷酸的肘弯处或肘弯上游切割此切割结构，从而分离第三寡核苷酸上的一对相互作用的标记物，产生信号(图1)。如果第一切割反应或第二切割反应中发生侵入切割反应事件(例如重叠的互补核苷酸产生的切割)，这对相互作用的标记物不会分开，因此没有信号产生。
可选择一对相互作用的标记物(例如荧光团和猝灭剂)的放置，以区分侵入切割反应和非侵入切割反应。如果第一切割反应或第二切割反应是侵入性的，这对相互作用的标记物没有被分开，因此没有产生可检测信号。因此，本发明的一个实施方式预见猝灭剂(例如BHQ)放置在第三核苷酸互补区的+1位置处以及荧光团(例如FAM)放置在肘弯上游处。在另一实施方式中，猝灭剂和荧光团的位置被颠倒过来。因此，仅当第一切割反应和第二切割反应中均形成非侵入切割结构时，荧光团和猝灭剂方被分开以产生可检测信号。
如果第一切割反应是侵入性的，在两个相互作用的标记物的肘弯下游处切割第二寡核苷酸。因此，标记物没有分开，也没有信号产生。
在一些实施方式中，反应在两个不同的混合步骤中进行。例如，在允许形成第一双链体和发生第一切割反应的条件下混合靶核酸、第一寡核苷酸、第二寡核苷酸、切割剂和聚合剂，制备第一反应混合物。随后在允许形成第二双链体和发生第二切割反应的条件下向第一反应混合物加入第三寡核苷酸和模板核酸，制备第二反应混合物。
聚合活性和切割工具/因子(means/agent)可能存在于单个酶上。提供这两种活性的这类酶包括大肠杆菌的DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、TthDNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。在一个替代实施方式中，聚合活性和切割工具分别由不同的酶提供，例如Pfu DNA聚合酶和FEN-1核酸酶。聚合酶活性是由可为DNA聚合酶和/或热稳定DNA聚合酶的聚合酶提供的。聚合酶可缺乏5′到3′的外切核酸酶活性。切割工具可包含5′核酸酶活性。这种5′核酸酶活性位于FEN-1核酸酶上。FEN-1核酸酶可能是活瓣特异的核酸酶。在一个实施方式中，FEN-1核酸酶是热稳定酶。
在本发明最后三个方面中任一个的又一实施方式中，一系列反应条件是核酸聚合反应条件。在又一实施方式中，核酸聚合反应条件是聚合酶链反应条件。
在本发明的一些实施方式中，第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸的5′部分与第二寡核苷酸的3′部分至少部分互补。在又一实施方式中，当第二寡核苷酸不与靶核酸杂交时，第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸的3′部分和5′部分形成茎结构。第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸可在第二寡核苷酸的5′部分和3′部分之间包括接头序列。该接头序列可能不与靶核酸互补，但可与模板核酸的第一部分互补。第一寡核苷酸、第二寡核苷酸或第三寡核苷酸或模板核酸中任一个的3′端可被封闭。
在本发明的又一实施方式中，本发明涉及一种组合物，其包含靶核酸、模板核酸、第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸。靶核酸和模板核酸从3′到5′方向具有第一区域和第二区域。在一些实施方式中，模板和/或靶还包括位于第一区域和第二区域之间的延伸区域。第一寡核苷酸与靶核酸的第一区域至少部分互补，并具有不与靶互补的3′末端核苷酸。第二寡核苷酸的3′区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，而且其5′区域不与靶核酸互补，但与模板核酸的第一区域至少部分互补。第三寡核苷酸的3′区域与模板核酸的第二区域至少部分互补，而其5′区域不与模板核酸互补。第三寡核苷酸具有5′区域和3′区域，其中3′区域与模板的第二区域至少部分互补，5′区域与模板不互补。一对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到第三寡核苷酸的5′区域，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第三寡核苷酸的3′区域。在又一方面，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第三寡核苷酸的+1位置。在又一实施方式中，所述组合物包括一对引物。
在另一方面，本发明提供了一种以单个切割反应检测靶核酸的方法。在这一方面，仅当两个切割反应均是非侵入性时方产生可检测信号。如果形成侵入切割结构，没有信号产生。该方法包括提供靶核酸(图1；A′C′)、第一寡核苷酸(图1；A-1)、第二寡核苷酸(图1；FC，但还具有一对相互作用的标记物)、切割剂和任选具有聚合活性的因子。靶核酸从3′到5′方向具有第一区域(A′)和第二区域(C′)。第一寡核苷酸与靶核酸的第一区域至少部分互补。第二寡核苷酸的3′区域与靶核酸的第二区域至少部分互补，且具有与靶核酸不互补的5′区域。第二寡核苷酸可操纵地连接到一对相互作用的标记物上，当第二寡核苷酸发生切割(例如第二寡核苷酸肘弯处的切割)使它们分开时，这对标记物会产生信号，但当第二寡核苷酸在两个标记物的下游被切割(例如第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的互补区重叠时)时，这对标记物不会产生信号。
在允许形成第一双链体和第一切割结构的反应条件下混合试剂。这些反应条件允许靶核酸与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸中的每一个形成第一双链体(图1)。在一些实施方式中，第一寡核苷酸的3′核苷酸与靶不互补。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上，使得至少由切口将第一寡核苷酸的靶互补区与第二寡核苷酸的互补区分开。第二寡核苷酸退火到靶上时形成5′非互补活瓣。
当寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的5′互补区(第一活瓣)形成第一切割结构。第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上，使得至少由切口将第一寡核苷酸的靶互补区和第二寡核苷酸分开。核酸酶在第二寡核苷酸的肘弯处或肘弯上游切割此切割结构，从而分离第二寡核苷酸上一对相互作用的标记物，产生信号。如果发生侵入切割反应(例如重叠的互补核苷酸产生的切割)，这对相互作用的标记物不会分开，因此没有信号产生。
在又一方面，本发明涉及具有第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的组合物。第一寡核苷酸与靶核酸的第一区域至少部分互补，还具有与靶不互补的3′末端核苷酸。第二寡核苷酸具有5′区域和3′区域，其中3′区域与靶的第二区域至少部分互补，5′区域与靶不互补，但与模板核酸的第一区域至少部分互补。第三寡核苷酸具有5′区域和3′区域，其中3′区域与模板的第二区域至少部分互补，5′区域与模板不互补。一对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到5′区域，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到3′区域。在又一方面，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第三寡核苷酸的+1位置。在又一实施方式中，所述组合物包括一对引物。
在又一方面，本发明涉及具有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的组合物。第一寡核苷酸与靶核酸的第一区域至少部分互补，还具有与靶不互补的3′末端核苷酸。第二寡核苷酸具有5′区域和3′区域，其中3′区域与靶的第二区域至少部分互补，5′区域与靶不互补。一对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到第二寡核苷酸的5′区域，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第二寡核苷酸的3′区域。在又一方面，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第三寡核苷酸的+1位置。在又一实施方式中，所述组合物包括一对引物。
在一个实施方式中，所述组合物还包括切割工具。在又一实施方式中，所述组合物还包括聚合酶。聚合酶和切割工具可能存在于单个酶上。提供这两种活性的这类酶包括大肠杆菌的DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、TthDNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。在一个替代实施方式中，聚合活性和切割工具分别由不同的酶提供，例如Pfu DNA聚合酶和FEN-1核酸酶。聚合酶活性是由可为DNA聚合酶和/或热稳定DNA聚合酶的聚合酶提供的。聚合酶可缺乏5′到3′的外切核酸酶活性。切割工具可包含5′核酸酶活性。这种5′核酸酶活性位于FEN-1核酸酶上。FEN-1核酸酶可能是活瓣特异的核酸酶。切割工具可为FEN-1核酸酶，聚合酶可为Pfu DNA聚合酶。
在组合物的另一实施方式中，第一寡核苷酸、第二寡核苷酸或第三寡核苷酸或模板核酸的3′端被封闭。3′端的封闭将防止聚合酶对寡核苷酸3′端的延伸。
这种封闭可包含与靶核酸不互补的碱基或包含在允许核酸合成或延伸的条件下抑制三磷酸核苷加入的修饰。优选情况下，封闭的3′端包括：
a)双脱氧核苷酸；
b)核苷酸，其中3′羟基已被替换为磷酸基；或
c)具有结合到3′碳或3′氧的报道部分的核苷酸。
在又一实施方式中，第二寡核苷酸的5′部分与第二寡核苷酸的3′部分至少部分互补。在又一实施方式中，第三寡核苷酸的5′部分与第三寡核苷酸的3′部分至少部分互补。在另一实施方式中，当第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸不与靶核酸或模板核酸杂交时，第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸的3′部分和5′部分形成茎结构。第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸可在第二寡核苷酸的5′部分和3′部分之间包括接头序列。在一些实施方式中，接头序列与靶核酸不互补，但与模板核酸的第一部分互补。
试剂盒可包含上述的任何一种组合物和用于该试剂盒的包装材料。
本发明实施方式和附图的下列描述和权利要求将更充分地体现本发明的进一步特点和优点。
附图简述
图1显示了FEN核酸酶的切割结构。
图2a是显示双链DNA和单链DNA吸光度差异的图。
图2b是显示DNA解链曲线的图。
图2c是显示温度对DNA相对吸光度的效应的图。
图2d是显示温度对DNA相对吸光度的效应的图。
图2e图示了温度对DNA荧光的效应，其中DNA被一对相互作用的标记物标记。
图2f是显示温度对DNA荧光的效应的图，其中DNA被一对相互作用的标记物标记。
图2g是显示靶核酸对DNA荧光的效应的图，其中DNA被一对相互作用的标记物标记。
图3是Sypro Orange染色的聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示CBP标记的PFU FEN-1蛋白。
图4是FEN-1核酸酶测定的放射自显影。
图5表示一个匙型探针(key probe)。
图6显示了可用于检测Fen活性的三个模板(1，2，3)。
图7是描绘采用图1所示的寡核苷酸进行的实时荧光检测的图。
图8图示本发明检测靶核酸的另一实施方式，其中采用均具有3′末端非互补核苷酸的第一寡核苷酸和释放的活瓣。
图9是来自实施例5描述的实时荧光检测的图。
图10是描绘实施例6描述的实时荧光检测的图。
图11图示本发明单个切割反应的另一实施方式。
具体实施方式
本发明提供了一种方法，其中通过形成和切割包含靶核酸、上游寡核苷酸和下游寡核苷酸的切割结构来检测靶核酸。可以依次通过两个或更多的切割反应实施该方法。在一个依次切割反应中，形成了包含靶核酸、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的第一切割结构。当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶核酸杂交时，形成第一切割结构。切割并释放第二寡核苷酸的5′活瓣。释放的活瓣在第二切割结构中用作上游寡核苷酸。第二切割结构包含模板核酸、第二寡核苷酸的释放的活瓣和第三寡核苷酸。当释放的活瓣和第三寡核苷酸与模板核酸杂交时，形成第二切割结构。如果第一切割事件和第二切割事件均是非侵入性的，则在一对相互作用的标记物之间切割第三寡核苷酸。这对相互作用的标记物之间的切割产生可检测信号。检测产生的信号来测定靶核酸的存在和/或量。如果第一切割事件或第二切割事件是侵入性的，则没有信号产生。
本文中所用的“靶核酸”系指从3′到5′方向包含与第一寡核苷酸至少一部分互补的第一区域和与第二寡核苷酸至少一部分互补的第二区域的多核苷酸。在一些实施方式中，该靶核酸可在靶的第一区域和第二区域之间具有延伸区域。所述靶核酸可包含单链或双链的DNA或RNA。
当涉及靶核酸时，本文中所用的“第一区域”是指足以允许第一寡核苷酸杂交的一段长度的核苷酸，其中所述“第一区域”与本文定义的第一寡核苷酸的至少一部分互补。“第一区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8至30个核苷酸，最优选范围是10至25个核苷酸。
当涉及下文所述的模板核酸时，本文中所用的“第一区域”是指足以允许第二寡核苷酸的释放的活瓣杂交的一段长度的核苷酸，其中所述“第一区域”与本文定义的第二寡核苷酸的释放的活瓣的至少一部分互补。“第一区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8至30个核苷酸，最优选范围是10至25个核苷酸。
本文中所用的“延伸区域”系指足以允许寡核苷酸(例如正向引物或第二寡核苷酸的释放的活瓣)经核酸聚合活性发生延伸的一段长度的核苷酸。“延伸区域”出现在靶核酸和模板核酸的一些实施方式中。如若出现，所述“延伸区域”位于靶核酸或模板核酸的第一区域和第二区域之间。“延伸区域”的长度是约1个核苷酸至约1000个核苷酸，优选长度范围是约1-100个核苷酸，更优选的长度范围是3至50个核苷酸，最优选的长度范围是3-10个核苷酸。
当涉及靶核酸时，本文中所用的“第二区域”是指足以允许第二寡核苷酸杂交的一段长度的核苷酸，其中所述“第二区域”与本文定义的第二寡核苷酸的至少一部分互补。“第二区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8至30个核苷酸，最优选范围是10至25个核苷酸。
当涉及模板核酸时，本文中所用的“第二区域”是指足以允许第三寡核苷酸杂交的一段长度的核苷酸，其中所述“第三区域”与本文定义的第三寡核苷酸的至少一部分互补。“第二区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8至30个核苷酸，最优选范围是10至25个核苷酸。
当涉及第一、第二、第三或第四寡核苷酸时，本文中所用的“至少一部分”是指不到第一、第二、第三或第四寡核苷酸100％(例如99％、90％、75％、50％、25％等)的核苷酸。
本文中所用的“模板核酸”系指从3′到5′方向包含与第二寡核苷酸的释放的活瓣至少一部分互补的第一区域和与第三寡核苷酸至少一部分互补的第二区域的多核苷酸。模板核酸还可在模板的第一区域和第二区域之间包括“延伸区域”。模板核酸可包含单链或双链的DNA或RNA或它们的化学修饰物或非天然变体。
本文中所用的“寡核苷酸”系指包含与靶核酸序列和/或模板核酸序列互补的区域的核酸。
本文中所用的术语“寡核苷酸”还系指待检测的引物、探针、上游寡核苷酸(例如第一寡核苷酸和第一释放的活瓣)、下游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸和第三寡核苷酸)和寡聚体片段，而且作为总称泛指多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其他类型的多核苷酸，后者是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)。术语“寡核苷酸”包括双链和单链的DNA以及双链和单链的RNA。术语“寡核苷酸”意指半合成或合成来源的基因组DNA或RNA、cDNA的多核苷酸，其中因其合成来源或操作，该多核苷酸：(1)不与其天然结合的多核苷酸的全部或一部分结合；和/或(2)连接到不同于与其天然连接的多核苷酸的多核苷酸上。当寡核苷酸用作引物以聚合活性使核苷酸聚合到其与延伸区域互补的3′端时，所述寡核苷酸也可称为引物。本发明的“寡核苷酸”还指肽核酸(PNA)或核酸与肽核酸的杂合物。
可用于本发明的寡核苷酸的长度范围一般是约8个核苷酸至约200个核苷酸。
本发明的“第一寡核苷酸”的长度优选是6至100个核苷酸，更优选是8至30个核苷酸，最优选是20个核苷酸。“第一寡核苷酸”与靶核酸至少部分互补。所述第一寡核苷酸可具有与靶核酸不互补的3′端。
本发明的“第二寡核苷酸”的长度优选是20-120个核苷酸，更优选是25-45个核苷酸，最优选是35个核苷酸。“第二寡核苷酸”包含3′区域和5′区域。“第二寡核苷酸”的3′区域与靶核酸至少部分互补，优选具有8-80个核苷酸，更优选具有10-20个核苷酸。对于其中包含预形成的活瓣的双链体结构的实施方式，“第二寡核苷酸”5′区域的长度优选是0至80个核苷酸，最优选是10至20个核苷酸。在本发明的另一实施方式中，本发明的第二寡核苷酸的5′区域不与靶核酸互补。
本发明的“第三寡核苷酸”的长度优选是20-120个核苷酸，更优选是25-45个核苷酸，最优选是35个核苷酸。“第三寡核苷酸”包含3′区域和5′区域。本发明的第三寡核苷酸包含与模板核酸的区域至少部分互补的3′区域，而且该3′区域优选具有8至80个核苷酸，最优选具有10-20个核苷酸。对于其中包含预形成的活瓣的双链体结构的实施方式，“第三寡核苷酸”5′区域的长度优选是0至80个核苷酸，最优选是10至20个核苷酸。在本发明的另一实施方式中，本发明的“第三寡核苷酸”的5′区域不与模板核酸互补。
在一个实施方式中，本发明使用了抗切割的寡核苷酸。在一个优选的实施方式中，第二寡核苷酸和/或第三寡核苷酸是抗切割的探针。
本文中所用的本发明的“抗切割的探针”或“抗切割的寡核苷酸”是形成切割结构的探针，其中在形成非重叠(非侵入)切割结构时该切割结构易被切割剂切割，但在形成重叠(侵入)切割结构时该切割结构不能被切割剂切割。通过引入一个或多个可使重叠结构所靶向的探针部分抵抗切割的修饰，实现这种对切割的抵抗。因此，抗探针的探针具有可抵抗本发明切割剂切割的至少一部分。
在一个实施方式中，抗切割的探针在+1和/或+2位置的下游包含一个或多个可使该探针抵抗本发明切割剂切割的修饰。这些修饰使得探针可抵抗重叠(侵入)切割结构对靶向切割区域的切割。但是，抗切割的探针易被非重叠(非侵入)切割结构在靶向切割区域切割。适宜的修饰包括但不限于将核酸磷酸酯替换为硫代磷酸酯和/或将2′羟基替换为2′-O-甲氧基。其他适宜的修饰包括2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2′F-ANA)核苷酸、锁核酸(locked-nucleic acids，LNA)和ENA：2′-O，4′-C-亚乙烯基桥连核酸(2′-O，4′-C-ethylene-bridged nucleic acids)。2006年11月30日递交的美国专利申请11/607,341描述了适合用于本发明的抗切割的寡核苷酸的制备和使用，该专利申请通过引用整体纳入本文。
提及具有5′活瓣的下游探针时，与靶杂交的该下游探针的核苷酸定义为+1直到+X的核苷酸，其中位置+1定义为下游探针杂交区域的5′末端核苷酸，区域+2定义为紧挨位置+1下游的核苷酸，依此类推。5′活瓣的核苷酸定义为-1直到-X的核苷酸。位置-1定义为活瓣区域的3′末端核苷酸。
本文中所用的本发明的“正向引物”的长度优选是6至100个核苷酸，更优选是8至30个核苷酸，最优选是20个核苷酸。“正向引物”与靶核酸和/或模板核酸在其3′末端至少部分互补，互补长度足以允许使用靶核酸或模板核酸作为模板以正向引物作为引物进行核酸合成。
本文中所用的本发明的“上游寡核苷酸”是退火到靶核酸或模板核酸上时位于下游寡核苷酸上游的任何寡核苷酸。例如，“上游寡核苷酸”可以是“第一寡核苷酸”或“释放的活瓣”。
本文中所用的本发明的“下游寡核苷酸”是退火到靶核酸或模板核酸上时位于上游寡核苷酸下游的任何寡核苷酸。例如，“下游寡核苷酸”可以是本发明的“第二”寡核苷酸或“第三”寡核苷酸。
本文中所用的“完全互补”是指一个寡核苷酸的100％核苷酸可与靶核酸或模板核酸的相应互补核苷酸发生氢键结合。
本文用来指寡核苷酸的“至少部分互补”是指寡核苷酸不到100％(例如99％、90％、75％、50％、25％等)的核苷酸可在标准的严格条件下与靶核酸或模板核酸杂交。当寡核苷酸是“部分互补”时，互补核苷酸的区域可为连续核苷酸或不为连续核苷酸。
对于本文定义的“第二寡核苷酸”，它不用做核酸合成的引物但却在其5′区域提供活瓣，“部分互补性”系指与靶核酸不互补的一段核苷酸区域，其后是在标准的严格条件下允许与靶核酸发生氢键结合的具有充分互补性的一段区域，其中所述第二寡核苷酸可形成本发明的双链体和/或切割结构。在一个实施方式中，具有充分互补性的区域可以是10个或更长(例如20、30、40、50、100等)的连续核苷酸。在另一实施方式中，具有充分互补性的区域包括与靶核酸互补的充分数目的非连续核苷酸，以允许与靶核酸形成杂交体。“第二寡核苷酸”的3′末端可与靶核酸互补，但不要求与靶核酸互补。当3′末端与靶核酸不互补时(例如当3′末端被标记和/或用于检测杂交或非杂交的寡核苷酸时)，非互补区可为连续的或不连续的。在一个实施方式中，具有非互补性的区域可以是连续1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸等，或是10个或更长片段的连续核苷酸(20、30、40、50个等等)。在另一实施方式中，具有非互补性的区域包括与靶核酸不互补的充分数目的不连续核苷酸。
本发明的“第一活瓣”、“第二活瓣”或“第一释放的活瓣”、“第二释放的活瓣”的长度优选是6至80个核苷酸，最优选是10-25个核苷酸。
本文定义的“释放的活瓣”可用作第二切割反应中的上游寡核苷酸。释放的活瓣可与模板核酸的第一区域杂交，但该活瓣的3′末端可与模板互补或不互补。在一个实施方式中，活瓣的3′末端与模板有10个或更多(20、30、40、50个等)连续核苷酸的互补长度。在另一实施方式中，活瓣的3′末端包含与模板核酸互补的区域，其中该互补区域包括与模板核酸互补的充足数目的非连续核苷酸。具有互补性的区域必须包含充足数目的连续核苷酸，以允许杂交体的形成。在一些实施方式中，释放的活瓣具有与模板核酸不互补的一个或多个3′末端核苷酸。
本文定义的“第三寡核苷酸”在其5′区域提供了活瓣，“部分互补性”系指与模板核酸不互补的至少10个连续核苷酸(20、30、40、50个核苷酸等)的区域，其后是允许在标准的严格条件下与模板核酸形成氢键的具有充分互补性的区域。这种具有充分互补性的区域可以是10个或更长(例如20、30、40、50、100个等)的连续核苷酸。“第三寡核苷酸”的3′末端可与模板核酸互补，但不必需与模板核酸互补。当3′末端不与模板核酸互补时(例如当3′末端被标记和/或用于检测杂交或非杂交的寡核苷酸时)，它可以具有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸等或10个或更长的连续核苷酸的非互补区，条件是第三寡核苷酸与模板核酸的互补性没有被破坏。
本文定义的“第三寡核苷酸”可提供5′活瓣，其可被切割并从切割结构上释放来。与模板互补的区域必须包含充足数目的连续核苷酸，以允许与模板核酸形成杂交体。
本文中所用的“混合”是指以任何次序合在一起。
本文中所用的“允许双链体形成的条件”系指有可能形成和优选最适于形成本发明双链体的缓冲液(即特定的盐浓度和有机溶剂浓度)、温度、温育时间和双链体组分(例如靶核酸、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸)的浓度。例如，在本发明的一个实施方式中，在“允许双链体形成的条件”下，靶核酸、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸将发生杂交，使得第二寡核苷酸的5′区域成为活瓣。
本文中所用的“双链体”系指包含靶核酸或模板核酸、上游寡核苷酸或上游引物和下游寡核苷酸至少3′区域的复合物。由于形成氢键，靶核酸或模板核酸的互补核苷酸碱基与上游寡核苷酸或上游引物以及下游寡核苷酸的至少3′区域的每一个互补核苷酸碱基发生杂交。
本文中所用的“第一双链体”系指包含靶、第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的至少3′区域的复合物，其中由于形成氢键，靶核酸或模板核酸的互补核苷酸碱基与第一寡核苷酸和第二寡核苷酸至少3′区域中的每一个互补核苷酸碱基发生杂交。在一些实施方式中，第二寡核苷酸的5′区域和靶核酸的延伸区域不互补，因此没有在双链体中形成杂交体。因此延伸区域可以是单链的。
本文中所用的“第一双链体”还指包含靶核酸、上游引物和下游寡核苷酸至少3′区域的复合物，其中由于形成氢键，模板核酸的互补核苷酸碱基与上游引物和下游寡核苷酸的至少3′区域的每一个互补核苷酸碱基发生杂交，其中下游寡核苷酸的5′区域是活瓣。
本文中所用的“第二双链体”系指包含模板核酸、第二寡核苷酸的释放的活瓣、第三寡核苷酸的至少3′区域的复合物，其中由于与模板核酸形成氢键，模板核酸的互补核苷酸碱基与第二寡核苷酸的释放的活瓣和第三寡核苷酸的至少3′区域的每一个互补核苷酸碱基发生杂交。
分支DNA或DNA/RNA杂交体的“活瓣”或“臂”系指未与分支DNA或DNA/RNA杂交体发生氢键结合但与分支DNA或DNA/RNA杂交体的氢键成员发生磷酸酯键结合的5′多核苷酸。因此活瓣是该结构双链部分悬垂(即分支)的核酸链。本发明的切割结构的“活瓣”优选为约1-80个核苷酸，更优选为约5-25个核苷酸，最优选为约10-20个核苷酸，并且优选在位于分支结构“肘弯”处的磷酸酯的位置或位于活瓣链肘弯近端和/或远端1至10个磷酸酯中任一个的位置进行切割。切割位置取决于上游寡核苷酸相对于下游寡核苷酸的位置。
本文中所用的“肘弯”系指位于5′活瓣的第一个单链核苷酸和第一个双链核苷酸(例如与靶核酸或模板核酸杂交的核苷酸)之间的磷酸酯键。本发明的“活瓣”可用可检测的标记物进行标记。当本发明的“活瓣”或“臂”是本文定义的“切割结构”的一部分时，其被切割工具切割，并被释放来，形成“释放臂”或“释放的活瓣”。
就核酸而言，术语“单链”系指这样的一条多核苷酸链，其可不与任何其他核酸形成氢键，或可在其内部形成自身氢键(形成二级结构或三级结构)或可与另外的核酸分子形成氢键。
就核酸而言，术语“单链的”系指不与另一条核酸形成氢键而且优选不含有或含有很少(少于10％，例如9％、5％、4％等)的内部互补性的一条多核苷酸链。
本文中所用的“延伸”系指在常规的DNA聚合反应中向第一寡核苷酸的3′端或第二寡核苷酸的释放的单链臂的3′端加入三磷酸核苷。因此，第一寡核苷酸的3′端和第二寡核苷酸的释放的单链臂的3′端没有被封闭，在本文中也被称为引物。
一般情况下，模板、第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的3′末端会被“封闭”以防止生成延伸产物。可使用非互补的碱基或向最后一个核苷酸的3′羟基加入化学部分例如生物素或磷酸基来实现“封闭”。还可通过除去3′-OH或使用缺乏3′-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸或通过本领域技术人员知晓的其他方法来实现封闭。
本文中所用的“核酸聚合活性”系指催化三磷酸核苷聚合的酶。一般而言，所述酶将在退火到靶序列上的引物的3′-端启动合成，并沿模板的5′-方向前进，如果还具有5′到3′的核酸酶活性，所述酶会水解插入的退火探针，释放标记的探针片段和未标记的探针片段，直到合成终止。已知的DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)(Pfu)DNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，“核酸聚合活性”则指RNA依赖的聚合活性，例如反转录酶。
本文中所用的“5′到3′外切核酸酶活性”或“5′→3′外切核酸酶活性”系指模板特异的核酸聚合酶的此种活性，例如传统与某些DNA聚合酶联系在一起的5′→3′外切酶活性，籍此活性单核苷酸或寡核苷酸从多核苷酸的5′端以连续方式被除去(即大肠杆菌DNA聚合酶I具有这种活性，而Klenow(Klenow等人，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，65：168)片段没有这种活性(Klenow等人，1971，Eur.J.Biochem.，22：371)，或多核苷酸可被内切核酸酶活性从5′端除去，而该内切酶活性可内在地存在于5′到3′的外切核酸酶活性中。
本文中所用的短语“基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性”或“基本缺乏5′→3′外切核酸酶活性”是指具有野生型酶不到10％、5％、1％、0.5％或0.1％的活性。短语“缺乏5′到3′外切核酸酶活性”或“缺乏5′→3′外切酶活性”是指具有不可检测的5′到3′外切核酸酶活性或具有野生型酶不到约1％、0.5％或0.1％的5′到3′外切核酸酶活性。可通过外切核酸酶测定来测量5′到3′的外切核酸酶活性，该测定包括下列步骤：带有切口的底物在适宜缓冲液例如10mM Tris-HCl(pH 8.0)、10mM MgCl2和50μg/ml牛血清白蛋白的存在下于60℃下切割30分钟，加入含10mM EDTA和1mg/ml溴酚蓝的95％甲酰胺终止切割反应，检测带切口的产物或不带切口的产物。
根据包括两个聚合步骤的本发明所述方法，可用相同的核酸聚合活性或不同的核酸聚合活性实施每个聚合步骤。
本文中所用的“聚合”、“聚合活性”或“聚合酶活性”系指向寡核苷酸的3′端加入三磷酸核苷，其中寡核苷酸的3′端没有被封闭。
本文中所用的“核苷”系指结合糖基(例如DNA中的2-脱氧核糖或RNA中的核糖)的任何嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶碱基。
本文中所用的“核苷酸”系指结合糖基的任何嘌呤或嘧啶碱基，或修饰的嘌呤或嘧啶碱基，其中糖基与磷酸基结合。
本文中所用的“聚合酶链反应”或“PCR”系指扩增特异多核苷酸模板序列的体外方法。PCR反应包括一系列重复的温度循环，一般在50-100μl的体积中进行。反应混合物包含dNTP(四种脱氧核糖核苷酸中的每一种：dATP、dCTP、dGTP和dTTP)、引物、缓冲液、DNA聚合酶和多核苷酸模板。一次PCR反应可由5至100个变性和多核苷酸分子合成的“循环”组成。美国专利4,683,195和4,683,202描述了PCR过程，二者公开内容通过引用纳入本文。
本文中所用的“聚合酶链反应条件”或“PCR条件”系指有可能进行PCR和优选最适进行PCR的缓冲液、一组温度温育步骤和时间。这组温度温育步骤和时间优选允许本发明核酸的变性、退火和延伸。PCR反应条件为本领域知晓，并在本文中进行了描述。
“核酸扩增反应”是指特定核酸序列数目的增加，可通过(但不限于)聚合酶链反应或连接酶链反应的体外方法来完成。
本文中所用的“核酸扩增反应条件”系指有可能进行核酸扩增和优选最适进行核酸扩增的缓冲液、一组温度温育步骤和时间。扩增是指特定核酸序列数目的增加，可通过(但不限于)聚合酶链反应或连接酶链反应的体外方法来完成。这类反应条件为本领域知晓并在本文中进行了描述。核酸反应条件包括PCR条件。
“核酸扩增反应混合物”系指包含核酸扩增必需组分例如缓冲液、各种dNTP、水、靶核酸和聚合酶的混合物。根据核酸扩增的方法，必需组分可有所不同。例如，连接酶链反应需要连接酶的存在，而某些聚合酶链反应可能不需要连接酶。
本文中所用的“切割结构”系指包含具有活瓣的至少一个双链体核酸的多核苷酸结构。本发明的“切割结构”可包含靶核酸序列或模板核酸序列，还可包括与靶序列(例如图1的A-1)至少部分互补和可能完全互补的上游寡核苷酸，以及与靶序列互补且可能包含活瓣的下游寡核苷酸(例如图1的FC或F2H)。在一个实施方式中，第一寡核苷酸退火到靶上形成“第一切割结构”，使得至少1个缺口将第一寡核苷酸的互补部分和第二寡核苷酸的互补部分分开。在另一实施方式中，通过从上游寡核苷酸(引物)的3′端聚合至由第二寡核苷酸的氢键而形成的双链体，形成“第一切割结构”(即双链体和活瓣的接合处)。在另一实施方式中，由退火到模板核酸上的第一释放的活瓣形成“第二切割结构”，使得至少由切口将释放的活瓣的互补部分与第三寡核苷酸的互补部分分开来。在另一实施方式中，上游寡核苷酸的3′端(即第二寡核苷酸的释放臂)聚合至由下游第三寡核苷酸和模板核酸之间的氢键而形成的双链体，形成“第二切割结构”(即双链体和活瓣的接合处)。优选情况下，上游寡核苷酸的3′末端被封闭，封闭末端可防止上游寡核苷酸3′端的延伸。
正如本文使用，还可使用替代术语“邻近”。
如果在这些反应中，新合成核酸的聚合完全通过延伸区域，则上文所指的距离当然没有核苷酸。
因此，本发明的“切割结构”可以是与模板核酸杂交的第二寡核苷酸和含有活瓣即下游寡核苷酸的5′部分的第三寡核苷酸。
本文中所用的“切割结构”包括5′活瓣，不包括不含有5′活瓣的结构，例如仅含有3′活瓣的双链核酸。本文中所用的“切割结构”包含核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸，因此可为RNA或DNA。
本文中所用的“切割工具”系指特异切割本发明的切割结构的因子，优选为酶。
术语“切割工具”或“切割剂”包括具有5′内切核酸酶活性的酶，例如DNA聚合酶，例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶I和来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)和黄栖热菌(Thermus flavus)(Tfl)的DNA聚合酶。术语“切割工具”包括切割本发明的切割结构的因子，其中该切割结构包含0-2个核苷酸、2-20个核苷酸、20-50个核苷酸或50个核苷酸以上的延伸区域单链缺口(即不与上游引物和/或下游探针杂交的一部分延伸区域)。术语“切割工具”还包括FEN核酸酶。术语“FEN核酸酶”是一种具有5′外切核酸酶活性和/或内切核酸酶活性的酶。术语“FEN核酸酶”还包括5′活瓣特异性的核酸酶。术语“切割工具”包括切割本发明的切割结构的FEN核酸酶，其中该切割结构包含0-2个核苷酸、2-20个核苷酸、20-50个核苷酸或50个核苷酸以上的延伸区域单链缺口(即不与上游引物和/或下游探针杂交的一部分延伸区域)。
本发明的“切割工具”或“切割剂”包括但不限于源自Archaeglobusfulgidus、詹氏甲烷球菌、强烈炽热球菌、人、小鼠或爪蟾(Xenopus laevis)的FEN核酸酶。本发明的核酸酶还包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)RAD27、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)RAD2、Pol IDNA聚合酶相关性5′到3′外切核酸酶结构域(例如大肠杆菌、水生栖热菌(Taq)、黄栖热菌(Tfl)、热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)(Bca)、肺炎链球菌)和FEN的噬菌体功能同源物，包括但不限于T55′到3′外切核酸酶、T7基因6外切核酸酶和T3基因6外切核酸酶。优选情况下，仅使用Taq、Tfl和Bca FEN核酸酶的5′到3′外切核酸酶结构域。本发明的“切割工具”还包括剂，优选为切割本发明的包含RNA/DNA复合物的切割结构的酶，其中RNA是模板核酸或靶核酸。术语“切割工具”不包括核糖核酸酶H。
“切割工具”还包括可切割包含上游寡核苷酸(例如图1的A-2)和一个或多个下游寡核苷酸(例如图1的FC)的切割结构的酶，其中聚合从上游寡核苷酸的3′端开始发生，使得上游寡核苷酸延伸的3′端邻近下游寡核苷酸的互补部分(例如图1的C)，但不与下游寡核苷酸的互补部分重叠。
“切割工具”还包括可切割包含上游寡核苷酸(例如图1的A-1)和下游寡核苷酸(例如图1的FC)的切割结构的酶，其中上游寡核苷酸和下游寡核苷酸退火到靶核酸或模板核酸上，使得至少由切口将这两个寡核苷酸的互补部分分开。
本文中所用的“邻近”系指被20个以下的核苷酸例如15个核苷酸、10个核苷酸、5个核苷酸或0个核苷酸分开。
“切割工具”或“切割剂”还包括可切割包含上游寡核苷酸(例如图1的A-2)和一个或多个下游寡核苷酸(例如图1的FC)的切割结构的酶，其中聚合从上游寡核苷酸的3′端开始发生，使得上游寡核苷酸延伸的3′端距离下游寡核苷酸的互补区域(例如图1的C)小于50个核苷酸，但不与下游寡核苷酸重叠。根据本发明的该实施方式，贯穿延伸区域并位于上游寡核苷酸3′端和足够接近下游寡核苷酸活瓣的接合处的位置之间的距离是一段允许在上游寡核苷酸的3′端发生足够数目的聚合以形成本发明的切割结构的长度。
根据包括两个切割步骤的本发明所述方法，可通过相同的切割工具或不同的切割工具来实施每个切割步骤。
本发明的“切割工具”可以是同时具有聚合酶活性和核酸酶活性的单个酶或具有核酸酶活性但缺乏聚合酶活性的单个酶。
本文中所用的“允许”是指允许反应进行，这样如果存在双链体形成所需的所有组分(例如第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和靶核酸，或第二寡核苷酸的释放的活瓣、模板核酸和第三寡核苷酸)，即可形成本文定义的双链体或第二双链体。“允许”还指向包含模板和第三寡核苷酸的混合物加入任何所需的组分(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣)，并允许反应进行以形成本文定义的“第二双链体”。“允许”还指向包含模板、第三寡核苷酸和第四寡核苷酸的混合物加入任何所需的组分(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣)，并允许反应进行以形成本文定义的“第二双链体”。“允许”还指向第二寡核苷酸的释放的活瓣加入任何所需的组分(例如模板和第三寡核苷酸)，并允许反应进行以形成本文定义的双链体或第二双链体。
本文中所用的“检测靶核酸序列”或“测量靶核酸序列”系指测定样品中特定靶核酸序列的存在或测定样品中特定靶核酸序列的量以指示样品中靶核酸的存在。可测量或检测的靶核酸序列的量优选是约1个分子至1020个分子，更优选是约100个分子至1017个分子，最优选是约1000个分子至1014个分子。根据本发明的一个实施方式，所检测的核酸源自本文定义的标记下游寡核苷酸(例如图1的F2H)。根据本发明，一对相互作用的标记物的第一成员连接到下游寡核苷酸的5′活瓣，这对相互作用的标记物的第二成员连接到下游寡核苷酸的3′区域。
可通过将标记物连接到5′端、3′端或通过标记寡核苷酸的内部来标记本发明的寡核苷酸(例如第一、第二或第三寡核苷酸)。
在另一实施方式中，探针(下游寡核苷酸)以FRET对标记。当探针(例如下游寡核苷酸)没有被切割或被侵入切割反应切割时，这对相互作用的标记物的成员发生相互作用。非侵入切割反应对探针的切割产生可检测信号(例如荧光)。这对相互作用的标记物可沿探针任何位置放置，条件是这对相互作用的标记物发生相互作用，并在探针被非侵入切割反应切割时产生可检测信号，而在寡核苷酸被侵入切割反应切割时不产生可检测信号。
在一个实施方式中，第二寡核苷酸或第三寡核苷酸包含一对相互作用的标记物。在另一实施方式中，这对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到所述第二寡核苷酸或第三寡核苷酸的5′活瓣。在又一实施方式中，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第二寡核苷酸或第三寡核苷酸的+1位置。或者，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到第二寡核苷酸或第三寡核苷酸的+2、+3、+4或+5位置。这对相互作用的标记物可为荧光团和猝灭剂。
本文中所用的“第三寡核苷酸的切割所产生信号的检测”系指测定样品中切割的标记第三寡核苷酸的存在或测定切割的标记第三寡核苷酸的量。可使用本领域熟知方法和本文描述方法来检测或测量标记第三寡核苷酸的切割。可通过检测荧光变化来测定切割的标记第三寡核苷酸的存在或量。例如，在第三寡核苷酸切割和位于第三寡核苷酸上的这对相互作用的标记物分离时。本文描述的检测方法可用于检测切割的第三寡核苷酸，其中检测任何量的切割第三寡核苷酸，不管该量是反应中产生的少部分还是大部分的切割第三寡核苷酸。一种检测或测量第三寡核苷酸切割的方法适合于测量或检测位于切割的第三寡核苷酸上的标记部分。
本文中所用的“标记活瓣”系指源自本发明的标记切割结构的切割单核苷酸或小寡核苷酸或寡核苷酸，其中切割的寡核苷酸优选为约6-80个核苷酸，更优选为10-25个核苷酸，这些寡核苷酸被核酸酶从切割结构上切割下来，可被本领域熟知方法和本文描述方法检测。
在一个实施方式中，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸与靶核酸的非重叠区杂交，第二寡核苷酸的释放的活瓣和第三寡核苷酸与模板核酸的非重叠区杂交。
当上游寡核苷酸(例如引物)的一个或多个核苷酸与作为下游寡核苷酸(例如探针)的靶的相同区域互补时，本文中所用的切割结构可称为“重叠的”或“侵入性的”在该实施方式中，这两个寡核苷酸将竞争结合到靶的相同区域。
本文中所用的“非重叠”或“非侵入性”是指如果两个寡核苷酸与靶(或模板)核酸杂交时，这两个寡核苷酸将不会相互竞争与靶(或模板)核酸的杂交。因此，靶(或模板)核酸各自的两个杂交区域不包括相同的一个或多个核苷酸。
本文中所用的“缺口(gap)”是指位于上游寡核苷酸的3′末端互补核苷酸和下游寡核苷酸的最5′端的互补核苷酸之间并至少具有1个核苷酸的一部分靶或模板。
本文中所用的“切口(nick)”是指上游核苷酸和下游寡核苷酸直接毗邻时，位于上游寡核苷酸的3′末端互补核苷酸和下游寡核苷酸最5′端的互补核苷酸之间的一部分靶或模板。当上述寡核苷酸不重叠并且它们之间不存在缺口，例如它们之间有0个核苷酸(即直接毗邻)时，即存在切口。
表现出链置换活性和可用于本发明的核酸聚合酶包括但不限于具有“温度活化的”链置换活性的古细菌DNA聚合酶(Vent、Deep Vent、Pfu、JDF-3、KOD(LTI的商品名Pfx)、Pwo、9 degrees North、Thermococcusaggregans、Thermococcus gorgonarius的exo plus形式和exo minus形式)，具有链置换活性的真细菌DNA聚合酶(exo minus Bst、exo minus Bca、Genta、Klenow片段、exo minus Klenow片段、exo minus T7 DNA聚合酶(测序酶)。
在一个实施方式中，切割工具包含5′核酸酶活性，其中将活瓣从切割结构上切割下来依赖切割位点处双链体DNA的形成。
在另一实施方式中，单个酶包含聚合活性和切割工具。
在另一实施方式中，包含聚合活性和切割工具的单个酶选自于由大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶组成的组。
在又一实施方式中，第一种酶包含聚合活性，第二种酶包含切割工具。
在另一实施方式中，切割工具包括FEN-1核酸酶。
在另一实施方式中，所述方法在等温条件下进行。
本文中所用的“等温条件”系指支持并优选最适于本发明的切割工具活性和聚合工具活性的温度。
在又一实施方式中，所述方法在一系列反应条件下进行。
本文中所用的“一系列反应条件”系指最适于本发明的双链体形成和切割步骤的两次或更多次的温度温育。例如，一系列反应条件包括PCR反应条件和核酸反应条件。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术，这些技术均位于本领域的技术范围内。这些技术在文献中进行了充分的解释。参看例如Sambrook，Fritsch&Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Second Edition；Oligonucleotide Synthesis(MJ.Gait，ed.，1984)；NucleicAcid Hybridization(B.D.Harnes&SJ.Higgins，eds.，1984)；A Practical Guide to Molecular Cloning(B.Perbal，1984)以及丛书Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)；Short Protocols In Molecular Biology，(Ausubel et al.，ed.，1995)。本文上下文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用纳入本文。
可在等温条件下实施本发明所述方法，或可在热循环条件下例如在PCR、核酸扩增的条件下实施本发明所述方法。
本发明提供了一种产生指示样品中靶核酸序列存在的信号的方法，其包括以下步骤：以上游寡核苷酸和下游寡核苷酸温育靶核酸序列以形成标记的切割结构，以及以核酸酶切割该切割结构。本发明还提供了在依次切割反应中产生指示样品中靶核酸序列存在的方法，本发明所述方法可用于下文和实施例所描述的基于PCR的测定。
按照标题为“切割结构”的部分所描述的方法，形成标记的切割结构，其包含上游寡核苷酸(例如图1的A-1)、具有5′非互补活瓣的标记下游寡核苷酸(例如图1的FC)和靶核酸序列(例如图1的A′C′)。下游寡核苷酸以一对相互作用的部分进行标记，这对部分的定位使得只有非侵入切割结构是可检测的。
简而言之，在靶核酸序列、上游寡核苷酸(例如图1的A-1)、标记的下游探针(例如图1的FC)(图1中显示为非标记的)、特异针对靶核酸序列的扩增引物(图1的A-2和R，任选)、核酸聚合酶(任选)、FEN核酸酶和适宜缓冲液(例如1X Pfu缓冲液，Stratagene，或具有15mM Tris-HCL(pH8)、50mM KCL、5.5mM MgCl2、8％甘油、1％DMSO的探针缓冲液)的存在下经PCR反应形成切割结构，其中PCR反应采用下列热循环参数：95℃，2分钟；40个循环的95℃，15秒(变性步骤)和60℃，60秒(退火/延伸步骤)。可延伸正向引物和反向引物来扩增靶。上游寡核苷酸和标记的下游核苷酸退火到靶上，以形成切割结构。以本发明的FEN核酸酶切割形成的标记结构。在肘弯处或肘弯的上游处切割下游寡核苷酸，从而导致一对相互作用的标记物的分离。这将产生可检测的切割事件。如果切割结构是侵入性的(例如正向引物延伸进入下游寡核苷酸与靶互补的区域)，下游寡核苷酸则在+1位置的下游被切割。因此，将在两个标记物的下游切割被适宜间隔开以区分侵入切割反应和非侵入切割反应的一对相互作用的标记物(例如，FAM在5′活瓣上，而BHQ位于+1位置)，且没有信号产生。
图1显示了在PCR条件下采用依次切割反应的本发明一个实施方式。第一切割反应和第二切割反应均包括靶(模板)核酸、上游寡核苷酸(第一切割反应的第一寡核苷酸或第二切割反应的释放的活瓣)和下游寡核苷酸(第一切割反应的第二寡核苷酸或第二切割反应的第三寡核苷酸)。
在这个实施方式中，依次检测反应产生指示靶核酸存在的可检测信号。仅当第一切割反应和第二切割反应均是非侵入性时方产生可检测信号。如果切割反应是侵入性的，没有信号产生。当(1)上游寡核苷酸和下游寡核苷酸二者的互补部分毗邻时(它们之间没有非互补的靶/模板核苷酸)和(2)上游寡核苷酸具有与下游寡核苷酸互补部分重叠的3′区域时，切割结构是侵入性的。如果这两个要求有一个没有满足，反应则是非侵入性的。因此，如果上游寡核苷酸与下游寡核苷酸的互补部分重叠。
第一切割反应(图1A)包括靶核酸(A′C′)、第一寡核苷酸(A-1)、第二寡核苷酸(FC)、反向引物(R)、正向引物(A-2)、聚合酶和切割剂。第二切割反应(图1B)采用模板核酸(F′H′)、第一切割反应产生的释放的活瓣(F)、第三寡核苷酸(F2H)和切割剂。
靶核酸和模板核酸从3′到5′方向具有第一区域(A′或F′)和第二区域(C′或H′)。
第一寡核苷酸(A-1)与靶的第一区域(A′)至少部分互补，并具有与靶不互补的3′末端核苷酸。第二寡核苷酸(FC)具有与靶不互补的5′活瓣(F)和与靶第二区域(C)互补的3′区域。但是，5′活瓣(F)与模板核酸(F′)的第一区域互补，并在活瓣的3′端包含一个与模板核酸不互补的核苷酸。3′端的非互补核酸作为封闭剂，抑制聚合酶对寡核苷酸的延伸。
第三寡核苷酸(F2H)具有与模板不互补的5′活瓣(F2)和与模板第二区域(H′)互补的3′区域。铰链区或肘弯区是第三寡核苷酸的互补区和非互补区的接合处。第三寡核苷酸可操纵地连接到一对相互作用的标记物。当第三寡核苷酸发生切割(例如在第三寡核苷酸的肘弯处切割)使它们分开时，这对标记物产生信号；但当第三寡核苷酸在这对标记物的下游切割时，这对标记物不产生信号。在一些实施方式中，可检测信号是FAM和BHQ。在一个实施方式中，FAM可操纵地连接到第三寡核苷酸的5′活瓣，BHQ则可操纵地连接到第三寡核苷酸互补部分的第一个核苷酸上(+1)。
第一反应包括两组上游寡核苷酸、第一寡核苷酸和引物的混合物。在该实施方式中，引物和第一寡核苷酸均与靶的相同的通用区域互补，因此一方的退火排除了另一方的退火。当引物用于扩增靶时，第一寡核苷酸形成非侵入切割结构。如果引物形成侵入切割结构，第二寡核苷酸在肘弯的下游发生切割，以防止在第二切割反应中产生任何可检测信号。
在使用第一寡核苷酸的反应中，单个非互补模板核酸将上游寡核苷酸的互补部分与下游寡核苷酸的互补部分分开。3′非互补核苷酸抑制第一寡核苷酸的延伸，并指导FEN在肘弯处切割第二寡核苷酸。这种切割生成了与模板核酸第一区域互补且包含与模板不互补的3′核苷酸的释放的活瓣。
反向引物退火到靶的互补链上，并被聚合酶延伸。
第一切割反应期间第二寡核苷酸的切割产生了第二切割反应必需的释放的活瓣。释放的活瓣退火到模板的第一区域上，第三寡核苷酸则退火到模板的第二区域上。
释放的活瓣退火到靶上，使得释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到模板上时，一个或两个非互补的模板核苷酸将释放的活瓣与第三寡核苷酸的互补部分分开。释放的活瓣具有抑制聚合酶对它的延伸且促进第二非侵入切割结构形成的3′非互补核苷酸。FEN在肘弯处切割第三寡核苷酸，分离荧光剂和猝灭剂，产生可检测信号。
在一个依次切割反应中，第一寡核苷酸优选具有单个3′末端非互补核苷酸。在其他实施方式中，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火结合到靶上时，第一寡核苷酸的互补部分与第二寡核苷酸的互补部分被1个非互补的靶核酸分离。释放的活瓣优选也具有单个3′末端非互补的核苷酸。而且，释放的活瓣和第三寡核苷酸的互补部分优选被2个非互补的模板核酸分离。
本发明所述方法还可用于不基于PCR的应用场合，以检测靶核酸序列。在一些实施方式中，它们可被固定在固相载体上。本领域知晓将核酸固定在在固相载体上的方法，Ausubel FM等人。Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Inc和生产商例如膜生产商Pall Corporation，Schleicher&Schuell、磁珠生产商Dynal、培养板生产商Costar，Nalgenunc和可用于本发明的其他载体的生产商CPG，Inc提供的方案描述了这些方法。可用于本发明的固相载体包括但不限于基于二氧化硅的基质、基于膜的基质和含表面的珠，包括但不限于基于苯乙烯、胶乳或二氧化硅的材料和其他聚合物。磁珠也可以用于本发明。可从上述生产商和其他已知生产商得到固相载体。
本发明还提供了一种检测溶液中靶核酸序列的不基于PCR的测定。本发明所述方法可用于检测溶液中的天然靶核酸序列，包括但不限于从细胞、组织、单细胞生物、细菌或病毒分离的RNA和DNA。本发明所述方法还可用于检测溶液中的合成靶，包括但不限于RNA或DNA寡核苷酸和肽核酸(PNA)。非PCR测定包括但不限于包括等温扩增的测定，其中由3′-5′合成活性合成的核酸的量呈线性增长或指数增长，FEN核酸酶用于切割下游探针。
I.核酸
A.可用于本发明的核酸序列
本发明提供了使用寡核苷酸、引物和探针来检测或测量靶核酸序列的方法。本文中所用的术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”系指待检测的引物、探针(上游寡核苷酸和下游寡核苷酸)和寡聚体片段，而且作为总称泛指多脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其他类型的多核苷酸，后者是嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷或修饰的嘌呤或嘧啶碱基(包括无碱基位点)或类似物例如蛋白质核酸(PNA)。没有打算区分术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”的长度，这些术语可互换使用。这些术语仅指分子的初级结构。因此，这些术语包括双链和单链DNA以及单链和双链RNA。
本文中所用的核酸序列互补体系指与核酸序列“反平行结合”的寡核苷酸，当核酸序列互补体与核酸序列比对时，使得其中一条序列的5’端与另一条序列的3’端配对。
寡核苷酸不一定物理上源自任何现有或天然序列，而是可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、反转录或它们的组合。术语“寡核苷酸”或“核酸”意指基因组DNA或RNA、cDNA、半合成或合成来源的多核苷酸，其中因其合成来源或操纵，该多核苷酸：(1)不与其天然结合的多核苷酸的全部或一部分结合；和/或(2)连接到不同于与其天然连接的多核苷酸的多核苷酸上。
因为单核苷酸反应制备寡核苷酸的方式可使一个单核苷酸的戊糖环的5′磷酸连接到磷酸二酯键方向上的邻近戊糖环的3′氧，如果其5′磷酸没有连接到单核苷酸戊糖环的3′氧，寡核苷酸的“端”或“末端”指“5′端”；如果其3′氧没有连接到随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸，则寡核苷酸的“端”或“末端”指″3′端″。正如本文使用，位于更大的寡核苷酸内部的核酸序列可称为5′区域或3′区域，这取决于它离该分子的5′末端还是3′末端更近。
当两个不同的非重叠寡核苷酸退火到相同的线性互补核酸序列的不同区域上，并且一个寡核苷酸的3′端朝向另一个的5′端，前者可称为“上游”寡核苷酸，而后者可称为“下游”寡核苷酸。
本发明所述核酸可包含天然核酸中不常见的某些碱基，包括例如肌苷和7-脱氮鸟嘌呤。无需完全互补；稳定的双链体可含有错配碱基对或不配对碱基。通过考虑许多变量，包括例如寡核苷酸的长度、碱基组成、寡核苷酸的序列、离子强度和错配碱基对的发生率，核酸技术领域的技术人员可凭经验确定双链体的稳定性。
核酸双链体的稳定性由解链温度即“Tm”来衡量。特定核酸双链体在特定条件下的Tm是指一半的碱基对发生解离时的温度。
B.可用于本发明的寡核苷酸
本发明提供了可用于检测或测量靶核酸，可用于扩增靶核酸序列和可用于形成本发明的切割结构的寡核苷酸引物、寡核苷酸探针(上游寡核苷酸和下游寡核苷酸)和模板核酸。
本文中所用的“扩增”系指通过等温方法或通过需要热循环的方法如聚合酶链反应的方法，产生附加拷贝的核酸序列。
1.引物
本发明提供了可通过聚合得以延伸的正向引物和反向引物。
术语“引物”可指一个以上的引物，指的是寡核苷酸，不论是纯化的限制酶切消化中的天然产生的寡核苷酸还是合成的寡核苷酸，其中当寡核苷酸置于催化合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下时，它可作为沿互补链合成的起始点。适合于合成引物延伸产物的条件包括在适宜的温度下四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和聚合诱导剂例如DNA聚合酶或反转录酶在适宜缓冲液(“缓冲液”包括作为辅因子或影响pH、离子强度等的取代物)中的存在。引物优选是单链的，以实现扩增的最大效率。
可用于本发明的寡核苷酸引物是可与模板核酸序列杂交并引发第二核酸链的酶促合成的单链DNA或RNA分子。引物与核酸分子库中的靶分子的一部分互补。预见到，通过化学合成方法或酶促合成方法制备本发明的寡核苷酸。或者，这类分子或其片段是天然的，可从其天然来源分离或从供货商购买。
还可通过解链温度估算方法，设计可用于本发明的引物，使其具有特定的解链温度(Tm)。商业程序如OligoTM、Primer Design和互联网上提供的程序如Primer3和Oligo Calculator可用于计算可用于本发明的核酸序列的Tm。优选情况下，按照例如Oligo Calculator计算，可用于本发明的扩增引物的Tm优选为约15℃到80℃，更优选为约50℃到60℃。寡核苷酸引物设计时可将这些因素考虑在内，并按照下列方法进行合成。
a.寡核苷酸引物设计策略
本发明的特定寡核苷酸的设计包括选择可识别靶序列但具有最小预测二级结构的序列。此外，分析该寡核苷酸的长度和GC含量，优化该寡核苷酸的Tm。而且，设计可用于基因组DNA扩增的PCR引物时，选择的引物序列没有表现出与GenBank数据库(或其他可用数据库)中的序列明显的匹配性。
使用容易获取的计算机程序可简化引物的设计，其中这些计算机程序开发用于辅助评估上述的几个参数和优化引物序列。这类程序的实例是DNAStarTM软件包(DNAStar，Inc.；Madison，WI)中的“PrimerSelect”、OLIGO4.0(National Biosciences，Inc.)、PRIMER、Oligonucleotide Selection Program、PGEN和AMPLIFY(Ausubel等人，1995，Short Protocols in Molecular Biology，3rd Edition，John Wiley&Sons描述)。在一个实施方式中，引物经设计具有可作为其他引物的靶的序列，以产生两端具有已知序列的PCR产物，其中已知序列可作为进一步扩增的靶(例如测定PCR产物的序列)。如果以具有共同“尾随序列”的特异引物来扩增许多不同的核酸序列，来自这些不同基因的PCR产物可随后用单组引物进行测序。或者，为了便于扩增序列的随后克隆，引物经设计具有连接到其5′端的限制性内切酶位点。因此，引物的所有核苷酸均源自靶核酸序列或邻近靶核酸序列的序列，除了形成限制性内切酶位点所需的少数核苷酸以外。这类酶和位点为本领域所熟知。如果靶核酸序列的基因组序列和靶核酸序列的开放阅读框序列是已知的，特定引物的设计完全位于本领域的技术范围内。
b.合成
使用本领域同样熟知的技术合成引物。制备具有特定序列的寡核苷酸的方法为本领域知晓，包括例如适宜序列的克隆和限制酶切消化分析以及直接化学合成。设计完成后，可通过适宜的化学合成方法例如Narang等人，1979，Methods in Enzymology，68：90描述的磷酸三酯方法、Brown等人，1979，Methods in Enzymology，68：109公开的磷酸二酯方法、Beaucage等人，1981，Tetrahedron Letters，22：1859公开的二乙基氨基磷酸酯方法和美国专利4,458,066公开的固相载体方法或通过其他的化学方法，采用商用自动化寡核苷酸合成仪(可商购获得)或VLSIPSTM技术制备寡核苷酸。
C.探针
本发明提供了可用于形成本文定义的切割结构或标记的切割结构的寡核苷酸探针。名为“切割结构”的段落提供了制备本发明的标记的切割结构的方法。本发明提供了第一、第二和第三寡核苷酸(本文全部进行了定义)，它们是本发明的一种或多种第一双链体或第二双链体的组分，或者是本发明的第一切割结构或第二切割结构的组分。本文中所用的“探针”系指本发明的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸或第三寡核苷酸中的任一种。
本发明的“第一寡核苷酸”的长度优选是10-120个核苷酸，更优选是15-40个核苷酸，最优选是20-30个核苷酸。“第一寡核苷酸”与靶核酸的第一区域至少部分互补。在一个实施方式中，第一寡核苷酸具有与靶不互补的单个3′末端核苷酸。在另一实施方式中，第一寡核苷酸具有与靶不互补的两个或多个3′末端核苷酸。
本发明的“第二寡核苷酸”的长度优选是20-120个核苷酸，更优选是25-45个核苷酸，最优选是25-35个核苷酸。“第二寡核苷酸”包含3′区域和5′区域。“第二寡核苷酸”的3′区域与靶核酸至少部分互补。“第二寡核苷酸”的5′区域的长度优选是8至80个核苷酸，最优选是10至20个核苷酸。在本发明的一个实施方式中，“第二寡核苷酸”的5′区域与模板核酸的区域至少部分互补。在本发明的另一实施方式中，本发明的第二寡核苷酸的5′区域不与靶核酸互补。
本发明的“第三寡核苷酸”的长度优选是20-120个核苷酸，更优选是25-45个核苷酸，最优选是25-35个核苷酸。“第三寡核苷酸”包含3′区域和5′区域。本发明的第三寡核苷酸包含与模板核酸的区域至少部分互补的3′区域，该3′区域优选具有8至80个核苷酸，最优选具有10-20个核苷酸。“第三寡核苷酸”的5′区域的长度优选是8至80个核苷酸，最优选是10至20个核苷酸。在本发明的一个实施方式中，本发明的“第三寡核苷酸”的5′区域不与模板核酸互补。
一般而言，探针的3′末端会被“封闭”，以防止探针被掺入到引物延伸产物中去。
1.标记物
可标记本发明的探针(例如通过连接放射性标记物、荧光标记物、猝灭剂或名为“切割结构”的段落所列举的任何标记物)。依据本领域熟知方法和本文描述方法(参看Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)制备标记的寡核苷酸。
2.包含二级结构的探针
本发明的一个实施方式的“探针”可以是包含与靶核酸序列或模板核酸序列互补的单个区域或多个区域的单链核酸(例如靶核酸结合序列或模板核酸结合序列)。本发明的该实施方式的“探针”具有当探针结合到靶核酸序列或模板核酸序列时即发生改变的二级结构，还可包含结合部分。本发明的该实施方式的“探针”结合到靶核酸序列或模板核酸序列，形成可被切割工具切割的切割结构，其中在切割温度下实施切割，其中当探针未结合到靶核酸序列或模板核酸序列时，探针的二级结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。结合到靶核酸或模板核酸之前，本发明的探针不能被本文定义的“切割工具”切割以产生信号。在本发明的一个实施方式中，探针可包含不能与靶核酸序列或模板核酸序列结合或互补的区域。在本发明的另一实施方式中，探针结合到靶核酸或模板核酸时没有二级结构。
本文中所用的“二级结构”系指三维构象，例如发夹、茎环结构(例如图5)、内环、凸环、分支结构或假结；多个茎环结构、三叶草型结构或任何三维结构。本文中所用的“二级结构”包括三级、四级等结构。包含这种三维结构的探针结合到靶核酸序列或模板核酸序列，形成可被切割工具在切割温度下切割的切割结构。探针没有结合到靶核酸序列或模板核酸序列时的三维结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。本文中所用的“二级结构”是指包含第一单链碱基序列(在本文中称为“互补核酸序列”)的序列与其后的第二互补序列(或在同一分子中，或在包含探针的第二分子中)发生自身折叠，生成反平行的双链体结构，其中单链序列和互补序列(即互补核酸序列)经形成氢键发生退火。本发明使用的寡核苷酸探针包括含二级结构的寡核苷酸，包括但不限于匙型探针(图5)。
本文中所用的第一“互补”核酸序列和第二“互补”核酸序列互相互补，可通过互补碱基之间形成的氢键发生退火。
本发明的该实施方式的“探针”可以是单分子。本文中所用的“单分子”探针包含结合到靶核酸序列或模板核酸序列上形成可被切割工具切割的切割结构的单个分子，其中在切割温度下实施切割，其中“单分子”探针未结合到靶核酸序列或模板核酸序列时，其二级结构优选在切割温度下或在低于切割温度的温度下是稳定的。可用于本发明的单分子探针包括但不限于匙型探针。
本文中所用的“分子”系指多核苷酸。
本发明的该实施方式的“探针”或“分子”的长度是5-10,000个核苷酸，理想情况是17-40个核苷酸，但也可使用包含不同长度的探针的探针或分子。
本发明的该实施方式的“探针”具有约5至约10,000个核苷酸和优选具有10至140个核苷酸的靶核酸或模板核酸结合序列。在本发明的一个实施方式中，本发明的“探针”包含至少第一和第二互补核酸序列或区域，它们的长度是3-250个核苷酸，优选是4-50个核苷酸，最优选是17-40个核苷酸。第一互补核酸序列和第二互补核酸序列可具有相同或不同长度。本发明提供了一种探针，其中第一互补核酸序列或第二互补核酸序列与靶核酸或模板核酸互补。在另一实施方式中，第一互补核酸序列和/或第二互补核酸序列位于靶核酸或模板核酸结合位点的上游(5′)。或者，第一互补核酸序列和/或第二互补核酸序列可位于靶核酸或模板核酸结合位点的下游(3′)。参照靶核酸或模板核酸结合序列来选择实际的长度，这样当探针在实施切割结构切割的温度下没有结合到靶核酸或模板核酸时，探针的二级结构是稳定的，其中该切割结构包含结合到靶核酸或模板核酸的探针。随着靶核酸或模板核酸结合序列的大小增加到500个核苷酸，互补核酸序列的长度可增加到15-125个核苷酸。对于长于100个核苷酸的靶核酸或模板核酸结合序列，互补核酸序列的长度不会进一步增加。如果探针还是等位基因区分探针，正如下文讨论，互补核酸序列的长度受到更多限制。
本文中所用的“靶核酸结合序列”系指特异结合靶核酸的探针区域。
本文中所用的“模板核酸结合序列”系指特异结合模板核酸的探针区域。
本发明的探针可形成本文定义的单个二级结构(包括茎环、发夹、内环、凸环、分支结构和假结)或多个二级结构或本文定义的任何三维结构。
例如，根据本发明的一个实施方式，探针可以是具有二级结构例如发夹或茎环的寡核苷酸，探针包括但不限于分子信标、别针(safety pin)、scorpion、sunrise/amplifluor探针和匙型探针。
分子信标探针包含发夹或茎环结构，所述结构具有一对相互作用的产生信号的标记部分(例如荧光团和猝灭剂)，当信标探针没有与靶核酸序列杂交时，这对标记部分的定位可有效猝灭可检测信号的生成。环包含与靶核酸互补的区域。环的两侧是5′区域和3′区域(“臂”)，当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，5′区域和3′区域将通过互补核酸序列发生可逆相互作用。或者，环的两侧是5′区域和3′区域(“臂”)，当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，5′区域和3′区域将通过所连接的亲和对成员发生可逆相互作用，形成二级结构。本文中所用的“臂”系指分子信标探针的区域，a)当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，这些区域通过互补核酸序列发生可逆相互作用或b)当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，探针区域将通过所连接的亲和对成员发生可逆相互作用，形成二级结构。当分子信标探针没有与靶杂交时，这些臂相互杂交，形成茎杂交体，后者有时称为“茎双链体”。这种结构是闭合构象。当分子信标探针与其靶杂交时，探针的“臂”被分离。这种结构是开放构象。在开放构象中，臂也可与靶杂交。这类探针可在溶液中游离，或者它们可被固定到固相表面上。当臂发生杂交时(例如形成茎)，猝灭剂离荧光团很近，可有效猝灭或抑制其荧光，使得探针不发光。美国专利5,925,517和美国专利6,037,130描述了这类探针。
正如本文使用，分子信标探针也可以是本文描述的“等位基因区分”探针。
可用于本发明的另一寡核苷酸探针是匙型探针。2006年2月9日递交的美国申请11/351,129描述了匙型探针，该申请通过引用整体纳入本文。结合靶的寡核苷酸任选通过接头寡核苷酸序列连接到其互补序列，形成包含茎和任选的环部分(参看图5)的发夹结构，可形成匙型探针。环部分含有任选的接头序列，或仅有1个连接第一序列和第二序列两端的共价键。形成环结构的接头序列可与靶序列杂交或不杂交。茎部分在第一序列和第二序列之间任选含有一个或多个错配；错配的数目可用于调节探针的解链温度。茎部分还可含有修饰核苷酸，例如小沟结合物(minor groove binders)或LNA，这些修饰核苷酸可改变探针对靶序列的亲和力，还可用于调节解链温度。匙型探针还可含有一对相互作用的标记物，例如一对荧光团/猝灭剂，这对标记物连接到探针末端或靠近末端处，这样当探针与靶序列杂交时产生可检测信号，例如荧光团发射的荧光增加。
对于可用于本发明的匙型探针，根据使用探针的测定条件，设计与靶互补的探针序列的长度、发生可逆相互作用的探针区域(例如茎杂交体)的长度和二者的关系，其中当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，探针区域通过互补核酸序列发生可逆相互作用。可根据本领域知晓的方法估算用于特定测定条件的靶互补序列的长度和茎杂交体序列的长度。当与核酸靶序列互补的探针区域没有结合到靶核酸上时，通过互补核酸序列发生可逆相互作用的每个探针区域具有6至100个核苷酸，优选具有8至50个核苷酸，最优选具有8至25个核苷酸。与靶互补的探针序列的长度优选是17-40个核苷酸，更优选是17-30个核苷酸，最优选是17-25个核苷酸。以常规实验测定通过互补核酸序列发生可逆相互作用的探针区域之间相互作用的稳定性，以实现适宜的功能。除了长度，还可通过改变G-C含量和插入破坏稳定的错配，调节通过互补核酸序列而彼此发生可逆相互作用的探针区域之间(通过互补核酸序列而彼此发生可逆相互作用的探针区域之间)相互作用的稳定性。可设计其中一个通过互补核酸序列发生可逆相互作用的探针区域，使其与靶部分或完全互补。
本发明的探针上可使用范围广泛的荧光团。可用探针包括香豆素、荧光素、四氯荧光素、六氯荧光素、荧光黄、罗丹明、BODIPY、四甲基罗丹明、Cy3、Cy5、Cy7、伊红、德克萨斯红和ROX。组合荧光团例如描述的荧光素-罗丹明二聚体也是适宜的。可选择荧光团使其在可见光谱内或可见光谱外例如紫外线或红外线范围内吸收和发射。
本领域描述的适宜猝灭剂特别包括DABCYL及其变体，例如DABSYL、DABMI和甲基红。荧光团还可用作猝灭剂，因为它们与其他某些荧光团接触时往往会猝灭荧光。优选的猝灭剂或是发色团例如DABCYL或孔雀绿，或是在探针处于开放构象时的检测范围内不发射荧光的荧光团。
在一个实施方式中，下游探针包含一对相互作用的标记物。在另一实施方式中，这对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到所述下游寡核苷酸的5′活瓣。在又一实施方式中，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到下游寡核苷酸的+1位置。在又一实施方式中，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到所述下游寡核苷酸的+2位置。在又一实施方式中，这对相互作用的标记物包含荧光团和猝灭剂。
一般而言，探针的3′末端会被“封闭”，以防止如果在反应中使用活性聚合酶时将探针掺入到引物延伸产物中去。可使用非互补碱基或向最后一个核苷酸的3′羟基加入化学部分例如生物素或磷酸基来实现“封闭”，根据所选择的部分，化学部分可发挥双重作用，另外作为标记物用于随后检测或俘获连接到标记物上的核酸。还可通过除去3′-OH或通过使用缺乏3′-OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸来实现封闭。
术语探针包括等位基因区分探针。本文中所用的“等位基因区分”探针优选与完全互补的靶核酸序列杂交，并区分至少有1个核苷酸差异的序列。与靶核酸序列相比至少有1个核苷酸差异的核酸序列(下称“靶样核酸序列”)因此不是本发明的等位基因区分探针的靶核酸序列。
等位基因区分探针不能与靶样核酸序列在依据本领域熟知的方法由实验优化而确定的特定温度下或温度范围内充分杂交，因此在仅有靶样核酸序列存在和在支持等位基因区分探针与靶核酸序列杂交的条件下等位基因区分探针结合到靶样核酸序列上时，其二级结构不会发生变化，其中与靶核酸序列相比，靶样核酸序列含有一个或多个核苷酸错配。
在一个实施方式中，本发明的“等位基因区分探针”系指与靶样核酸序列杂交的探针，其中靶样核酸序列与靶核酸序列存在至少1个核苷酸的差异，其中变异核苷酸不位于等位基因区分位点。根据本发明的该实施方式，“等位基因区分探针”不能在依据本领域熟知方法由实验优化而确定的特定温度下或温度范围内结合到在等位基因区分位点还至少具有1个核苷酸差异的靶样核酸序列。单个核苷酸差异只影响结合到靶核酸序列或靶样核酸序列的探针比例。例如，本发明提供了一种完全匹配的探针，其中在过量探针的存在下，多达100％的靶或模板位于探针-靶复合物或探针-模板复合物中(例如与探针结合)。本发明还提供了包含至少1个单碱基错配的探针，其中至少1-5％、优选5-10％的靶样序列或模板样序列在用于形成包含靶序列或模板序列和完全匹配的探针的复合物的相同条件下结合到探针上。
本文中所用的“等位基因区分位点”系指不同于包含靶核酸序列的所有可能的等位基因相应区域的靶核酸序列的区域。
可用于本发明的等位基因区分探针还包括相比于靶序列，以更低效率结合到靶样序列上的探针。在靶样序列或靶序列存在下，在低于(至少5℃，优选10℃或更多)探针二级结构Tm的温度下，实施FRET测定，测量探针结合到靶序列或靶样序列的效率。靶序列存在或不存在时荧光水平的变化与靶样序列存在或不存在时荧光水平的变化的比较，提供了探针结合到靶序列或靶样序列的效率的有效衡量标准。
在本发明的一种方法中，与靶核酸序列杂交相比，探针与靶样序列杂交时，与靶序列相比以更低效率结合到靶样序列的探针其二级结构将发生更小的变化(例如优选是25-50％，更优选是50-75％，最优选是75-90％的结合到靶核酸序列时的荧光变化值)，例如由本文描述的FRET测定所测量的荧光来确定。在本发明的一个方法中，与靶序列相比，以更低效率结合到靶样序列的探针将产生指示样品中靶样核酸序列存在的信号。但是，信号的强度会发生变化(例如优选地比探针结合到靶核酸序列时的荧光变化小或大25-50％、更优选地小或大50-75％、最优选地小或大75-90％)，而在靶序列存在下产生的信号强度，正如上文描述的，变化更小。
“指示靶核酸序列或靶样核酸序列存在的信号”系指相当于靶核酸序列或靶样核酸序列的1个分子到1020个分子、更优选约100个分子到1017个分子和最优选约1000个分子到1014个分子所产生信号的信号。
D.靶核酸
本发明提供了“靶核酸”，该多核苷酸从3′到5′方向包含与第一寡核苷酸至少部分互补的第一区域、延伸区域和与第二寡核苷酸至少部分互补的第二区域。所述靶核酸可包含单链或双链的DNA或RNA。
本发明还提供了“靶核酸”，该多核苷酸从3′到5′方向包含与第一寡核苷酸至少部分互补的第一区域和与第二寡核苷酸至少部分互补的第二区域。
本发明的靶核酸包含“第一区域”，其是足以允许本文定义的第一寡核苷酸杂交的一段长度的核苷酸，其中“第一区域”与第一寡核苷酸至少部分互补。“第一区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最优选范围是10-25个核苷酸。
在一些实施方式中，本发明的靶核酸还包含“延伸区域”，其是足以允许寡核苷酸(例如第一寡核苷酸)通过核酸聚合活性得以延伸的一段长度的核苷酸。“延伸区域”的长度范围是约1个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约3-100个核苷酸，最优选范围是3-30个核苷酸。
靶核酸的第二区域是与探针(例如本文定义的第二寡核苷酸)至少部分互补的一段长度的核苷酸。“第二区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最佳范围是10-25个核苷酸。
E.模板核酸
本发明还提供了“模板核酸”，该多核苷酸从3′到5′方向包含与本文定义的第二寡核苷酸的释放的活瓣至少部分互补的第一区域、延伸区域和与探针(例如本文定义的第三寡核苷酸)至少部分互补的第二区域。
本发明还提供了“模板核酸”，该多核苷酸从3′到5′方向包含与第二寡核苷酸的释放的活瓣至少部分互补的第一区域和与探针(例如本文定义的第三寡核苷酸)至少部分互补的第二区域。所述模板核酸可包含单链或双链的DNA或RNA。
本发明的模板核酸包含“第一区域”，其是足以允许本文定义的第二寡核苷酸的释放的活瓣杂交的一段长度的核苷酸，其中“第一区域”与第二寡核苷酸的释放的活瓣至少部分互补。“第一区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最优选范围是10-25个核苷酸。
在一些实施方式中，本发明的模板核酸还包含“延伸区域”，其是足以允许寡核苷酸(例如本文定义的第二寡核苷酸的释放的活瓣)通过核酸聚合活性得以延伸的一段长度的核苷酸。“延伸区域”的长度范围是约1个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约3-100个核苷酸，最优选范围是3-30个核苷酸。
模板核酸的第二区域是与探针(例如本文定义的第三寡核苷酸)至少部分互补的一段长度的核苷酸。“第二区域”的长度范围是约6个核苷酸至约1000个核苷酸，优选范围是约8-30个核苷酸，最优选范围是10-25个核苷酸。
F.杂交
本发明的引物和探针(例如第一、第二和第三寡核苷酸或正向引物和反向引物)可被标记，并可用于制备标记的切割结构。下列组合的寡核苷酸可退火到靶核酸序列内部的序列上：第二寡核苷酸和第一寡核苷酸或正向引物和第二寡核苷酸。下列组合的寡核苷酸可退火到模板核酸序列内部的序列上：第三寡核苷酸和第二寡核苷酸的释放的活瓣。
在一个实施方式中，杂交的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸形成切割结构，该切割结构被本发明的切割剂切割，释放第二寡核苷酸的活瓣。在另一实施方式中，杂交的第二寡核苷酸的释放的活瓣和第三寡核苷酸形成切割结构，该切割结构被本发明的切割工具切割，释放第三寡核苷酸的活瓣。第一切割反应和第二切割反应可为非侵入性的。在非侵入切割反应中，切割发生在第三寡核苷酸的肘弯处或肘弯下游。一对相互作用的标记物被连接到第三寡核苷酸上，使得非侵入切割(在肘弯处或肘弯下游切割)将两个标记物分开，产生可检测信号。
在一个实施方式中，杂交的正向引物通过聚合得以延伸，形成切割结构，该切割结构被本发明的切割剂切割，释放第二寡核苷酸的活瓣。在另一实施方式中，杂交的第二寡核苷酸的释放的活瓣和第三寡核苷酸形成切割结构，该切割结构被本发明的切割工具切割，释放第三寡核苷酸的活瓣。如果第一切割反应或第二切割反应是侵入性的，切割将发生在第三寡核苷酸肘弯的下游。肘弯下游的切割导致第三寡核苷酸活瓣的释放，其中第三寡核苷酸含有一对相互作用的标记物的两个成员。因此没有产生可检测的信号。
典型地，当两个核酸序列基本互补时(在一段至少具有14至25个核苷酸的长度上至少约65％互补，优选至少约75％互补，更优选至少约90％互补)，发生选择性杂交。参看Kanehisa，M.，1984，Nucleic Acids Res.12：203，其通过引用纳入本文。因此，预计可容忍本文定义的寡核苷酸结合位点处的一定程度的错配。这类错配可很小，例如单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸。或者，错配区域可包括环，其被定义为存在不间断的连续4个或更多核苷酸错配的区域。
许多因素影响寡核苷酸与第二核酸分子杂交的效率和选择性。这些因素包括寡核苷酸长度、核苷酸序列和/或组成、杂交温度、缓冲液组成和需要寡核苷酸与其杂交的区域的可能位阻，设计本发明的寡核苷酸时将考虑到这些因素。
寡核苷酸长度与寡核苷酸退火结合靶序列的效率和精确性存在正相关。具体而言，更长的序列比更短序列具有更高的解链温度(Tm)，更不可能在给定的靶序列内重复，从而尽量避免了混乱杂交(promiscuoushybridization)。具有高G-C含量或包含回文序列的寡核苷酸序列往往发生自身杂交，其靶向位点也是如此，因为溶液一般支持单分子杂交动力学，而不支持双分子杂交动力学。但是，设计含有充足数目的G-C核苷酸配对的寡核苷酸同样是重要的，因为每个G-C配对由三个氢键连接，而不是A、T碱基配对结合到靶序列时的两个氢键，因此形成更紧密更强的键。杂交温度与寡核苷酸退火效率呈反比，引发反应或杂交混合物中可能包含的有机溶剂例如甲酰胺的浓度同样与与寡核苷酸退火效率呈反比，而增加盐浓度则促进键合。在严格的退火条件下，更长的杂交探针或合成引物比更短的杂交探针或合成引物的杂交效率更高，而后者足以用于更宽容的条件下。本文中所用的“标准严格条件”是指仅当序列之间具有至少95％、优选至少97％的相同性时才发生杂交。42℃过夜温育后，序列在严格的条件下杂交，随后进行严格的洗涤(0.2X SSC，65℃)。某些实施方式可能需要更高的杂交温度来实现特异杂交，例如其中使用等位基因区分探针来区分具有至少1个核苷酸差异的不同序列。由于几种因素影响杂交的严格性，不同参数的组合比单个因素的绝对尺度更加重要。
G.核酸的生成
本发明提供了用于扩增靶核酸序列和用于形成切割结构的待检测或测量的核酸。
本发明使用的核酸包含RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物。本发明同时包括核酸的有义链和反义链。根据本发明，所述核酸可用化学方式或生物化学方式修饰，或可含有非天然的或衍生的核苷酸碱基。这类修饰包括例如标记、甲基化、以类似物置换一个或多个天然核苷酸、核苷酸之间的修饰例如不带电的键(甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯等)、悬置部分(pendent moieties)(例如多肽)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂、烷化剂和修饰键(例如α-异头核酸(alpha anomeric nucleic acids)等)。模拟多核苷酸经氢键和其他化学相互作用结合到指定序列的能力的合成分子也包括在内。这类分子为本领域知晓，包括例如分子骨架中的磷酸酯键被替换为肽键的分子。
1.包含DNA的核酸
a.克隆
可通过本领域技术人员熟知的克隆方法从cDNA文库或基因组文库中分离出包含DNA的核酸。简而言之，包含特定核酸序列的DNA克隆的分离包括筛选重组DNA或cDNA文库和鉴定含有所需序列的克隆。克隆包括下列步骤。特定文库的克隆被涂抹到平板上，转移到适宜的底物上进行筛选，变性，探针检查特定核酸的存在。下文含有对杂交条件和产生标记探针的方法的描述。
优选通过与核酸探针的杂交或通过可被抗体检测到的蛋白表达来鉴定所需克隆。或者，按照下文描述方法，通过由一组特定引物所限定的序列的聚合酶链扩增，鉴定所需克隆。
适宜文库的选择包括鉴定所需序列丰富来源的组织或细胞系。而且，如果目的核酸含有调控序列或内含子序列，则筛选基因组文库(Ausubel等人，同上)。
b.基因组DNA
本发明的核酸序列可从基因组DNA扩增。按照下列方法从组织或细胞分离基因组DNA。
为了便于检测来自特定组织的基因变异形式，分离不含周围正常组织的该组织。为了从哺乳动物组织分离出基因组DNA，切碎组织，液氮冷冻。冷冻组织以预冷的研钵和研杵研磨至细粉末，随后按每100mg组织加入1.2ml消化缓冲液，悬浮于消化缓冲液中(100mM NaCl，10mM Tris-HCl，pH 8.0，25mM EDTA，pH 8.0，0.5％(体积/体积)SDS，0.1mg/ml蛋白酶K)为了从哺乳动物的组织培养细胞中分离基因组DNA，500xg，5分钟离心沉淀细胞，细胞重悬浮在1-10ml的冷PBS中，500xg，5分钟重新离心沉淀细胞，随后细胞重悬浮于1体积的消化缓冲液中。
消化缓冲液中的样品在50℃下温育(振荡)12-18小时，随后加入等体积的苯酚/氯仿/异丙醇进行提取。如果离心步骤(1700xg，10分钟)后，各相没有分离，则又加入1体积的消化缓冲液(无蛋白酶K)，重复离心步骤。如果两相的界面出现明显的白色浓稠物质，重复有机提取步骤。提取上层后，水层转移至新管，加入1/2体积的7.5M乙酸铵和2体积的100％乙醇。1700x g离心2分钟，沉淀核酸，70％乙醇洗涤，通风干燥，最后以1mg/ml重悬浮于TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，pH 8.0)。样品在37℃下和0.1％SDS和1μg/ml无DNA酶的RNA酶的存在下温育1小时，重复提取和乙醇沉淀步骤，除去残留RNA。根据该方法，基因组DNA的产率预计约为2mg DNA/1g细胞或组织(Ausubel等人，同上)。依据该方法分离的基因组DNA可用于本发明的PCR分析。
c.(cDNA或基因组DNA的)限制酶切消化
鉴定含有特定靶核酸序列的所需cDNA或基因组克隆后，可用限制性内切酶进行消化，从这些克隆分离出本发明的核酸。
限制性内切酶消化的技术为本领域技术人员所熟知(Ausubel等人，同上)。可用于限制性内切酶消化的试剂可容易地从Stratagene等供应商或其他来源获得。
d.PCR
可从基因组DNA或其他天然来源经聚合酶链反应(PCR)扩增本发明的核酸。PCR方法为本领域技术人员所熟知。
PCR提供了一种快速扩增特定DNA序列的方法，其中使用由依赖DNA的热稳定DNA聚合酶催化的DNA复制的多个循环，扩增目的靶序列。PCR需要待扩增的靶核酸序列、位于待扩增序列两侧的两条单链寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、缓冲液和盐的存在。
按照Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.，155：335描述的方法实施PCR，该文献通过引用纳入本文。
美国专利4,683,202、4,683,195和4,800,159公开了聚合酶链反应(PCR)技术。最简单形式的PCR是一种使用两个与相反链杂交且位于靶DNA目的区域两侧的寡核苷酸引物进行特异DNA序列酶促合成的体外方法。包括模板变性、引物退火和由DNA聚合酶催化的退火引物延伸的一系列重复步骤导致特异片段的指数性累积，其中特异片段的末端由两个引物的5′端限定。据报道PCR可选择性地富集特异的DNA序列，使其增加109倍。Saiki等人，1985，Science，230：1350也描述了PCR方法。
采用模板DNA(至少1fg，更有用的是1-1000ng)和至少25pmol的寡核苷酸引物进行PCR。典型的反应混合物包括：2μl DNA、25pmol寡核苷酸引物、2.5μl适宜缓冲液、0.4μl 1.25μM dNTP、2.5单位的Taq DNA聚合酶(Stratagene)和去离子水，总体积25μl。矿物油覆盖于反应混合物表面，使用程序控制的热循环仪进行PCR。
根据实际的严格性要求，调节PCR循环每个步骤的长度和温度以及循环数目。退火温度和时间由引物退火到模板上的预计效率和可容忍的错配程度决定。优化引物退火条件的严格性的能力完全位于本领域普通技术人员的知识范围内。使用30℃和72℃之间的退火温度。正常情况下模板分子的最初变性在92℃和99℃之间进行4分钟，随后是由变性(94-99℃，15秒至1分钟)、退火(上文讨论所决定的温度，1-2分钟)和延伸(72℃，1分钟)组成的20-40个循环。最后的延伸步骤一般在72℃下进行4分钟，随后可能是在4℃下的不确定时间(0-24小时)的步骤。
一般用于标准PCR技术的检测方法在杂交测定中使用标记的引物和扩增的DNA。优选情况下，探针例如以32P、生物素、辣根过氧化物酶(HRP)等进行标记，以允许检测杂交。
其他的检测方法包括使用片段长度多态性(PCR FLP)、与等位基因特异的寡核苷酸(ASO)探针的杂交(Saiki等人，1986，Nature 324：163)或经双脱氧方法进行直接测序(使用扩增的DNA而非克隆的DNA)。标准PCR技术(基本)如下进行：复制位于两个引物间的DNA序列、提供作为反应主要产物并具有不同长度的DNA序列，其每条链的5’端均以引物终止。因此，引物间的插入和删除导致不同长度的产物序列，可通过PCR-FLP测定产物大小来检测产物序列。在一个ASO杂交的实例中，扩增DNA被固定在尼龙滤纸(例如通过UV辐射)的一系列“斑点印迹”上，随后使扩增DNA与HRP标记的寡核苷酸探针在严格条件下杂交。洗涤后，加入四甲基联苯胺(TMB)和过氧化氢。HRP氧化过氧化氢，后者反过来又将TMB氧化为蓝色沉淀物，从而指示杂交的探针。
2.包含RNA的核酸
本发明还提供了包含RNA的核酸。
可依据本领域熟知的方法(Ausubel等人，同上)纯化包含RNA的核酸。可依据本领域熟知的方法(Ausubel等人，同上)和下文描述的方法从细胞和组织中分离总RNA。
依据下列方法从哺乳动物组织纯化RNA。取出目的组织后，剪得≤2g的组织碎片，随后液氮快速冷冻以防止RNA降解。加入适宜体积的胍溶液(例如每2g组织加入20ml的胍溶液)，在组织匀浆器(tissuemizer)中研磨组织样品，进行两到三次10秒长的破裂(burst)。为了制备组织胍溶液(1L)，将590.8g异硫氰酸胍溶解于约400ml DEPC处理的H2O中。加入25ml 2M Tris-HCl，pH 7.5(终浓度0.05M)和20ml Na2EDTA(终浓度0.01M)，过夜搅拌溶液，体积调整为950ml，随后加入50ml的2-ME.
匀浆组织样品在12℃下12,000xg离心10分钟。形成的上清在置于9ml 5.7M CsCl溶液(0.1g CsCl/ml)上的0.1体积20％肌氨酰的存在下于65℃温育2分钟，随后113,000xg，22℃过夜离心分离。小心除去上清后，倒转管，沥干液体。管的底部(含有RNA沉淀)置于50ml塑料管中，在3ml组织重悬缓冲液(5mM EDTA，0.5％(体积/体积)肌氨酰，5％(体积/体积)2-ME)的存在下4℃过夜温育，以完全重悬浮RNA沉淀。形成的RNA溶液先后以25∶24∶1的苯酚/氯仿/异丙醇、24∶1的氯仿/异丙醇进行提取，加入3M乙酸钠(pH 5.2)和2.5体积的100％乙醇进行沉淀，随后重悬浮于DEPC水中(Chirgwin等人，1979，Biochemistry，18：5294)。
或者，依据下列单步方案从哺乳动物组织分离RNA。在玻璃特氟隆匀浆器中按每100mg组织加入1ml变性液(4M硫代硫酸胍，25mM柠檬酸钠，pH 7.0，0.1M 2-ME，0.5％(重量/体积)N-十二烷基肌氨酸)的比例，匀浆制备目的组织。匀浆物转移至5ml的聚丙烯管后，先后加入0.1ml的2M乙酸钠(pH 4)、1ml水饱和苯酚和0.2ml 49∶1的氯仿/异丙醇。加入每一组分后混合样品，加入所有组分后样品在0-4℃下温育15分钟。10,000xg，4℃离心20分钟分离样品，加入1ml 100％异丙醇进行沉淀，-20℃温育30分钟，10,000xg，4℃离心10分钟沉淀样品。形成的RNA沉淀溶解在0.3ml的变性液中，转移至微量离心管，加入0.3ml的100％异丙醇，-20下放置30分钟进行沉淀，10,000xg，4℃离心10分钟。RNA沉淀以70％乙醇洗涤，干燥后重悬浮于100-200μl DEPC处理水或DEPC处理的0.5％SDS(Chomczynski和Sacchi，1987，Anal.Biochem..162：156)。
可依据体外转录方法产生包含RNA的核酸。
体外转录的技术为本领域技术人员熟知。简而言之，将目的基因插入到含SP6、T3或T7启动子的载体上。用适宜的限制性内切酶在位于编码序列下游的单个位点处消化载体，使载体线性化。苯酚/氯仿提取后，DNA以乙醇沉淀，随后以70％乙醇洗涤，干燥后重悬浮于无菌水。采用转录缓冲液(200mM Tris-HCl，pH 8.0，40mM MgCl2，10mM亚精胺，250NaCl[T7或T3]或200mM Tris-HCl，pH 7.5，30mM MgCl2，10mM亚精胺[SP6])、二硫苏糖醇、RNA酶抑制剂、四种核糖核苷三磷酸的每一种以及SP6、T7或T3RNA聚合酶在37℃下温育线性化DNA 30分钟，进行体外转录反应。为了制备包含RNA的放射性标记的多核苷酸，弃用未标记的UTP，向反应混合物加入35S-UTP。随后以DNA酶I进行温育，除去DNA模板。乙醇沉淀后，以闪烁计数器计算放射性标记的RNA数目，测定cpm/μl(Ausubel等人，同上)。
或者，通过化学合成技术例如固相亚磷酰胺(下文描述)制备包含RNA的核酸。
3.包含寡核苷酸的核酸
可使用可商购获得的寡核苷酸合成仪器制备包含寡核苷酸的核酸(下文描述)。
本领域技术人员熟知的是，可合成具有某些化学部分和/或俘获部分的寡核苷酸，使得它们可被偶联到固相载体上，结合上结合部分或标记物。适宜的俘获成分包括但不限于核酸结合蛋白或核苷酸序列、生物素、半抗原、蛋白质或具有化学反应活性的部分。这类寡核苷酸或可首先用于溶液，随后被俘获到固相载体上，或可首先结合到固相载体上，随后用于检测检测反应。后者的实例是将上游探针分子偶联到固相载体上，使得上游探针分子的5′端包含荧光猝灭剂。同一上游探针分子还包含位于一定位置的荧光团，使得FEN核酸酶的切割将猝灭剂同荧光团物理上分开。例如，靶核酸可与固相上游探针寡核苷酸杂交，液相上游引物也可与靶分子杂交，使得FEN核酸酶的切割反应发生在固相载体上，释放复合物中的5′猝灭剂部分。这将导致结合到固相载体上的荧光团可被检测到，因而揭示了适宜标记或鉴定的固相载体上切割事件的存在。不同的上游探针分子可结合到阵列中的不同位点。阵列上的位点可鉴定探针分子，指示可与探针分子杂交的模板的存在。
II.双链体
本发明提供了用于制备本发明的切割结构的双链体。
在允许双链体组分杂交和形成双链体的条件下以任何次序混合双链体的组分，形成本发明的双链体。在一个实施方式中，首先靶核酸或模板核酸与下游寡核苷酸杂交，随后加入上游寡核苷酸，形成双链体。在另一实施方式中，靶核酸和/或模板核酸同时与下游寡核苷酸和上游寡核苷酸杂交，形成双链体。在一个实施方式中，在热循环反应的退火步骤期间形成双链体。在适宜条件下进行靶核酸或模板核酸与一个或多个寡核苷酸的杂交。适宜的条件包括例如允许包含二级结构的探针的变性和允许靶核酸或模板核酸与单个探针或多个探针的互补碱基之间氢键的形成的温度。在某些实施方式中，向杂交混合物加入适宜量的变性剂例如二甲基亚砜(DMSO)或甘油。适宜量的变性剂足以允许本发明的第一双链体或第二双链体的杂交和形成以及下文描述的聚合和/或切割步骤。可用于本发明的变性剂浓度依双链体组分的碱基对组成而变化。可通过本领域知晓方法和下文描述方法以实验确定可用于本发明的变性剂浓度，该浓度足以允许互补核酸的杂交、引物(例如正向引物和反向引物)的聚合和切割结构的切割。在一个实施方式中，变性剂是DMSO，使用浓度为0至6％，对于约0.1至1kb范围内的核酸，优选浓度为约1.5至2％。对于大于10kb的核酸，可使用大于2％的DMSO浓度。或者，甘油可用作变性剂，浓度为0至10％，优选为5至8％。可联合使用上述两种变性剂或甚至其他的变性剂，它们的浓度可通过本领域知晓方法以实验确定。
确定“可允许双链体组分杂交的条件”的方法为本领域知晓，名为“核酸”的段落详细讨论了影响核酸杂交的参数。
A.第一双链体
在一个实施方式中，本发明提供了包含靶核酸(例如图1的A′C′)、具有与靶(例如图1的A-1)不互补的3′末端核苷酸的上游寡核苷酸(第一寡核苷酸)和下游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸，例如图1的FC)的第一双链体。下游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸)具有与靶核酸不互补的5′区域和与靶互补的3′区域。根据该实施方式，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸最3′端的互补核苷酸和第二寡核苷酸最5′端的互补核苷酸至少被切口分开。第一双链体形成第一切割结构。
在另一实施方式中，本发明提供了包含靶核酸(例如图1的A′C′)、与靶第一区域互补的正向引物(例如图1的A-2)和下游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸，例如图1的FC)的第一双链体。下游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸)具有与靶核酸不互补的5′区域和与靶第二区域互补的3′区域。第一双链体形成第一切割结构。
在一个实施方式中，首先靶核酸与第二寡核苷酸杂交，随后加入第一寡核苷酸，形成双链体。
在另一实施方式中，靶核酸同时与上游寡核苷酸和下游寡核苷酸杂交，形成双链体。
在一个实施方式中，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被切口分开。
在另一实施方式中，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。
在另一实施方式中，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。
在又一实施方式中，当第一寡核苷酸和第二寡核苷酸退火到靶上时，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开。
B.第二双链体
本发明提供了包含模板核酸(例如图1的F′H′)、上游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣，例如图1的F)和下游寡核苷酸(例如第三寡核苷酸，例如图1的F2H)的第二双链体。第三寡核苷酸具有与模板核酸不互补的5′区域和与模板第二区域互补的3′区域。根据该实施方式，上游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣)和下游寡核苷酸(例如第三寡核苷酸)与模板杂交，使得释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到靶上时，释放的活瓣的最3′端互补核苷酸和第三寡核苷酸的最5′端互补核苷酸至少被切口分开。
在一个实施方式中，当释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到模板核酸上时，释放的活瓣和第三寡核苷酸被切口分开。
在另一实施方式中，当释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到模板核酸上时，释放的活瓣和第三寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。
在又一实施方式中，当所述释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到靶上时，释放的活瓣和第三寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。
在又一实施方式中，当释放的活瓣和第三寡核苷酸退火到靶上时，释放的活瓣和第三寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开。
III.核酸聚合活性
本发明提供了可用于等温反应的核酸聚合活性(包括核酸聚合酶)。本发明的可用于等温反应的核酸聚合活性包括但不限于下文列出的任何核酸聚合酶。
本发明的核酸聚合酶可以是热稳定的。本文中所用的“热稳定的”系指在优选高达约90-100℃和更优选约70-98℃的温度下稳定的活性酶，例如与具有类似活性的非热稳定形式的酶相比。例如，与来自大肠杆菌或哺乳动物FEN酶的核酸聚合酶相比，源于嗜热生物例如强烈炽热球菌詹氏甲烷球菌、A.fulgidus或P.horikoshii的热稳定核酸聚合酶或FEN核酸酶在升高的温度下更加稳定，活性更高。美国专利4,889,818描述了一种分离自水生栖热菌的代表性热稳定核酸聚合酶(Taq)，Saiki等人，1988，Science 239：487描述了一种在常规PCR中使用该酶的方法。Lundberg等人，1991，Gene，108：1-6描述了另一种分离自强烈炽热球菌(Pfu)的代表性热稳定核酸聚合酶。其他的代表性温度稳定型聚合酶包括例如提取自嗜热细菌黄栖热菌、红栖热菌(Thermus ruber)、嗜热栖热菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(其最适温度比其他列出的细菌略低)、乳栖热菌(Thermus lacteus)、红色栖热菌(Thermusrubens)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)或提取自嗜热古细菌Thermococcus litoralis和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)的聚合酶。
温度稳定型聚合酶和FEN核酸酶优选用于热循环方法，其中双链核酸在PCR循环中暴露于高温下(约95℃)发生变性。
可用于本发明的已知DNA聚合酶包括例如大肠杆菌DNA聚合酶I、嗜热栖热菌(Tth)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶、Thermococcus litoralis DNA聚合酶、水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶和强烈炽热球菌(Pfu)DNA聚合酶。
本发明的基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的核酸聚合酶包括但不限于Klenow DNA聚合酶、Klenow exo-DNA聚合酶和T7 DNA聚合酶(测序酶)。
本发明的基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的热稳定核酸聚合酶包括但不限于Pfu、exo-Pfu(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Pfu突变形式)、Taq的Stoffel片段、N-截短的Bst、N-截短的Bca、Genta、JdF3 exo-、Vent，Vent exo-(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Vent突变形式)、Deep Vent、Deep Vent exo-(缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Deep Vent突变形式)、U1Tma和ThermoSequenase。
可用于本发明某些实施方式的核酸聚合酶基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性，包括但不限于exo-Pfu DNA(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的PfuDNA聚合酶的突变形式，Cline等人，1996，Nucleic Acids Research，24：3546；美国专利5,556,772；可从Stratagene，La Jolla，Calif.目录号600163商购获得)、exo-Tma DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的Tma DNA聚合酶的突变形式)、exo-Tli DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的exo-Tli DNA聚合酶的突变形式，New England Biolabs，(目录号257))、exo-大肠杆菌DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的大肠杆菌DNA聚合酶的突变形式)、大肠杆菌DNA聚合酶I的exo-Klenow片段(Stratagene，目录号600069)、exo-T7 DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的T7 DNA聚合酶的突变形式)、exo-KOD DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的KOD DNA聚合酶的突变形式)、exo-JDF-3 DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的JDF-3 DNA聚合酶的突变形式)、exo-PGB-D DNA聚合酶(基本缺乏3′到5′外切核酸酶活性的PGB-D DNA聚合酶的突变形式，New England Biolabs，目录号259)、Tth DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶(例如目录号600131，600132，600139，Stratagene)；UlTma(N-截短)Thermatoga martima DNA聚合酶；DNA聚合酶I的Klenow片段、9°Nm DNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly，MA停产的产品)、″3′-5′exo reduced″突变体(Southworth等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci 93：5281)和测序酶(USB，Cleveland，OH)。可通过本领域熟知的方式定义上述任何一种酶的聚合酶活性。根据本发明，1单位的DNA聚合酶活性定义为最适温度下催化10nmol总dNTP在30分钟内掺入到聚合形式的酶量。
可用于本发明的核酸聚合酶既包括天然聚合酶也包括缺乏5′到3′外切核酸酶活性的聚合酶突变体。可用于本发明的核酸聚合酶可具有不同程度的热稳定性。
聚合剂是聚合酶。在一个实施方式中，聚合剂缺乏5′到3′的外切核酸酶活性。在另一实施方式中，聚合剂是热稳定的。在又一实施方式中，单个酶含有聚合活性和切割活性。具有两种活性的酶包括：大肠杆菌DNA聚合酶I、T7 DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。在一个替代实施方式中，切割活性和聚合活性由不同的酶提供。不同的酶可提供为单一的制剂。
下文列出了可用于本发明的具有不同程度热稳定性且基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的其他核酸聚合酶。
A.噬菌体DNA聚合酶(可用于37℃测定)：
噬菌体DNA聚合酶没有5′到3′的外切核酸酶活性，因为这一活性由不同的多肽编码。适宜DNA聚合酶的实例是T4、T7和Φ29 DNA聚合酶。可商购获得的酶是：T4(可从许多来源例如Epicentre获得)和T7(可从许多来源例如Epicentre得到未修饰形式和从USB得到3′到5′exo-T7″测序酶″DNA聚合酶)。
B.古细菌DNA聚合酶：
已从古细菌鉴定出两类不同的DNA聚合酶：1.B家族/polα类型(来自强烈炽热球菌的Pfu同源物)和2.pol II类型(强烈炽热球菌DP1/DP22-亚基聚合酶的同源物)。已表明来自这两类的DNA聚合酶天然缺乏相关的5′到3′外切核酸酶活性，但具有3′到5′外切核酸酶(校正)活性。适宜的DNA聚合酶(polα或pol II)可源自具有类似于所需测定温度的最佳生长温度的古细菌。适宜古细菌的实例包括但不限于：
1.不耐热的(可用于37℃测定)-例如沃氏甲烷球菌(Methanococcusvoltae)。
2.热稳定的(可用于非PCR测定)-例如硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarium)、詹氏甲烷球菌、嗜酸热原体(Thermoplasma acidophilum)。据估计，适宜的古细菌表现出＜80-85℃的最高生长温度或＜70-80℃的最佳生长温度。
3.热稳定的(可用于PCR测定)-例如热球菌类(furiosus，菌种GB-D，菌株KODl，woesii，abysii，horikoshii)、热球菌类(litoralis，菌种9°North-7，菌种JDF-3，gorgonarius)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)和闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)。据估计，适宜的古细菌表现出＞80-85℃的最高生长温度或＞70-80℃的最佳生长温度。来自古细菌polαDNA聚合酶组的适宜PCR酶可商购获得，包括KOD(Toyobo)、Pfx(Life Technologies，Inc.)、Vent(New England BioLabs)、Deep Vent(New England BioLabs)和Pwo(Boehringer-Mannheim)。
下列参考文献描述了与上文列出的古细菌相关的其他古细菌：Archaea：A Laboratory Manual(Robb，F.T和Place，A.R.，eds.)、Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1995和ThermophilicBacteria(Kristjansson，J.K.，ed.)CRC Press，Inc.，Boca Raton，Florida，1992。
C.真细菌DNA聚合酶：
有三类真细菌DNA聚合酶，即pol I、II和III。Pol I DNA聚合酶家族的酶具有5′到3′外切核酸酶活性，某些成员还表现出3′到5′外切核酸酶活性。Pol II DNA聚合酶天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性，但表现出3′到5′外切核酸酶活性。Pol III DNA聚合酶代表细胞的主要复制型DNA聚合酶，由多个亚基组成。pol III催化亚基缺乏5′到3′外切核酸酶活性，但有些情况下3′到5′外切核酸酶活性位于同一多肽上。
没有商业来源的真细菌pol II和pol III DNA聚合酶。
有多种可商购获得的Pol I DNA聚合酶，其中一些已被修饰，减少或消除了5′到3′外切核酸酶活性。用于消除pol I DNA聚合酶中5′到3′外切核酸酶活性的方法包括：
-诱变(例如Xu等人，1997，J.MoI.Biol.，268：284和Kim等人，1997，MoI. Cells.7：468描述)。
-蛋白水解消化催化的N-截短(例如Klenow等人，1971，Eur.J.Biochem.，22：371描述)，或
-克隆和表达C-末端片段进行N-截短(Lawyer等人，1993，PCR Methods Appl..2：275描述)。
至于古细菌来源，测定温度要求决定了哪种真细菌用做可用于本发明的DNA聚合酶的来源(例如嗜常温菌、嗜热菌、超嗜热菌)。
1.嗜常温/不耐热(可用于37℃测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自中温真细菌例如大肠杆菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、分支杆菌(结核、麻风)的pol II或pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从上文列出的中温真细菌分离出用于N-截短或诱变的Pol I DNA聚合酶(Ci)。可商购获得的真细菌DNA聚合酶pol I片段是Klenow片段(N-截短的大肠杆菌polI；Stratagene)。
2.热稳定(可用于非PCR测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自嗜热真细菌例如杆菌类(例如嗜热脂肪芽孢杆菌、热坚芽孢杆菌、caldovelox)的pol II或pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从上文列出的嗜热真细菌例如杆菌类分离出用于N-截短或诱变的适宜pol I DNA聚合酶。可商购获得以商品名Bst DNA聚合酶I大片段(Bio-Rad)和等温DNA聚合酶(Epicentre)销售的嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶pol I的热稳定N-截短片段。热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)pol I的C-末端片段可从Panvera(以商品名Ladderman销售)获得。
3.热稳定(可用于PCR测定)
i.基本天然缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶：来自栖热菌类(水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，红栖热菌，caldophilus，filiformis，brokianus)或来自海栖热袍菌的pol II或pol III催化亚基。Yi-Ping等人，1999，J.MoI.Evol.，48：756和McHenry等人，1997，J.MoI.Biol.，272：178描述了来自嗜热栖热菌和水生栖热菌的pol III催化亚基。
ii.基本缺乏5′到3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶突变体：可从许多嗜热真细菌包括栖热菌属和海栖热袍菌(参看上文)分离出用于N-截短或诱变的适宜pol I DNA聚合酶。可商购获得以商品名KlenTaql(Ab Peptides)、Stoffel片段(Perkin-Elmer)和ThermoSequenase(Amersham)进行销售的水生栖热菌DNA聚合酶pol I(Taq)的热稳定片段。除了C-末端片段外，5′到3′外切核酸酶-Taq突变体也可商购获得，例如TaqFS(Hoffrnan-LaRoche)。除了5′到3′外切核酸酶-形式的Taq，还可商购获得海栖热袍菌DNA聚合酶I的N-截短形式(商品名UlTma，Perkin-Elmer)。
Thermophilic Bacteria(Kristjansson，J.K.，ed.)CRC Press，Inc.，BocaRaton，Florida，1992描述了与上文列出的真细菌相关的其他真细菌。
D.真核5′到3′外切核酸酶DNA聚合酶(可用于37℃测定)
已从真核生物鉴定出几种DNA聚合酶，包括DNA polα(复制/修饰)、δ(复制)、ε(复制)、β(修复)和γ(线粒体复制)。真核生物DNA聚合酶没有5′到3′外切核酸酶活性，因为这一活性由不同的多肽(例如哺乳动物FEN-1或酵母RAD2)编码。可从许多真核生物(包括但不限于酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞、果蝇)和真核病毒(例如EBV、腺病毒)分离出适宜的热稳定DNA聚合酶。
除了缺乏5′到3′外切核酸酶活性以外还缺乏3′-5′外切核酸酶(校正)活性的DNA聚合酶突变体可能在基于FEN的检测策略中表现出改进的性能。例如，降低或消除内在的3′到5′外切核酸酶活性可通过减少标记探针的非特异外切核酸降解来降低背景信号。已鉴定出三种3′到5′外切核酸酶基序，已表明这些区域的突变可消除Klenow、Φ29、T4、T7和Vent DNA聚合酶、酵母Polα、Polβ和Polγ和枯草杆菌Pol III的3′到5′外切核酸酶活性(Derbeyshire等人，1995，Methods.Enzymol.262：363综述)。制备3′到5′外切核酸酶活性降低或消除的其他DNA聚合酶突变体的方法为本领域熟知。
同时缺乏5′到3′和3′到5′外切核酸酶活性的可商购获得的酶包括测序酶(exo-T7；USB)、Pfu exo-(Stratagene)、exo-Vent(New England BioLabs)、exo-Deep Vent(New England BioLabs)、exo-Klenow片段(Stratagene)、Bst(Bio-Rad)、Isotherm(Epicentre)、Ladderman(Panvera)、KlenTaql(Ab Peptides)、Stoffel片段(Perkin-Elmer)、ThermoSequenase(USB)和TaqFS(Hoffman-LaRoche)。
具有链置换活性的核酸聚合酶也可用于本发明。
如果使用了不同于Pfu的聚合酶，选择缓冲液和延伸温度，以允许可用于本发明的特定聚合酶发挥最佳活性。可用于本发明聚合酶的缓冲液和延伸温度为本领域知晓，还可由销售商的说明书来确定。
可用于本发明的其他核酸酶包括缺乏5′到3′外切核酸酶活性但具有3′到5′DNA合成活性的Taq聚合酶的突变形式，其包含下列突变：D144S/F667Y Taq，其中D144S消除了5′到3′外切核酸酶活性，而F667Y提高了ddNTP的掺入。
可依据Xu等人，1997，J.MoI.Biol.，268：284的方法制备Pol I聚合酶的Exo-突变体。
IV.切割结构
本发明提供了一种可被核酸酶(例如FEN核酸酶)切割的切割结构，因而教导了制备切割结构的方法。
A.切割结构的制备
1.在本发明的一个实施方式中，使用适宜的缓冲液(例如可从Stratagene(目录号600153)获得的1X Pfu缓冲液或具有15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO的探针缓冲液)在允许靶核酸序列与寡核苷酸杂交以形成本发明的双链体的条件下(例如95℃，10秒-5分钟；随后冷却至约50-60℃)，温育靶核酸(图1的A′C′)、下游探针(例如第二寡核苷酸，例如图1的FC)和上游寡核苷酸(例如第一寡核苷酸，例如图2的A-2)，形成第一切割结构。探针的5′区域与靶不互补，因此退火到靶上时，探针形成5′活瓣。上游寡核苷酸的3′末端核苷酸与靶不互补。当上游寡核苷酸的互补部分与下游寡核苷酸的互补部分退火到靶上使得它们至少被切口分开时，形成切割结构。形成和切割该结构的最佳温度依特定的寡核苷酸和聚合酶而变化。反应可包括正向引物和反向引物，反应可在PCR反应条件下进行。例如，本发明的切割结构可在下列反应下形成：(1)95℃，2分钟，1循环，(2)95℃，1秒，(3)60℃，18秒。步骤(2)和(3)可循环进行。
2.在本发明的另一实施方式中，使用适宜的缓冲液(例如可从Stratagene(目录号600153)获得的1X Pfu缓冲液或具有15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO的探针缓冲液)在允许模板核酸序列与寡核苷酸杂交以形成本发明的第二双链体的条件下(例如95℃，10秒-5分钟；随后冷却至约50-60℃)，温育模板核酸(图1的F′H′)、下游探针(例如第三寡核苷酸，例如图1的F2H)和上游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣，例如图1的F)，形成第二切割结构。探针的5′区域与模板不互补，因此当该寡核苷酸的3′区域退火到模板上时，探针形成5′活瓣。上游寡核苷酸的3′末端核苷酸与模板不互补。当上游寡核苷酸的模板互补部分与下游寡核苷酸的互补部分退火到模板使得它们至少被切口分开时，形成切割结构。形成和切割该结构的最佳温度依特定的寡核苷酸和聚合酶而变化。反应可包括正向引物和反向引物，反应可在PCR反应条件下进行。例如，本发明的切割结构可在下列反应下形成：95℃，2分钟，1循环，(2)95℃，1秒，(3)60℃，18秒。步骤(2)和(3)可循环进行。
还可按下列方法制备上述1-2部分中任一个所描述的切割结构。切割结构的组分在最适于杂交和随后切割以及某些实施方式中聚合的步骤的温度(例如50℃、69℃或72℃)下杂交。切割结构的组分在一段足以允许本文定义的第一双链体或第二双链体杂交和形成的时间下杂交。
在本发明的某些实施方式中，在变性剂(例如DMSO或甘油)的存在下温育第一双链体或第二双链体的组分，形成第一双链体或第二双链体，其中变性剂的浓度足以允许本发明的第一双链体或第二双链体的杂交和形成，以及随后下文描述的切割和某些实施方式中的聚合步骤。可用于本发明的变性剂的浓度依双链体组分的碱基对组成而变化。可通过本领域知晓方法和下文描述方法以实验确定可用于本发明的变性剂浓度，该浓度足以允许本发明的互补核酸的杂交、切割结构的切割和某些实施方式中引物(例如正向引物)的聚合。在一个实施方式中，变性剂是DMSO，使用浓度为0至6％，对于约0.1至1kb范围内的核酸，优选浓度为约1.5至2％。对于大于10kb的核酸，可使用大于2％的DMSO浓度。或者，甘油可用作变性剂，浓度为0至10％，优选为5至8％。可联合使用上述两种变性剂或甚至其他的变性剂，通过本领域知晓方法以实验方式确定它们的浓度。
对于本发明的等温反应，形成本文定义的第一双链体之后所发生的全部反应步骤在相同的温度下进行。
可使用探针制备本发明的切割结构，其中探针具有结合到靶核酸序列时即发生变化的二级结构。
B.如何制备标记的切割结构
本发明提供了标记的切割结构。按照上文名为“切割结构”的段落中的A1-A2部分所描述方法，形成标记的切割结构，其中一个或两个下游寡核苷酸被标记(例如一对相互作用的部分的第一成员位于第二或第三寡核苷酸的5′活瓣，而这对相互作用的部分的第二成员位于第二或第三寡核苷酸的3′区域)，使得非侵入切割结构的切割产生可检测信号。标记核酸探针或寡核苷酸的方法为本领域熟知(参看Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上)。
正如下文描述，可掺入能被分光法、光化学法、生物化学法、免疫化学法、酶法或化学法检测的部分，标记寡核苷酸探针。将标记物连接或缀合到寡核苷酸探针的方法当然取决于使用的标记物和标记物在探针上的位置。在一些实施方式中，第三寡核苷酸以一对相互作用的部分标记。这对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到所述5′活瓣，这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到探针的+1核苷酸。
适合用于本发明的各种标记物以及将它们加入到下游寡核苷酸上的方法为本领域知晓，包括但不限于可发生相互作用以增强、改变或降低信号的酶(例如碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶)、酶底物、放射性原子、荧光染料、发色团、化学发光标记物、电化学发光标记物例如OrigenTM(Igen)。当然，如果标记分子用于以热循环仪器进行的PCR测定，该标记物必须能够经受该自动化过程所需的温度循环。
1.荧光团
用作标记物来构建本发明标记探针的荧光团包括罗丹明和衍生物(例如德克萨斯红)、荧光素和衍生物(例如5-溴甲基荧光素)、荧光黄、IAEDANS、7-Me2N-香豆素-4-乙酸酯、7-羟基-4-甲基-香豆素-3-乙酸酯、7-氨基-4-甲基-香豆素-3-乙酸酯(AMCA)、monobromobimane、三磺酸芘例如Cascade Blue、以及monobromorimethyl-ammoniobimane。一般而言，优选具有宽斯托克斯位移的荧光团，以允许使用具有滤光片的荧光计而非单色仪来增加检测效率。
以荧光团标记的探针可容易用于核酸酶(例如FEN-核酸酶)介导的对切割结构的切割，其中切割结构包含本发明的标记探针。如果标记物位于探针的5′-端，通过本领域熟知的方法从完整的杂交探针分离出核酸酶(例如FEN-核酸酶)产生的标记片段。在本发明的另一实施方式中，可使用例如荧光偏振实现杂交的标记探针的检测，其中荧光偏振是一种基于分子翻滚(molecular tumbling)来区分大小分子的技术。大分子(即完整的标记探针)在溶液中比小分子翻滚慢得多。荧光部分连接到目的分子的适宜位点(例如标记探针的5′端)后，可根据分子翻滚测量(和区分)该荧光部分，从而区分完整探针和消化探针。
2.FRET
本文中所用的短语“相互作用的标记物对”以及短语“一对相互作用的标记物”以及短语“第一和第二部分”系指一对通过物理方式、光学方式或其它方式发生相互作用以允许通过可检测信号检测二者邻近性的分子。“一对相互作用的标记物”的实例包括但不限于适合用于荧光共振能量转移(FRET)(Stryer，L.Ann.Rev.Biochem.47，819-846，1978)、闪烁邻近测定法(SPA)(Hart和Greenwald，Molecular Immunology 16：265-267，1979；美国专利4,658,649)、发光共振能量转移(LRET)(Mathis，G.Clin.Chem.41，1391-1397，1995)、直接猝灭(Tyagi等人，Nature Biotechnology 16，49-53，1998)、化学发光能量转移(CRET)(Campbell，A.K和Patel，A.Biochem.J.216，185-194，1983)、生物发光共振能量转移(BRET)(Xu，Y.，Piston D.W.，Johnson，Proc.Natl.Acad.Sc，96，151-156，1999)或激基缔合物形成(Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy，KluwerAcademic/Plenum Press，New York，1999)的标记物。
第一部分和第二部分“可操纵地连接”到本发明的寡核苷酸。这意味着每个部分以任何符合其操作的方式(即以任何符合探针切割后提供可检测信号的方式)被连接到其相应序列上。例如，这对部分可或以共价键或以非共价键连接到本发明的寡核苷酸上。非共价键连接的实例包括通过杂交、氢键、离子键、疏水相互作用、范德华相互作用和蛋白-核酸相互作用的连接，其中可使用其中任何一种非共价键连接可操纵地将第一或第二部分偶联到本发明的寡核苷酸上。共价连接到寡核苷酸的5′和3′端或其附近的部分是优选的。
正如本文使用，提及的“荧光”或“荧光基团”或“荧光团”分别包括发光和发光基团。
本文中所用的“荧光的增加”系指荧光团发射的可检测荧光增加。当例如荧光团和猝灭剂的距离因例如切割工具催化的切割反应而增加使得猝灭减弱时，可导致荧光的增加。当荧光团发射的荧光增加了至少2倍，例如2、2.5、3、4、5、6、7、8、10倍或更多倍时，发生“荧光的增加”。
a.与FRET相容的荧光团
可用于本发明的一对相互作用的标记物可包含一对与FRET相容的染料或猝灭剂-染料对。在一个实施方式中，该对包含荧光团-猝灭剂对。
本发明的寡核苷酸允许通过荧光检测/测量靶核酸。它们可用荧光团和猝灭剂标记，使得完整寡核苷酸上的荧光团发射的荧光基本被猝灭，而切割的寡核苷酸或某些实施方式中与靶杂交的寡核苷酸中的荧光没有被猝灭，因而发生探针切割或某些实施方式中的靶杂交时，导致总荧光的增加。而且，实时检测扩增反应产物期间荧光信号的生成允许精确定量样品中靶序列的初始数目。
可使用各种各样的荧光团，包括但不限于：5-FAM(也称为5-羧基荧光素；也称为Spiro(异苯并呋喃-1(3H)，9′-(9H)占吨)-5-羧酸，3′，6′-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素(isobenzofuran-1(3H)，9′-(9H)xanthene)-5-carboxylicacid，3′，6′-dihydroxy-3-oxo-6-carboxyfluorescein))；5-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰-荧光素基)-6-羧酸])；6-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；5-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；6-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-6-羧酸])；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，4-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基-氨基))；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基氨基))；EDANS(5-((2-氨乙基)氨基)萘-1-磺酸)；1，5-IAEDANS(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)；DABCYL(4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸)Cy5(吲哚二碳菁-5)Cy3(吲哚二碳菁-3)；BODIPY FL(2，6-二溴-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-二环戊二烯并苯-3-丙酸)(2，6-dibromo-4，4-difluoro-5，7-dimethyl-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene-3-proprionic acid)；Quasar-670(Bioreseach Technologies)；CalOrange(Bioresearch Technologies)；Rox以及它们的适宜衍生物。
b.与FRET相容的猝灭剂
本文中所用的术语“猝灭剂”系指结合荧光供体或接近荧光供体时可减少荧光供体发射的发色分子或化合物的发色部分。可通过几种机制中的任何一种发生猝灭，其中包括荧光共振能量转移、光诱导电子转移、系间跨越的顺磁增强(paramagnetic enhancement of intersystem crossing)、Dexter交换耦合和激发耦合例如暗复合物的形成。与没有猝灭剂时的荧光相比，荧光团发射的荧光减少至少10％，例如15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.9％或更多时，荧光被“猝灭”。
猝灭剂可为任何可猝灭来自测定中使用的激发荧光团的至少一次荧光发射的物质。文献中有大量关于选择用于特定探针的适宜报道剂-猝灭剂对的实际指导，例如下列参考文献所例示：Clegg(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90：2994-2998)；Wu等人(1994，Anal.Biochem.，218：1-13)；Pesce等人，editors，Fluorescence Spectroscopy(1971，Marcel Dekker，New York)；White等人，Fluorescence Analysis：A Practical Approach(1970，Marcel Dekker，New York)等。文献还包括提供荧光分子和发色分子详尽列表和提供它们用于选择报道剂-猝灭剂的相关光学性质的参考文献，例如Berlman，Handbook ofFluorescence Spectra of Aromatic Molecules，2nd Edition(1971，AcademicPress，New York)；Griffiths，Colour and Constitution of Organic Molecules(1976，Academic Press，New York)；Bishop，editor，Indicators(1972，PergamonPress，Oxford)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(1992 Molecular Probes，Eugene)Pringsheim，Fluorescence andPhosphorescence(1949，Interscience Publishers，New York)，所有这些文献均通过引用纳入本文。而且，文献还提供了衍生用于通过可加入到寡核苷酸上的普通反应基团而共价连接的报道剂和猝灭剂分子的详尽指导，例如下列参考文献所例示，例如参看Haugland(上文引用)、Ullman等人、美国专利3,996,345、Khanna等人、美国专利4,351,760，所有这些文献均通过引用纳入本文。
许多可商购获得的猝灭剂为本领域知晓，包括但不限于DABCYL、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3。BHQ(″黑洞猝灭剂″)猝灭剂是防止杂交事件发生前出现荧光的一类新的黑色猝灭剂。此外，这些新的猝灭剂没有天然荧光，几乎消除了使用其他猝灭剂时遇到的背景问题。BHQ猝灭剂可用于猝灭几乎所有的报道染料，可从例如Biosearch Technologies，Inc(Novato，CA)商购获得。
c.荧光团和猝灭剂的连接
在本发明的一个实施方式中，一对相互作用的标记物的一个成员被连接到下游寡核苷酸(例如第二或第三寡核苷酸)的5′区域，这对相互作用的标记物的第二成员被连接到下游寡核苷酸(例如第二或第三寡核苷酸)的3′区域。在本发明的一个实施方式中，荧光团或猝灭剂被连接到本发明寡核苷酸的3′核苷酸。在本发明的另一实施方式中，荧光团或猝灭剂被连接到5′核苷酸。在又一实施方式中，荧光团或猝灭剂被连接到本发明寡核苷酸的内部。在一些实施方式中，荧光团或猝灭剂被连接到探针的5′核苷酸，而所述荧光团或猝灭剂中的另一个被连接到探针的3′核苷酸。可通过直接偶联进行连接，或者使用长度为例如约1至约5原子的间隔分子进行连接。
对于荧光团或猝灭剂的内部连接，可使用本领域知晓的任何方式进行连接。许多参考文献描述了用于将许多染料连接到寡核苷酸的适宜连接方法，例如Marshall，Histochemical J.，7：299-303(1975)；Menchen等人，美国专利5,188,934；Menchen等人，欧洲专利申请87310256.0和Bergot等人，国际申请PCT/US90/05565，这些参考文献均通过引用纳入本文。
荧光团/猝灭剂对的每个成员可连接到寡核苷酸内部的任何地方，优选与该对另一成员具有一定距离，使得寡核苷酸没有切割或与模板核酸杂交时，发生足量的猝灭。
在一个实施方式中，可在单个寡核苷酸探针上使用两个相互作用的标记物(例如FRET对或非FRET对)，适当考虑保持两个标记物在寡核苷酸上的适当间距，以允许在寡核苷酸探针解折叠(例如由于探针二级结构的变化)或水解期间分隔标记物。
在另一实施方式中，可在单个寡核苷酸探针上(例如第三寡核苷酸)使用两个相互作用的标记物(例如FRET对或非FRET对)，适当考虑保持两个标记物在寡核苷酸上的适当间距，以允许在非侵入切割事件期间分隔两个标记物，但不允许在侵入切割事件期间分隔两个标记物。
在某些实施方式中，释放标记物的荧光随后与仍结合在靶上的标记物相比较。如果探针合成时具有两个被约20个核苷酸分隔开的荧光团和猝灭剂，在核酸酶(例如FEN-核酸酶)的存在下发生切割后，没有必要将核酸酶(例如FEN-核酸酶)产生的片段和仍结合在靶上的探针分开。或者，猝灭剂如此定位，使得探针未与靶核酸序列杂交时不会产生荧光。这种双重标记的探针完整时或未与靶核酸序列杂交时不会产生荧光(或就双分子或多分子探针而言，探针未解离时)，因为染料发射的光被猝灭剂猝灭。因此，完整探针发射的任何荧光被认为是背景荧光。在一个实施方式中，当标记探针被FEN核酸酶在非侵入切割反应中切割时，染料和猝灭剂被分开，释放的片段将产生荧光。或者，当标记探针与靶核酸杂交时，染料和猝灭剂的距离增加，因而荧光水平升高。在一个实施方式中，其中探针是双分子或多分子探针，组成探针的分子的解离导致荧光的增加。荧光的量与样品中存在的核酸靶序列的量呈正比。
还可在本发明中使用多个寡核苷酸，以实现其他益处。例如，只需将所需要的尽可能多的探针放入反应混合物，即可检测样品中任何数目的病原体；探针可各自包含不同的标记物以便于检测。例如，可向反应混合物加入多组不同的第一寡核苷酸、第二寡核苷酸、模板核酸和第三寡核苷酸。每种第二寡核苷酸与来自不同病原体的核酸序列的区域互补。如果反应混合物中存在病原体，相应的第二寡核苷酸将与病原体的核酸序列杂交。切割第二寡核苷酸。随后切割的活瓣与该活瓣特异的模板核酸杂交。活瓣、模板和第三寡核苷酸形成第二切割结构，第二切割结构被切割。第三寡核苷酸的切割产生指示特定病原体的信号。可产生针对每个目的病原体的多个不同信号例如荧光信号。这类反应可在Mx3005P实时PCR系统(Stratagene，California)中进行。
尽管可选择寡核苷酸序列以实现重要的益处，但也可通过选择探针标记物来实现重要的优点。标记物可通过各种技术直接或间接地连接到寡核苷酸上。根据使用的标记物的具体类型，标记物可位于探针的5′端或3′端，探针内部，或连接到具有不同大小和组成的间隔臂上，以便于信号相互作用。利用可商购获得的亚磷酰胺试剂，可用适宜保护的亚磷酰胺产生在5′末端或3′末端含有官能团(例如硫醇或伯胺)的寡聚体，可使用例如PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications，Innis等人，eds.AcademicPress，Ind.，1990描述的方案标记它们。
美国专利4,914,210描述了引入寡核苷酸官能化试剂以向寡核苷酸探针序列(一般是5′末端)引入一个或多个巯基、氨基或羟基部分的方法。可使用多核苷酸激酶和γ-32P-ATP或γ-33P-ATP引入作为放射性同位素的5′磷酸基，以提供报道基团。可使合成过程中加入的氨基胸苷残基或6-氨基己基残基与生物素的N-羟基琥珀酰亚胺酯反应，向5′端加入生物素。3′末端的标记物可使用多核苷酸末端转移酶来添加所需部分，例如蛹虫草菌素35S-dATP和生物素酰化的dUTP。
寡核苷酸衍生物也可用作标记物。例如，亚乙烯基-dA(etheno-dA)和亚乙烯基-A(etheno-A)是可被掺入核酸探针的已知荧光腺嘌呤核苷酸。同样，亚乙烯基-dC或2-氨基嘌呤脱氧核苷是另一种可用于探针合成的类似物。活瓣特异的核酸酶活性可水解含有这类核苷酸衍生物的探针，释放荧光强得多的单核苷酸。
使用标记探针(例如匙型探针)制备本发明的标记切割结构，其中探针具有结合到靶核酸序列时即发生变化的二级结构。本发明的标记探针可具有本文定义的单个二级结构(包括茎环、发夹、内环、凸环、分支结构和假结)或多个二级结构或、三叶草型结构或任何三维结构。可用于形成本发明的标记切割结构的标记探针还可包含共价结合或非共价结合的亚基(例如本文定义的双分子或多分子探针)。
确定荧光团/猝灭剂对的位置
正如上文描述，本发明在一个实施方式中预见使用荧光团/猝灭剂对进行双重标记的探针。当标记探针被FEN核酸酶(或本文描述的其他核酸酶)切割时，可将荧光团和猝灭剂分隔开，余下的片段会产生荧光。预见到，可特异选择探针上荧光团和猝灭剂的位置，以区分探针的非重叠(侵入)切割和重叠(非侵入)切割。本领域技术人员应理解的是，报道分子的定位尽管已在荧光团/猝灭剂对的语境中进行了描述，但不限于此具体的报道系统。报道分子的位置还可应用于其他的报道系统例如嵌入染料，其中探针特定位点的切割将导致染料信号的猝灭。还可在任何包含相互作用的报道分子的报道系统中使用位置策略，其中分子间的相互作用可被探针非互补部分的切割破坏。这类报道系统为本领域知晓并在本文中进行了描述。
Pfu FEN主要在相对于上游寡核苷酸(例如第二寡核苷酸的释放的活瓣)3′端的单个位置处切割下游探针(例如第三寡核苷酸)的活瓣，其中上游寡核苷酸与靶/模板核酸杂交。与靶杂交的下游探针的核苷酸定义为+1直到+X的核苷酸，其中位置+1定义为下游探针杂交区域的5′末端核苷酸，区域+2定义为紧挨位置+1下游的核苷酸，依此类推。当上游寡核苷酸不与下游核苷酸的杂交区域重叠但却毗邻下游寡核苷酸，使得这两个寡核苷酸的互补部分之间仅有1个核苷酸长的缺口(例如具有单个3′末端非互补核苷酸的上游寡核苷酸与具有5′非互补活瓣的下游寡核苷酸杂交时所生成)，FEN切割下游寡核苷酸位置+1的上游。如果上游寡核苷酸具有与探针杂交区域5′端重叠的单个3′碱基(与靶互补或不互补)，并与靶在该3′碱基位置处杂交，探针的切割则发生在下游寡核苷酸+1位置的下游。
因此，如果一对相互作用的标记物的一个成员例如猝灭剂被连接到探针杂交区域的碱基+1上，且荧光团被连接到5′活瓣的碱基上，那么位置+1下游处的切割将使得猝灭剂和报道基团仍连接在相同的核酸分子上。但是，如果切割发生在探针位置+1的上游，位于碱基+1上的猝灭剂则与位于活瓣上的报道基团分开。因此，如果在位置+1的上游发生切割，上游寡核苷酸不能具有与下游探针杂交区域重叠的区域。因此，重叠结构(例如侵入切割结构)将导致位置+1或+2下游的切割，其中重叠结构中，上游寡核苷酸具有同时与靶互补和与下游探针的互补部分重叠的3′部分。因此位于位置+1的猝灭剂和位于5′活瓣的报道基团没有发生物理分离。重叠(侵入切割)结构引起的切割事件不会被检测到，而非重叠(非侵入)切割结构(例如毗邻上游寡核苷酸和下游寡核苷酸)引起的切割事件是可检测的。因此，猝灭剂分子(例如BHQ)在下游探针的杂交/互补部分的放置允许区分侵入切割和非侵入切割。
因此，本发明的一个实施方式预见猝灭剂(例如BHQ)在下游引物互补区的+1位置处的放置以及荧光团(例如FAM)在肘弯上游处的放置。还预见到，可颠倒荧光团/猝灭剂对的定位，使得猝灭剂位于5′活瓣上，而荧光团则位于下游探针互补区域的位置+1。
因此，本发明预见下游探针的使用，其中下游探针具有位于肘弯上游的荧光基团(例如但不限于FAM基团)和位于位置+1的猝灭剂，以仅从非侵入切割结构产生信号，而不从侵入切割结构产生信号。
在一些实施方式中，具有相互作用的标记物对的选择性放置的引物是抗切割的探针。在该实施方式中，仅当形成非重叠的切割结构时方切割探针。同样，仅当形成和切割非重叠切割结构时方产生可检测信号。
因此，只要上游寡核苷酸没有与下游寡核苷酸互补的重叠区，切割将发生在+1位置或其上游。如果上游寡核苷酸在其3′端含有一个或多个与下游寡核苷酸杂交区域(例如侵入切割结构)重叠的碱基，切割将发生在+1和一对相互作用的标记物的两个成员的下游。
C.切割切割结构和产生信号
可通过本文描述的方法切割本发明的切割结构。
D.释放的标记片段的检测
可通过本领域熟知的各种方法实现标记片段的检测或验证，标记片段的检测或验证可依赖于标记部分或包含标记的切割结构的部分的特点。
V.切割工具
可用于本发明的核酸酶包括具有5′内切核酸活性的酶，例如DNA聚合酶，例如来自大肠杆菌的DNA聚合酶I和来自水生栖热菌(Taq)、嗜热栖热菌(Tth)和黄栖热菌(Tfl)的DNA聚合酶。可用于本发明的核酸酶还包括具有5′-3′外切核酸酶活性的DNA聚合酶，包括但不限于真细菌DNA聚合酶I，包括源自嗜热菌类(Taq，Tfl，Tth，Tea(caldophilus)Tbr(brockianus)的酶，源自杆菌类(Bst，Bca，Magenta(全长聚合酶，非N-截短形式))的酶，源自栖热袍菌属(Tma(maritima)，Tne(neopolitana))的酶和大肠杆菌DNA聚合酶I。术语核酸酶还包括FEN核酸酶。
FEN-1是～40kDa的依赖二价金属离子的外切核酸酶和内切核酸酶，其特异识别5′单链活瓣链，并沿该臂迁移到位于接合处的切割位点，在该接合处，双链体DNA的两条链毗邻活瓣。内切核酸酶活性和外切核酸酶活性对于活瓣或切口最5′位置的碱基均表现出很低的敏感性。FEN-1的内切核酸底物结合和切割和外切核酸底物结合和切割受上游寡核苷酸(活瓣邻近链或引物)刺激。对于大肠杆菌pol I同样也是如此。该酶的内切核酸酶活性不依赖5′活瓣的长度，可切割仅有1个核苷酸长的5′活瓣。内切核酸酶活性和外切核酸酶活性对底物的化学性质不敏感，可切割DNA和RNA。
内切核酸活性和外切核酸活性受生理浓度内的盐浓度抑制。与0mMNaCl相比，50mM NaCl将外切核酸酶活性抑制为原来的1/50。50mM NaCl仅将内切核酸酶活性抑制为原来的1/7。
虽然5′-OH末端是FEN-1装载到5′活瓣底物上的良好底物，但当5′-OH是双链DNA结构中的切口的一部分时，它是极差的底物。末端磷酸的静电排斥可能有利于使得底物转变为假-活瓣构象，从而为FEN-1提供底物的活性形式。这样的解释表明存在单一活性位点和将FEN-1装载到活瓣的5′单链DNA末端或切口的假-活瓣构象的单一机制。与该模型一致的是，观察到切口处的最佳活性需要极低的Mg2+和单价盐浓度，它们将破坏碱基配对的稳定性，并促进切口向活瓣的转变。更高的Mg2+和单价盐浓度不利于转变，并抑制确实需要转变而转化为活瓣的切口结构或缺口结构的切割。稳定活瓣结构的切割最适合在中等Mg2+水平下进行，而且不会随Mg2+浓度升高而减少。这是因为活瓣结构无需解开碱基对以实现其结构；因此它对Mg2+完全不敏感。虽然内切核酸活性随单价盐而降低，但降低程度不如外切核酸活性那么明显。而且，以前已表明单核苷酸活瓣是有效底物。所有这些观察结果与以下事实一致，即当FEN-1用作外切核酸酶时，降解产物的长度从1个核苷酸到几个核苷酸不等。预计切口转变为不同长度的活瓣随局部序列而变化，这取决于G/C含量。总而言之，切口经呼吸形成过渡活瓣意味着FEN-1的外切核酸活性与内切核酸活性相同(Lieber，1997综述，同上)。
FEN-1的外切核酸酶活性和外切核酸酶活性无需辅助蛋白即可切割DNA和RNA。但在复制叉处，FEN-1不与其他蛋白相互作用，包括DNA解旋酶和增殖细胞核抗原(PCNA)、DNA聚合酶δ和ε的持续因子(processivity factor)。PCNA显著刺激FEN-1的内切核酸活性和外切核酸活性。
FEN-1酶的功能与几种更小的噬菌体5′→3′外切核酸酶例如T5 5′外切核酸酶和T4核糖核酸酶H以及更大的真核生物核苷酸切除修复酶例如XPG相关，其中XPG在氧化性碱基损伤的转录偶联修复中也发挥作用。在真细菌例如大肠杆菌和水生栖热菌中，冈崎片段的加工由Pol I 5′→3′外切核酸酶结构域提供。这些细菌和噬菌体酶与FEN-1共享两个具有有限序列同源性的区域，名为N(N-末端)区和I(中间)区，其中残基相似性集中在7个保守的酸性残基周围。根据T4核糖核酸酶H和T5外切核酸酶的晶体结构以及诱变数据，有人认为这些残基结合到影响DNA水解所需的两个Mg2+离子上，但尚不完全清楚每个金属离子在催化循环中发挥的作用，该作用在每种酶中略有不同(Hosfield等人，1998b综述，同上)。
编码可用于本发明的FEN-1酶的FEN-1基因包括鼠fen-1、人fen-1、大鼠fen-1、爪蟾fen-1和源自四种古细菌Archaeglobus fulgidus、詹氏甲烷球菌、强烈炽热球菌和Pyrococcus horikoshii的fen-1。已从人(GenBank检索号：NM_004111和L37374)、小鼠(GenBank检索号：L26320)、大鼠(GenBank检索号：AA819793)、爪蟾(GenBank检索号：U68141和U64563)和强烈炽热球菌(GenBank检索号：AFOl 3497)分离出编码FEN-1酶的cDNA克隆。也已测定P.horikoshii活瓣内切核酸酶的完整核苷酸序列(GenBank检索号：AB005215)。FEN-1家族还包括酿酒酵母RAD27基因(GenBank检索号：Z28113 Y13137)和粟酒裂殖酵母RAD2基因(GenBank检索号：X77041)。Methanobacterium thermautotrophiculum的古细菌基因组也已测序。虽然FEN-1同原核生物和病毒的5′→3′外切核酸酶的序列相似性低，但真核生物界内的FEN-1在氨基酸水平上高度保守，其中人和酿酒酵母的FEN-1蛋白有60％的相同性，78％的相似性。三种古细菌FEN-1蛋白也可与真核FEN-1酶高度同源(Matsui等人，1999.，J.Biol.Chem.，274：18297；Hosfield等人，1998b，J.Biol.Chem.，273：27154和Lieber， 1997，BioEssays.19：233综述)。
人和其他FEN-1家族成员之间两个保守的核酸酶结构域(N-末端即N结构域和中间即I结构域)的序列类似性是92％(鼠)、79％(酿酒酵母)、77％(粟酒裂殖酵母)、72％(A.fulgidus)、76％(詹氏甲烷球菌)和74％(强烈炽热球菌)。
FEN-1特异识别5′单链活瓣链的主干，沿该活瓣臂迁移至位于接合处的切割位点，其中接合处位于双链体DNA和活瓣的两条链之间。如果除去活瓣上游的链(有时称为活瓣邻近链或引物链)，形成的结构称为假-Y。该结构被FEN-1切割，但效率是原来的1/20到1/100。FEN-1不切割3′单链活瓣。但是，作为外切核酸酶的FEN-1将水解含有缺口或切口的双链DNA底物(Hosfield等人，1998a，同上；Hosfield等人，1999b，同上和Lieber 1997，同上)。作为外切核酸酶，FEN-1作用于切口，并以更低效率作用于双链DNA的缺口或5′凹端。对于缺口结构，FEN-1结合和切割的效率随缺口大小增加到多达5个核苷酸时而降低，随后效率稳定在等同于在双链DNA内部5′凹端上的活性的切割水平。平端双链DNA、3′凹端和单链DNA不被切割(Lieber 1997综述，同上)。
已从各种生物包括人(GenBank检索号：NM_004111和L37374)、小鼠(GenBank检索号：L26320)、大鼠(GenBank检索号：AA819793)、酵母(GenBank检索号：Z28113 Y13137和GenBank检索号：X77041)和爪蟾(GenBank检索号：U68141和U64563)分离出可用于本发明的FEN核酸酶。可使用本领域熟知的常规技术克隆和表达这类酶。
本发明的FEN核酸酶优选是热稳定的。已从各种热稳定生物包括四种古细菌分离和鉴定出热稳定FEN核酸酶。已测定了强烈炽热球菌活瓣内切核酸酶的cDNA序列(GenBank检索号：AFO 13497)和氨基酸序列(Hosfield等人，1998a，同上和Hosfield等人，1998b)。测定了P.horikoshii活瓣内切核酸酶的完整核苷酸序列(GenBank检索号：AB005215)和氨基酸序列(Matsui等人，同上)。还测定了詹氏甲烷球菌活瓣内切核酸酶(Hosfield等人，1998b和Matsui等人，1999，同上)和A.fulgidus活瓣内切核酸酶(Hosfield等人，1998b)的氨基酸序列。
可使用本领域熟知技术和Hosfield等人，1998a，同上；Hosfield等人，1998b；Kaiser等人，1999，J.Biol.Chem.，274：21387和Matusi等人，同上和本文名为“克隆Pfu FEN-1”的实施例5描述的技术克隆和过表达热稳定FEN1酶。
可通过包括下列方法的各种方法测量FEN酶的内切核酸酶活性。
A.FEN内切核酸酶活性测定
1.使用模板(例如图6显示)评估本发明的FEN核酸酶活性。
模板1是具有下列序列的5′33P标记的寡核苷酸(Heltest4)：5′AAAATAAATAAAAAAAATACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG 3′。Heltest4的下划线部分代表与M13mp18+互补的区域。切割产物是具有序列AAAATAAATAAAAAAAAT的18核苷酸片段。
Heltest4结合到M13上，产生互补的双链结构域以及非互补的5′突出端。该双链体形成了还用于解旋酶测定的模板2(图6)。模板3(图6)具有结合到M13上的附加引物(FENAS))，并直接毗邻Heltest4。FENAS的序列是5′CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA 3′。在模板3的存在下，FEN结合到Heltest4的游离5′末端，迁移到接头处，切割Heltest4，产生18核苷酸片段。模板1和模板2用作对照，但模板2还可用作模板。
依据下文描述方法制备模板：
               模板1    模板2    模板3
Heltest4       14μl    14μl    14μl
M13            **       14μl    14μl
FENAS          **       **       14μl
H2O            28μl    14μl    **
10x Pfu缓冲液  4.6μl   4.6μl   4.6μl
10x Pfu缓冲液可从Stratagene(Stratagene目录号600153)获得。根据本发明所述方法，稀释10x Pfu缓冲液，使得反应在1x缓冲液中进行。
M13是M13mp18+链，浓度是200ng/μL，33P标记的Heltest4浓度是适宜的0.7ng/μl，FENAS的浓度是4.3ng/μl。基于这些浓度，Heltest4和M13的摩尔量(5x10-14)大致相等，FENAS为约10倍摩尔过量(6x10-13)。
模板混合物在95℃下加热5分钟，冷却至室温，放置45分钟，随后4℃过夜储存。
2μl FEN-1或2μl H2O(对照)与这三种模板按如下比例混合：
3μl模板
0.7μl10x克隆Pfu缓冲液
0.56μl100mM MgCl2
2.00μl酶或H2O
0.74μl H2O
7.00μl总体积
反应在50℃下进行30分钟，向每份样品加入2μl甲酰胺″测序终止″液终止反应。样品在95℃下加热5分钟，上样到6％丙烯酰胺/7M尿素CastAway(Stratagene)凝胶。
或者，可在下列缓冲液中分析FEN活性，其中使用1小时的温育时间。
10x FEN缓冲液
500mM Tris-HCl pH 8.0
100mM MgCl2
下面的反应混合物与2μl FEN或2μl H2O(对照)混合。
3μl模板
0.7μl10x FEN缓冲液
2.00μl酶或H2O
1.3μl H2O
7.00μl总体积
样品在Robocycler 96孔热盖热循环仪中50℃温育1小时。加入2μl测序终止染料溶液后，样品在99℃下加热5分钟。样品上样到11英寸长的手工灌制的20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下运行，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中干燥2小时。凝胶与X射线胶片过夜接触。
2.还可以依据Kaiser等人，同上)的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，反应在含有10mM MOPS，pH 7.5，0.05％Tween 20，0.05％Nonidet P-40，101g/ml tRNA、用于TaqPol和TthPol的200mM KCl或用于其他所有酶的50mM KCI的10μl体积中进行。反应条件可依分析的切割结构而变化。底物(2μM)和各种量的酶与指出的(上文)反应混合物混合，Chill-out(MJ Research)液体石蜡封盖。底物在90℃下加热20秒进行变性，冷却至50℃，随后加入MgCl2或MnCl2启动反应，反应在50℃下温育一段指定长度的时间。加入1011含10mM EDTA和0.02％甲基紫(Sigma)的95％甲酰胺，终止反应。样品在90℃下加热1分钟，随即在含7M尿素的20％丙烯酰胺凝胶(19∶1交联)上电泳，缓冲液为45mM Tris硼酸，pH 8.3，1.4mM EDTA。除非另有说明，每泳道上样1μl的终止的反应液。使用505nm滤镜以FMBIO-100荧光凝胶扫描仪(Hitachi)扫描凝胶。根据未切割底物和切割底物的相应条带强度，以FMBIO分析软件(6.0版，Hitachi)测定切割产物的比例。切割产物的比例不应超过20％，以确保测量结果近似于最初的切割率。切割率定义为切割产物的浓度除以酶浓度和反应时间(分钟)。对于每种酶，使用三个数据点来测定切割率和实验误差。
3.还可以依据Hosfield等人，1998a，同上的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，不同量的FEN和1.54pmol标记切割底物的终体积为13μl，在不同的温度下温育30分钟，随后以等体积的终止液(10mM EDTA，95％去离子甲酰胺和0.008％溴酚蓝和和二甲苯蓝)终止反应。样品以变性的15％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，使用IPLabGel系统(Stratagene)，运行MacBAS图像分析软件，定量起始材料和产物的相对量。多数反应在标准的测定缓冲液(10mM Tris-HCl(pH 8.0)，10mM MgCl2和50μg/ml牛血清白蛋白)中进行，但在一系列实验中改变标准缓冲液，研究不同二价金属和pH值的效应。对于二价金属，弃用MgCl2，使用终浓度为10mM的不同金属离子。为了研究pH的影响，使用终浓度为10mM的含有不同量的Tris-HCl、甘氨酸和乙酸钠的缓冲液，以得到25℃下宽泛的pH值范围。
4.还可以依据Matusi等人，1999，同上的方法测量FEN内切核酸酶活性。简而言之，酶反应在含有50mM Tris-HCl(pH 7.4)，1.5mM MgCl2，0.5mM β-巯基乙醇，100μg/ml牛血清白蛋白和0.6pmol标记切割结构的15μl反应混合物中进行。60℃温育30分钟后，加入含有10mM EDTA和1mg/ml溴酚蓝的15μl 95％甲酰胺终止反应。样品在95℃下加热10分钟，随后上样到含有7M尿素和10x TBE(89mM Tris-HCl，89mM硼酸，2mM EDTA(pH 8.0))的15％聚丙烯酰胺凝胶(35cmx42.5cm)，随后以2000V电泳2小时。使用Phosphorlmager(Bio-Rad)显示和定量反应产物。大小标准参照物即寡核苷酸以[γ-32P]ATP和T4多核苷酸激酶标记5′端。
为了测定最佳pH，在含有1.5mM MgCl2，0.5mM β-巯基乙醇，100μg/ml牛血清白蛋白和0.6pmol 5′端标记的切割结构的测定混合物(15μl)和下列其中一种50mM缓冲液中进行反应，60℃下反应30分钟。使用3种不同的50mM缓冲液，以得到如下的宽泛pH范围：乙酸钠缓冲液(pH4.0-5.5)、磷酸缓冲液(pH 5.5-8.0)和硼酸缓冲液(pH 8.0-9.4)。
B.FEN外切核酸酶活性测定
可用Matsui等人，1999，同上描述和上文总结的测量FEN-1内切核酸酶活性的方法来测量本发明的FEN核酸酶的外切核酸酶活性。
或者，可用Hosfield等人，1998b，同上描述的方法分析FEN酶的外切核酸酶活性。简而言之，使用带有切口的FEN底物在与内切核酸酶测定相同的条件下(上文描述)检测外切核酸酶活性。
可使用Klenow片段的3′-5′外切核酸酶活性通过5′32P-标记的模板链的部分消化，得到外切核酸酶实验和内切核酸酶实验中DNA切割的精确位置。
名为“切割结构”的段落描述了本发明的切割结构。
VI.测定探针二级结构的稳定性
A.解链温度测定
解链温度测定利用了双链DNA和单链DNA的不同吸收性质，即双链DNA(所谓双链DNA是指自身折叠形成反向平行双链体结构的一段核酸序列，其中互补序列(碱基对)以氢键相连)比单链DNA在260nm波长处吸收要少，由分光光度法测定260nm波长处的吸收。
DNA的变性发生在狭窄的温度范围内，导致DNA许多物理性质的显著变化。一种特别有用的变化是光密度。核苷酸的杂环在紫外线范围强烈吸收(最大吸收波长接近每个碱基特征性的260nm)。但是，DNA的吸收比相同组成的游离寡核苷酸混合物低了约40％。这一效应称为增色性，它源自碱基电子系统的相互作用，它们在双螺旋状的平行排列中的堆积可能引起这种相互作用。任何偏离双链体状态的变化立即反映在该效应的下降(即光密度朝游离碱基的特征值方向升高)(图2a)。因此可通过增色性跟踪双链DNA的变性(图2b和2c)。
DNA链发生分离的温度范围中点被称为解链温度，以Tm表示。图2c显示了由吸光度变化测定的解链曲线的实例。该曲线总是采取相同的形式，但其在温标上的绝对位置(即其Tm)同时受DNA碱基组成和使用的变性条件的影响。
DNA分子的解链温度明显取决于其碱基组成。富含GC碱基对的DNA分子的Tm比富含AT碱基对的DNA分子高(图2b)。许多物种DNA的Tm随GC含量呈线性变化，随GC碱基对的比例从20％升高至78％，Tm也随之从77℃升高至100℃。即Tm对碱基组成的依赖性是线性的，G-C含量每增加1％，Tm增加约0.4℃。GC碱基对比AT碱基对更加稳定，因为它们的碱基对由三个氢键连接在一起，而不是两个。此外，相邻GC碱基对之间的相互作用比相邻AT碱基对更强。因此，DNA富含AT的区域首先解链。
一种对Tm的主要效应是由溶液离子强度施加的。单价阳离子浓度每增加10倍，Tm增加16.6℃。最常使用的条件是在提供0.18M单价Na+浓度和90℃左右Tm的0.12M磷酸缓冲液中进行DNA操作。
在破坏氢键稳定性的试剂例如甲酰胺的存在下进行反应，可极大地改变Tm。这可使Tm低至40℃，优点是DNA不会发生暴露于高温所产生的损伤(例如链断裂)(Stryer，Biochemistry，1998，3rd Edition，W.H.Freeman andCo.，81-82页和Lewin，Genes II，1985，John Wiley&Sons，63-64页)。
按如下的解链温度测定方法测定本发明的探针二级结构的稳定性。
在足以允许探针变性和重退火的各种温度和时间下和在允许探针变性和重退火的缓冲液中温育含有约0.2μg/ml到100μg/ml探针的样品，在分光光度计中测量石英比色杯(具有适合于使用的分光光度计的光程长度，例如1cm)中样品在温度范围下的吸光度，其中温度范围的下限温度至少比探针的Tm或预测Tm低50℃，而温度范围的上限温度至少比探针的Tm或预测Tm高50℃，制备探针的标准曲线(例如图2c)，其中以吸光度对温度作图。根据本领域熟知的方法(参看Sambrook，同上；Ausubel，同上)，基于碱基对组成预测探针的Tm。使用各种缓冲液(例如1X TNE缓冲液(10X-0.1M Tris碱，10mM EDTA，2.0M NaCl，pH 7.4)、本文描述的FEN核酸酶缓冲液、本文描述的1X克隆Pfu缓冲液、本文描述的1X Sentinel分子信标缓冲液)，其中含有可能适合和优选最适合用于切割反应的特定核酸酶的缓冲液，生成和比较标准曲线。随温度升高监测缓冲液的pH，按需要进行调整。
在单光束紫外线到可见光范围(UV-VIS)的分光光度计中进行该测定。优选情况下，通过自动比较含有样品溶液的比色杯和含有空白的参照比色杯(匹配比色杯)，在双光束分光光度计中进行测定以简化测量。空白是等体积的样品缓冲液。
可控制分光光度计的温度，以便在特定的温度下测量样品的吸光度。可用于本发明的分光光度计包括但不限于结合使用MicroTm AnalysisAccessory(Beckman Coulter，Inc.，Columbia，MD)的Beckman
Figure G2007800500405D00711
600/7000分光光度计。
探针二级结构在特定温度和缓冲液中的稳定性可通过测量探针在上述特定温度下的吸光度和测定吸光值是否低于由标准曲线所测定的Tm时的吸光值来测定，其中使用与检测温度时使用的相同缓冲液或上述已知可产生类似标准曲线的缓冲液生成该标准曲线，其中缓冲液可能适合和优选最适合用于探针切割反应的核酸酶。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下吸光度水平低于(即至少5％，优选20％，最优选25％或更多)相当于探针Tm的温度时的吸光度水平，探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的解链温度测定中是“稳定的”(参看图2c和2d)。
B.FRET
FRET测定可用于本发明的两个用途。第一是测定本文定义的探针二级结构是否“稳定”。第二是测定探针结合到靶核酸时探针的二级结构是否发生“变化”或探针是否已被切割工具切割。
“FRET”是两个染料分子电子激发态之间距离依赖型的相互作用，其中激发从一个供体分子转移到一个受体分子。FRET是由分隔一个荧光供体基团和一个相互作用的共振能量受体(或是另一个荧光团、发色团或猝灭剂)的距离的变化引起的。供体部分和受体部分的组合被称为“FRET对”。有效的FRET相互作用需要染料对的吸收光谱和发射光谱具有高度的重叠性。
在大多数实施方式中，FRET的供体染料和受体染料是不同的，其中可通过受体敏化荧光的出现和/或通过供体荧光的猝灭来检测FRET。当供体和受体相同时，通过形成的荧光偏振检测FRET。FRET依赖于分子间距离的负6次方(Stryer等人，1978，Ann.Rev.Biochem.，47：819；Selvin，1995，Methods Enzvmol..246：300).。
本文中所用的术语“供体”系指在第一波长处吸收并在第二更长波长处发射的荧光团。术语“受体”系指具有与供体发射光谱重叠的吸收光谱的荧光团、发色团或猝灭剂，当位于供体基团附近时(一般1-100nm之间)，它们可吸收来自供体的部分或大部分发射能量。如果受体是可表现出FRET的荧光团，那么它在第三更长波长处再次发射；如果它是发色团或猝灭剂，那么它将释放吸收自供体的能量，而不发射光子。虽然受体基团与供体基团邻近时受体的吸收光谱与供体的发射光谱重叠，但对于溶液中游离分子的光谱而言，无需这样。因此受体包括表现出FRET或猝灭的荧光团、发色团或猝灭剂，其中当受体位于本发明的探针上的供体附近时，由于探针结合本文定义的靶核酸而发生变化的探针二级结构的存在，受体发生猝灭。受体不包括在a)等于或高于Tm的温度(例如比Tm高5℃，例如6℃、10℃、25℃、50℃或更多)下或在b)靶核酸存在时表现出FRET或猝灭的荧光团、发色团或猝灭剂。
本文提及的“荧光”或“荧光基团”或“荧光团”分别包括发光和发光基团和适宜的发色团。适宜的发光探针包括但不限于以lanthium螯合物加入的铕和铽的发光离子(Heyduk和Heyduk，1997)。镧系元素离子也是将能量转移给荧光基团的良好供体(Selvin，1995)。可使用“开笼”螯合物亚磷酰胺将含有镧系元素离子的发光离子掺入核酸。
本文中所用的术语“猝灭”系指能量从供体转移到受体，其中伴有供体所显示的荧光强度降低。
供体和受体基团可独立地选自适宜的荧光基团、发色团和猝灭基团。可用于本发明的供体和受体包括但不限于：5-FAM(也称为5-羧基荧光素；也称为Spiro(异苯并呋喃-1(3H)，9′-(9H)占吨)-5-羧酸，3′，6′-二羟基-3-氧代-6-羧基荧光素)；5-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰-荧光素基)-6-羧酸])；6-六氯-荧光素([4，7，2′，4′，5′，7′-六氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；5-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-5-羧酸])；6-四氯-荧光素([4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-二叔戊酰荧光素基)-6-羧酸])；5-TAMRA(5-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，4-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基-氨基))；6-TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明；占吨鎓，9-(2，5-二羧基苯基)-3，6-双(二甲基氨基))；EDANS(5-((2-氨乙基)氨基)萘-1-磺酸)；1，5-IAEDANS(5-((((2-碘乙酰基)氨基)乙基)氨基)萘-1-磺酸)；DABCYL(4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮基)苯甲酸)Cy5(吲哚二碳菁-5)Cy3(吲哚二碳菁-3)；BODIPY FL(2，6-二溴-4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼-3a，4a-二氮杂-二环戊二烯并苯-3-丙酸)，以及它们的适宜衍生物。
在本发明的某些实施方式中，还可用两个发色团标记探针，标记物对的吸收光谱变化用作检测信号，以作为测量荧光变化的替代选择。
在本发明所述方法中，以本领域知晓的方法，采用荧光分光光度计或酶标仪在一个或多个波长处测量探针的荧光强度。
C.荧光猝灭测定
荧光猝灭测定可用于本发明的两个用途。第一是测定本文定义的探针二级结构是否“稳定”。第二是测定探针结合靶核酸时探针的二级结构是否发生“变化”。
本发明的探针以一对相互作用的标记物(例如FRET对或非FRET对)标记，其中这对标记物的一个成员是荧光团，这对标记物的另一个成员是猝灭剂。例如，本发明的探针以荧光团和猝灭剂标记，在没有靶核酸的情况下和在温度范围内测量荧光，其中该温度范围的下限温度比探针Tm或预测Tm至少低50℃，该温度范围的上限温度至少比探针Tm或预测Tm至少高50℃。
D.稳定性
按下文方法测定本发明的探针的二级结构的“稳定性”。采用本领域熟知的方法(例如Glazer和Mathies，1997，Curr.Opin.Biotechnol..8：94；Ju等人，1995，Analytical Biochemistry，231：131)描述)，以本文描述的一对相互作用的标记物(FRET对或非FRET对)标记探针。这对相互作用的标记物在探针的位置可使得探针结合到靶核酸后探针的二级结构发生变化时，标记物被分隔开。
将含有配于1X解链缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM MgCl2)或配于5mM Tris-HCl，pH 8.0，0.1mM EDTA或配于其他适宜缓冲液中一般为125nM探针的样品温育一段足以允许探针变性和重退火的时间，制备探针的标准曲线(例如图2e)，其中以荧光对温度进行作图(一般情况下使用每分钟发生1℃变化的荧光计或分光光度计在温度范围内测量荧光计的荧光或扫描荧光分光光度计，生成标准曲线，其中该温度范围的下限温度比探针Tm或预测Tm至少低50℃，而该温度范围的上限温度比探针Tm或预测Tm至少高50℃)。根据本领域熟知的方法(参看Sambrook，同上；Ausubel，同上)，基于碱基对组成预测探针的Tm。
使用各种缓冲液(例如1X TNE缓冲液(10X-0.1M Tris碱，10mM EDTA，2.0M NaCl，pH 7.4)、本文描述的FEN核酸酶缓冲液、本文描述的1X克隆Pfu缓冲液)，其中含有可能适合和优选最适合用于切割反应的特定核酸酶的缓冲液，生成和比较标准曲线。随温度升高监测缓冲液的pH，按需要进行调整。
可控制荧光计或分光光度计的温度，以便在特定的温度下测量样品的荧光。例如可使用结合可调温的水浴器(例如可从Fisher Scientific获得)的Perkin-Elmer LS50B发光分光光度计，测量荧光。
探针二级结构在特定温度下的稳定性可通过测量探针在上述特定温度下的荧光和测定荧光值是否低于标准曲线所测定的Tm处的荧光值来测定。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下荧光水平发生变化(即相对于探针Tm的温度时的荧光水平至少多于或少于5％，优选20％，最优选25％)，探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的FRET测定中是“稳定的”。如果在切割反应温度(即发生切割的温度)下或在低于切割反应温度的温度下荧光水平发生变化(即相对于探针Tm的温度时的荧光水平至少多于或少于5％，优选20％，最优选25％)，探针的二级结构在切割反应温度下或低于切割反应温度的温度下的荧光猝灭测定中是“稳定的”。
或者，可修改Gelfand等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：6113)的方法，测定以一对相互作用的标记物标记的探针在上文描述的温度范围内的荧光，从而测定探针二级结构的稳定性，其中该文献通过引用纳入本文。
VII.检测二级结构
如上所述(参看图2e)，可针对FRET测定中包含一对相互作用的标记物的探针，生成荧光与温度的标准曲线，检测本发明的二级结构。表现出与温度变化呈相关性的荧光变化的探针(参看图2e)(例如荧光随FRET反应温度的升高而升高)可形成二级结构。
VIII.测量二级结构的变化
可在FRET测定或荧光猝灭测定中和上述低于探针Tm的特定温度下(例如切割温度)，以及100mM到10μM靶核酸序列(一般靶核酸序列比探针浓度过量2-4摩尔，即使用250-500nm的靶核酸序列)存在或不存在的情况下，分析包含一对相互作用的标记物的探针，可检测本发明的二级结构的“变化”。
或者，可修改Gelfand等人(1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96：6113)的方法，测定以一对相互作用标记物标记的探针在上文描述的靶核酸存在或不存在的情况下的荧光，从而测定探针二级结构的稳定性，其中该文献通过引用纳入本文。
本发明的探针结合到靶核酸并被非侵入切割反应切割时所发生的二级结构“变化”以荧光的增加来衡量，使得探针在低于探针Tm的温度下结合到靶核酸和发生切割后，荧光水平高于(例如至少5％，优选5-20％，更优选25％或更多)靶核酸序列不存在时的荧光水平(参看图2g)。
IX.样品
本发明提供了一种检测或测量本文定义的样品中靶核酸序列的方法。本文中所用的“样品”系指任何含有或推测含有目的核酸(靶核酸序列)的物质，或含有或推测含有目的靶核酸序列而本身即是靶核酸序列的任何物质。因此术语“样品”包括靶核酸序列(基因组DNA、cDNA或RNA)、细胞、生物、组织或包括但不限于例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿液、泪液、粪便、皮肤外分泌物、呼吸道外分泌物、肠道外分泌物、泌尿生殖道外分泌物、唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织的体液或物质的样品，以及体外细胞培养成分、自然分离物(例如饮用水、海水、固体材料)、微生物标本和用核酸示踪分子“标记”的物体或标本的样品。
实施例
下列非限制性实施例阐述了本发明，其中使用了下列物质和方法。此后引用的每篇参考文献的全部公开内容均通过引用纳入本文。
实施例1：克隆Pfu FEN-1
可依据下列方法制备可用于本发明的热稳定FEN核酸酶。
可依据本领域熟知的PCR克隆方法从源于强烈炽热球菌(P.furiosus)(ATCC#43587)的基因组DNA分离热稳定FEN核酸酶。可依据本领域熟知方法和下文描述方法在细菌细胞内过表达克隆的Pfu FEN-1。
合成和纯化下列pCAL-n-EK克隆寡核苷酸：
a.
5’GACGACGACAAGATGGGTGTCCCAATTGGTGAGATTATACCAAGAAAAG3’，和
b.
5’GGAACAAGACCCGTTTATCTCTTGAACCAACTTTCAAGGGTTGATTGTTTTCCACT 3’
从Stratagene获得亲和力蛋白表达和纯化系统，并按照生产商的方案 进行使用。
扩增
采用基因特异引物(上文描述的寡核苷酸a和b)经PCR扩增制备插入DNA，其中引物在其5′端含有与pCAL-n-EK载体单链尾互补的12-核苷酸序列和13-核苷酸序列，因而允许定向克隆。通过制备含有下列组分的扩增反应(5个独立的100μl反应)，从源自强烈炽热球菌的基因组DNA扩增FEN-1序列：
50μl  10x cPfu缓冲液(Stratagene)
7.5μl Pfu基因组DNA(约100ng/μl)
7.5μl PfuTurbo(2.5u/μl)，(Stratagene，目录号600250)
15μl  混合引物对(每个100ng/μl)(上文描述的寡核苷酸a和b)
4μl   100mM dNTP
416μl H2O
500μl 总体积
并使用Stratagene Robocycler 96孔热盖热循环仪在下列条件下进行扩增：
Window  195℃  1分钟  1个循环
Window  295℃  1分钟
        50℃   1分钟  30个循环
        72℃   3分钟
来自5个反应的PCR产物合并为1管，使用StrataPrep PCR进行纯化，洗脱在50μl的1mM Tris-HCl pH 8.6中。FEN-1PCR产物在凝胶上分析，测定其具有约1000bp。
通过生成不依赖连接的克隆末端(LIC)，将包含fen-1基因的PCR产物退火到pC ALnEK LIC载体(Stratagene)上，依据下列方法以退火混合物转化细胞，从而将包含fen-1基因的PCR产物克隆到pC ALnEK LIC载体(Stratagene)上。简而言之，PCR扩增后，纯化PCR产物，在dATP(根据手册，dATP包括在亲和力
Figure G2007800500405D00781
蛋白表达和纯化系统内，Stratagene，目录号204301)的存在下以Pfu DNA聚合酶处理PCR产物。在没有dTTP、dGTP和dCTP的情况下，Pfu DNA聚合酶的3′到5′外切核酸酶活性分别除去PCR产物3′端的至少12个核苷酸和13个核苷酸。该活性继续发挥作用，直到遇到第1个腺嘌呤，产生具有与pCAL-n-EK载体单链尾互补的5′-延伸单链尾的DNA片段。
生成LIC末端
制备下列混合物，生成LIC末端：
45μl 纯化的PCR产物(～0.5μg/μl)
2.5μl 10mM dATP
5μl 10x cPfu缓冲液
1μl cPfu(2.5u/μl)
0.5μl H2O
cPfu和cPfu缓冲液可从Stratagene(cPfu和cPfu缓冲液，Stratagene目录号600153)得到。
样品在72℃下温育20分钟，产物冷却至室温。向每份样品加入40ng制备的pCALnEK LIC载体(可从Stratagene商购获得亲和力LIC克隆和蛋白表达试剂盒(214405)中的制备载体的)。合并载体和插入DNA，室温退火，随后转化高度感受态的细菌宿主细胞(Wyborski等人，1997，Strategies.10：1)。
制备用于产生FEN的细胞
过夜培养的20ml FEN-1克隆(克隆3)接种到2升的LB-AMP上。生长约11小时，此时细胞的OD600达到0.974。细胞以1mM IPTG过夜诱导(约12小时)。离心收集细胞，形成的细胞糊状物-20℃保存。
标记FEN-1的纯化
细胞重悬浮于20ml的钙结合缓冲液
CaCl 2 结合缓冲液
50mM Tris-HCl(pH 8.0)
150mM NaCl
1.0mM MgOAc
2mM CaCl2
采用Branson超声波仪以微探头(microtip)超声破碎样品.输出设置为5，工作周期(duty cycle)为90％。超声破碎样品3次，操作间隙样品置于冰上。超声破碎物以26,890xg离心。澄清上清与1ml的洗涤(配于CaCl2结合缓冲液中)钙调蛋白琼脂糖(CAM琼脂糖)在50ml的锥形管内混合，室温(40℃)下在缓慢旋转的轮上温育5小时。慢速离心(台式离心机，5000rpm)收集CAM琼脂糖。
除去上清后，CAM琼脂糖以50ml CaCl2结合缓冲液洗涤，转移到一次性的滴加柱(drip column)上。原容器和移液管彻底漂洗，除去残余的琼脂糖。柱以约200ml的CaCl2结合缓冲液漂洗。
采用10ml 50mM NaCl洗脱缓冲液(50mM NaCl，50mM Tris-HCl pH8.0，2mM EGTA)进行洗脱。收集0.5ml的组分。采用1M NaCl洗脱缓冲液进行第二次洗脱步骤，其中收集0.5ml的组分。
纯化的标记FEN-1的评估
含有洗脱到1M NaCl中CBP标记的Pfu FEN-1组分以SDS煮沸，并以SDS-PAGE在染有Sypro Orange的4-20％凝胶上分析(图3)。
未切割的FEN-1的蛋白浓度测得为大约150ng/微升(下文)。
纯化FEN-1的肠激酶蛋白酶(EK)切割
组分3-9以50mM NaCl，50mM Tris-HCl pH 8.0和2mM CaCl2在4℃下过夜透析。
透析的FEN-1中出现不透光的极细沉淀物。稀释样品时，除去1/20的沉淀物。稀释样品时，仍可检测到1/3的不溶物。1/3的稀释物在37℃下加热2分钟，随后与Tween 20混合，终浓度为0.1％。加入Tween 20后，溶液中几乎立刻形成“丝”和更粗糙的固体物，即使溶液调节为1M NaCl，也无法逆转这种现象。
使用1/20稀释的样品以及以1x EK缓冲液漂洗透析袋而制备的稀释样品作为底物，进行EK切割。加入1μl EK(1u/μl)，室温过夜进行EK切割(约16小时)。
合并100μl CAM琼脂糖的100μl STI琼脂糖以10ml 1xSTI缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.0，200mM NaCl，2mM CaCl2，0.1％Tween 20)漂洗两次。NaCl加入到两份EK样品中，使得终浓度为200mM NaCl。合并两份样品，加入到漂洗的琼脂糖。40℃下，样品在轮上缓慢旋转3小时，随后以台式离心机(上述)经慢速离心分离。除去上清，树脂以500μl 1xSTI漂洗两次。合并两次漂洗液，与原上清分开保存。样品在4-20％凝胶上以SDS-PAGE进行分析。
与浓度约为50ng/ml的Pfu标准相比，消化产物的浓度约为23ng/μl。
实施例2：FEN核酸酶活性
可依据名为“FEN核酸酶”的段落或下文描述的方法测定FEN核酸酶的内切核酸酶活性和实施例1制备的FEN核酸酶的切割结构要求。
简而言之，使用3个模板(图6)评估本发明的FEN核酸酶活性。模板1是具有下列序列的5′33P标记寡核苷酸(Heltest4)：
5′AAAATAAATAAAAAAAATACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCG3′。
Heltest4的下划线部分代表与M13mp18+互补的区域。切割产物是具有序列AAAATAAATAAAAAAAAT的18核苷酸片段。Heltest4结合到M13上，产生互补的双链结构域以及非互补的5′突出端。该双链体形成模板2(图6)。模板3(图6)具有结合到M13上的附加引物(FENAS)，其直接毗邻Heltest4。FENAS的序列是：5′CCATTCGCCATTCAGGCTGCGCA 3′。
在模板3的存在下，FEN核酸酶结合到Heltest4的游离5′末端，迁移到接头处，切割Heltest4，产生18核苷酸片段。形成的切割产物在6％丙烯酰胺/7M尿素测序凝胶上进行分离。
按如下方法制备模板：
            模板1    模板2    模板3
Heltest4    14μl    14μl    14μl
M13         **       14μl    14μl
FENAS       **       **       14μl
H2O           28μl    14μl    **
10x Pfu缓冲液 4.6μl   4.6μl   4.6μl
Pfu缓冲液可从Stratagene(目录号600153)得到。
模板混合物在95℃下加热5分钟，冷却至室温，放置45分钟，随后4℃过夜保存。
酶样品如下：
A.H2O(对照)
B.2μl未稀释未切割的FEN-I(～445ng/μl)
C.2μl未切割FEN-I(～44.5ng/μl)的1/10稀释液
D.2μl肠激酶蛋白酶(EK)切割的FEN-I(～23ng/μl)
四种反应混合物与下列三种模板混合：
3μl模板1、模板2模板3
0.7μl 10x克隆Pfu缓冲液
0.6μl 100mM MgCl2
2.00μl FEN-I或H2O
0.7μl H2O
7.00μl总体积
反应在50℃下进行30分钟，随后向每份样品加入2μl甲酰胺″测序终止″液终止反应。样品在95℃下加热5分钟，上样到6％丙烯酰胺/7M尿素Cast Away凝胶(Stratagene)。
或者，可在下列缓冲液中分析FEN核酸酶活性，其中使用1小时的温育时间。
10x FEN核酸酶缓冲液
500mM Tris-HCl pH 8.0
100mM MgCl2
反应混合物如下：
3μl模板1、模板2或模板3
0.7μl 10x FEN核酸酶缓冲液
2.00μl FEN-1或H2O(A-D，同上)
1.3μl H2O
7.00μl总体积
样品在Robocyler 96孔热盖热循环仪中50℃下温育1小时。加入2μl测序终止(95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝、0.05％二甲苯蓝，均可从Stratagene获得)染料溶液后，样品在99℃下加热5分钟。样品上样到11英寸长的手浇20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺/7M尿素凝胶上。凝胶在20瓦特下运行，直至溴酚蓝迁移约2/3的总距离。从玻璃板上取出凝胶，凝胶在固定液(15％甲醇，5％乙酸)中浸泡10分钟，随后在水中浸泡10分钟。凝胶放置在Whatmann 3mm滤纸上，塑料膜覆盖，在加热的真空凝胶干燥器中干燥2小时(～80C)。凝胶与X射线胶片过夜接触。
图4显示了FEN-1核酸酶测定的放射自显影，其中加入下列组分切割模板1、2和3(按上文描述方法制备)：
A.H2O
B.2μl CBP-标记的Pfu FEN-1
C.2μl CBP-标记的Pfu FEN-1，已稀释(1∶10)
D.2μl EK切割的Pfu FEN-1
泳道如下：泳道1A、1B、1C和1D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板1。泳道2A、2B、2C和2D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板1。泳道3A、3B、3C和3D分别代表以H2O、未稀释的CBP-标记Pfu FEN-1、1∶10稀释的CBP-标记Pfu FEN-1和EK切割的Pfu FEN-1切割的模板3。
标记的Pfu FEN-1含有N-末端CBP亲和力纯化标记。标记FEN-1和未标记FEN-1活性的任何差异是由于蛋白浓度(上文提供了酶样品的浓度)的差异，因为标记FEN-1与未标记FEN-1的量不相等。标记的Pfu FEN-1和未标记的Pfu FEN-1均表现出切割活性。
图4显示了在没有FEN-1的情况下切割的背景水平(泳道1A、2A和3A)。而且，该图显示，相比于模板1，标记的Pfu FEN-1切割了更多的模板2。具体而言，在未稀释、标记Pfu FEN-1的存在下切割了最多的模板2(泳道2B)。模板3的分析显示，未稀释、标记的Pfu FEN-1切割了最多的模板3，而稀释的标记Pfu FEN-1切割了最少的模板3。标记探针以40-43的核苷酸条带迁移。与模板2相比，FEN-1优选切割模板3(其含有上游引物)。切割产物条带是以16-20核苷酸迁移的主要条带。标记的切割产物的不均一性是标记底物的不均一性引起的，标记底物使用前没有经凝胶纯化。
实施例3：采用仅当非侵入切割反应发生切割时方产生可检测信号的本发明寡核苷酸进行实时定量PCR检测
按照下列方法检测和/或测量靶核酸序列：
制备含有图1所示的寡核苷酸的反应。这些寡核苷酸包括：具有3′非互补核苷酸的第一寡核苷酸(图1A的A-1)、上游引物(图1A的A-2)、第二寡核苷酸(图1A的F-C)、靶核酸(图1A的A′C′)、模板核酸(图1B的F′H′)和第三寡核苷酸(图1B的F2H)。封闭第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的3′端。设计第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，使得它们与靶杂交时，第一寡核苷酸的互补部分与第二寡核苷酸的互补部分被1个核苷酸长的缺口分隔开(图1A)。同样，释放的活瓣和第三寡核苷酸也是如此设计，使得它们退火到模板上时它们的互补部分形成缺口(2个核苷酸长的缺口；图B)。而且，为了促进非侵入切割反应，抑制引物延伸，设计第一寡核苷酸和释放的活瓣，使其各自具有3′末端非互补核苷酸。
第三寡核苷酸被偶联到一对相互作用的标记物，当该寡核苷酸在肘弯处被切割时，这对标记物会产生可检测信号。这种情况仅在切割反应是非侵入性时才会发生。将FAM定位于第三寡核苷酸的5′活瓣和将BHQ2定位于第三寡核苷酸的+1核苷酸，实现对第三寡核苷酸的标记。因此，如果第一切割反应是非侵入性的，释放的活瓣会与模板核酸杂交，使得2个核苷酸长的缺口将3′末端互补核苷酸与第三寡核苷酸的互补部分分隔开。这将导致第三寡核苷酸在肘弯处的切割，因而允许分离标记物。但是，如果第一切割反应时侵入性的，释放的活瓣将与模板核酸杂交，使得一个或多个附加核苷酸被包含在释放的活瓣的3′端。这将导致第二切割反应在这对相互作用的标记物的下游切割，标记物不会分离，因此没有信号产生。
反应条件如下：
初级系统组分：
10到1X106拷贝的靶
300nM A-2寡核苷酸
500nmA-1寡核苷酸
200nm反向引物
200nm第二寡核苷酸
次级系统组分：
600nm模板核酸(参看图1)
200nm第三寡核苷酸(参看图1)
1X探针缓冲液(15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO)+(NTPs)
1.25U Pfu V93R exo(-)聚合酶
200ng FEN-1内切核酸酶
反应混合物置于热循环仪中，在下列条件下循环：
(1)95℃，2分钟，1循环
(2)95℃，10秒
(3)60℃，30秒
步骤(1)和(2)重复50个循环。
每个循环的60℃步骤结束时采集荧光数据。结果以图形方式呈现在图7中。结果表明，本方法可有效检测和测量样品中靶核酸的量。
实施例4：采用仅当非侵入切割反应发生切割时方产生可检测信号的单个切割反应进行实时定量PCR检测
本领域普通技术人员会理解，可在非序列反应中进行上述反应。如果反应以非序列方式进行，系统可包括：
系统组分：
10到1X106拷贝的靶
300nMA-2寡核苷酸
500nmA-1寡核苷酸
200nm反向引物
200nm第二寡核苷酸(标记)
1X探针缓冲液(15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO)(+NTPs)
1.25U Pfu V93R exo(-)聚合酶
200ng FEN-1内切核酸酶
反应混合物随后置于热循环仪中，在下列条件下循环：
(1)95℃，2分钟，1循环
(2)95℃，10秒
(3)60℃，30秒
步骤(1)和(2)重复50个循环。可在每个循环的60℃步骤结束时采集荧光数据。
在该反应中，第二寡核苷酸被上文描述的一对相互作用的标记物标记，以进行第三寡核苷酸的依次切割反应。
实施例5：引物/上游(第一)寡核苷酸比例的优化
以下列方法检测和/或测量靶核酸序列，以测定引物与上游寡核苷酸的最佳比例：
制备含有图8所示的寡核苷酸的反应。这些寡核苷酸包括第一寡核苷酸(图8A的A-1)、上游引物(图8A的A-2)、反向引物(图8A的R)、第二寡核苷酸(图8A的F-C)、靶核酸(图8A的A′C′)、模板核酸(图8B的F5H′)和第三寡核苷酸(图8B的F2H)。封闭第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的3′端。第三寡核苷酸含有一对相互作用的标记物，当这对标记物被分隔开时，例如第三寡核苷酸肘弯处发生切割时，这对标记物会产生可检测信号。FAM被偶联到第三寡核苷酸的5′活瓣，而BHQ2被偶联到第三寡核苷酸的+1核苷酸。
靶的浓度和引物/上游寡核苷酸的比例在反应混合物中变化。反应条件如下：
初级系统组分：
2.5到2.5X105拷贝的靶
400nm不同的引物混合物：
正向引物(A-2)：上游寡核苷酸(0∶100)
正向引物(A-2)：上游寡核苷酸(10∶90)
正向引物(A-2)：上游寡核苷酸(25∶75)
200nm反向引物
200nm下游寡核苷酸
次级系统组分：
50nm模板核酸
200nm第三寡核苷酸
1X探针缓冲液(15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO)(+dNTP)
1.25U Pfu V93R exo(-)聚合酶
100ng FEN-1内切核酸酶
反应混合物置于热循环仪中，在下列条件下循环：
(1)95℃，2分钟，1循环
(2)95℃，1秒
(3)60℃，18秒
步骤(1)和(2)重复55个循环。
每个循环的60℃步骤结束时采集荧光数据。结果以图形方式呈现在图9中。结果表明，最佳的引物/上游寡核苷酸比例是10∶90。
实施例6：上游寡核苷酸和下游探针在靶上位置的优化
为了优化第三寡核苷酸切割产生的信号，改变上游寡核苷酸相对于下游(第三)寡核苷酸在靶上的位置，进行反应。第三寡核苷酸具有偶联到下游寡核苷酸-3位置的FAM标记物和偶联到+1的BHQ2(参看图8B)。
本实施例使用了图8B所示的寡核苷酸。所述寡核苷酸包括上游寡核苷酸(图8的F)、模板核酸(图8的F5H′)和第三寡核苷酸(探针)(图8的FH)。上游寡核苷酸的长度长短不一，包括下列寡核苷酸；图8b所示的上游寡核苷酸、具有1个附加3′核苷酸的上游寡核苷酸、具有2个附加3′核苷酸的上游寡核苷酸或具有3个附加3′核苷酸的上游寡核苷酸(2nt重叠)。反应条件如下：
200nm模板核酸
200nm第三寡核苷酸
200nm上游寡核苷酸(具有0-3个附加3′核苷酸)
1X探针缓冲液(15mM Tris-HCL(pH8)，50mM KCL，5.5mM MgCl2，8％甘油，1％DMSO)(+dNTP)
+/-1.25U Pfu V93R exo(-)聚合酶
100ng FEN-1内切核酸酶
反应混合物置于热循环仪中，在下列条件下循环：
(1)95℃，2分钟，1循环
(2)95℃，1秒
(3)60℃，18秒
步骤(1)和(2)重复40个循环。
每个循环的60℃步骤结束时采集荧光数据。结果以图形方式呈现在图10中。当上游寡核苷酸的互补部分与下游寡核苷酸的互补部分被2个核苷酸长的缺口分隔开时，而且当上游寡核苷酸具有单个3′末端非互补核苷酸时，产生最佳信号。

Claims (48)

1.一种检测靶核酸的方法，其包括：
(a)提供：
靶核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，
模板核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，
与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补的第一寡核苷酸，
包含5′区域和3′区域的第二寡核苷酸，其中所述3′区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，且其中所述5′区域不与所述靶核酸互补，但与所述模板核酸的所述第一区域至少部分互补，
包含5′区域和3′区域的第三寡核苷酸，其中所述3′区域与所述模板核酸的所述第二区域至少部分互补，且所述5′区域不与所述模板核酸互补，
切割剂，以及
聚合剂；
(b)在反应条件下混合所述靶核酸、所述模板核酸、所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸、所述第三寡核苷酸、所述切割剂和所述聚合剂，其中所述反应条件允许：
所述靶核酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸中的每一个形成双链体，其中所述第二寡核苷酸的5′区域形成第一切割结构的第一活瓣，
以所述切割剂切割所述第一活瓣，从而允许释放第一活瓣，
以所述释放的第一活瓣、所述模板核酸和所述第三寡核苷酸形成第二双链体，其中所述第三寡核苷酸的5’区域形成第二切割结构的第二活瓣，以及
以所述切割剂切割所述第二活瓣；以及
(c)检测所述第二活瓣切割所产生的信号，其中仅当形成所述第一双链体时所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸至少被切口分开时，方产生所述信号。
2.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸具有与所述靶核酸不互补的单个3′核苷酸。
3.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸是抗切割的寡核苷酸。
4.权利要求1的方法，其中所述释放的活瓣具有与所述模板核酸不互补的单个3′核苷酸。
5.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸具有与所述靶核酸不互补的两个或更多的3′核苷酸。
6.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸和/或释放的活瓣包含3′封闭。
7.权利要求1的方法，其中所述释放的活瓣具有与所述模板核酸不互补的两个或更多的3′核苷酸。
8.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被切口分开。
9.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。
10.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。
11.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开.
12.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被切口分开。
13.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。
14.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。
15.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开。
16.权利要求1的方法，其还包括正向引物。
17.权利要求16的方法，其中所述正向引物与所述靶核酸的第一区域互补。
18.权利要求16的方法，其还包括反向引物。
19.权利要求1的方法，其中所述聚合剂缺乏5′到3′外切核酸酶活性。
20.权利要求1的方法，其中所述聚合剂是热稳定的。
21.权利要求1的方法，其中单个酶包含所述聚合剂和所述切割剂。
22.权利要求22的方法，其中所述酶是大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。
23.权利要求1的方法，其中第一酶包含所述聚合剂，第二酶包含所述切割剂。
24.权利要求1的方法，其中所述切割剂是5′核酸酶。
25.权利要求1的方法，其中所述切割剂是FEN-1核酸酶。
26.权利要求24的方法，其中所述5′核酸酶是热稳定的。
27.权利要求23的方法，其中所述第一酶和第二酶以单一制剂提供。
28.权利要求23的方法，其中所述第一酶是Pfu DNA聚合酶，所述第二酶是FEN-1核酸酶。
29.权利要求1的方法，其中所述反应条件是核酸聚合反应条件。
30.权利要求29的方法，其中所述核酸聚合反应条件是聚合酶链反应条件。
31.权利要求1的方法，其中所述第三寡核苷酸包含一对相互作用的标记物。
32.权利要求1的方法，其中所述相互作用的标记物对的第一成员可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的5′活瓣。
33.权利要求32的方法，其中所述相互作用的标记物对的第二成员可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的+1位置。
34.权利要求32的方法，其中所述相互作用的标记物对的第二成员可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的+2位置。
35.权利要求31的方法，其中所述相互作用的标记物对包含荧光团和猝灭剂。
36.权利要求35的方法，其中所述猝灭剂可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的+1位置，所述荧光团可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的5′活瓣。
37.权利要求35的方法，其中所述信号检测包括检测所述第三寡核苷酸切割时所述相互作用的标记物对的所述第一成员和第二成员之间的荧光变化。
38.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸和所述第三寡核苷酸的3′核苷酸被封闭.
39.一种检测靶核酸的方法，其包括：
(a)提供：
靶核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，
模板核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，
与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补的第一寡核苷酸，
包含5′区域和3′区域的第二寡核苷酸，其中所述3′区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，其中所述5′区域不与所述靶核酸互补，但与所述模板核酸的所述第一区域至少部分互补，
包含5′区域和3′区域的第三寡核苷酸，其中所述3′区域与所述模板核酸的所述第二区域至少部分互补，所述5′区域不与所述模板核酸互补，
切割剂，以及
聚合剂；
(b)在反应条件下混合所述靶核酸、所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸、所述切割剂和所述聚合剂，形成反应混合物，其中所述反应条件允许：
所述靶核酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸中的每一个形成双链体，其中所述第二寡核苷酸的5′区域形成第一切割结构的第一活瓣，
以所述切割剂切割所述第一活瓣，从而允许释放第一活瓣，
(c)在反应条件下在所述反应混合物中混合所述释放的第一活瓣、所述第三寡核苷酸和所述模板核酸，其中所述反应条件允许：
以所述释放的第一活瓣、所述模板核酸和所述第三寡核苷酸形成第二双链体，其中所述第三寡核苷酸的5’区域形成第二切割结构的第二活瓣，
以所述切割剂切割所述第二活瓣；以及
(d)检测所述第二活瓣切割所产生的信号，其中仅当形成所述第一双链体时所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸至少被切口分开时，方产生所述信号。
40.一种组合物，包括：
(i)与靶核酸的第一区域至少部分互补的第一寡核苷酸；
(ii)包含5′区域和3′区域的第二寡核苷酸，其中所述3′区域与所述靶核酸的第二区域至少部分互补，其中所述5′区域与所述靶核酸不互补，但与模板核酸的第一区域至少部分互补；以及
(iii)包含5′区域和3′区域的第三寡核苷酸，其中所述3′区域与所述模板核酸的第二区域至少部分互补，所述5′区域不与模板核酸互补，其中一对相互作用的标记物的第一成员可操纵地连接到所述5′区域，其中这对相互作用的标记物的第二成员可操纵地连接到所述3′区域。
41.权利要求40的组合物，其还包含所述模板核酸，所述模板核酸从3′到5′方向包含所述第一区域和所述第二区域。
42.权利要求40的方法，其中所述相互作用的标记物对的第二成员可操纵地连接到所述第三寡核苷酸的+1位置。
43.权利要求40的组合物，其还包括切割剂。
44.权利要求40的组合物，其还包括聚合剂。
45.包含权利要求40的组合物和用于该组合物的包装材料的试剂盒。
46.权利要求45的试剂盒，其还包括切割剂。
47.权利要求45的试剂盒，其还包括聚合剂。
48.一种检测靶核酸的方法，其包括：
(a)提供：
靶核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，
与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补的第一寡核苷酸，
包含5′区域和3′区域的第二寡核苷酸，其中所述3′区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，其中所述5′区域不与所述靶核酸互补，
切割剂，以及
聚合剂；
(b)在反应条件下混合所述靶核酸、所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸、所述切割剂和所述聚合剂，其中所述反应条件允许：
所述靶核酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸中的每一个形成双链体，其中所述第二寡核苷酸的5′区域形成切割结构的第一活瓣，
以所述切割剂切割所述第一活瓣；以及
(c)检测所述第一活瓣切割所产生的信号，其中仅当形成所述第一双链体时所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸的互补部分至少被切口分开时，方产生所述信号。
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