JP2009540867A - 逆転写酵素を用いて切断構造を形成することによる標的核酸の検出のための方法 - Google Patents

逆転写酵素を用いて切断構造を形成することによる標的核酸の検出のための方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させるための方法に関する。この組成物および方法は、逆転写酵素と、ヌクレアーゼと、上流プライマーと、下流プローブとを含む。

Description

関連の出願
本出願は、それらの内容が参照により本明細書に組み込まれる、１９９９年１０月２９日出願の米国特許出願第０９／４３０，６９２号（現在、米国特許第６，５２８，２５４号）の一部継続である、２０００年８月３０日出願の米国特許出願第０９／６５０，８８８号（現在、米国特許第６，５４８，２５０号）の一部継続である、２０００年１１月３０日出願の米国特許出願第０９／７２８，５７４号に対して米国特許法第１２０条の下で優先権を主張する一部継続である。
ＤＮＡ複製、組換えおよび修復の忠実度は、ゲノム安定性を維持するには必須であり、これらのプロセスは、全ての生物体に存在する５’→３’エキソヌクレアーゼ酵素に依存する。ＤＮＡ修復については、これらの酵素は、損傷されたフラグメント切除および組換えミスマッチの補正に必要である。複製のために、これらのヌクレアーゼは、ラギング（ｌａｇｇｉｎｇ）鎖ＤＮＡ合成の間の岡崎（Ｏｋａｚａｋｉ）フラグメントの十分なプロセシングに重要である。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでは、この後者の活性は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＰｏｌＩ）によって提供され、ポリＩの５’３’エキソヌクレアーゼドメインにおける不活性化変異を有するＥ．ｃｏｌｉ株は、岡崎フラグメントをプロセシングできないために生存できない。しかし真核生物のＤＮＡポリメラーゼは、内因性の５’→３’エキソヌクレアーゼドメインを欠き、この重要な活性は、５’ＤＮＡフラップのエンドヌクレアーゼとしても作用する、多機能性の構造的に特異的なメタロヌクレアーゼＦＥＮ−１（５’エキソヌクレアーゼ−１またはフラップエンドヌクレアーゼ−１）によって提供される（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ，Ｃｅｌｌ，９５：１３５において概説される）。
酵素が標識核酸フラグメントを生成することによる、核酸を検出および／または測定する方法は当分野で公知である。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、５’標識された標的ＤＮＡと、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離したＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）および所望の切断点で配列にハイブリダイズ可能な部分的相補オリゴヌクレオチドとを共にインキュベートすることによって標的ＤＮＡ分子を切断する方法を開示している。部分的相補オリゴヌクレオチドにより、所望の切断部位と対向して３’伸長を有する二本鎖を含む基質構造の形成を通じてＴａｑポリメラーゼに標的ＤＮＡが指向されて、オリゴヌクレオチドの非相補領域から３’アームが得られ、基質分子の非アニーリング５’領域から５’アームが得られる。部分的に相補的なオリゴヌクレオチドは、所望の切断点で標的配列にハイブリダイズしない場合またはハイブリダイズする場合のいずれかに、短いヘアピンを形成することができる３’ヌクレオチド伸長を含む。標識されたフラグメントの遊離は、Ｔａｑポリメラーゼによる切断後に検出される。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性および野生型熱安定性ヌクレアーゼ活性をほとんどまたは全く含まない変異体の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの生成を開示している。変異体ポリメラーゼは、５’→３’合成活性を欠くので有用であると言われており、従って、合成活性は検出アッセイにおけるＤＮＡ切断ステップと組み合わせた際の望ましくない副作用である。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性を欠く野生型Ｔａｑポリメラーゼまたは変異体Ｔａｑポリメラーゼがヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの存在下での熱変性および引き続く冷却によって形成された５’末端標識ヘアピン構造の切断によって標識フラグメントを遊離することができることを開示している。さらに、米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号は、合成活性を欠く変異体Ｔａｑポリメラーゼがヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの不在下でもこのヘアピン構造を切断することができることを教示している。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、ヘアピン構造の３’アームに結合するプライマーの存在下、合成活性を欠く変異体Ｔａｑポリメラーゼによるヘアピン構造の切断により１種類の標識切断産物が得られる一方で、野生型Ｔａｑ酵素の高レベルの合成活性に起因して野生型Ｔａｑポリメラーゼは複数の切断産物を生成し、ｄＮＴＰの存在下でヘアピン構造が二本鎖形態に変換されるということを開示している。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、野生型Ｔａｑポリメラーゼではなく合成活性の減少を示す変異体Ｔａｑポリメラーゼが、５’末端標識標的核酸と、標的核酸の一部にハイブダイズする相補的なオリゴヌクレオチドとを含む線状核酸基質の切断により単一の標識されたフラグメントを遊離することが可能であり、それによってその標的核酸の５’および３’領域がオリゴヌクレオチドとアニーリングせずに一本鎖を維持することを開示している。
米国特許第５，８４３，６６９号、同第５，７１９，０２８号、同第５，８３７，４５０号、同第５，８４６，７１７号、および同第５，８８８，７８０号はまた、天然に存在する二次構造の領域での標識された核酸基質の切断法を開示している。この方法によれば、ビオチン標識ＤＮＡ基質をＰＣＲによって調製し、野生型ＴａｑポリメラーゼまたはＣｌｅａｖａｓｅＢＮ（合成活性および野生型５’→３’ヌクレアーゼ活性が減少した変異体Ｔａｑポリメラーゼ）と混合し、９５℃で５秒間インキュベートして基質を変性させ、次いで急速に６５℃に冷却し、相補的な塩基間の鎖内水素結合を形成させることによってＤＮＡの固有の二次構造を想定することを可能にする。反応混合物を６５℃でインキュベートして切断を可能にし、ビオチン化切断産物を検出する。
ＦＥＮ−１酵素を用いて標識核酸フラグメントを生成する核酸の検出および／または測定法は当分野で公知である。
米国特許第５，８４３，６６９号は、合成活性の減少を示す変異体Ｔａｑポリメラーゼの存在下または不在下で熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼを用いる、切断酵素フラグメント長多形分析（ｃｌｅａｖａｓｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）による多形検出法を開示している。本方法によれば、二本鎖Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲ反応において５’末端標識プライマー（ＴＭＲ蛍光色素で標識）を用いることによって標識する。ＴＭＲ標識ＰＣＲ産物を、９５℃への加熱によって変性し、そして５５℃に冷却して切断構造を作製する。米国特許第５，８４３，６６９号は、切断構造が二次構造を含む一本鎖核酸基質の領域を含むことを開示している。ＣｌｅａｖａｓｅＢＮヌクレアーゼ、古細菌Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ由来のＦＥＮ−１ヌクレアーゼ、またはその両方の酵素の存在下で切断を行う。標識反応産物をゲル電気泳動で可視化し、続いて蛍光画像処理を行う。米国特許第５，８４３，６６９号は、ＣｌｅａｖａｓｅＢＮヌクレアーゼおよびＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＦＥＮ−１ヌクレアーゼにより互いに容易に識別される切断パターンが得られること、両酵素を含む反応由来の切断パターンには各々の個々の酵素での切断によって得られるパターンの要素を含むが各々の個々の酵素によって得られた単なる切断パターンの複合物ではないということを開示する。これによって、１つの酵素によって切断されていない（そして、この酵素パターンでのバンドとして認められる）フラグメントのいくつかは、同一の反応混合物で第２の酵素によって切断することができることが示される。
Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．は、標的ＤＮＡの領域に部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプローブの重複対を標的ＤＮＡと混合して５’フラップ領域を形成し、熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼによる標識下流プローブの切断によって標識切断産物が得られる、ＤＮＡの検出法を開示している。Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．はまた、切断シグナルを増幅してアトモル未満のレベルで標的ＤＮＡを定量的に検出することができるような、下流オリゴヌクレオチドプローブの複数のコピーを温度サイクリングの不在下で１つの標的配列について切断することができる反応条件を開示している（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２９２）。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の技術は、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号で開示されている。その最も単純な形態では、ＰＣＲは反対の鎖とハイブリダイズして、標的ＤＮＡ中の対象の領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的ＤＮＡ配列の酵素合成のためのインビトロの方法である。テンプレートの変性、プライマーのアニーリング、およびＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングしたプライマーの伸長を含む連続した反復性の一連の反復ステップにより、末端がプライマーの５’末端によって規定される特定のフラグメントが指数関数的に蓄積される。ＰＣＲにより１０９倍という特定のＤＮＡ配列の選択的富化が可能であると報告されている。ＰＣＲ法はまた、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０：１３５０にも記載されている。
ＰＣＲ技術は非常に強力な核酸配列増幅法であるが、増幅物質の検出には、標的ＤＮＡが存在するかどうかを決定するためのさらなる操作およびＰＣＲ産物の処理が必要である。増幅物質の検出に現在必要とされるその後の操作ステップ数を減少させることが望ましい。標的配列が増幅している間にシグナルが発生するアッセイ系では、増幅ステップの間にシグナルを発生しないＰＣＲ法と比較して、増幅物質の検出に必要な操作ステップはより少ない。
米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号は、増幅すべき核酸、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＴａｑポリメラーゼ、増幅領域に相補的な領域を含む５’→３’、または５’および３’末端標識プローブ、ならびにさらなる非相補性５’テール領域の存在下でのＰＣＲ反応の増幅ステップの間にシグナルを発生させるステップを含むＰＣＲベースの標識プローブ遊離アッセイを開示している。米国特許第５，２１０，０１５号および同第５，４８７，９７２号は、Ｔａｑポリメラーゼが重合依存様式（例えば、ｄＮＴＰの不在下）で上流プローブによって標識プローブ付近に位置付けられた場合、このＰＣＲベースのアッセイによりハイブリダイズプローブの５’標識末端を遊離することができることをさらに開示している。
本発明は、サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させる方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、核酸ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、ＦＥＮヌクレアーゼを用いてこの切断構造を切断してシグナルを発生させるステップとを含み、このシグナルの発生がこのサンプル中の標的核酸配列の存在の指標である方法を提供する。
第一の態様では、本発明はある配列中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させる方法に関する。本発明に従う切断構造は、この標的を含むサンプルと、逆転写酵素、プライマーおよびプローブとをインキュベートすることによって形成される。このプライマーは、下流プローブの上流の標的にハイブリダイズする。この逆転写酵素は、プライマーを伸長して、これがこの標的に対して相補的であるＤＮＡ分子を合成する。この合成された鎖は、下流プローブと切断構造を形成する。次いで、この切断構造は、切断剤（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）によって切断され、それによって遊離フラグメントおよび／または検出可能シグナルが発生され、これがサンプル中の標的核酸の存在および／または量の指標である。
一実施形態では、この逆転写酵素は熱安定性である。適切な逆転写酵素としては、ウイルス、レトロウイルスおよび細菌酵素が含まれる。例えば、この逆転写酵素は以下であってもよい。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ。
別の実施形態では、この切断剤は、ＦＥＮヌクレアーゼである。ＦＥＮは、熱安定性であり得る。
この切断構造は、検出可能シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含んでもよい。あるいは、この切断構造は、１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む。この部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位によって隔てられ、切断剤による切断がないときの検出可能シグナルを消光するように効率的に位置決めされる。切断構造が形成されかつ切断剤によって切断される場合、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は切断部位を切断し、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離して、それによって検出可能なシグナルを発生させる。対の相互作用性シグナル発生部分は、消光物質および蛍光発光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）であってもよい。
別の態様では、本発明は、サンプル中の標的核酸の存在の指標であるシグナルを発生させる方法に関する。上流プライマー、下流プローブ、逆転写酵素および切断剤をサンプルと混合する。この混合物を、上流プライマーと、下流プローブとのアニーリング、（ｉｉ）上流プライマーの伸長、および（ｉｉｉ）切断構造の切断を可能にする反応条件に供する。この逆転写酵素は、プライマー伸長産物を合成し、これが下流プローブとともに切断構造を形成する。次いで、切断剤は、その切断構造を切断してその切断構造から標識されたフラグメントを遊離し、これによって検出可能な標識フラグメントを作成する。これらの標識されたフラグメントは、サンプル中の標的配列の存在の指標として検出および／または測定される。あるいは、標的の存在は、切断構造の切断の際に発生されるシグナルを検出および／または測定することによって決定される。
一実施形態では、この逆転写酵素は、熱安定性である。適切な逆転写酵素としてはウイルス、レトロウイルスおよび細菌の酵素が含まれる。例えば、逆転写酵素は以下であってもよい。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ。
別の実施形態では、この切断剤はＦＥＮヌクレアーゼである。ＦＥＮは、熱安定性であってもよい。
この切断構造は、検出可能シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含んでもよい。あるいは、この切断構造は、１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む。この部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位によって隔てられ、かつ切断剤による切断がないときの検出可能なシグナルを消光するのに効率的に位置決めされる。切断構造が形成されかつ切断剤によって切断される場合、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性はこの部位を切断し、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離して、それによって検出可能なシグナルを発生させる。対の相互作用性シグナル発生部分は、消光物質および蛍光発光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）であってもよい。
いくつかの実施形態では、下流プローブは、５’領域および３’領域を含み、この３’領域は上記標的に対して相補的であり、かつその標的とアニーリングし、そしてこの５’領域はフラップを形成する。
さらに別の態様では、本発明は、標的核酸を検出するための方法を提供し、ここでは上流プライマーおよび下流プローブが提供される。上流プライマーは少なくとも部分的には、標的核酸の第一の領域に対して相補的であり、かつ下流プローブの３’領域は標的核酸の第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的である。標的の第一および第二の領域は、伸長領域によって隔てられる。プローブおよびプライマーは、標的核酸と上流プライマーとの間および標的と下流オリゴヌクレオチドの３’領域の間の二本鎖の形成を可能にする条件下で、標的と混合される。この反応物は、逆転写酵素の重合化活性による相補的ＤＮＡ鎖の重合によって、標的の伸長領域が切断構造を形成するために十分な長さにまで上流プライマーを伸長することができる反応条件に供される。この反応条件によってまた、切断剤による切断構造の切断も可能になる。切断構造は切断されて、下流オリゴヌクレオチドの検出フラグメントが遊離され、これが検出される。あるいは、標的の存在は、切断構造の切断の際に発生されるシグナルを検出および／または測定することによって検出される。
ある実施形態では、この逆転写酵素活性は、下流プローブの少なくとも一部を置き換える。
一実施形態では、この逆転写酵素は熱安定性である。適切な逆転写酵素としては、ウイルス、レトロウイルスおよび細菌の酵素が含まれる。例えば、逆転写酵素は以下であってもよい。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ。
別の実施形態では、この切断剤はＦＥＮヌクレアーゼである。ＦＥＮは、熱安定性であってもよい。
この切断構造は、検出可能シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含んでもよい。あるいは、この切断構造は、１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む。この部分は、ＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位によって隔てられ、かつ切断剤による切断がないときの検出可能なシグナルを消光するのに効率的に位置決めされる。切断構造が形成されかつ切断剤によって切断される場合、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性は切断部位を切断し、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離して、それによって検出可能なシグナルを発生させる。対の相互作用性シグナル発生部分は、消光物質および蛍光発光物質（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｒ）であってもよい。
一実施形態では、逆転写酵素重合活性は、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合し、その結果、重合された相補的な核酸は、その３’末端において二本鎖で下流オリゴヌクレオチドに対して隣接する。
別の実施形態では、逆転写酵素重合活性は、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合し、その結果、伸長領域は完全に二本鎖核酸である。
ある実施形態では、下流プローブの５’領域は、標的にハイブリダイズされた場合に５’フラップを有する。
さらに別の態様では、本発明は、本発明の方法を行うための組成物を提供する。本発明は、逆転写酵素、切断剤、第一のオリゴヌクレオチドおよび第二のオリゴヌクレオチドを含む組成物を提供する。この逆転写酵素は、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴであってもよい。ある実施形態では、この逆転写酵素は熱安定性である。
さらなる実施形態では、この組成物は標的核酸を含む。この切断剤は、５’ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ）であってもよい。このヌクレアーゼは熱安定性であってもよい。
ある実施形態では、第二のオリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドに結合された保護基を有する。第二のオリゴヌクレオチドは好ましくは標識される。例えば、第二のオリゴヌクレオチドは、シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を有し得る。あるいは、第二のオリゴヌクレオチドは、１対の相互作用性シグナル発生標識部分（例えば、消光物質および蛍光発光物質）を有する。この標識は、第二のオリゴヌクレオチドの５’領域または３’領域に機能的に連結され得る。ある実施形態では、１対の相互作用性シグナル発生部分は、ＦＥＮヌクレアーゼに対して感受性である部位がこの標識を隔てるように、第二のオリゴヌクレオチドに対して機能的に連結される。
別の態様では、本発明は、組成物を提供し、この組成物は、３’から５’の順序に第一の領域、伸長領域、および第二の領域を有する標的核酸と；前記標的核酸の第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である第一のオリゴヌクレオチドと；５’領域および３’領域を有する第二のオリゴヌクレオチドであって、前記３’領域がこの標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、前記５’領域がこの標的核酸に対して相補的でない第二のオリゴヌクレオチドと；逆転写酵素と；切断手段とを含む。別の実施形態では、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域は、標的核酸の第一の領域の上流であってもよく、下流であってもよく、またはそれを含んでもよい領域に対して少なくとも部分的に相補的である。
少なくとも２つの態様のいずれかの一実施形態では、切断剤は、５’ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ）である。さらなる実施形態では、このＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび／または逆転写酵素は熱安定性である。
第二のオリゴヌクレオチドは、３’末端ヌクレオチドに保護基を含んでもよい。好ましくは、第二のオリゴヌクレオチドは検出可能に標識される。例えば、第二のオリゴヌクレオチドはシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含み得る。あるいは、第二のオリゴヌクレオチドは、１対の相互作用性シグナル発生標識部分（例えば、消光物質および蛍光発光物質）を含む。
別の態様では、本発明は、本明細書において上記される任意の組成物を含むキットを提供する。
本明細書において用いる場合、「プローブ」という用語は、そのプローブ中の少なくとも１つの配列が標的領域中の配列と相補的であることに起因して、標的核酸中の配列と二本鎖構造を形成する標識されたオリゴヌクレオチドを指す。プローブは、好ましくは、プライマーにおいて用いられる配列に相補的な配列を含まない。このプローブは、標的核酸に相補的である領域（例えば、標的核酸結合配列）を含む（例えば、図４のＣ）。ある実施形態では、本発明による「プローブ」は、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、さらに結合部分を含む。本発明による「プローブ」は、標的核酸に結合して、ヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成し、ここで切断は、切断温度で行われ、このプローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、好ましくは、切断温度以下で安定である。本発明によるプローブは、標的核酸に対する結合の前に、本明細書で規定されるような、「ヌクレアーゼ」によってシグナルを発生するように切断されることはない。本発明の一実施形態では、プローブは、標的核酸に結合できないかまたは相補的でない領域を含み得る。本発明の別の実施形態では、プローブは、標的核酸に結合しない場合二次構造を有さない。一実施形態では、このプローブは、５’領域および３’領域を有する。この３’領域は、標的に相補的であり、かつこの５’領域は、この標的に対して相補的であっても相補的でなくてもよい。
＜二次構造を有するプローブ＞
本明細書において用いる場合、「二次構造」とは、三次元の高次構造（例えば、ヘアピン、ステム・ループ構造、内部ループ、バルジ・ループ、分岐構造またはシュードノット、図１および３；マルチ・ステム・ループ構造、クローバー型構造、または任意の三次元構造を言う。本明細書において用いる場合、「二次構造」とは、三次構造、四次構造などを含む。このような三次元構造を含むプローブは、標的核酸に結合して、切断温度でヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成する。プローブの三次元構造は、標的核酸に結合しない場合、好ましくは、切断温度以下で安定である。「二次構造」とは本明細書において用いる場合、塩基の第一の一本鎖配列（本明細書においては「相補的な核酸配列」と呼ばれる（例えば、図４のｂ））を、続いて第二の相補的な配列を同じ分子に（例えば、図４におけるｂ’）、またはプローブを含む第二の分子に含む配列であって、それ自体折り畳んで逆平行二本鎖構造を生成し、その一本鎖配列および相補的配列（すなわち、相補的な核酸配列）が水素結合の形成によってアニーリングする配列を意味し得る。オリゴヌクレオチドプローブとは、本発明において用いる場合、二次構造を含むオリゴヌクレオチドを含み、これには、限定はしないが、分子指標、安全ピン（図９）、スコーピオン（ｓｃｏｒｐｉｏｎ）（図１０）、およびサンライズ（ｓｕｎｒｉｓｅ）／アンプリフロアー（ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ）プローブ（図１１）が含まれ、この詳細および構造は、下記にそして対応する図面に記載されている。
本明細書において用いる場合、第一および第二の「相補的な」核酸配列は、互いに対して相補的であり、かつ相補的な塩基の間の水素結合の形成によってアニーリングし得る。
二次構造とはまた、本明細書に規定される親和性対を含む核酸分子の高次構造をいい、この親和性対は、この親和性対を含む対の部分の間に存在する引力の結果として可逆的に会合する。本明細書において用いる場合、二次構造は、プローブ上の結合部分を捕獲エレメントに対する結合から妨げ、そして標的核酸に対するプローブの結合およびこの結合したプローブの引き続く切断の際の、二次構造における変化によって、この結合部分が捕獲エレメントによって捕獲される事が可能になる。
本発明による「プローブ」は単分子（ｕｎｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ）であってもよい。本明細書において用いる場合、「単分子」プローブは、単一分子を含み、これが、標的核酸に結合して、ヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成し、ここで切断は、切断温度で行われ、かつこの「単分子」プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、好ましくは、切断温度以下で安定である。本発明に従って有用な単分子プローブとしては、限定はしないが、指標プローブ、ヘアピン、ステム・ループ、内部ループ、バルジ・ループまたはシュードノット構造を含むプローブ、スコーピオン・プローブ、およびサンライズ／アンプリフロアー・プローブが含まれる。
本発明に従う「プローブ」は、２つ以上の分子（例えば、二分子または多分子）であってもよい。二分子または多分子プローブを含む少なくとも１つの分子は、標的核酸に結合して、ヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成し、ここで切断は、切断温度で行われ、かつこのプローブの分子の二次構造は、標的核酸に結合しない場合、好ましくは、切断温度以下で安定である。多分子プローブを含む分子は、互いに分子間結合（例えば、水素結合または共有結合）を介して会合する。例えば、非相同ループ（図１を参照のこと）、またはクローバー葉構造（クローバー葉構造の１つ以上のループが別個の分子を含み、かつ、会合してクローバー葉構造を形成する前記分子は、分子間結合（例えば、水素結合または共有結合）を介して会合する）は、本発明に従って有用な多分子プローブの例である。
本明細書において用いる場合、「分子」とは、ポリヌクレオチドをいい、そしてこれは、ポリヌクレオチドを含み、さらに親和性対の結合した部分を含む。
「プローブ」または「分子」は、５〜１０，０００ヌクレオチド長、理想的は、６〜５０００、７〜１０００、８〜５００、９〜２５０、１０〜１００および１７〜４０ヌクレオチド長であるが、異なる長さのプローブを含むプローブまたは分子が有用である。
本発明に従うプローブは、５〜１０，０００ヌクレオチド、好ましくは１０〜約１４０ヌクレオチドの標的核酸結合配列を有する。一実施形態では、本発明に従う「プローブ」は、３〜２５０、好ましくは４〜１５０、そしてさらに好ましくは５〜１１０、そして最も好ましくは６〜５０ヌクレオチド長である、少なくとも第一および第二の相補的な核酸配列または領域を含む。この第一および第二の相補的な核酸配列は、同じ長さを有してもよいし、または異なる長さであってもよい。本発明は、プローブであって、その第一および第二の相補的な核酸配列が両方とも標的核酸結合部位の上流（５’）に位置するプローブを提供する。あるいは、第一および第二の相補的な核酸配列は、両方とも、標的核酸結合部位の下流（３’）に位置してもよい。別の実施形態では、本発明は、第一の相補的核酸配列が、標的核酸結合部位の上流（５’）であり、かつ第二の相補的な核酸配列が、標的核酸結合部位の下流（３’）であるプローブを提供する。別の実施形態では、本発明は、第二の相補的な核酸配列が標的核酸結合部位の上流（５’）であり、かつ第一の相補的な核酸配列が、標的核酸結合部位の下流（３’）であるプローブを提供する。この正確な長さは、標的核酸結合配列に対して選択され、その結果このプローブの二次構造は好ましくは、標的核酸に対して結合したプローブを含む切断構造の切断が行われる温度でこのプローブが標的核酸に結合しない場合、安定である。標的核酸結合配列が、５００ヌクレオチドのサイズまで増大するにつれ、相補的な核酸配列の長さは、１５〜１２５ヌクレオチドまで増大し得る。１００ヌクレオチドを超える標的核酸結合配列については、相補的な核酸配列の長さは、さらに増大する必要はない。このプローブがまた対立遺伝子識別プローブである場合、相補的核酸配列の長さは、下記に考察されるとおり、さらに制限される。
本明細書において用いる場合、「標的核酸結合配列」とは、標的核酸に特異的に結合するプローブの領域を言う。
「ヘアピン構造」または「ステム（ｓｔｅｍ）」とは、一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡにおいて隣接する逆位の相補的な配列の間の塩基対合によって形成される二重らせんの領域を言う。
「ステム・ループ」構造とは、ヘアピン構造であって、さらに、一端で不対の塩基のループを含むヘアピン構造を言う。
本明細書において用いる場合、標的核酸に結合しない場合「安定な」二次構造を有するプローブとは、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションを可能にする条件下であるが、標的核酸の不在下で、このプローブを構成する塩基対の５０％以上（例えば、５０％、５５％、７５％または１００％）が解離されない二次構造を言う。
核酸の二本鎖の「安定性」は、融点すなわち「Ｔｍ」で決定される。特定の条件（例えば、塩濃度および／または有機溶媒の存在または不存在）の下での特定の核酸二本鎖のＴｍとは、二本鎖分子の塩基対のうち半分（５０％）が解離されている（すなわち、塩基対で互いにハイブリダイズしない）温度である。
標的核酸に対して結合しない場合のプローブの二次構造の「安定性」は、融点アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイ、または蛍光クエンチングアッセイ（その詳細は、「プローブの安定性または二次構造の決定」と題された項に記載される）で規定される。
ある実施形態では、本発明において有用なプローブは好ましくは、標的に結合しない場合、または切断反応の温度以下で、「安定」である二次構造を有する。従って、プローブ／標的核酸ハイブリッドのヌクレアーゼ切断が本発明に従って行われる温度は、二次構造のＴｍよりも低くなければならない。このプローブの二次構造は、切断反応の温度以下の温度での光吸収のレベルが、プローブのＴｍ以上である温度で光吸収のレベルよりも低い（すなわち、少なくとも５％未満、好ましくは２０％未満、そして最も好ましくは２５％未満など）場合、切断反応の温度（すなわちここで切断が行われる）以下の温度での融点アッセイで「安定」である。
本発明の方法によれば、二次構造の安定性は、ＦＲＥＴアッセイまたは蛍光クエンチングアッセイ（「プローブの二次構造の安定性の決定」と題された項に記載される）によって測定され得る。本明細書において用いる場合、蛍光クエンチングアッセイは、ＦＲＥＴアッセイを含み得る。本発明によるプローブは、例えば、２ヌクレオチドの距離にわたって相互作用し得る、適切な対の相互作用性標識（例えば、ＦＲＥＴ対（例えば、下記の「プローブの二次構造の安定性の決定」と題された項で記載される））で、または例えば、２０ヌクレオチドの距離にわたって相互作用し得る非ＦＲＥＴ対（例えば、テトラメチルローダミンおよびＤＡＢＣＹＬ）で標識される。例えば、本発明によるプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識されてもよく、次いで、標的核酸の不在下で、種々の温度において蛍光が測定される。Ｔｍとは、蛍光のレベルが特定のプローブについて観察される蛍光の最大レベルの５０％である温度である。図１２ｅを参照のこと。プローブの核酸配列が公知である特定のプローブについてのＴｍは、当分野で公知の方法に従って予測され得る。従って、蛍光は、ある範囲の温度にまたがって測定され、例えば、本発明に従うプローブについて、この範囲の下限温度は、Ｔｍまたは予測Ｔｍよりも少なくとも５０℃低く、そしてこの範囲の上限温度は、Ｔｍまたは予測Ｔｍよりも少なくとも５０℃高い。
本明細書における二次構造とは、蛍光のレベルまたは波長が、プローブのＴｍで観察されるＦＲＥＴのレベルまたは波長と比較して増大または減少される場合（例えば、少なくとも５％未満、好ましくは２０％未満、そしてさらに好ましくは２５％未満など）、切断温度以下である温度下でＦＲＥＴアッセイにおいて「安定」と規定される（図１２ｅおよび図１２ｆを参照のこと）。例えば、ＦＲＥＴにおける増大または減少は、本発明によるＦＲＥＴアッセイで生じ得る。別の実施形態では、新規なシフトした波長における増大、または新規なシフトした波長における減少を生じる波長におけるシフトが、本発明に従うＦＲＥＴアッセイで生じ得る。
本発明に従う、二次構造における「変化」は、蛍光クエンチングアッセイで測定され得、ここでは本発明に従うプローブは、標的核酸の不在下で、かつプローブのＴｍ未満の温度において蛍光のクエンチング（上記のとおり）が起こるように位置決めされたフルオロフォアおよびクエンチャーを含む。本明細書において用いる場合、本発明に従うプローブが標的核酸に結合する場合に生じる二次構造における「変化」とは、このようなアッセイにおける蛍光の増大であって、その結果プローブのＴｍ未満の温度での標的核酸に対するプローブの結合後の蛍光のレベルが、標的核酸の不在下で観察される蛍光のレベルより大きい（例えば、少なくとも５％、好ましくは５〜２０％、そして最も好ましくは２５％以上）である増大を言う（図１２ｇを参照のこと）。
本発明に従う二次構造は、フルオロフォアおよびクエンチャーを含むプローブを蛍光クエンチングアッセイ（上記のような）に対して供することによって決定され得る。温度の変化に相関して蛍光の変化を示すプローブ（図１２ｅを参照のこと）（例えば、ＦＲＥＴ反応の温度が上昇するとともに蛍光は増大する）は、二次構造を形成し得る。
本明細書において用いる場合、本発明に従って有用である「切断温度」とは、二次構造を有するプローブのＴｍ未満である温度（少なくとも１℃、好ましくは１０℃）である。この「切断温度」には、切断反応で使用される特定のヌクレアーゼに適用できる、好ましくは最適である温度が最初に選択される。
好ましくはこのプローブの３’末端は、活性なポリメラーゼが反応中で用いられる場合、プライマー伸長産物へのプローブの組み込みを禁止するために「ブロック」される。「ブロッキング」は、非相補的な塩基を用いることによって、またはビオチンまたはリン酸基のような化学基を、最後のヌクレオチドの３’ヒドロキシルに付加することによって達成され得、これは、選択された部分に依存して、標識に結合された核酸の引き続く検出または捕獲のための標識としても作用することによって二重の目的で機能し得る。ブロッキングはまた、３’−ＯＨの除去によって行ってもまたはジデオキシヌクレオチドなどの３’−ＯＨを欠くヌクレオチドを用いることによって行ってもよい。
プローブという用語は、対立遺伝子識別プローブを含む。本明細書において用いる場合、「対立遺伝子識別」プローブは完全に相補的な標的核酸に対して優先的にハイブリダイズして、少なくとも１つのヌクレオチドによって変化する配列に対して区別する。標的核酸に比較して、少なくとも１つのヌクレオチドが異なる核酸配列は、本明細書において以降では、「標的様核酸配列」と呼ばれ、従って、本発明による対立遺伝子識別プローブの標的核酸ではない。対立遺伝子識別プローブは、少なくとも単一のヌクレオチドの相違で標的と標的様配列との間を識別することを可能にする実験最適化によって決定される、特定の温度で、またはある範囲の温度内で、標的核酸相補的配列に比べて１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む標的様核酸配列に対して十分にハイブリダイズせず、従って、標的様核酸配列のみの存在下で、そして標的核酸に対する対立遺伝子識別プローブのハイブリダイゼーションを支持する条件下で、標的様核酸配列に対する結合の際に二次構造における変化を受けない。
一実施形態では、本発明による「対立遺伝子識別プローブ」とは、標的核酸とは少なくとも１つのヌクレオチドが異なる標的様核酸配列に対してハイブリダイズするプローブであって、ここで改変ヌクレオチドが対立遺伝子識別部位に位置しないプローブを言う。本発明のこの実施形態によれば、「対立遺伝子識別プローブ」は、対立遺伝子識別プローブが少なくとも単一のヌクレオチドの相違で標的と標的様配列との間を識別することを可能にする実験最適化によって決定される、特定の温度で、またはある範囲の温度内で、対立遺伝子識別部位における少なくとも１つのヌクレオチドによっても変化する標的様核酸配列に結合できない。単一のヌクレオチド相違は、標的または標的様核酸配列に結合するプローブの割合にわずかに影響する。例えば、本発明は、標的の１００％全てが、過剰なプローブの存在下で、プローブ標的複合体となる（例えば、プローブによって結合される）完全マッチしたプローブを提供する。本発明はまた、標的配列および完全マッチプローブを含む複合体を形成するために用いられるのと同じ条件下で、標的様配列の少なくとも１〜５％、好ましくは５〜１０％がプローブによって結合される、少なくとも１つの単一塩基ミスマッチを含むプローブを提供する。
本明細書において用いる場合、「対立遺伝子識別部位」とは、標的核酸を含む全ての推定対立遺伝子における対応する領域とは（少なくとも１ヌクレオチドが）異なる標的核酸の領域を言う。
本発明に従って有用な対立遺伝子識別プローブはまた、標的配列に比較して、標的様配列に対して事実上結合しないプローブを含む。標的配列または標的様配列に対するプローブの結合の有効性は、標的様配列または標的配列の存在下で、プローブの二次構造のＴｍ未満である温度（少なくとも１℃そして好ましくは１０℃以上）で行われる、ＦＲＥＴアッセイで測定され得る。標的様配列の有無における蛍光のレベルの変化に比較した標的配列の有無における蛍光のレベルの変化によって、標的または標的様配列に対するプローブの結合の有効性の有効な測定が得られる。
本発明による方法では、標的配列に比較して標的様配列に対して有効に結合しないプローブは、標的様配列に対するハイブリダイゼーションの際に、標的核酸の場合と比較して、本明細書に記載されるようなＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングアッセイにおいて蛍光を測定することによって決定されるように、より小さい（例えば、標的核酸に対する結合の際の蛍光における変化の値の、好ましくは２５〜５０％、さらに好ましくは５０〜７５％、そして最も好ましくは７５〜９０％）二次構造上の変化を受けるだろう。本発明に従う方法では、標的配列に比べて標的様配列に対して効率的に結合しないプローブは、サンプル中の標的様核酸配列の存在の指標であるシグナルを発し得る。しかし、このシグナルの強度は、より小さい変化として上記されるように、標的配列の存在下では、発生されるシグナルの強度が変化し得る（例えば、標的核酸に対する結合の際の蛍光における変化の値の、好ましくは２５〜５０％、さらに好ましくは５０〜７５％、そして最も好ましくは７５〜９０％未満またはそれ以上）。
「標的核酸の存在の指標であるシグナル」または「標的様核酸配列」とは、標的核酸または標的様核酸配列の１分子〜１０２０分子、より好ましくは、約１００分子〜１０１７分子、そして最も好ましくは約１０００分子〜１０１４分子から発生されるシグナルに等しいシグナルを言う。
本明細書において用いる場合、「結合部分」とは、ヌクレアーゼによるプローブの切断の際に遊離され、結合部分と捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として捕獲エレメントに対して特異的に結合する（この結合部分と捕獲エレメントとの間の特異的な結合は、プローブの二次結合が本明細書に規定されるように「変化」された場合にのみ生じる）プローブの領域（例えば、図４のａｂ）を言う。「特異的に結合する」とは、相補的な核酸との水素結合を介すること、または例えば、結合部分と結合タンパク質（結合部分の核酸配列に対して特異的に結合し得る）との間の相互作用を介することを意味する。「結合部分」は、プローブが標的核酸に結合する能力を妨害しない。結合部分は、プローブがそのネイティブな二次構造である場合、捕獲エレメントに結合できず、そして標的またはテンプレート核酸に対する結合の際、好ましくは切断剤による切断後に、捕獲エレメントに対する結合部分の結合が可能となるように二次構造が変化する。
一実施形態では、切断されて結合部分を形成するプローブの領域は、標的核酸にハイブリダイズできない。本明細書に規定されるような、「相補的核酸配列」ではない「結合部分」の領域（例えば、図４のＡ）は、１〜６０ヌクレオチド、好ましくは、１〜２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは１〜１０ヌクレオチド長である。本明細書に規定されるような結合部分、または結合部分と本明細書に規定されるような捕獲エレメントとの間の特定の結合を検出する方法は、当分野で周知であり、そして本明細書において以下に記載される。
本発明の一実施形態では、プローブは、さらに「レポーター」を含む。
本明細書において用いる場合、「レポーター」とは、本明細書において下に規定される「標識」、および／または本明細書において下に規定される「タグ」を言う。
本明細書中で使用される、「標識」または「シグナルを提供できる標識部分」とは、検出可能な（好ましくは、定量可能な）シグナルの提供に使用することができ、核酸に機能的に連結することができる任意の原子または分子を言う。標識は、蛍光、放射能、比色定量、重力測定、Ｘ線回折または吸収、磁性、酵素活性、質量分析、結合親和性、ハイブリダイゼーション高周波、ナノ結晶などによって検出可能なシグナルを提供し得る。本発明の方法に従う標識されたプローブは、５’末端、３’末端または内部で標識される。この標識は、「直接」、すなわち、色素、または「間接的」、すなわち、ビオチン、ジゴキシン、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などであってもよい。「間接的な標識」の検出のためには、さらなる成分、例えば、標識された抗体、または酵素基質を付加して、捕獲された、遊離された、標識された核酸フラグメントを可視化する必要がある。本発明の一実施形態では、標識は、本明細書に規定されるとおり、二次構造が（例えば、結合部分がアクセス可能であるように）「変化」しない限り、検出可能なシグナルを提供できない。
「結合部分」とはまた、「タグ」を言う。本明細書において用いる場合、「タグ」とは、プローブの５’末端に機能的に連結され（例えば、図１のＲ）、かつ、タグと捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として捕獲エレメントに特異的に結合する部分であって、タグと捕獲エレメントとの間の特異的な結合が、プローブの二次構造が（例えば、タグが捕獲エレメントに接近可能であるように）変化した場合にのみ生じる部分を言う。「特異的に結合する」とは、「タグ」および捕獲エレメントについていう場合、例えば、タンパク質とリガンド、抗体と抗原、タンパク質サブユニット、または核酸結合タンパク質と核酸結合部位との間の、共有結合または水素結合、または静電気引力を介すること、または相互作用を介することを意味する。タグは、プローブが標的核酸にアニーリングする能力を妨げない。タグとしては、限定はしないが、ビオチン、ストレプトアビジン、アビジン、抗体、抗原、ハプテン、タンパク質または化学的に反応性の部分が含まれる。「タグ」は本明細書において規定される場合、本明細書に規定されるような「捕獲エレメント」に結合し得る。本発明によれば、「タグ」および「捕獲エレメント」は、結合対として機能する。例えば、一実施形態では、タグがビオチンである場合、対応する捕獲エレメントはビオチンである。あるいは、別の実施形態では、タグが抗体である場合、対応する捕獲エレメントは抗原である。
本発明は、結合部分を含む「プローブ」を考慮し、「プローブ」は、本明細書に規定されるような「タグ」を含み、かつ「プローブ」は、ヌクレアーゼによるプローブの切断の際に遊離されるプローブの領域である結合部分（例えば、捕獲エレメントに結合する核酸配列）と「タグ」の両方を含む。
本明細書において用いる場合、「捕獲エレメント」とは、例えば、化学的な架橋または共有結合によって、固体基質に結合される物質であって、この物質は、結合部分と捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として、（例えば、水素結合を介して、または核酸結合タンパク質と核酸結合部分との間の、もしくは相補的な核酸の間の相互作用を介して）結合部分に対して特異的に結合し、かつ、結合部分と捕獲エレメントとの間の特異的な結合が、結合部分を含むプローブの二次構造が本明細書に規定されるように「変化した」場合にのみ生じる物質を言う。捕獲エレメントとしては、限定はしないが、核酸結合タンパク質またはヌクレオチド配列が含まれる。
本明細書において用いる場合、「捕獲エレメント」とはまた、例えば、化学的な架橋または共有結合によって、固体基質に結合される物質であって、この物質は、タグと捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として、（例えば、共有結合もしくは水素結合または静電気引力を介して、例えば、タンパク質とリガンド、抗体と抗原、タンパク質サブユニット、核酸結合タンパク質と核酸結合部位との間、または相補的な核酸の間の相互作用を介して）タグに対して特異的に結合し、かつ、タグと捕獲エレメントとの間の特異的な結合が、タグを含むプローブの二次構造が本明細書に規定されるように「変化した」場合にのみ生じる物質を言う。捕獲エレメントとしては、限定はしないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、抗体、抗原、ハプテン、タンパク質または化学的に反応性の部分が含まれる。「タグ」は本明細書において規定される場合、本明細書に規定されるような「捕獲エレメント」に結合し得る。本発明によれば、「タグ」および「捕獲エレメント」は、結合対として機能する。例えば、一実施形態では、捕獲エレメントがビオチンである場合、対応するタグはアビジンである。あるいは、別の実施形態では、捕獲エレメントが抗体である場合、対応するタグは抗原である。
本明細書において用いる場合、「固体支持体」とは、分子（例えば、捕獲エレメント）が可逆的に結合し得る表面を意味し、これには、膜、セファロースビーズ、磁気ビーズ、組織培養プレート、シリカベースのマトリックス、膜ベースの材料、限定はしないがスチレン、ラテックスまたはシリカベースのマトリックスを含む表面を含むビーズ、および他のポリマー、例えば、酢酸セルロース、テフロン、ポリ二フッ化ビニリデン、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエステル、カルボネート、ポリスルホン、金属、ゼオライト、紙、アルミナ、ガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド、プラスチック、濾紙、デキストラン、ゲルマニウム、シリコン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ガリウムヒ素、ガリウムリン、酸化ケイ素、硝酸ケイ素ならびにそれらの組み合わせが含まれるがこれらには限定されない。本明細書に規定されるような捕獲エレメントを結合する方法は、当分野で周知であり、本明細書の下記に規定される。さらなる固体支持体も本明細書において下記に考察される。
本明細書において用いる場合、「親和性対」とは、部分の間に存在する引力の結果として可逆的に結合し得る部分の対（例えば、相補的な核酸配列、タンパク質−リガンド、抗体−抗原、タンパク質サブユニット、および核酸結合タンパク質−結合部位）を言う。「親和性対」としては、結合部分と対応する捕獲エレメントとの組み合わせ、およびタグと対応する捕獲エレメントとの組み合わせが含まれる。
親和性対が、互いと可逆的に相互作用する相補的な核酸領域を含む実施形態では、標的核酸結合配列、および親和性対を含む核酸配列の長さは、予測（ｐｒｏｊｅｃｔｅｄ）ハイブリダイゼーションアッセイの条件下でプローブの適切な熱力学関数について選択される。ハイブリダイゼーションアッセイの当業者は、妥当な条件としては、プローブ、標的および溶質濃度、検出温度、変性剤および体積排除剤（ｖｏｌｕｍｅ ｅｘｃｌｕｄｅｒ）の存在、ならびに他のハイブリダイゼーション影響因子が含まれることを理解する。標的核酸結合配列の長さは、７〜約１０，０００ヌクレオチド、好ましくは８〜５０００、９〜５００、９〜２５０、そして最も好ましくは、１０〜１４０ヌクレオチドの範囲でもよい。このプローブがまた対立遺伝子識別プローブである場合、この長さは、下記に考察されるとおり、さらに制限される（この文章は、論理において、結合部分：捕獲エレメントの概念からプローブ：標的の概念にジャンプしている）。
親和性対が互いに可逆的に相互作用する相補的な核酸領域を含み、かつ標的核酸にハイブリダイズもできず、標的核酸に相補的でもない実施形態では、親和性対の相補的な核酸領域配列は、アッセイの条件下および検出温度で、プローブが標的に結合されない場合、プローブの構造がプローブの結合部分が捕獲エレメントに結合しないような構造であるのに十分な長さの配列でなければならない（例えば、相補的な核酸配列が会合される）。用いられるアッセイ条件に依存して、３〜２５ヌクレオチド長の相補的な核酸配列は、この機能を果たし得る。４〜１５、そしてさらに好ましくは５〜１１のヌクレオチドという中間的な範囲がしばしば適切である。正確な長さが標的核酸結合配列に関して選択され、その結果プローブの二次構造は、標的核酸に対して結合したプローブを含む切断構造の切断が行われる温度で標的核酸に結合しない場合、安定である。標的核酸結合配列が１００ヌクレオチドまでサイズ増大するにつれて、相補的な核酸配列の長さは、１５〜２５ヌクレオチドまで増大し得る。１００ヌクレオチドを超える標的核酸結合配列については、相補的な核酸配列の長さは、さらに増大する必要はない。プローブがまた対立遺伝子識別プローブである場合、この相補的な核酸配列の長さは、下に考察されるとおり、さらに制限される。
標的核酸相補的配列に比べて、１つ以上のヌクレオチドミスマッチを含む標的様核酸配列に対して十分にハイブリダイズしない対立遺伝子識別プローブは、用いられるアッセイ条件下で、プローブ中の二次構造の減少または排除、および標的核酸とのハイブリダイゼーションが、標的核酸相補的配列が特定の反応条件下で完全に相補的な標的配列を見出す場合にのみ、効率的に生じるように設計されなければならない。特定の反応条件としては、例えば、対立遺伝子識別プローブが、標的と標的様配列との間を少なくとも単一のヌクレオチド相違で識別することを可能にする、実験的な最適化によって決定される特定の温度または温度範囲を含んでもよい。
一実施形態では、本発明による「対立遺伝子識別プローブ」とは、標的核酸から少なくとも１ヌクレオチドが変化する標的様核酸配列にハイブリダイズするプローブであって、この改変ヌクレオチドが、対立遺伝子識別部位に位置しないプローブを言う。本発明のこの実施形態によれば、「対立遺伝子識別プローブ」は、特定の反応条件下で対立遺伝子識別部位における少なくとも１つのヌクレオチドでまた変化する標的様核酸配列に効率的に結合できない。特定の反応条件としては、例えば、対立遺伝子識別プローブが標的と標的様配列との間を少なくとも単一のヌクレオチド相違で識別することを可能にするための、実験最適化によって決定される特定の温度または温度の範囲を挙げることができる。
本発明の一実施形態では、本発明による対立遺伝子識別プローブは好ましくは、標的核酸結合配列を６〜５０個、そして好ましくは７〜２５個のヌクレオチド、そして３〜８個のヌクレオチドの相補的な核酸配列を含む。二次構造のグアノシン−シチジン含量およびプローブ標的ハイブリッド、塩およびアッセイ温度は全て考慮されるべきであり、例えば、マグネシウム塩は、短い、対立遺伝子識別プローブを設計する場合考慮することが特に重要である強力な安定化効果を有する。
対立遺伝子識別プローブが、約５０ヌクレオチド長の標的核酸結合配列を有する場合、この配列は、識別されるべき単一のヌクレオチドミスマッチが標的核酸相補的配列の中央またはその付近で生じるように設計すべきである。例えば、２１ヌクレオチド長である配列を含むプローブは、好ましくは、そのミスマッチが標的核酸相補的配列の１４の最も中心に位置するヌクレオチドの１つに対向して、そして最も好ましくは、７つの最も中心に位置するヌクレオチドの１つに対向して生じるように設計すべきである。標的核酸結合配列／標的様核酸結合配列の中央または中央付近に識別されるべきミスマッチが生じるプローブを設計することは、対立遺伝子識別プローブの能力を改善すると考えられる。
本明細書において用いる場合、「ヌクレアーゼ」または「切断剤」とは、すなわち、本発明によるいわゆる切断構造を切断するという点で特異的であり、標的核酸にハイブリダイズしていないプローブまたはプライマー、あるいはプローブまたはプライマーにハイブリダイズされない標的核酸を実質的に切断しないという点で特異的でない酵素を言う。「ヌクレアーゼ」という用語は、例えばＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｓ（Ｔｔｈ）、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（ＴｆＩ）由来のＤＮＡポリメラーゼのような、５’エンドヌクレアーゼ活性を保有する酵素を含む。ヌクレアーゼという用語はまた、ＦＥＮヌクレアーゼを包含する。「ＦＥＮヌクレアーゼ」という用語は、５’エキソヌクレアーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を保有する酵素を含む。「ＦＥＮヌクレアーゼ」という用語はまた、５’フラップ−特異的ヌクレアーゼを体現する。本発明によるヌクレアーゼまたは切断剤としては、限定はしないが、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ヒト、マウス、またはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素が含まれる。本発明によるヌクレアーゼとしてはまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＲＡＤ２、ＰｏｌＩ ＤＮＡポリメラーゼ会合５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびＦＥＮのファージ機能性ホモログ（Ｔ５ ５’ →３’エキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ、およびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない）も含まれる。好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、およびＢｃａ ＦＥＮヌクレアーゼの５’ →３’エキソヌクレアーゼドメインのみを用いる。「ヌクレアーゼ」という用語は、ＲＮＡｓｅＨを含まない。
本明細書において用いる場合、「捕獲された」とは、捕獲エレメントによる結合部分の捕獲、または捕獲エレメントによるタグの捕獲についていう場合、例えば、タンパク質とリガンド、抗体と抗原、タンパク質サブユニット、核酸結合タンパク質と核酸結合部分との間、または相補的な核酸の間の水素結合、共有結合による、または相互作用を介した特異的な結合であって、この相互作用する対の１つの部分が固体支持体に結合される結合を意味する。安定な捕獲の条件下で、結合は、少なくとも約１×１０３Ｍ−１、通常は少なくとも１×１０４Ｍ−１、典型的には少なくとも１×１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１×１０６Ｍ−１〜１×１０７Ｍ−１以上という解離定数（ＫＤ）で、安定な条件下でヘテロ二量体の形成を生じる。本明細書に記載されるような捕獲エレメントと、本明細書に規定されるような結合部分またはタグとの間の結合反応を行う方法は、当分野で周知であり、かつ本明細書において下に記載される。本明細書に規定されるような固体支持体に対する本発明による捕獲エレメントを結合する方法は、当分野で周知であり、かつ本明細書において下に規定される。
本明細書中で用いる場合、「野生型」とは、遺伝子または遺伝子産物であって、天然に存在する供給源から単離された場合、その遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する（すなわち、遺伝子配列を有し、またはコードし、または酵素の配列または活性を保有する）遺伝子または遺伝子産物を言う。
本発明による「５’フラップ特異性ヌクレアーゼ」（本明細書中では「フラップ特異性ヌクレアーゼ」ともいう）は、５’一本鎖として突出する一本鎖フラップを取り除くことができるエンドヌクレアーゼである。本発明の一実施形態では、本発明によるフラップ特異性ヌクレアーゼはまた、偽Ｙ（ｐｓｅｕｄｏ−Ｙ）構造を切断することができる。本発明のフラップ特異性ヌクレアーゼの基質は、標的核酸およびオリゴヌクレオチドプローブであって、その標的核酸に相補的である領域を含む、本明細書に規定されるような標的核酸およびオリゴヌクレオチドプローブを含む。別の実施形態では、本発明によるフラップ特異的なヌクレアーゼの基質は、標的核酸、その標的核酸に相補的である上流オリゴヌクレオチド、および下流プローブであって、本発明に従う、標的核酸に相補的である領域を含むものを含む。一実施形態では、この上流のオリゴヌクレオチドおよび下流のプローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、この上流のオリゴヌクレオチドおよび下流のプローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする。
本明細書において用いる場合、「隣接」とは、２０ヌクレオチド未満、例えば、１５ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、５ヌクレオチド、または０ヌクレオチドで隔てられることを言う。
本発明によるフラップ特異的なヌクレアーゼの基質はまた、標的核酸と、第二の核酸（その一部は標的核酸と特異的にハイブリダイズする）と、標的核酸と特異的にハイブリダイズする第三の核酸からのプライマー伸長産物とを含む。
本明細書で用いる場合、「切断構造」とは、フラップ、ループ、一本鎖バブル、Ｄループ、ニック、またはギャップを含む一本鎖領域を有する少なくとも二本鎖核酸を含むポリヌクレオチド構造（例えば、図１に例示される）を言う。従って、本発明の切断構造は、分岐した核酸のフラップ鎖を含むポリヌクレオチド構造を含み、ここで５’一本鎖ポリヌクレオチドフラップは、その構造の二本鎖部分との接合部付近の位置から伸長し、そして好ましくは、フラップは検出可能な標識で標識されている。本発明による切断構造のフラップは、好ましくは、約１〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜２０ヌクレオチドであり、そして好ましくは、この分岐した構造の「肘部」に位置するリン酸に位置する位置で、またはフラップ鎖の肘部の近位および／もしくは遠位に位置する１〜１０個のリン酸のいずれかで切断される。本明細書において用いる場合、「肘部」とは、５’フラップの第一の一本鎖ヌクレオチドと第一の二本鎖（例えば、標的核酸にハイブリダイズする）ヌクレオチドとの間のリン酸結合を言う。一実施形態では、切断構造のフラップは、標的核酸にハイブリダイズできない。
本発明の一実施形態による切断構造は好ましくは、標的核酸を含み、そしてまた、標的核酸に対して相補的である領域を介して標的核酸と特異的にハイブリダイズする、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブ、およびこのハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブから伸長するフラップを含んでもよい。本発明の別の実施形態では、切断構造は、標的核酸（例えば、図４のＢ）、標的配列に相補的である上流オリゴヌクレオチド（例えば、図４のＡ）、および本発明による下流オリゴヌクレオチドプローブを含み、標的配列（例えば、図４のＣ）に相補的である領域を含む。一実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、この上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする。
本発明による切断構造は、本発明の下流オリゴヌクレオチドプローブから伸長するフラップを含むポリヌクレオチド構造（このフラップは、核酸ポリメラーゼの合成活性によって、上流オリゴヌクレオチドの伸長により形成される）、および引き続く、部分的な下流オリゴヌクレオチドの５’末端の部分的な置換を含むポリヌクレオチド構造であってもよい。このような切断構造では、下流オリゴヌクレオチドは、この下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を妨げるために３’末端でブロックされ得る。
本発明の一実施形態による切断構造は、標的核酸とオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイズによって形成され得、ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、そしてさらに前記標的核酸にアニーリングする結合部分および相補的領域、ならびに標的核酸にアニーリングせず５’フラップを形成する非相補的領域を含む。
切断構造はまた、フラップの上流鎖（本明細書中ではフラップ隣接鎖またはプライマー鎖という）が存在しない場合に形成される偽Ｙ構造、およびギャップまたはニックを含む二本鎖ＤＮＡ基質であってもよい。本明細書において用いる場合、「切断構造」は、３’一本鎖フラップのみを有する二本鎖核酸構造を含まない。本明細書において用いる場合、「切断構造」はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含むので、ＲＮＡであっても、またはＤＮＡであってもよい。
本発明による切断構造は、標的核酸配列にハイブリダイズし得る上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）が、標的核酸にアニーリングする本発明の下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）の１塩基対に対して同一である重複するフラップであってもよく、この重複は一本鎖フラップの伸長のポイントの直接下流である。
本発明の一実施形態による切断構造は、以下のステップによって形成される。１．ａ）上流の３’末端、好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの下流１０，０００ヌクレオチド以内に位置し、かつ少なくとも１つの検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプローブ、ｃ）標的配列が上流プライマーおよび下流プローブの両方に対して少なくとも部分的に相補的である適切な標的核酸、およびｄ）適切な緩衝液を、核酸配列をオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下でインキュベートするステップと、２．新規に合成された上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端が下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端の少なくとも一部（すなわち、少なくとも１〜１０ヌクレオチド）に隣接するかおよび／またはその少なくとも一部を置換するようなポリメラーゼ、例えば、ＲＴの合成活性によって上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端を伸長させるステップ。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は、本発明による特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に好都合である。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端でブロックして、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。
本発明の別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸配列を、少なくとも１つの検出可能な標識を有し、かつ、この標的核酸とはアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補的５’領域およびこの標的核酸配列にアニーリングする相補的３’領域をさらに含むオリゴヌクレオチドと共にインキュベートすることによって調製することができる。
本発明の別の実施形態では、本発明による切断領域は、標的核酸を、下流オリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、さらに、結合部分と、標的核酸とはアニーリングせずに５’フラップを形成する非相補的５’領域と、標的核酸にアニーリングする相補的３’領域とを含む）と、上流オリゴヌクレオチドプライマーを共にインキュベートすることによって調製されることができる。一実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする。
本発明の別の実施形態では、切断構造は、以下のステップによって形成される。１．ａ）プロモーター領域の下流１０，０００ヌクレオチド以内に位置し、かつ少なくとも１つの検出可能な標識を含むオリゴヌクレオチドプローブと、ｂ）適切な標的核酸であって、その標的配列がプロモーター領域を含み、下流プローブに対して少なくとも部分的に相補的である適切な標的核酸と、ｃ）適切な緩衝液とを、核酸配列をオリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズでき、かつ、プロモーター領域がＲＮＡポリメラーゼに結合できる条件下でインキュベートするステップと、２．新規に合成されたＲＮＡの合成された３’末端が下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端の少なくとも一部（すなわち、少なくとも１〜１０ヌクレオチド）に隣接するかおよび／またはその少なくとも一部を置換するようなＲＮＡポリメラーゼの合成活性によってＲＮＡを合成させるステップ。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は、本発明による特定のＲＮＡポリメラーゼによる鎖置換に好都合である。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端でブロックして、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。
本発明の好ましい実施形態では、切断構造は標識される。本発明の一実施形態による標識切断構造は、以下のステップによって形成される。１．ａ）上流の伸長可能な３’末端、例えば、オリゴヌクレオチドプライマーと、ｂ）標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有する標識プローブであって、さらに、好ましくは上流プライマーの下流１０，０００以内、より好ましくは５００ヌクレオチド以内に位置する結合部分をさらに含む標識プローブと、ならびにｃ）適切な標識核酸であって、その標識配列がプライマーおよび標識プローブの両方に相補的である標識核酸と、ならびにｄ）適切な緩衝液とを、核酸配列がプライマーにハイブリダイズできる条件下でインキュベートするステップと、本発明の一実施形態では、２．上流プライマーの新規に合成された３’末端が下流プローブの５’末端を部分的に置換するようなポリメラーゼの合成活性によって上流プライマーの３’末端を伸長させるステップ。本発明の方法によれば、緩衝液および伸長温度は、本発明による特定の核酸ポリメラーゼによる鎖置換に好都合である。好ましくは、下流オリゴヌクレオチドを３’末端でブロックして、下流オリゴヌクレオチドの３’末端の伸長を防止する。一実施形態では、この上流プライマーおよび下流プローブは、標的核酸の非重複性の領域にハイブリダイズする。
別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブであって、結合部分と、標的核酸にアニーリングせず５’フラップを形成する非相補的な標識された５’領域と、標的核酸にアニーリングする相補的な３’領域とをさらに含むプローブとをインキュベートすることによって調製され得る。別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、下流プローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、さらに、結合部分と、標的核酸にアニーリングせず５’フラップを形成する非相補的な標識された５’領域と、標的核酸にアニーリングする相補的な３’領域とを含む）と、上流オリゴヌクレオチドプライマーとをインキュベートすることによって調製され得る。一実施形態では、この上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、この上流のオリゴヌクレオチドおよび下流のプローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする。
本明細書において用いる場合、「シグナルを発生する」とは、サンプル中の標的核酸の存在の指標として、切断構造から遊離される遊離核酸フラグメントを検出および／または測定することを言う。一実施形態では、シグナルを発生するとはまた、固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される遊離核酸フラグメントを検出および／または測定することを言う。
本明細書において用いる場合、「サンプル」とは、対象の核酸（標的核酸）を含むかもしくは含むと予想されるか、またはそれ自体が対象の標的核酸配列を含むかもしくは含むと予想される核酸である任意の物質を言う。従って、「サンプル」という用語は、核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物体、組織、液体、または物質（例えば、限定はしないが、血漿、血清、髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便；皮膚、気管、腸および尿生殖路の外分泌物；唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養成分のサンプル、天然の単離物（飲料水、海水、固体物質など）、微生物試料、ならびに核酸トレーサー分子で「マークされた」対象物または試料を含む）のサンプルを含む。
本明細書において用いる場合、「標的核酸」または「テンプレート核酸配列」とは、複製、増幅、および／または検出されるべき核酸の領域を言う。１つの実施形態では、「標的核酸配列」または「テンプレート核酸配列」は、増幅に用いられる２つのプライマー配列の間に存在する。
いくつかの実施形態では、「標的核酸」は、３’から５’の順序で、第一のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である第一の領域と、伸長領域と、第二のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的な第二の領域を含む。この標的核酸は、１本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含んでもよい。
本明細書において用いる場合、「第一の領域」とは、標的核酸についていう場合、第一のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよび伸長を可能にするのに十分な長さのヌクレオチドを意味し、ここで「第一の領域」は、本明細書に規定される第一のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的である。「第一の領域」は、約６ヌクレオチドから約１０００ヌクレオチド長の範囲であり、ここで好ましい範囲とは約８〜３０ヌクレオチド、そして最適には１０〜２５ヌクレオチドの範囲である。
本明細書において用いる場合、「伸長領域」とは、核酸重合化活性を介して、オリゴヌクレオチド（例えば、第一のオリゴヌクレオチドまたは第二のオリゴヌクレオチドの遊離されたフラップ）の伸長を可能にするのに十分な長さのヌクレオチドを言う。「伸長領域」とは、約１ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長の範囲であり、ここで好ましい範囲は約１〜１００ヌクレオチド、さらに好ましい範囲は３〜５０、そして最適には、５〜１０ヌクレオチド長の範囲である。「伸長領域」は、プライマーの３’末端と下流オリゴヌクレオチド（すなわち、第二の領域にハイブリダイズする）とが、本発明の切断方法によりフラップ（下流オリゴヌクレオチドの５’末端）が切断されるために十分近くに位置するようなところまで、上流プライマー（例えば、本明細書において規定されるような、第一のオリゴヌクレオチド、または第二のオリゴヌクレオチドの遊離されたフラップ）が伸長領域に相補的な核酸の重合を介して伸長されない限り、本発明の切断方法が下流オリゴヌクレオチド（例えば、第二のオリゴヌクレオチド）を切断することができないような長さの領域である。
本明細書において用いる場合、「第二の領域」とは、標的核酸についていう場合、第二のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な長さのヌクレオチドであって、ここで「第二の領域」が、本明細書に規定される第二のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であるヌクレオチドを意味する。「第二の領域」は、約６ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド長の範囲であり、好ましくは、約８〜３０ヌクレオチド、そして最適には、１０〜２５ヌクレオチドの範囲である。
本明細書において用いる場合、「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を言う。一般に、この酵素は、標的配列にアニーリングしたプライマーの３’末端での合成を開始し、テンプレートに沿った５’方向に進行し、そして５’→３’ヌクレアーゼ活性を有する場合、合成が終結するまで、介在するアニーリングしたプローブを加水分解して標識および未標識プローブフラグメントの両方を遊離する。公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。「核酸ポリメラーゼ」という用語はまた、ＲＮＡポリメラーゼを含む。核酸テンプレートがＲＮＡであるならば、「核酸ポリメラーゼ」とは、逆転写酵素のようなＲＮＡ依存性の重合化活性を言う。
公知の逆転写酵素としては、例えば以下が含まれる。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ。
本明細書において用いる場合、「ＲＮＡポリメラーゼ」という用語は、ＲＮＡ分子の重合化を触媒する酵素を指す。ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼを含む。本発明における使用に適切なＲＮＡポリメラーゼとしては、バクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼコア酵素、およびヒトＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ヒトミトコンドリアのＲＮＡポリメラーゼおよびＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼ（ＨＣＶ由来）が含まれる。
本明細書において用いる場合、「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性」または「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性」とは、いくつかのＤＮＡポリメラーゼに伝統的に関連するテンプレート特異性核酸ポリメラーゼの活性（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性）であって、それによってモノヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが連続的にポリヌクレオチドの５’末端から除去され（すなわち、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩはこの活性を有するがクレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９７０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６５：１６８）フラグメントは有さない（Ｋｌｅｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：３７１））、またはポリヌクレオチドが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に固有に存在し得るヌクレオチド末端結合分解活性によって５’末端から除去される活性を言う。
本明細書において用いる場合、「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く」「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く」とは、野生型酵素活性の１０％、５％、１％、０．５％、または０．１％未満であることを意味する。「５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を欠く」または「５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く」とは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が検出不可能であるか、野生型酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の約１％、０．５％、または０．１％であることを意味する。
構造的に特異的なエンドヌクレアーゼ活性を検出するために、フラップ構造からなるＤＮＡテンプレート（下流フラップオリゴヌクレオチドは、５’末端で放射性標識される）を使用する。この反応は、ｄＮＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて行う（上流プライマーを伸ばすため）。放射性標識された切断産物は、ゲル電気泳動によって可視化する（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８）。
あるいは、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、均一に標識され、さらにニックを入れられた二本鎖ＤＮＡを用いてアッセイされる。ｄＮＴＰの有無におけるＤＮＡポリメラーゼによる放射性活性（ＴＣＡ可溶性ｃｐｍ）の遊離を測定する。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有する非プルーフリーディング（ｎｏｎ−ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ）ＤＮＡポリメラーゼを、ｄＮＴＰの存在下で生じる重合反応によって１０倍以上刺激する（ｄＮＴＰの存在下で遊離されるｃｐｍが増大する）。３’→５’エキソ活性を有するプルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼは、ｄＮＴＰの存在下で生じる付属する重合化によって完全に阻害される（ｄＮＴＰの存在下で放出されるｃｐｍが減少する）（米国特許第５，３５２，７７８号）。
本発明に従って有用なヌクレアーゼとしては、５’エンドヌクレアーゼ活性を保有する任意の酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＥ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）由来のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明による有用なヌクレアーゼとしてはまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが含まれ、これには、限定はしないが、真正細菌のＤＮＡポリメラーゼＩが含まれ、これには、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来の酵素（Ｔａｑ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｃａ（ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｔｂｒ（ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来の酵素（Ｂｓｔ、Ｂｃａ、Ｍａｇｅｎｔａ（全長ポリメラーゼ、ＮＯＴ Ｎ短縮バージョン））、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来の酵素（Ｔｍａ（ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｎｅ（ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ））およびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩが含まれる。ヌクレアーゼという用語はまた、ＦＥＮヌクレアーゼを体現している。本発明に従って有用なさらなる核酸ポリメラーゼは、下の「核酸ポリメラーゼ」と題された項に含まれる。
本明細書において用いる場合、「切断」とは、切断構造を別個の（すなわち、リン酸ジエステル結合によって他のフラグメントまたは核酸と物理的に連結していない）フラグメントまたはヌクレオチドと、切断構造から遊離されるフラグメントとに酵素的に分離することを言う。例えば、標識切断構造の切断は、本発明による、そして以下に定義された標識された切断構造を、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド由来のフラグメントを含む別個のフラグメントへ分離されることを言うか、または、別個のフラグメントの１つが、標的核酸配列由来であるか、および／または標識フラグメントに存在する標識部分の検出に適切な当分野で周知であり本明細書中に記載される方法によって検出および／または測定することができる、標的核酸と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド由来の標識核酸フラグメントであるフラグメントへ分離されることを言う。
本明細書において用いる場合、「エンドヌクレアーゼ」とは、核酸分子内の結合、好ましくは、リン酸ジエステル結合を切断する酵素を言う。本発明に従うエンドヌクレアーゼは、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに特異的であり得る。
本明細書において用いる場合、「エキソヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド間の結合、好ましくは、リン酸ジエステル結合をポリヌクレオチドの末端から１つずつ切断する酵素を言う。本発明によるエキソヌクレアーゼは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子の５’または３’末端に特異的であり得るので、本明細書中では５’エキソヌクレアーゼまたは３’エキソヌクレアーゼと呼ぶ。
本明細書において用いる場合、「切断手段」とは、本発明による切断構造に特異的である、すなわち切断構造を切断する薬剤、好ましくは酵素を言う。
本明細書において用いる場合、「フラップ」とは、二本鎖核酸分子から伸長する一本鎖ＤＮＡの領域を言う。本発明によるフラップは、好ましくは約１〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜２５ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１０〜２０ヌクレオチドである。
好ましい実施形態では、結合部分はタグである。
別の好ましい実施形態では、この結合部分は、捕獲エレメントに結合する核酸配列である。
本発明はまた、標的核酸を検出または測定する方法を提供し、この方法は以下のステップを含む。標的核酸を含むサンプルと前記標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブとをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップであって、前記プローブがさらに結合部分を含むステップと、前記切断構造をヌクレアーゼで切断して、核酸フラグメントを遊離させるステップであって、前記切断が切断温度で行われ、前記プローブの二次構造は、標的核酸に結合されない場合、切断温度以下で安定であるステップと、前記サンプル中の標的配列の存在の指標として固体支持体上で捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって、捕獲されたフラグメントの量を検出および／または測定するステップ。
本明細書において用いる場合、「標的核酸配列を検出する」または「標的核酸配列を測定する」とは、サンプル中の特定の標的核酸の存在の決定、またはサンプル中の標的核酸の存在の指標としてのこのサンプル中の特定の標的核酸の量の決定を言う。測定または検出することができる標的核酸の量は好ましくは、約１分子〜１０２０分子、より好ましくは約１００分子〜１０１７分子、最も好ましくは約１０００分子〜１０１４分子である。本発明の一実施形態によれば、検出される核酸は、本発明による切断構造の下流プローブ（例えば、図４のＣ）の標識５’末端由来であり、これは標的核酸が本発明による切断構造の上流プローブ（例えば、図４のＡ）の３’伸長に置換されている。本発明によれば、本発明による切断構造を含む下流プローブ（例えば、図４のＣ）の５’末端に標識が結合している。あるいは、下流プローブの３’末端に標識が結合し、そして下流プローブの５’フラップにクエンチャーが結合している。本発明によれば、本発明による切断構造を含む下流プローブの３’末端（例えば、図４のＣ）に標識を結合させてもよい。
本発明によれば、下流プローブ（例えば、図４のＣ）を内部標識してもよい。好ましい実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、前記標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブ（前記プローブは、前記標的核酸にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補的な標識の５’領域および前記標的核酸にアニーリングする相補的な３’領域をさらに含む）とをインキュベートすることによって調製され得る。本発明のこの実施形態によれば、検出される核酸は、プローブの標識された５’フラップ領域由来である。好ましくは、標的核酸配列の量と切断され検出された核酸によって発生したシグナルとの間に直接的な相関関係が存在する。
別の実施形態では、このプローブは、オリゴヌクレオチドプローブが変性している（例えば、プローブの二次構造における変化に起因する）間または加水分解の間に標識を分離できるように位置決めされた１対の相互作用標識（例えば、ＦＲＥＴ、または非ＦＲＥＴ対）で標識される。本明細書において用いる場合、「固体支持体上の捕獲エレメントによって捕獲されるフラグメントの量を検出すること」、または「固体支持体上の捕獲エレメントによって捕獲されるフラグメントの量を測定すること」、または「固体支持体上の捕獲エレメントによって捕獲されるフラグメントの量を検出すること」、または「固体支持体上の捕獲エレメントによって捕獲されるフラグメントの量を測定すること」とは、サンプル中の標識フラグメントもしくは未標識フラグメントの存在を決定すること、またはサンプル中の標識フラグメントもしくは未標識フラグメントの量を決定することを言う。当分野で周知でありかつ本明細書中に記載の方法を用いて、固体支持体上の捕獲エレメントに対して結合した標識または未標識のフラグメントの遊離を、あるいは固体支持体上の捕獲エレメントからの標識または未標識のフラグメントの遊離後に検出または測定し得る。本明細書に記載される検出方法は、フラグメントを検出するように機能し、ここでフラグメントの量は、反応中で発生するフラグメントの割合が小さくても大きくても検出される。標識されたフラグメントの遊離を検出または測定する方法は、固体支持体上の捕獲エレメントに対して結合した標識フラグメントに存在する標識部分を測定または検出するために適切である。非標識フラグメントの検出または測定の方法としては、例えば、ゲル電気泳動、またはハイブリダイゼーション（当分野で周知の方法に従う）が含まれる。本発明に記載される検出方法は、遊離されたフラグメントの１または２モル程度（最大１〜２百万まで、例えば、１０、１００、１０００、１０，０００、百万）が検出される場合、機能する。
本明細書において用いる場合、「標識（された）フラグメント」とは、本発明による標識された切断構造由来の切断されたモノヌクレオチド、または小さなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドをいい、この切断されたオリゴヌクレオチドは好ましくは、ヌクレアーゼによって切断構造から切断される、約１〜１０００ヌクレオチド、より好ましくは約５〜５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは約１６〜１８ヌクレオチドであり、これは、当分野で周知でありかつ本明細書中に記載の方法によって検出することができる。一実施形態では、プローブは、二分子または多分子プローブであり、ここで前記プローブを含む第一の分子は、フルオロフォアで標識され、そして前記プローブを含む第二の分子は、クエンチャーで標識される。本明細書において用いる場合、「サブプローブ」および「サブクエンチャー」とは、本発明に従う二分子または多分子のプローブの第一の分子をいい、これは、フルオロフォアおよび本発明による二分子または多分子プローブの第二の分子（それぞれクエンチャーで標識される）で標識される。この実施形態によれば、標的核酸に対する二分子または多分子プローブの結合、およびヌクレアーゼによる切断の後、このサブプローブおよびサブクエンチャーは、互いから解離し（すなわち、サブプローブとサブクエンチャーとの間の距離が増大する）、そしてこの解離、ならびにサブプローブおよびサブクエンチャーの引き続く分離の結果としてシグナルが発生される。
好ましい実施形態では、この結合部分はタグである。
別の好ましい実施形態では、この結合部分は、捕獲エレメントに結合する核酸配列である。
好ましい実施形態では、この方法はさらに、核酸ポリメラーゼを含む。
別の好ましい実施形態では、この切断構造はさらに、５’フラップを含む。
別の好ましい実施形態では、この切断構図はさらに、オリゴヌクレオチドプライマーを含む。
別の好ましい実施形態では、この二次構造は、ステム・ループ構造、ヘアピン構造、内部ループ、バルジ・ループ、分枝構造、ジュードノット構造、またはクローバー葉構造からなる群より選択される。
別の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＦＥＮヌクレアーゼである。
別の好ましい実施形態では、ＦＥＮヌクレアーゼは、Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ヒト、マウス、またはＸｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ由来のＦＥＮヌクレアーゼ酵素からなる群より選択される。本発明によるＦＥＮヌクレアーゼとしてはまた、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＲＡＤ２、ＰｏｌＩ ＤＮＡポリメラーゼ会合５’→３’エキソヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、およびＦＥＮのファージ機能性ホモログ（Ｔ４、Ｔ５ ５’→３’エキソヌクレアーゼ、Ｔ７遺伝子６エキソヌクレアーゼ、およびＴ３遺伝子６エキソヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない）も含まれる。
好ましくは、Ｔａｑ、Ｔｆｌ、およびＢｃａ ＦＥＮヌクレアーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼドメインのみを用いる。
別の好ましい実施形態では、プローブはさらにレポーターを含む。
別の好ましい実施形態では、このレポーターはタグを含む。
別の好ましい実施形態では、このフラグメントは、捕獲エレメントに対するタグの結合によって捕獲される。
別の好ましい実施形態では、シグナルを発生し得る少なくとも１つの標的部分を含む切断構造が形成される。
別の好ましい実施形態では、プローブが標的核酸に結合されない場合に検出シグナルを消光するようにプローブ上に効率的に配置される、１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、切断構造が形成される。
別の好ましい実施形態では、標識部分は、ヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって隔てられ、その結果、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が、前記ヌクレアーゼ切断に感受性である部位を切断することにより、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することが可能になり、それによって検出可能なシグナルが発生する。
上記のような、１対の相互作用性シグナル発生標識部分の存在によって、捕獲エレメントに結合し得るアニーリングされた未切断のプローブと、捕獲エレメントに結合される遊離された標識フラグメントとを識別することが可能になる。
別の好ましい実施形態では、相互作用性シグナル発生部分の対は、消光部分および蛍光部分を含む。
本発明はまた、サンプル中の標的核酸を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応プロセスを提供する。このプロセスは、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブを含む切断構造を提供するステップを含み、前記プローブはさらに結合部分、１セットのオリゴヌクレオチドプライマーを含み、ここで第一のプライマーが標的核酸の１つの鎖における領域に相補的である配列を含み、かつ相補的ＤＮＡ鎖の合成を開始し、そして第二のプライマーが、標的核酸の第二の鎖における領域に相補的な配列を含み、かつ相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始する。このプロセスはまた、以下のＰＣＲサイクルステップに許容的な条件下で、テンプレート依存性重合剤として核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸を増幅するステップ、（ｉ）標的核酸内に含まれるテンプレート核酸配列に対する増幅に必要なプライマーのアニーリングと、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼにプライマー伸長産物を合成させ、前記プライマーを伸長するステップと、（ｉｉｉ）前記切断構造からの標識フラグメントの遊離用の切断剤としてヌクレアーゼを使用して切断構造を切断し、それによって検出可能な標識フラグメントを作成するステップとを含む。このプロセスによれば、この切断は、切断温度で行われ、そして二次プライマーの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される遊離された、標識フラグメントの量は、サンプル中の標的配列の存在の指標として検出および／または測定される。
本明細書において用いる場合、「オリゴヌクレオチドプライマー」とは、核酸テンプレートにハイブリダイズ可能であり、かつ第２の核酸鎖の酵素合成を開始させる一本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を言う。本発明に従って有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、約６〜１００ヌクレオチド長、好ましくは約１７〜５０ヌクレオチド長、より好ましくは約１７〜４５ヌクレオチド長である。本発明による切断構造の形成に有用なオリゴヌクレオチドプローブは、約１７〜４０ヌクレオチド長、好ましくは約１７〜３０ヌクレオチド長、そしてより好ましくは約１７〜２５ヌクレオチド長である。
本明細書において用いる場合、「テンプレート依存性重合剤」とは、適切な塩、金属陽イオン、適切な安定剤、およびｐＨ緩衝系を含む反応媒体中での、適量の４つのデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）または本明細書中に記載のアナログの存在下で、オリゴヌクレオチドプライマーを伸長し得る酵素を言う。テンプレート依存性重合剤とは、プライマーおよびテンプレート依存性ＤＮＡ合成を触媒し、かつ５’→３’ヌクレアーゼ活性を保有することが公知の酵素である。好ましくは、本発明によるテンプレート依存性重合剤は、５’→３’ヌクレアーゼ活性を欠く。
本明細書において用いる場合、「増幅（する、ステップ）」とは、ポリメラーゼ連鎖反応の方法を含む核酸配列のさらなるコピーを作製することを言う。
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＦＥＮヌクレアーゼである。
好ましい実施形態では、結合部分はタグである。
別の好ましい実施形態では、この結合部分は、捕獲エレメントに結合する核酸配列である。
別の好ましい実施形態では、ステップｂのオリゴヌクレオチドプライマーは、フォワードプライマーが、切断構造の上流に位置し、かつリバースプライマーが切断構造の下流に位置するように方向付けられる。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、鎖置換活性を有する。
鎖置換活性を示し、かつ本発明に従って有用である核酸ポリメラーゼとしては、限定はしないが、「温度活性化」鎖置換活性を有する古細菌のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｐｆｕ、ＪＤＦ−３、ＫＯＤ（ＬＴＩの商標Ｐｆｘ）、Ｐｗｏ、９ ｄｅｇｒｅｅｓ Ｎｏｒｔｈ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓのエキソ・プラスおよびエキソ・マイナスのバージョン）、および鎖置換活性を有する真正細菌のＤＮＡポリメラーゼ（エキソ・マイナスのＢｓｔ、エキソ・マイナスのＢｃａ、Ｇｅｎｔａ、Ｋｌｅｎｏｗフラグメント、エキソ・マイナスのＫｌｅｎｏｗフラグメントエキソマイナスＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ））が含まれる。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
熱の好ましい実施形態では、このヌクレアーゼは熱安定性である。
本明細書において用いる場合、「熱安定性」とは、例えば、類似の活性を有する非熱安定性型の酵素と比較して、好ましくは約９０〜１００℃、より好ましくは約７０〜９８０Ｃほどの大きさの温度で安定かつ活性な酵素を言う。例えば、好温性生物、例えば、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ、またはＰ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来の熱安定性核酸ポリメラーゼまたはＦＥＮヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の核酸ポリメラーゼまたは哺乳動物ＦＥＮ酵素と比較して、高温でより安定でかつ活性である。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）から単離された代表的な熱安定性核酸ポリメラーゼは、米国特許第４，８８９，８１８号に記載され、従来のＰＣＲでのその使用法は、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７に記載されている。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）から単離された別の典型的な熱安定性核酸ポリメラーゼは、Ｌｕｎｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ，１０８：１−６に記載されている。さらなる典型的な熱安定性ポリメラーゼとしては、例えば、好温性細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｒ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（列挙した他の細菌よりも幾分低い至適温度を有する）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｒｕｂｅｎｓ、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａから、または好温性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓおよびＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓから抽出されたポリメラーゼが含まれる。
ＰＣＲサイクル中の高温（約９５℃）への暴露によって二本鎖核酸が変性される熱サイクルプロセスでは、温度安定性のポリメラーゼおよびＦＥＮヌクレアーゼが好ましい。
別の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはフラップ特異性ヌクレアーゼである。
別の好ましい実施形態では、このプローブはさらにレポーターを含む。
別の好ましい実施形態では、このレポーターはタグを含む。
別の好ましい実施形態では、このフラグメントは、捕獲フラグメントに対するこのタグの結合によって捕獲される。
別の好ましい実施形態では、シグナルを発生し得る少なくとも１つの標識部分を含む切断構造が形成される。
別の好ましい実施形態では、プローブが標的核酸に結合されない場合に検出シグナルを消光するようにプローブ上に効率的に位置される、１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、切断構造が形成される。
別の好ましい実施形態では、標識部分は、ヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって隔てられ、その結果、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が、このヌクレアーゼ切断に感受性である部位を切断することにより、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することが可能になり、それによって検出可能なシグナルが発生する。
別の好ましい実施形態では、相互作用性シグナル発生部分の対は、消光部分および蛍光部分を含む。
別の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、ＴａｑポリメラーゼおよびＰｆｕポリメラーゼからなる群より選択される。
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応プロセスを提供し、ここでは、標的核酸の増幅および検出が、同時に起きる（すなわち、リアルタイムの検出）。本発明はまた、標的核酸配列の検出前に標的核酸の増幅が生じる（すなわち、終点検出）ポリメラーゼ連鎖反応のプロセスを提供する。
本発明はまた、切断構造を同時に形成し、サンプル中で標的核酸を増幅し、そして切断構造を切断するためのポリメラーゼ連鎖反応のプロセスを提供する。前記プロセスは以下のステップを含む。（ａ）標的核酸の１つの鎖中の第一の領域に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマーと、前記標的核酸の同じ鎖中の第二の領域に相補的な下流標識プローブ（前記下流標識プローブは、前記標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を形成し得、前記プローブはさらに結合部分を含む）と、前記標的核酸の第二の鎖における領域に相補的な下流オリゴヌクレオチドプライマーを得るステップ。このプロセスのこのステップに従って、上流プライマーは、相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始し、そして下流プライマーは、相補的なＤＮＡ鎖の合成を開始する。前記プロセスはまた、（ｂ）固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって生成および捕獲される核酸を検出するステップを含む。検出される核酸は、標的核酸の増幅および切断を含む反応により生成され、この核酸ポリメラーゼは、以下のＰＣＲサイクルを許容する条件下で、テンプレート依存性重合剤であり、ステップ（ａ）の上流プライマーのプライマー伸長産物が、ステップ（ａ）の下流プローブと部分的に置き換わり、切断構造を形成させる。（ｉ）標的核酸配列内に対してプライマーをアニーリングさせるステップと、（ｉｉ）核酸ポリメラーゼがプライマー伸長産物を合成し、ステップ（ａ）のプライマーを伸長するステップ。この条件はまた、（ｉｉｉ）前記切断構造から検出可能な標識フラグメントを遊離させるための切断剤としてヌクレアーゼを使用し、前記切断構造を切断するステップにも許容的である。この切断は、切断温度で行われ、そしてプローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。
好ましい実施形態では、この切断構造はさらに５’フラップを含む。
本発明はまた、切断構造を形成する方法を提供し、この方法は以下のステップを含む。（ａ）標的核酸を提供するステップと、（ｂ）標的核酸に相補的な上流プライマーを提供するステップと、（ｃ）標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有する下流プローブを提供するステップであって、このプローブが結合部分をさらに含むステップと、（ｄ）標的核酸、上流プライマーおよび下流プローブをアニーリングさせるステップ。この切断構造は、切断温度でヌクレアーゼを用いて切断され得る。このプローブの二次構造は、標的核酸に結合されない場合、切断温度以下で安定である。
好ましい実施形態では、この切断構造は５’フラップを含む。
本発明はまた、標的核酸、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブ（このプローブはさらに結合部分を含む）、およびヌクレアーゼを含む組成物を提供する。この組成物のプローブおよび標的核酸は結合して、切断温度でヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成し得る。このプローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。
好ましい実施形態では、この組成物はさらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
別の好ましい実施形態では、前記プローブおよびオリゴヌクレオチドは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。
本発明はまた、サンプル中の標的核酸の存在の指標であるシグナルを発生させるためのキットを提供し、このキットは、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有するプローブ（このプローブはさらに、結合部分を含む）、およびヌクレアーゼを含む。このキットのプローブは、標的核酸に結合して、切断温度でヌクレアーゼによって切断され得る切断構造を形成し得る。プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。
好ましい実施形態では、このキットはさらにオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
別の好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＦＥＮヌクレアーゼである。
別の好ましい実施形態では、プローブは、少なくとも１つの標識部分を含む。
別の好ましい実施形態では、このプローブは、プローブが標的核酸に結合されない場合、検出可能なシグナルを消光するように効率的に位置された１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む。
別の好ましい実施形態では、標識部分は、ヌクレアーゼ切断に感受性である部位によって隔てられ、その結果、ヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性により、ヌクレアーゼ切断に対して感受性である部位での切断が起こり、第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することが可能になり、それによって検出可能なシグナルが発生する。
別の好ましい実施形態では、相互作用性シグナル発生部分の対は、消光部分および蛍光部分を含む。
本発明のさらなる特徴および利点は以下のとおりである。特許請求の範囲に記載の本発明は、標的核酸を検出および／または測定するためのシグナルの発生の方法を提供し、ここではシグナル発生がサンプル中の標的核酸の存在の指標である。特許請求の範囲に記載の本発明の方法は、複数のステップを必要としない。特許請求の範囲に記載の本発明はまた、標的核酸の存在の指標としてシグナルを発生させるステップを含む、標的核酸を検出および／または測定するためのＰＣＲベースの方法を提供する。特許請求の範囲に記載の本発明によって、標的核酸配列の同時増幅および検出および／または測定が可能である。特許請求の範囲に記載の本発明はまた、標的核酸を検出および／または測定するためのＰＣＲベースの方法を提供し、この方法は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す核酸ポリメラーゼの不在下でシグナルを発生させるステップを含む。本発明のさらなる特徴および利点は、以下の実施形態の記載およびその図面ならびに特許請求の範囲からより詳細に明らかとなる。
ＦＥＮヌクレアーゼ切断構造を示している。 ＦＥＮヌクレアーゼ活性を検出するために用いられ得る３つのテンプレート（標識１、２および３）を示している。 二次構造を示している。 本発明によるシグナルを発生させるための合成および切断の反応を図示する図である。 ＣＢＰタグ化したＰＦＵ ＦＥＮ−１タンパク質を示しているＳｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅ染色ポリアクリルアミドゲルである。 ＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフである。 ローリングサークル増幅のためのオープンサイクルプローブの説明図である。 ローリングサークル増幅の説明図である。 安全ピンプローブの説明図である。 配列ｔｃｇｃａｇｔｇｔｃ ｇａｃｃｔｇｃｇｃは配列番号３１である。 配列ｃａｇｃｃｇｔｃｇａ ｔｃｃｇｃａｇｇｔｃ ｇａｃａｃｔｇｃｃｇ ｔｃｇａｃｇｇｃｔｇは配列番号３２である。 配列ｇｃａｇｃｔｇｃｃｇ ａｃは配列番号３３である。 配列ｔｃｃｇｃａｇｇｔｃ ｇａｃａｃｔｇｃｃｇ ｔｃｇａｃｇｇｃｔｇは配列番号３４である。 スコーピオン・プローブの説明図である。 サンライズ／アンプリフロアー・プローブの説明図である。 二本鎖ＤＮＡ対一本鎖ＤＮＡの光吸光度における相違を示しているグラフである。 ＤＮＡ融解曲線を示すグラフである。 ＤＮＡの相対的な光学的吸収に対する温度の影響を示しているグラフである。 ＤＮＡの相対的な光学的吸収に対する温度の影響を示しているグラフである。 １対の相互作用標識で標識されたＤＮＡの蛍光に対する温度の影響を示しているグラフである。 １対の相互作用標識で標識されたＤＮＡの蛍光に対する温度の影響を示しているグラフである。 １対の相互作用標識で標識されたＤＮＡの蛍光に対する標的核酸の影響を示しているグラフである。
本発明は、核酸が核酸ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）およびヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）の組み合わせで処理される、サンプル中の標的核酸の存在を検出するためのシグナルを発生させる方法を提供する。本発明はまた、サンプル中での標的核酸配列の同時の増幅、切断および検出を可能にする、核酸を検出または測定するためのプロセスを提供する。
本発明の実施は、他に示さない限り、当分野の技術の範囲内である分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に詳細に例示される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第２版；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．，１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｙｄｉｚａｔｉｏｎ」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄ．，１９８４）；「Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ」（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；およびシリーズのＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，１９９５）を参照のこと。本明細書中で言及（上記および下記の両方）のされる全ての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中で参照により組み込まれる。
Ｉ．ヌクレアーゼ
本発明に従って有用なヌクレアーゼとしては、５’エンドヌクレアーゼ的な活性を保有する任意の酵素、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｕｓ（Ｔｔｈ）、およびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ（Ｔｆｌ）由来のＤＮＡポリメラーゼが含まれる。本発明に従って有用なヌクレアーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが含まれ、これには、限定はしないが、真正細菌のＤＮＡポリメラーゼＩが含まれ、これには、Ｔｈｅｒｍｕｓ種由来の酵素（Ｔａｑ、Ｔｆｌ、Ｔｔｈ、Ｔｃａ（ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）Ｔｂｒ（ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種由来の酵素（Ｂｓｔ、Ｂｃａ、Ｍａｇｅｎｔａ（全長ポリメラーゼ、ＮＯＴ Ｎ短縮バージョン））、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ種由来の酵素（Ｔｍａ（ｍａｒｉｔｉｍａ、Ｔｎｅ（ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ））およびＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩが含まれる。ヌクレアーゼという用語はまた、ＦＥＮヌクレアーゼを体現している。本発明に従って有用なヌクレアーゼは、標的核酸にハイブリダイズしないプローブもしくはプライマー、またはプローブもしくはプライマーにハイブリダイズされない標的核酸を切断できない。
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の骨格を特異的に認識し、二本鎖ＤＮＡの２つの鎖が一本鎖アームに隣接する接合点に存在する切断部位で前記アームを見つけ出す約４０ｋＤａの二価の金属イオン依存性エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼ的な活性およびエキソヌクレアーゼ的な活性の両方とも、フラップまたはニックの最も５’側の位置の塩基に対して感受性をほとんど示さない。ＦＥＮ−１のエンドヌクレアーゼ的およびエキソヌクレアーゼ的な基質結合および切断は両方とも、上流オリゴヌクレオチド（フラップ隣接鎖またはプライマー）によって刺激される。これはまた、Ｅ．ｃｏｌｉのｐｏｌＩの場合も同様である。酵素のエンドヌクレアーゼ活性は、５’フラップの長さとは独立し、１ヌクレオチドほどの小ささの５’フラップの切断も行う。このエンドヌクレアーゼ活性およびエキソヌクレアーゼ活性は、基質の化学的性質に非感受性であり、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を切断する。
エンドヌクレアーゼ的活性およびエキソヌクレアーゼ的活性の両方とも、生理学的な範囲の塩濃度で阻害される。０ｍＭのＮａＣｌと比較して５０ｍＭのＮａＣｌではエキソヌクレアーゼ活性が５０倍阻害される。エンドヌクレアーゼ活性は５０ｍＭのＮａＣｌで７倍しか阻害されない（Ｌｉｅｂｅｒ １９９７（前出）で概説）。
５’−ＯＨ末端は５’フラップ基質に対するＦＥＮ−１のローディングのための良好な基質であるが、それが二本鎖ＤＮＡ構造中のニックの一部でない場合は、極めて不十分な基質としてしか作用しない。末端リン酸塩の静電気的相反はＦＥＮ−１の基質の活性形態を与える基質の偽フラップ（ｐｓｅｕｄｏ−ｆｌａｐ）配置への基質の揺らぎ（ｂｒｅａｔｈｉｎｇ）に有利と考えられる。このような説明によって、単一の活性部位、およびニックのフラップまたは１つの偽フラップ配置の５’ｓｓＤＮＡ末端へのＦＥＮ−１の単一のローディング機構が示される。このモデルは、ニックでの至適活性には塩基の対合を不安定化してニックのフラップへの揺らぎに有利である非常に低いＭｇ２＋および１価の塩濃度が必要であるという所見と一致する。より高いＭｇ２＋および１価の塩濃度は揺らぎに不利であり、フラップへの変換に揺らぎが必要であるニック化またはギャップ化構造の切断を阻害する。安定フラップ構造の切断には、中程度のＭｇ２＋レベルが最適であり、Ｍｇ２＋濃度の増加に伴って切断は減少しない。これは、フラップ構造がその構造を達成するために塩基対を融解する必要がなく、そのため、Ｍｇ２＋に全く非感受性であるという理由である。エンドヌクレアーゼ的活性は１価の塩で減少するが、エキソヌクレアーゼ的活性で認められる減少ほど急な減少ではない。さらに、１ヌクレオチドフラップは有効な基質であることが以前に示されている。これらの所見の全ては、ＦＥＮ−１がエキソヌクレアーゼとして機能すると解釈される場合、分解産物のサイズは１〜数ヌクレオチド長に変化するという事実と一致している。ニックの種々の長さのフラップへの揺らぎは、Ｇ／Ｃ含量に依存する局所配列によって変化すると予想される。まとめると、一過性のフラップを形成するニックの揺らぎは、ＦＥＮ−１のエキソヌクレアーゼ的活性がエンドヌクレアーゼ的活性と同一であるということを意味する（Ｌｉｅｂｅｒ，１９９７（前出）に概説）。
ＦＥＮ−１のエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの活性は、補助タンパク質の必要なしに、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を切断する。しかし、複製フォークでは、ＦＥＮ−１は他のタンパク質（ＤＮＡヘリカーゼおよび増幅細胞核抗原（ＰＣＮＡ）、ＤＮＡポリメラーゼδおよびεの進化性因子（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ ｆａｃｔｏｒ）を含む）と相互作用する。ＰＣＮＡは、ＦＥＮ−１のエンドヌクレアーゼ的活性およびエキソヌクレアーゼ的活性を有意に刺激する。
ＦＥＮ−１酵素は、いくつかのより小さなバクテリオファージ５’→３’エキソヌクレアーゼ（例えば、Ｔ５ ５’エキソヌクレアーゼおよびＴ４ ＲＮアーゼＨ）ならびにより大きな真核生物ヌクレオチド除去修復（ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ）酵素（例えば、ＸＰＧ）（酸化的塩基損傷の転写組み合わせ修復においても作用する）に機能的に関連する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓなどの真正細菌では、ＰｏｌＩ５’→３’エキソヌクレアーゼドメインによって岡崎プロセシングが行われる。これらの細菌およびファージ酵素は約７つの保存酸性残基に残基類似性が集中している、ＦＥＮ−１との限定された２つの配列相同領域（Ｎ（Ｎ末端）およびＩ（中間）領域と名づける）を共有している。Ｔ４ ＲＮアーゼＨおよびＴ５エキソヌクレアーゼの結晶構造、ならびに変異誘発データに基づいて、これらの残基はＤＮＡ加水分解への影響に必要な２つのＭｇ２＋イオンに結合すると提唱されているが、各金属が触媒サイクルで果たす役割は、各酵素について微妙に異なり、十分に理解されていない（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ（前出）で概説）。
本発明で有用なＦＥＮ−１酵素をコードするｆｅｎ−１遺伝子としては、マウスｆｅｎ−１、ヒトｆｅｎ−１、ラットｆｅｎ−１、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓのｆｅｎ−１、ならびに４つの古細菌Ａｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ由来のｆｅｎ−１遺伝子が含まれる。ＦＥＮ−１酵素をコードするｃＤＮＡクローンがヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ８１９７９３）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）、およびＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３４９７）から単離されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉフラップエンドヌクレアーゼの完全なヌクレオチド配列もまた決定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００５２１５）。ＦＥＮ−１ファミリーには、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＲＡＤ２７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２８１１３、Ｙ１３１３７）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ ＲＡＤ２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７０４１）も含まれる。Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｌｕｍの古細菌ゲノムもまた配列決定されている。ＦＥＮ−１と原核生物およびウイルスの５’→３’エキソヌクレアーゼとの間の配列類似性は低いにもかかわらず、真核生物界内のＦＥＮ−１は、アミノ酸レベルでは高度に保存され、ヒトおよびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのタンパク質は６０％同一であり、かつ７８％類似である。３つの古細菌ＦＥＮ−１タンパク質はまた、真核生物ＦＥＮ−１酵素と相同性が高い（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１８２９７，Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：２７１５４、およびＬｉｅｂｅｒ，１９９７，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９：２３３に概説）。
ヒトと他のＦＥＮ−１ファミリーメンバーとの間の２つの保存されたヌクレアーゼドメイン（Ｎ末端またはＮおよび中間またはＩのドメイン）の配列類似性は、９２％（マウス）、７９％（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、７７％（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、７２％（Ａ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、７６％（Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、および７４％（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ）である。
ＦＥＮ−１は、５’一本鎖フラップ鎖の骨格を特異的に認識し、このフラップアームを二本鎖ＤＮＡの２つの鎖と一本鎖アームとの間の接合点に位置する切断部位へ移動させる。フラップの上流の鎖（フラップ隣接鎖またはプライマー鎖と呼ぶこともある）が取り除かれた場合、得られた構造を偽Ｙ（図１を参照のこと）と名づける。この構造はＦＥＮ−１によって切断されるが、効率は１／２０〜１／１００である。ＦＥＮ−１は３’一本鎖フラップを切断しない。しかし、エキソヌクレアーゼとして作用するＦＥＮ−１は、ギャップまたはニックを含むｄｓＤＮＡ基質を加水分解する（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ（前出）、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９ｂ（前出）、およびＬｉｅｂｅｒ、１９９７（前出）に概説）。エキソヌクレアーゼ的に、ＦＥＮ−１はｄｓＤＮＡのニックにおいて、そして低効率でギャップにおいて、または陥凹（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）５’末端で作用する。ギャップ構造では、ＦＥＮ−１結合および切断の効率は約５ヌクレオチドまでのギャップのサイズの増加に伴って減少し、その後、ｄｓＤＮＡ内の陥凹５’末端に対する活性と等価の切断レベルで安定化する。平滑末端ｄｓＤＮＡ、陥凹３’末端、およびｓｓＤＮＡは切断されない（Ｌｉｅｂｅｒ、１９９７（前出）で概説）。ＦＥＮ酵素の切断活性は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｏｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：４８０９；Ｒａｏ，１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０；５４０６およびＨｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｅｌｌ，９５：１３５−１４６に記載される。
本発明に従って有用であるＦＥＮヌクレアーゼは、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４１１１およびＬ３７３７４）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ２６３２０）、ラット（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡ８１９７９３）、酵母（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｚ２８１１３ Ｙ１３１３７およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ７７０４１）、およびｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ６８１４１およびＵ６４５６３）を含む種々の生物から単離されている。このような酵素は、当分野で周知の従来技術を用いてクローニングおよび過剰発現することができる。
本発明によるＦＥＮヌクレアーゼは、好ましくは熱安定性である。熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼは、４つの古細菌を含む種々の熱安定性生物から単離されかつ特徴づけられている。Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓフラップエンドヌクレアーゼのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１３４９７）およびアミノ酸配列（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ、前出およびＨｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ）は決定されている。Ｐ．ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉフラップエンドヌクレアーゼの完全なヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００５２１５）およびアミノ酸配列（Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，前出）もまた決定されている。Ｍ．ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂおよびＭａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，前出）およびＡ．ｆｕｌｇｉｄｕｓ（Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ）のフラップエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列もまた決定されている。
熱安定性ＦＥＮ１酵素は、当分野で周知であり、かつＨｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ａ（前出）、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：２１３８７、およびＭａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．（前出）に記載の技術、ならびに本明細書中の実施例２「Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のクローニング」と題された技術を用いてクローニングおよび過剰発現することができる。
ＦＥＮ酵素のエンドヌクレアーゼ活性を、以下を含む種々の方法で測定することができる。
Ａ．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性アッセイ
１．テンプレート（例えば、図２に示される）を用いて、本発明によるＦＥＮヌクレアーゼ活性を評価する。
テンプレート１は、以下の配列を有する５’３３Ｐ標識オリゴヌクレオチド（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である。
５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号１）。Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線部分は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域を示す。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ（配列番号２）を含む１８ヌクレオチドのフラグメントである。
Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して相補二本鎖ドメインおよび非相補５’オーバーハングを生じる。この二本鎖により、ヘリカーゼアッセイでも用いられるテンプレート２（図２）が形成される。テンプレート３（図２）はＭ１３に結合し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４に直接隣接するさらなるプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は、５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ３’（配列番号３）である。テンプレート３の存在下で、ＦＥＮはＨｅｌｔｅｓｔ４の遊離の５’末端に結合し、接合点に移動し、そしてＨｅｌｔｅｓｔ４を切断して１８ヌクレオチドのフラグメントを生じる。テンプレート１および２はコントロールとして機能するが、テンプレート２はテンプレートとしても機能し得る。
テンプレートを以下に記載のように調製する。
テンプレート１ テンプレート２ テンプレート３
Ｈｅｌｔｅｓｔ４ １４μｌ １４μｌ １４μｌ
Ｍ１３ ＊＊ １４μｌ １４μｌ
ＦＥＮＡＳ ＊＊ ＊＊ １４μｌ
Ｈ２Ｏ ２８μｌ １４μｌ ＊＊
１０×Ｐｆｕ緩衝液 ４．６μｌ ４．６μｌ ４．６μｌ
１０×Ｐｆｕ緩衝液はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５３６）から入手可能である。本発明の方法によれば、１０×Ｐｆｕ緩衝液を、１×緩衝液の存在下で反応を行うように希釈する。
Ｍ１３は、Ｍ１３ｍｐ１８＋鎖であり、２００ｎｇ／μＬの濃度であり、３３Ｐ標識Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、約０．７ｎｇ／μｌの濃度であり、ＦＥＮＡＳは４．３ｎｇ／μｌの濃度である。これらの濃度に基づくと、Ｈｅｌｔｅｓｔ４およびＭ１３は、およそ等モル量（５×１０−１４）であり、ＦＥＮＡＳは約１０倍モル過剰（６×１０−１３）で存在する。
テンプレート混合物は、９５０Ｃで５分間加熱し４５分間室温に冷却し、４℃で一晩保存する。
２μｌのＦＥＮ−１またはコントロールとしてのＨ２Ｏを、以下のように３つのテンプレートと混合する。
３μｌ テンプレート
０．７μｌ １０×クローニングＰｆｕ緩衝液
０．５６μｌ １００ｍＭ ＭｇＣｌ２
２．００μｌの酵素またはＨ２Ｏ
０．７４μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ。
この反応を５０℃で３０分間進行させ、各サンプルへの２μｌのホルムアミド「シークエンシング停止」溶液の添加によって停止させる。サンプルを９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素ＣａｓｔＡｗａｙ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ゲルにロードする。
あるいは、ＦＥＮ活性は、１時間のインキュベーション時間を利用する以下の緩衝液で分析してもよい。
１０×ＦＥＮ緩衝液
５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１００ｍＭ ＭｇＣｌ２
以下の反応混合物を、２μｌのＦＥＮ、またはコントロールとしての２μｌのＨ２Ｏと混合する。
３μｌ テンプレート
０．７μｌ １０×ＦＥＮ緩衝液
２．００μｌ 酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌ Ｈ２Ｏ
全量７．００μｌ。
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の、用時調製の２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素ゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸漬させる。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆い、加熱吸引ゲルドライヤー中で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させる。
２．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性はまた、Ｋａｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．（前出）の方法に従って測定することもできる。要するに、１０ｍＭのＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０、１０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ、そしてＴａｑＰｏｌおよびＴｔｈＰｏｌについては２００ｍＭのＫＣｌ、または全ての他の酵素については５０ｍＭのＫＣｌを含む１０μｌの体積中で反応を行う。分析される切断構造に依存して、反応条件を変化させてもよい。基質（２１Ｍ）および種々の量の酵素を、表示（上記）の反応緩衝液と混合し、Ｃｈｉｌｌ−ｏｕｔ（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）液体ワックスを重ねる。基質を９００Ｃで２０秒間加熱変性させて５００Ｃに冷却し、次いでＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２の添加によって反応を開始させ、特定の時間５００Ｃでインキュベートする。１０ｍＭのＥＤＴＡおよび０．０２％メチルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）を含む１０μｌの９５％ホルムアミドの添加によって反応を停止させる。サンプルを９００Ｃで１分間加熱し、その直後に７Ｍ尿素、４５ｍＭのＴｒｉｓホウ酸（ｐＨ８．３）１．４ｍＭのＥＤＴＡ緩衝液を含む２０％変性アクリルアミドゲル（１９：１架橋）で電気泳動を行う。他で表示しない限り、レーンあたり１μｌの各停止反応物をロードする。ゲルを、５０５ｎｍフィルターを用いたＦＭＢＩＯ−１００蛍光ゲルスキャナー（Ｈｉｔａｃｈｉ）でスキャニングする。ＦＭＢＩＯ分析ソフトウェア（バージョン６．０、Ｈｉｔａｃｈｉ）を用いて未切断および切断基質に対応するバンドの強度から切断産物の画分を決定する。測定値を最初の切断率度に確実に近づけるために、切断産物の画分は２０％を超えるべきではない。切断率とは、酵素濃度および反応時間（分）で割った切断産物の濃度と定義する。各酵素について、３つの測定点を用いて、率および実験誤差を決定する。
３．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性は、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８８ａ（前出）の方法に従って測定してもよい。要するに、１３μｌの最終容積中で、種々の量のＦＥＮおよび１．５４ｐｍｏｌの標識切断基質を、異なる温度で３０分間インキュベートし、その後にこの反応を同容積の停止溶液（１０ｍＭのＥＤＴＡ、９５％脱イオンホルムアミド、および０．００８％ブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノール）で消光させる。サンプルを変性１５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、出発物質および生成物の相対量を、ＭａｃＢＡＳ画像分析ソフトウェアを実行するＩＰＬａｂＧｅｌシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて定量する。ほとんどの反応は、標準アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、および５０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）中で行うが、一連の実験では、異なる２価の金属およびｐＨレベルの効果を標準緩衝液を変化させて研究する。２価の金属については、ＭｇＣｌ２を除外し、異なる金属イオンを１０ｍＭの最終濃度で用いる。ｐＨの影響を研究するために、異なる量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ、グリシンおよび酢酸ナトリウムを含む緩衝液を１０ｍＭの最終濃度で用いて、２５０Ｃで広域のｐＨを得る。
４．ＦＥＮエンドヌクレアーゼ活性は、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９（前出）の方法に従って測定してもよい。要するに、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および０．６ｐｍｏｌの標識切断構造を含む１５μｌの反応混合物中で酵素反応を行う。６００Ｃで３０分のインキュベーション後、１０ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍｇ／ｍｌのブロモフェノールブルーを含む１５μｌの９５％ホルムアミドの添加によって反応を停止させる。このサンプルを９５０Ｃで１０分間加熱し、７Ｍ尿素および１０×ＴＢＥ（８９ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、８９ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））を含む１５％ポリアクリルアミドゲル（３５ｃｍ×４２．５ｃｍ）にロードし、次いで、２０００Ｖで２時間電気泳動する。反応生成物を可視化して、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量する。サイズマーカーであるオリゴヌクレオチドを、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで５’末端標識する。
至適ｐＨを決定するために、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、および０．６ｐｍｏｌの５’末端標識切断構造を５０ｍＭの以下の緩衝液中の１つに含むアッセイ混合物（１５μｌ）中で６００Ｃで３０分間反応を行う。以下の３つの異なる５０ｍＭの緩衝液を用いて、以下のような広域のｐＨを得る。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０〜５．５）、リン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、ホウ酸緩衝液（ｐＨ８．０〜９．４）。
Ｂ．ＦＥＮエキソヌクレアーゼ活性アッセイ
本発明によるＦＥＮヌクレアーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、Ｍａｔｓｕｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９（前出）に記載され、上記でまとめられているＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ活性測定法によって測定することができる。
あるいは、ＦＥＮ酵素のエキソヌクレアーゼ活性は、Ｈｏｓｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８ｂ（前出）に記載の方法によって分析することができる。要するに、エンドヌクレアーゼアッセイで記載された条件（上記）と同一の条件下で、ＦＥＮのニック化基質を用いてエキソヌクレアーゼ活性をアッセイする。
エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの両方の実験における正確なＤＮＡ切断位置は、クレノウフラグメントの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を用いた５’３２Ｐ標識テンプレート鎖の部分的消化によって得ることができる。
本発明の一実施形態による切断構造は、標的核酸にアニーリングしたオリゴヌクレオチドプローブの部分的に置換された５’末端を含む。本発明による別の切断構造は、標的核酸（例えば、図４のＢ）、本発明による上流オリゴヌクレオチドプローブを含み、そして、標的配列に相補的である領域（例えば、図４のＡ）、およびこの標的配列に相補的である下流オリゴヌクレオチド（例えば、図４のＣ）を含む。本発明による切断構造は、上流オリゴヌクレオチドと下流プローブとの間の重複によって、または核酸ポリメラーゼの合成活性による上流オリゴヌクレオチドの伸長と、それに続く下流オリゴヌクレオチドの５’末端の部分的置換によって、形成され得る。「切断構造」と題された項に記載の方法に従ってこの型の切断構造を形成する。
あるいは、本発明による切断構造は、本発明によるオリゴヌクレオチドプローブに対して標的核酸をアニーリングすることによって形成され、前記オリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸に相補的である領域と、前記標的核酸にアニーリングしない非相補性領域とを含み、そして５’フラップを形成する。本実施形態によれば、切断構造は、オリゴヌクレオチドの非相補領域によって形成された５’フラップを含む。
本発明による切断構造はまた、重複フラップを含み、ここで標的核酸にアニーリングすることができる上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）は標的核酸にアニーリングする本発明による下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）の１（または複数）の塩基対に相補的であり、１つ（または複数）の塩基対重複は、一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流であり、そしてタイトル「切断構造」の項に記載の方法に従って形成される。一実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする。別の実施形態では、上流オリゴヌクレオチドおよび下流プローブは、標的核酸の隣接領域にハイブリダイズする。
ＩＩ．核酸ポリメラーゼ
本発明は核酸ポリメラーゼを提供する。好ましくは、本発明による核酸ポリメラーゼは熱安定性である。
本発明に従って有用な公知のＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）のＤＮＡポリメラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ、およびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ（Ｐｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。
本発明に従って有用な公知のＲＮＡポリメラーゼとしては、例えば、バクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６のＲＮＡポリメラーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡポリメラーゼコア酵素、およびヒトＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼおよびＮＳ５Ｂ ＲＮＡポリメラーゼ（ＨＣＶ由来）が含まれる。
本発明において有用な核酸ポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素が含まれる。本発明に従って有用な公知の逆転写酵素としては、例えば以下が含まれる。モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴ。
本発明に従って有用な、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く核酸ポリメラーゼとしては、限定はしないが、クレノウおよびクレノウエキソポリメラーゼ、およびＴ７ ＤＮＡポリメラーゼ（シーケナーゼ）が含まれる。
本発明によって有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠く熱安定性核酸ポリメラーゼとしては、限定はしないが、Ｐｆｕ、エキソ−Ｐｆｕ（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕの変異型）、ＴａｑのＳｔｏｆｆｅｌフラグメント、Ｎ短縮Ｂｓｔ、Ｎ短縮Ｂｃａ、Ｇｅｎｔａ、ＪｄＦ３エキソ−、Ｖｅｎｔ、Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＶｅｎｔの変異型）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔエキソ−（３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＤｅｅｐ Ｖｅｎｔの変異型）、Ｕ１Ｔｍａ、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅおよびＴｈｅｒｍｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅが含まれる。
本発明によって有用な核酸ポリメラーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く天然のポリメラーゼおよびポリメラーゼ変異体の両方が含まれる。本発明によって有用な核酸ポリメラーゼは、異なる程度の熱安定性を保有し得る。好ましくは、本発明による核酸ポリメラーゼは、核酸プライマーを伸長させることができる温度で鎖置換活性を示す。本発明の好ましい実施形態では、核酸ポリメラーゼは、５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く。
本発明に従って有用な異なる程度の熱安定性を有する、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くさらなる核酸ポリメラーゼを以下に列挙する。
Ａ．バクテリアファージＤＮＡポリメラーゼ（３７０Ｃでのアッセイに有用）：
バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が別のポリペプチドによってコードされるのでこの活性を欠く。適切なＤＮＡポリメラーゼの例は、Ｔ４、Ｔ７、およびφ２９ＤＮＡポリメラーゼである。市販の酵素は以下である。Ｔ４（多数の供給源（例えば、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）から市販されている）およびＴ７（多数の供給源（例えば、未修飾についてはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ、そして３’→５’エキソ−Ｔ７「シークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）」ＤＮＡポリメラーゼについてはＵＳＢ）から市販されている）。
Ｂ．古細菌ＤＮＡポリメラーゼ：
古細菌で同定されたＤＮＡポリメラーゼには以下の２つの異なるクラスが存在する。１．ファミリーＢ／ｐｏｌα型（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＰｆｕのホモログ）、および２．ｐｏｌＩＩ型（Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ ＤＰ１／ＤＰ２サブユニットポリメラーゼのホモログ）。両クラス由来のＤＮＡポリメラーゼは、関連する５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠き、かつ３’→５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を保有することが示されている。適切なＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌαまたはｐｏｌＩＩ）は、所望のアッセイ温度と類似の至適成長温度を有する古細菌に由来し得る。適切な古細菌の例としては、限定はしないが以下が含まれる。
１．熱不安定性（３７０Ｃでのアッセイに有用）−例えば、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｖｏｌｔａｅ。
２．熱安定性（非ＰＣＲアッセイで有用）−例えば、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉ、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ。適切な古細菌は、８０〜８５℃以下の最大成長温度または７０〜８０℃以下の至適成長温度を示すと評価されている。
３．熱安定性（ＰＣＲアッセイで有用）−例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種（ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ＧＢ−Ｄ種、ＫＯＤ１株の種、ｗｏｅｓｉｉ、ａｂｙｓｉｉ、ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ種（ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、９°Ｎｏｒｔｈ−７種、ＪＤＦ−３種、ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）、Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ、およびＡｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ。適切な古細菌は、８０〜８５℃以上の最大成長温度または７０〜８０℃以上の至適成長温度を示すと評価されている。古細菌ｐｏｌαＤＮＡポリメラーゼ群由来の適切なＰＣＲ酵素は市販され、これにはＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、およびＰｗｏ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）が含まれる。
上記で列挙された古細菌に関連するさらなる古細菌は、以下の引用文献に記載されている。Ａｒｃｈａｅａ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｒｏｂｂ，Ｆ．Ｔ．ａｎｄ Ｐｌａｃｅ，Ａ．Ｒ．，ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９５およびＴｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２。
Ｃ．真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ：
３つのクラスの真正細菌ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌＩ、ＩＩ、およびＩＩＩ）が存在する。ＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼファミリーの酵素は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有し、特定のメンバーはまた３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＰｏｌＩＩＤＮＡポリメラーゼは、天然には５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を示す。ＰｏｌＩＩＩＤＮＡポリメラーゼは、細胞の主要な複製的ＤＮＡポリメラーゼに相当し、複数のサブユニットから構成されている。ｐｏｌＩＩＩ触媒性サブユニットは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、同一のポリペプチド中に３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が存在する場合もある。
真正細菌のｐｏｌＩＩおよびｐｏｌＩＩＩＤＮＡポリメラーゼの供給源は市販されていない。種々の市販のＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼが存在し、そのいくつかは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が減少しているか消滅するように改変されている。ｐｏｌＩＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の消失に用いられている方法としては、以下が含まれる。
−変異誘発（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：２８４およびＫｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，７：４６８に記載）、
−タンパク質分解消化によるＮ短縮（Ｋｌｅｎｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９７１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２２：３７１に記載）、または
−Ｃ末端フラグメントのクローニングおよび発現によるＮ短縮（Ｌａｗｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ．，２：２７５に記載）。
古細菌の供給源については、アッセイ温度要件によって、どの真正細菌（例えば、中温菌、好熱菌、超好熱菌）が本発明によって有用なＤＮＡポリメラーゼの供給源として用いられるべきかを決定する。
１．中温菌／熱不安定性菌（３７０Ｃでのアッセイに有用）
ｉ．天然で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：中温真正細菌、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、ｌｅｐｒａｅ）由来のｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニット。
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のためのＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼは、上記の中温真正細菌から単離することができる（Ｃｉ）。市販の真正細菌ＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩフラグメントは、クレノウフラグメント（Ｎ短縮のＥ．ｃｏｌｉのｐｏｌＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）である。
２．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然で実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：好熱真正細菌、例えば、Ｂａｃｉｌｕｓ種（例えば、ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、ｃａｌｄｏｖｅｌｏｘ）由来のＰｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩ触媒サブユニット。
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のための適切なＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼは、上記のＢａｃｉｌｌｕｓなどの好熱真正細菌から単離することができる。Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩの熱安定性Ｎ短縮フラグメントは市販され、商標名Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ巨大フラグメント（Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＩｓｏｔｈｅｒｍＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ））として販売されている。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ ｐｏｌＩのＣ末端フラグメントは、Ｐａｎｖｅｒａ（商標名Ｌａｄｄｅｒｍａｎとして販売）から入手可能である。
３．熱安定性菌（ＰＣＲアッセイに有用）
ｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然には実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｈｅｒｍｕｓ種（ａｑｕａｔｉｃｕｓ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｌａｖｕｓ、ｒｕｂｅｒ、ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ、ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、ｂｒｏｋｉａｎｕｓ）由来またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＰｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩの触媒性サブユニット。Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来の触媒ｐｏｌＩＩＩサブユニットは、Ｙｉ−Ｐｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．，４８：７５６およびＭｃＨｅｎｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７２：１７８に記載されている。
ｉｉ．５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体：Ｎ短縮または変異誘発のための適切なＰｏｌＩＤＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ種およびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（上記）を含む種々の好熱性真正細菌から単離することができる。Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼｐｏｌＩ（Ｔａｑ）の熱安定性フラグメントは市販され、商標名ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、およびＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）として販売されている。Ｃ末端フラグメントに加えて、５’→３’エキソヌクレアーゼ−Ｔａｑ変異体、例えば、ＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）もまた市販されている。Ｔａｑの５’→３’エキソヌクレアーゼ−バージョンに加えて、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａＤＮＡポリメラーゼＩのＮ短縮バージョンもまた市販されている（商標名ＵｌＴｍａ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）。
上記の細菌に関連するさらなる真正細菌は、「Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉａ」（Ｋｒｉｓｔｊａｎｓｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ，１９９２に記載されている。
Ｄ．真核生物５’→３’エキソヌクレアーゼ−ＤＮＡポリメラーゼ（３７０Ｃでのアッセイに有用）。
真核生物でいくつかのＤＮＡポリメラーゼが同定され、これにはＤＮＡ ｐｏｌα（複製／修復）、δ（複製）、ε（複製）、β（修復）、およびγ（ミトコンドリア複製）が含まれる。真核生物ＤＮＡポリメラーゼは、この活性が別のポリペプチド（例えば、哺乳動物ＦＥＮ−１または酵母ＲＡＤ２）によってコードされるので、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く。適切な熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼは、種々の真核生物（酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｐｈｉｌａ）を含むが、これらに限定されない）および真核ウイルス（例えば、ＥＢＶ、アデノウイルス）から単離することができる。
３’→５’エキソヌクレアーゼ（プルーフリーディング）活性を欠くＤＮＡポリメラーゼ変異体は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くことに加えて、ＦＥＮベースの検出ストラテジーにおいて改良された能力を示し得ることが可能である。例えば、固有の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の減少および消滅は、標識プローブの非特異的エキソヌクレアーゼ分解の減少によってバックグラウンドシグナルを低減し得る。３つの３’→５’エキソヌクレアーゼモチーフが同定され、これらの領域の変異によって、クレノウ、φ２９、Ｔ４、Ｔ７、およびＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ、酵母Ｐｏｌα、Ｐｏｌβ、およびＰｏｌγ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＰｏｌＩＩＩの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が消滅することが示されている（Ｄｅｒｂｅｙｓｈｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６２：３６３に概説）。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性か減少または消滅したさらなるＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製法は、当分野で周知である。
５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く市販の酵素としては、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（エキソ−Ｔ７；ＵＳＢ）、Ｐｆｕエキソ−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、エキソ−Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）、エキソ−クレノウフラグメント（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｂｓｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｉｓｏｔｈｅｒｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、Ｌａｄｄｅｒｍａｎ（Ｐａｎｖｅｒａ）、ＫｌｅｎＴａｑ１（Ａｂ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、Ｓｔｏｆｆｅｌフラグメント（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＴｈｅｒｍｏＳｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢ）、およびＴａｑＦＳ（Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）が含まれる。
Ｐｆｕ以外のポリメラーゼを用いる場合、本発明によって有用な特定のポリメラーゼによって至適活性が得られるように緩衝液および伸長温度を選択する。本発明によるポリメラーゼに有用な緩衝液および伸長温度は当分野で公知であり、製造供給元の仕様書からも決定できる。
Ｅ．ＲＮＡポリメラーゼ
本発明において有用なＲＮＡポリメラーゼとしては、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの両方が含まれる。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、プライミングされたテンプレートから、プライミングされていないテンプレートから、またはプライミングされたもしくはプライミングされていないテンプレートのいずれかから、ＲＮＡの新規な鎖を合成できることを特徴とする。ＲＮＡポリメラーゼは、プライマーの不在下で一本鎖ＲＮＡテンプレートからＲＮＡを認識かつ合成することが特定されている。このタイプのプライミング機構の例は、ＮＳ５Ｂと名づけられたＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＲＮＡポリメラーゼである。ＮＳ５Ｂは、ＨＣＶのＲＮＡゲノムを複製することを担うＲＮＡポリメラーゼとして特徴付けられている。ＮＳ５Ｂは、自己プライミング、既存のプライマーを伸長すること、または新規なＲＮＡ合成を開始することによってＲＮＡ合成の伸長を触媒することが実証されている。Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０００，７４（２）：８５１−８５３。
ＲＮＡポリメラーゼはまた、プライミングされた一本鎖ＲＮＡテンプレートからＲＮＡを認識かつ合成することが同定されている。いくつかの引用文献、例えば、Ｓｃｈｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９３，２６８（１６）：１１８５８−１１８６７，Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ．，２００３，１７（１）：４９−６３、または２００５年８月３１日出願、米国特許出願第１１／２１７，９７２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）では、この文脈で用いられ得るＲＮＡポリメラーゼを詳述している。これらの場合、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ＲＮＡの標的集団を選択的に増幅してもよい。
「ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、ＲＮＡから複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。表３は、本発明を行うのに有用であり得るＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの非網羅的な列挙を示す。これらのポリメラーゼおよびこれらを用いて標的を増幅する方法は、２００５年８月３１日出願の米国特許出願第１１／２１７，９７２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。
「ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ」とは、（通常は二本鎖の）プロモーター配列を有する二本鎖のまたは部分的に二本鎖のＤＮＡ分子から複数のＲＮＡコピーを合成する酵素である。本発明は、一本鎖プロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼとともに、一本鎖のプロモーターを含むことが留意されるべきである。ＤＮＡ依存性のＲＮＡポリメラーゼの例は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにバクテリオファージＴ７、Ｔ３およびＳＰ６である。本発明における使用に適切なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、市販されている。
一実施形態では、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、熱安定性である。熱安定性のＲＮＡポリメラーゼは、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来であることが、実証されている。
ＲＮＡポリメラーゼは、天然または組換えのいずれかの供給源から得ることができる。例えば、天然のウイルスＲＮＡポリメラーゼは、ウイルス感染した宿主細胞から単離され得る。例としては、Ｐｆｅｉｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（２００３）１００（１２）：７２８９−７２９４に記載されるようなウイルス力価および感染の方法論を用いるハニー（ｈｏｎｅｙ）血清型１のポリオウイルスによるＨｅＬａ細胞の感染が含まれる。細胞性ＲＮＡポリメラーゼは、天然のＲＮＡポリメラーゼを発現する細胞から得ることが可能で、ここでは細胞が増殖されて、Ｓｃｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）のとおりＲＮＡポリメラーゼが回収される。適切なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは市販もされている。
Ｆ．逆転写酵素
本明細書において用いる場合、「逆転写酵素（ＲＴ）」という用語は、本明細書に開示されるか、または当分野で公知である方法によって測定される、逆転写酵素活性を示す任意の酵素を指す。従って、本発明の「逆転写酵素」としては、レトロウイルス、他のウイルスおよび細菌由来の逆転写酵素、ならびに逆転写酵素活性を示すＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｎｅＤＮＡポリメラーゼ、ＴｍａＤＮＡポリメラーゼなどが含まれる。レトロウイルス由来のＲＴとしては、限定はしないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴが含まれ、そして米国特許出願公開第２００３／０１９８９４４号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。概説については、例えば、Ｌｅｖｉｎ，１９９７，Ｃｅｌｌ，８８：５−８；Ｂｒｏｓｉｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １１：１６３−７９を参照のこと。
本明細書において用いる場合、「逆転写酵素活性」という用語は、酵素（例えば、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ）がテンプレートとしてＲＮＡ鎖を利用してＤＮＡ鎖（すなわち、ｃＤＮＡ）を合成する能力を指すとして交換可能に用いられる。ＲＴ活性を測定するための方法は、本明細書に提供され、そしてまた当分野で周知である。例えば、Ｑｕａｎ−Ｔ−ＲＴアッセイ系は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉ１１）から市販され、そしてＢｏｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９８９，３４１：１６７−１６８に記載されている。
ある実施形態では、逆転写酵素は、ＲＮａｓｅＨ活性が減少している（すなわち、ＲＮａｓｅＨ−酵素）。例えば、ＲＮａｓｅＨ活性の減少は、野性型または「ＲＮａｓｅＨ＋」酵素（例えば、野性型Ｍ−ＭＬＶまたはＡＭＶ逆転写酵素）のＲＮａｓｅＨ活性の２０％未満、さらに好ましくは１５％、１０％または５％未満、そして最も好ましくは２％未満であってもよい。任意の酵素のＲＮａｓｅＨ活性は、種々のアッセイ、例えば、米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号；および同第６，０６３，６０８号に；Ｋｏｔｅｗｉｃｚ、Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）に、そしてＧｅｒａｒｄ、Ｇ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ＦＯＣＵＳ １４（５）：９１（１９９２）（その全ての開示が参照により本明細書に詳細に組み込まれる）に記載のアッセイなどによって決定され得る。
本発明における使用のためのＲＮａｓｅＨ逆転写酵素としては限定はしないが、Ｍ−ＭＬＶ Ｈ−逆転写酵素、ＲＳＶ Ｈ−逆転写酵素、ＡＭＶ Ｈ−逆転写酵素、ＲＡＶ Ｈ−逆転写酵素、ＭＡＶ Ｈ−逆転写酵素、およびＨＩＶ Ｈ−逆転写酵素（例えば、以前に記載された）が含まれる（各々の内容が参照により組み込まれる米国特許第５，２４４，７９７号；同第５，４０５，７７６号；同第５，６６８，００５号および同第６，０６３，６０８号；ならびにＷＯ９８／４７９１２を参照のこと）。
本発明での使用のための逆転写酵素は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．），Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．），Ｓｉｇｍａ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）またはＲｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，Ｃａｌｉｆ．）から購入できる。あるいは、逆転写酵素活性を有するポリペプチドは、当業者に周知である天然のタンパク質を単離および精製するための標準的な手順に従って、天然のウイルスまたは細菌の供給源から単離され得る（例えば、Ｈｏｕｔｓ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２９：５１７（１９７９）を参照のこと）。さらに、逆転写酵素は、当業者になじみのある組換えＤＮＡ技術によって調製されてもよい（例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：２６５（１９８８）；Ｓｏｌｔｉｓ，Ｄ．Ａ．，およびＳｋａｌｋａ、Ａ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３３７２−３３７６（１９８８）を参照のこと）。上記の引用文献の全体的な教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ＲＮａｓｅＨ活性が低下している酵素はまた、当分野で公知の方法によって、例えば、対象の逆転写酵素内のＲＮａｓｅＨドメインを変異することによって、好ましくは、上記されるような、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，０６３，６０８号に記載されるような、１つ以上の点変異、１つ以上の欠失変異、および／または１つ以上の挿入変異によって得ることもできる。
ＩＩＩ．核酸
Ａ．本発明で有用な核酸配列
本発明は、標的核酸の検出または測定法を提供し、また、本発明による切断構造形成のために、オリゴヌクレオチド、プライマーおよびプローブ、ならびにテンプレート核酸配列の増幅のためのプライマーを利用する。
本明細書において用いる場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、検出すべきプライマー、プローブ、およびオリゴマーフラグメントをいい、そしてポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、およびプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基（脱塩基部位を含む）のＮグリコシドである任意の他の型のポリヌクレオチドの総称である。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語の間の長さに意図される差は存在せず、これらの用語は、交換可能に用いられる。これらの用語は、分子の一次構造のみを言う。従ってこれらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。
本明細書において用いる場合、核酸配列の相補性とは、一方の配列の５’末端が他の配列の３’末端と対合するように核酸配列を整列させた場合に「逆行性会合（ａｎｔｉｐａｒａｌｌｅｌ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）」であるオリゴヌクレオチドを言う。
オリゴヌクレオチドは、必ずしも任意の現存または天然の配列に物理的に由来しないが、任意の様式（化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、またはその組み合わせを含む）で作製することができる。「オリゴヌクレオチド」または「核酸」という用語は、その合成の起源または操作によって（１）天然で会合しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合していないか、そして／または（２）天然で連結しているもの以外のポリヌクレオチドに連結している、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源のポリヌクレオチドを意図する。
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がリン酸ジエステル結合を介して一方向でその隣接物の３’酸素に結合するような方式で、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドを作製するので、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結しない場合、「５’末端」と呼ばれ、その３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結しない場合、「３’末端」と呼ばれる。本明細書において用いる場合、「核酸配列」はまた、より大きなオリゴヌクレオチドの内部であったとしても、５’および３’末端を有するということができる。
２つの異なる非重複オリゴヌクレオチドが同一の鎖状の相補的な核酸配列の異なる領域にアニーリングし、一方のオリゴヌクレオチドの３’末端が他方の５’末端に向いている場合、前者を「上流」オリゴヌクレオチドと呼び、後者を「下流」オリゴヌクレオチドと呼んでもよい。
天然の核酸中で一般的には見出されない特定の塩基が、本発明の核酸に包含されてもよく、例えば、イノシンおよび７−デアザグアニンが包含される。相補性は完全でなくてもよく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対または非マッチ塩基を含んでもよい。核酸技術の当業者は、多数の変数（例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、オリゴヌクレチドの塩基組成および配列、イオン強度、ならびにミスマッチ塩基対の頻度を含む）を経験的に考慮して二本鎖安定性を決定することができる。
核酸二本鎖の安定性は、融点（すなわち、「Ｔｍ」）によって測定される。特定の条件下での特定の核酸二本鎖のＴｍは、塩基対の半分が解離する温度である。
Ｂ．本発明で有用なプライマーおよびプローブ
本発明は、テンプレート核酸配列の増幅のため、および本発明による切断構造の形成のための核酸の検出または測定に有用なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを提供する。
「プライマー」という用語は、１つより多いプライマーを指してもよく、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が触媒される条件下に置かれた場合に、相補鎖に沿った合成の開始点として作用することができる、天然に存在するか、精製された制限消化物としてか、または合成されたオリゴヌクレオチドを言う。このような条件としては、適切な緩衝液（「緩衝液」は、補助因子であるかｐＨ、イオン強度などに影響を与える置換基を含む）中の４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸および重合誘導剤、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在および適切な温度が含まれる。最大の増幅効率のためには、好ましくはプライマーは一本鎖である。
本発明によって有用なオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレート核酸配列とハイブリダイズ可能な、第２の核酸鎖の酵素合成を開始させる一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。プライマーは、核酸分子のプール中に存在する標的分子の一部に相補的である。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを化学的または酵素的いずれかの合成法によって調製することが意図される。あるいは、このような分子またはそのフラグメントは天然に存在し、その天然の供給源から単離するか、供給業者から購入する。オリゴヌクレオチドプライマーは、５〜１００ヌクレオチド長、理想的には１７〜４０ヌクレオチド長であるが、異なる長さのプライマーが有用である。増幅のためのプライマーは、好ましくは約１７〜２５ヌクレオチドである。本発明による切断構造の作製のためのプライマーは、好ましくは約１７〜４５ヌクレオチドである。本発明による有用なプライマーは、融点評価法によって特定の融点（Ｔｍ）を有するようにも設計する。市販のプログラム（ＯｌｉｇｏＴＭを含む）、Ｐｒｉｍｅｒ Ｄｅｓｉｇｎおよびインターネットで利用可能なプログラム（Ｐｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含む）を用いて、本発明によって有用な核酸配列の融点を計算してもよい。好ましくは、例えばＯｌｉｇｏ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒによって計算した場合、本発明で有用な増幅プライマーのＴｍは、約４５〜６５０Ｃとの間、より好ましくは約５０℃〜６０℃の間である。好ましくは、本発明によって有用なプローブのＴｍは、対応する増幅プライマーのＴｍより７０Ｃ高い。
本発明に従うプライマーおよびプローブは、標識されてもよく、そして標識された切断構造を調製するために用いられてもよい。対の一本鎖ＤＮＡプライマー、ＤＮＡプライマー、およびプローブまたはプローブを、標的核酸内の配列にアニーリングしてもよい。特定の実施形態では、プライマーを用いて、標的核酸のＤＮＡ合成を増幅することを開始してもよい。
典型的には、２つの核酸配列が実質的に相補的である場合（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約６５％相補的、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも約９０％相補的）、選択的なハイブリダイゼーションが起こる。Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｍ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：２０３（本明細書中で参照により組み込まれる）を参照のこと。結果として、プライミング部位での一定程度のミスマッチが許容されると予想される。このようなミスマッチは小さくてもよく、例えば、モノ、ジ、またはトリヌクレオチドである。あるいは、ミスマッチ領域は、中断のない一連の４つ以上のヌクレオチド中にミスマッチが存在する領域と定義される、ループを含んでもよい。
多数の因子がプライマーの第２の核酸分子へのハイブリダイゼーションの効率および選択性に影響する。本発明のオリゴヌクレオチドプライマーの設計には、これらの因子（プライマー長、ヌクレオチド配列および／または組成、ハイブリダイゼーション温度、緩衝液の組成、およびハイブリダイゼーションにプライマーが必要な領域における立体障害の潜在性を含む）を考慮する。
プライマー長と、プライマーが標的配列にアニーリングする効率および精度との間には正の相関が存在する。特に、より長い配列は短い配列よりも高い融点（ＴＭ）を有し、また、所与の標的配列内で反復される可能性も低いので、ハイブリダイゼーションのばらつきが最小になる。高Ｇ−Ｃ含量または回文構造配列を含むプライマー配列は、その意図する標的部位においてハイブリダイズするのと同じようにして自己ハイブリダイズする傾向がある。なぜなら、これは二分子よりもむしろ一分子のハイブリダイゼーション反応速度論が一般に溶液中で有利であるからである。しかし、十分なＧ−Ｃヌクレオチド対合数を含むプライマーを設計することが重要でもある。なぜなら、ＡとＴとの塩基対が標的配列に結合する場合に見出される２つの水素結合ではなく、３つの水素結合で各Ｇ−Ｃ対が結合し、それによってより固く強力な結合が形成されるからである。ハイブリダイゼーション温度は、プライミング反応物またはハイブリダイゼーション混合物中に含まれ得る有機溶媒（例えば、ホルムアミド）の濃度と同様にプライマーアニーリング効率と反比例して変化するが、一方、塩濃度の増加は結合を促進する。ストリンジェントなアニーリング条件下では、より長いハイブリダイゼーションプローブまたは合成プライマーは、さらに許容的な条件下で十分である、さらに短いものよりも効率的にハイブリダイズする。好ましくは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブに対して核酸配列がハイブリダイズすることを可能にする条件下で（例えば、９５℃）、適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ＰＣＲコア緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ＃６００５００；１×Ｐｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ＃２００５３６；または１×クローニングＰｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌｏｇ＃２００５３２）中で行われる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、変化してもよく（例えば、約１Ｍ未満の塩濃度から、さらに通常では、約５００ｍＭ未満、そして好ましくは２００ｍＭ未満）、そしてハイブリダイゼーション温度は、長さおよび／または核酸組成物またはオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブに依存して、変化してもよい（例えば、０℃程度の低さから２２℃より上、約３０℃より上、そして（ほとんどの場合）約３７℃を超えて）。フラグメントが長いほど、特異的なハイブリダイゼーションに必要な温度は高くなり得る。いくつかの要因が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与えるので、パラメータの組み合わせは、単一の要因の絶対的基準よりも重要である。
これらの検討材料を考慮してオリゴヌクレオチドプライマーを設計し、以下の方法に従って合成することができる。
１．オリゴヌクレオチドプライマー設計ストラテジー
配列決定またはＰＣＲの対象のための特定のオリゴヌクレオチドプライマーの設計は、標的配列を認識することができるが最小の推定二次構造を有する配列の選択を含む。オリゴヌクレオチド配列は、標的核酸配列の１つの部位のみに結合してもよいし、または結合しなくてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドのＴｍをオリゴヌクレオチドの長さおよびＧＣ含量の分析によって至適化する。さらに、ゲノムＤＮＡの増幅に有用なＰＣＲプライマーを設計する場合、選択されたプライマー配列はＧｅｎＢａｎｋデータベース（または他の利用可能なデータベース）中の配列と有意なマッチングを示さない。
本発明によって有用なプライマーの設計は、上記のいくつかのパラメータおよびプライマー配列の至適化の評価を支援するために開発された、容易に入手可能なコンピュータプログラムの使用によって容易になる。このようなプログラムの例は、ＤＮＡＳｔａｒＴＭソフトウェアパッケージの「ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ」（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ＯＬＩＧＯ ４．０（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｉｎｃ．）、ＰＲＩＭＥＲ、オリゴヌクレオチド選択プログラム、ＰＧＥＮ、およびＡｍｐｌｉｆｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５「Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子生物学ショートプロトコル）」、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓに記載）である。一実施形態では、（例えば、ＰＣＲ産物を配列決定するための）さらなる増幅用の標的として役立つ末端上の公知の配列を有するＰＣＲ産物を作製するために、他のプライマーの標的として役立つ配列を用いてプライマーを設計する。多数の異なる標的核酸配列が共通の「テール配列」を共有する特異的プライマーで増幅された場合、これらの別個の遺伝子由来のＰＣＲ産物を単一のセットのプライマーを用いて引き続いて配列決定することができる。あるいは、増幅配列のその後のクローニングを容易にするために、その５’末端に付加された制限酵素部位配列を用いてプライマーを設計する。従って、プライマーの全ヌクレオチドは、制限酵素部位を形成するために必要ないくつかのヌクレオチドを除いて、標的核酸配列または標的核酸配列に隣接する配列由来である。このような酵素および部位は当分野で周知である。標的核酸のゲノム配列および標的核酸のオープンリーディングフレームの配列が公知である場合、特定のプライマーの設計は十分に当業者の技術の範囲内である。
本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドが固体支持体に結合し、かつ結合部分またはタグに結合することができるように、オリゴヌクレオチドを特定の化学的および／または捕獲部分（本明細書に記載されるような捕獲エレメントを含む）を用いて合成することができることは、当業者に周知である。適切な捕獲エレメントとしては、限定はしないが、核酸結合タンパク質、またはヌクレオチド配列が含まれる。適切な捕獲エレメントとしては、限定はしないが、ビオチン、ハプテン、タンパク質、または化学反応性部分が含まれる。このようなオリゴヌクレオチドを、溶液中で最初に用い、次いで固体支持体に捕獲するか、または固体支持体に最初に結合し、次いで検出反応で用いてもよい。後者の例は、下流プローブ分子の５’末端が蛍光クエンチャーを含むように、下流プローブ分子を固体支持体に結合させることである。いくつかの下流プローブ分子はまた、ＦＥＮヌクレアーゼ切断がフルオロフォアからクエンチャーを物理的に分離するような位置にフルオロフォアを含む。例えば、標的核酸は固相下流プローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、液相上流プライマーはまた標的分子とハイブリダイズすることが可能であり、その結果、固体支持体でＦＥＮ切断反応が起こって複合体から５’ 消光部分が遊離する。これにより、固体支持体結合フルオロフォアを検出することができるので、適切に標識されるか特定された固体支持体上で切断事象の存在が明らかとなる。異なる下流プローブ分子が、アレイ上の異なる位置に結合してもよい。アレイ上の位置によりプローブ分子を同定し、プローブ分子がハイブリダイズすることができるテンプレートの存在が示される。
２．合成
当分野でこれも周知である技術を用いて、プライマー自体を合成する。特異的配列のオリゴヌクレオチドの調製法が当分野で公知であり、これには、例えば、適切な配列のクローニングおよび制限消化分析ならびに直接的化学合成が含まれる。一旦設計されると、例えば、Ｎａｒａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８：９０に記載のリン酸トリエステル法、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｇｙ，６８：１０９に開示のリン酸ジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９に開示のジエチルホスホロアミデート法、および米国特許第４，４５８，０６６号に開示の固体支持体法を含む適切な化学合成法によって、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機（市販されている）もしくはＶＬＳＩＰＳＴＭ技術のいずれかを用いる他の化学的方法によって、オリゴヌクレオチドを調製する。
Ｃ．プローブ
本発明は、本明細書中で定義の切断構造または標識された切断構造の形成に有用なプローブを提供する。本発明の標識切断構造の調製法を、以下の「切断構造」と題された項に記載している。
本明細書において用いる場合、「プローブ」という用語は、プローブ中の少なくとも１つの配列が標的領域中の配列と相補的であることに起因して、標的核酸中の配列と二本鎖構造を形成するプローブを言う。ある実施形態では、このプローブは、二次構造を有する。本発明によるプローブはまた標識されてもよい。このプローブは好ましくは、プライマー伸長で用いられる配列に相補的な配列を含まない。一般に、このプローブの３’末端を「ブロック」してプライマー伸長産物へのプローブの組み込みを阻止する。本発明によるプローブの標識法および適切な標識は、以下の「切断構造」と題された項に記載する。
本発明によるプローブの一般的な設計は、「本発明によって有用なプライマーおよびプローブ」と題された項に記載される。典型的には、本発明によるプローブは、約７〜１４０ヌクレオチド、好ましくは約１０〜１４０ヌクレオチド長である標的核酸結合配列を含む（図４のＣ）。一実施形態では、本発明によるプローブはまた、互いに対して相補的でありかつ結合して、標的核酸の不在下で二次構造の領域を形成する、本明細書に規定されるような、２つの相補的な核酸配列領域を含む（図４のｂおよびｂ’）。領域ｂおよびｂ’は、３〜２５ヌクレオチド、好ましくは４〜１５ヌクレオチド、さらに好ましくは５〜１１ヌクレオチド長である。正確な長さは、標的核酸結合配列を参照して選択され、その結果プローブの二次構造は好ましくは、標的核酸に結合するプローブを含む切断構造の切断が行われる温度で標的核酸に対してプローブが結合されない場合、安定である。
ある実施形態では、本発明によるプローブは、本明細書に規定される二次構造（ステム・ループ、ヘアピン、内部ループ、バルジ・ループ、分枝構造およびシュードノットを含む）、または複数の二次構造、クローバー葉構造、または本明細書において上で規定される任意の三次元構造を形成できる。
例えば、本発明の一実施形態によれば、プローブは、ヘアピンまたはステム・ループのような二次構造を有するオリゴヌクレオチドであってもよく、これには限定はしないが、分子指標、安全ピン、スコーピオンおよびサンライズ／アンプリフロアー・プローブが含まれる。
分子指標プローブは、ヘアピンまたはステム・ループ構造を含み、これは、この指標プローブが標的核酸にハイブリダイズしない場合、検出可能なシグナルを消光するように効率的に位置決めされた１対の相互作用性シグナル発生標識部分（例えば、フルオロフォアおよびクエンチャー）を保有する。このループは、標的核酸に相補的である領域を含む。このループは、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合しない場合、相補的核酸配列によって互いに可逆的に相互作用する５’および３’領域（「アーム」）に隣接する。あるいは、このループは、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合されない場合、親和性対の結合された部分によって互いと可逆的に相互作用して二次構造を形成する５’および３’領域（「アーム」）に隣接する。本明細書において用いる場合、「アーム」とは、ａ）核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合しない場合、相補的な核酸配列によって互いと可逆的に相互作用する分子指標プローブの領域か、またはｂ）親和性対（アフィニティー・ペア）の結合した部分によって互いと可逆的に相互作用して、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合しない場合、二次構造を形成する、分子指標プローブの領域を言う。分子指標プローブが標的にハイブリダイズじない場合、このアームは、互いとハイブリダイズして、時に、「ステム・二本鎖（ｓｔｅｍ ｄｕｐｌｅｘ））」と呼ばれるステム・ハイブリッドを形成する。これは、閉じた高次構造である。分子指標プローブが、その標的にハイブリダイズする場合、プローブの「アーム」が隔てられる。これは開口された高次構造である。この開口高次構造では、アームはまた、標的にハイブリダイズし得る。このようなプローブは、溶液中でフリーであってもよいし、またはそれらは、固体表面に係合されてもよい。このアームがハイブリダイズする（例えば、ステムを形成する）場合、クエンチャーはフルオロフォアに極めて近く、かつその蛍光を効率的に消光または抑制し、プローブは暗くなる。このようなプローブは米国特許第５，９２５，５１７号および米国特許第６，０３７，１３０号に記載される。
本明細書において用いる場合、分子指標プローブとはまた、本明細書に記載されるような「対立遺伝子識別」プローブであってもよい。
分子指標プローブは、一方のアームに結合されたフルオロフォアと、他のアームに結合されたクエンチャーとを有する。このフルオロフォアおよびクエンチャー、例えば、テトラメチルローダミンおよびＤＡＢＣＹＬは、ＦＲＥＴ対である必要はない。
本発明に有用なステム・ループプローブについては、標的に相補的であるプローブ配列の長さ、相補的な核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域（例えば、ステム・ハイブリッド）の長さ（核酸標的配列に相補的な領域が標的核酸に結合しない場合）、および２つの関連は、プローブが利用されるアッセイ条件に従って設計される。特定のアッセイ条件のための標的相補的配列およびステム・ハイブリッド配列の長さは、当分野で周知であるものに従って評価され得る。相補的核酸配列によって互いと可逆的に相互作用するプローブの領域は、核酸標的配列に相補的であるプローブの領域が標的核酸に結合しない場合、各々６〜１００、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは８〜２５ヌクレオチドの範囲である。標的に相補的であるプローブ配列の長さは好ましくは、１７〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。
本発明に従って改変された分子指標プローブのオリゴヌクレオチド配列は、ＤＮＡであっても、ＲＮＡであっても、ｃＤＮＡであっても、またはそれらの組み合わせであってもよい。改変ヌクレオチドは、例えば、ニトロピロールベースのヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドを含んでもよい。改変結合はまた、例えば、ホスホロチオエートが含まれてもよい。改変ヌクレオチドおよび改変結合も、本発明による波長シフトプライマー中に組み込まれてもよい。
安全ピンプローブは、本発明において利用される場合、「ユニバーサル」ヘアピンプローブ１（図９、ｂ１７１、配列番号３１）を要し、これには、ヘアピン構造と、ヘアピンの５’アーム上のフルオロフォア（ＦＡＭ）と、そして３’アーム上にクエンチャー（Ｄａｂｃｙｌ）を含み、そしてプローブ２（図９、ＳＰ１７０ａ、配列番号３２）は、ステム・ループを含み、これは、２つのドメインを含む。プローブ２の５’の２／３（配列番号３４）は、ヘアピンプローブ１に相補的な（ユニバーサル）配列、およびＤＮＡポリメラーゼを停止させるヌクレオチド、およびプローブ２の３’の１／３を有し、これが標的特異的プライマーとして機能する。リバースプライマー（すなわち、プローブ２の３’の１／３）から開始されるポリメラーゼは、トップの鎖（配列番号３３）を合成するので、プローブ２の５’末端は、「停止ヌクレオチド（ｓｔｏｐ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）」が到達するまで、５’エキソヌクレアーゼ活性によって置換かつ変性される。この時点で、プローブ２の残りは、広がるかまたは折り畳まれず、そしてヘアピンプローブ１（配列番号３１）の標的として機能し、それによってクエンチャーからフルオロフォアを隔てる（図９）。
本発明において用いられるスコーピオン・プローブは、３’プライマーとともにフルオロフォア／クエンチャー対を保有するヘアピン構造を含む５’伸長プローブテールを含む。このプローブテールは、ポリメラーゼがプローブを複製することをブロックするヘキサエチレン・グリコール（ＨＥＧ）の包含によって５’→３’方向で複製から「保護（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）」される。第一回の増幅の間、３’標的特異的プライマーは、標的にアニーリングし、かつ伸長され、その結果そのスコーピオンはここで、５’プローブについて新規に合成された標的領域を保有する、新規に合成された鎖に組み込まれる。次の回の変性およびアニーリングの間、スコーピオンのヘアピンループのプローブ領域は、標的にハイブリダイズし、これによって、フルオロフォアおよびクエンチャーを分け、そして測定可能なシグナルを生じる。このようなプローブは、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８０４−８０７（１９９９）および図１０に記載される。
本発明で有用なさらなるオリゴヌクレオチドプローブは、サンライズ／アンプリフロアー・プローブである。このサンライズ／アンプリフロアー・プローブは、ＨＥＧモノマーを欠いて、ヘアピンプローブ領域の５’→３’複製をブロックすることを除けば、スコーピオン・プローブと同様の構造のプローブである。従って、初回の増幅では、サンライズ／アンプリフロアーの３’標的特異的プライマーは、標的にアニーリングして、伸長され、これによって、新規に合成された鎖（サンライズ鎖）にヘアピンプローブを組み込む。２回目の増幅の間、第二の非標識プライマーは、サンライズ鎖の３’末端にアニーリングする（図１１のサイクル２）。しかし、ポリメラーゼが、ヘアピンの５’末端に達する場合、ＨＥＧ終止配列を欠くことに起因して、このポリメラーゼは、ヘアピンを置き換えて複製し、これによって、フルオロフォアおよびクエンチャーを分けて、直線化したヘアピンプローブを新規な鎖に組み込む。このタイプのプローブはさらに、Ｎａｚａｒｎｅｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２５：２５１６−２５２１（１９９７）に、そして図１１に記載される。
本発明において有用な安全ピン、スコーピオン、およびサンライズ／アンプリフロアー・プローブについては、この標的に相補的であるプローブ配列の長さは、この核酸標的配列に相補的な領域が標的核酸に結合せず、かつこの２つの関連が、プローブが利用されるアッセイ条件に従って設計される場合、相補的な核酸配列によって互いと可逆的に相互作用するプローブの領域（例えば、ステム・ハイブリッド）の長さ。特定のアッセイ条件のための標的相補的な配列およびステム・ハイブリッド配列の長さは、当分野で公知であるものに従って評価され得る。相補的な核酸配列によって互いと可逆的に相互作用するプローブの領域は、核酸標的配列に相補的な領域が標的核酸に結合しない場合、各々６〜１００、好ましくは８〜５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは８〜２５ヌクレオチドである。標的に相補的であるプローブ配列の長さは好ましくは、１７〜４０ヌクレオチド、より好ましくは１７〜３０ヌクレオチド、そして最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチド長である。相補的な核酸配列によって互いと可逆的に相互作用するプローブの領域の間の相互作用の安定性は、適切な機能を達成するための慣用的な実験によって決定される。長さに加えて、相補的な核酸配列によって互いと可逆的に相互作用するプローブの領域の間の相互作用は、Ｇ−Ｃ含量を変更すること、および不安低下ミスマッチを挿入することによって調整され得る。相補的な核酸配列によって互いに可逆的に相互作用するプローブの領域の１つは、この標的と部分的にまたは完全に相補的であるように設計され得る。３’アームが標的に相補的である場合、プローブは、ＤＮＡポリメラーゼのプライマーとして機能し得る。さらに、波長−シフト分子指標プローブは、係合などによって、固体表面に固定されてもよいし、または自由に動いてもよい。
広範なフルオロフォアが、本発明によるプローブおよびプライマーで用いられ得る。利用可能なフルオロフォアとしては、クマリン、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ルシファー・イエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、テトラメチルローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、エオシン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ）およびＲＯＸが含まれる。組み合わせたフルオロフォア、例えば、フルオレセイン−ローダミン二量体、（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：２８１６に記載される）も適切である。フルオロフォアは、可視スペクトルにおいて、または可視スペクトルの外に、例えば、紫外線領域または赤外線領域で、吸収および放射するように選択され得る。
当分野で記載される適切な消光物質としては、特にＤＡＢＣＹＬおよびその改変体、例えば、ＤＡＢＳＹＬ，ＤＡＢＭＩおよびメチルレッド（Ｍｅｔｈｙｌ Ｒｅｄ）が含まれる。フルオロフォアはまた、クエンチャーとして用いられてもよい。なぜなら、それらは、特定の他のフルオロフォアと接触するとき、フルオロフォアを消光する傾向であるからである。好ましいクエンチャーは、発色団、例えば、ＤＡＢＣＹＬもしくはマラカイトグリーン、またはプローブが開口した高次構造であるとき検出範囲で蛍光を発しないフルオロフォアのいずれかである。
Ｄ．核酸の産生
本発明は、標的核酸の増幅のため、および切断構造の形成のために検出または測定されるべき核酸を提供する。
本発明は、核酸（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、および混合ポリマーを含む）を利用する。本発明には、核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方が含まれる。本発明によれば、核酸は化学的に改変されても、もしくは生化学的に改変されてもよいし、または非天然もしくは誘導されたヌクレオチド塩基を含んでもよい。このような改変としては、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの置換、ヌクレオチド間改変、例えば、無電荷結合（例えば、リン酸メチル、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｏｒｓ）（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、および改変結合（例えば、αアノマー核酸など）が含まれる。水素結合および他の化学的相互作用を介した設計配列への結合能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。このような分子は当分野で公知であり、例えば、分子の骨格におけるリン酸結合をペプチド結合に置換されている分子が含まれる。
１．ＤＮＡを含む核酸
ａ．クローニング
ＤＮＡを含む核酸は、当業者に周知のクローニング法（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）によってｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離することができる。要するに、特定の核酸配列を含むＤＮＡクローンの単離は、組換えＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、および所望の配列を含むクローンの同定を含む。クローニングは、以下のステップを含む。特定のライブラリーのクローンをプレートに広げ、適切なスクリーニング用基質に移し、変性し、特定の核酸の存在を探索する。ハイブリッド条件および標識プローブの作製法を、以下に記載する。
所望のクローンを、核酸プローブへのハイブリダイゼーションによって、または抗体により検出することができるタンパク質の発現によって同定することが好ましい。あるいは、所望のクローンを、下記の方法に従った特定のプライマーのセットによって定義される配列のポリメラーゼ連鎖増幅によって同定する。
適切なライブラリーの選択は、所望の配列の豊富な供給源である組織または細胞株の同定を含む。さらに、対象の核酸が調節配列またはイントロン配列を含む場合、ゲノムライブラリーをスクリーニングする（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。
ｂ．ゲノムＤＮＡ
本発明の核酸配列を、ゲノムＤＮＡから増幅する。以下の方法に従って、ゲノムＤＮＡを組織または細胞から単離する。
特定の組織由来の遺伝子の変形型の検出を容易にするために、周囲の正常な組織から組織を単離する。哺乳動物組織からゲノムＤＮＡを単離するために、組織を細かく刻んで液体窒素中で凍結する。凍結組織を予め冷却した乳鉢および乳棒で微粉に挽き、１００ｍｇの組織あたり１．２ｍｌの消化緩衝液で、消化緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）中に懸濁する。哺乳動物組織培養細胞からゲノムＤＮＡを単離するために、５００×ｇで５分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、１〜１０ｍｌの氷冷ＰＢＳに再懸濁し、５００×ｇで５分間に再ペレット化し、１容積の消化緩衝液中に再懸濁する。
消化緩衝液中のサンプルを、５００Ｃで１２〜１８時間（震盪しながら）インキュベートし、次いで、同容積のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出する。遠心分離ステップ（１７００×ｇで１０分間）後に層が分離しない場合、別の容積の消化緩衝液（プロテイナーゼＫを含まない）を添加して、遠心分離ステップを繰り返す。厚い白色の物質が二層の境界で確認されれば、有機抽出ステップを繰り返す。上部を抽出後、水層を、１／２容積の７．５Ｍ酢酸アンモニウムおよび２容積の１００％エタノールを添加した新しいチューブに移す。核酸を１７００×ｇで２分間の遠心分離でペレットにし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥して、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。０．１％ＳＤＳおよび１μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅなしのＲＮａｓｅの存在下で、３７０Ｃで１時間、このサンプルをインキュベートすること、そして抽出およびエタノール沈殿ステップを繰り返すことによって、残りのＲＮＡを除去する。本方法によるゲノムＤＮＡの収率は、約２ｍｇＤＮＡ／１ｇ細胞または組織と予想される（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。本方法によって単離したゲノムＤＮＡは、本発明に従って、ＰＣＲ分析に用いることができる。
ｃ．（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡの）制限消化
特定の標的核酸配列を含む所望のｃＤＮＡまたはゲノムクローンの同定後、制限酵素での消化によってこれらのクローンから本発明の核酸を単離してもよい。
制限酵素消化技術は当業者に周知である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。制限酵素消化に有用な試薬は、他の供給源と同様に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅを含む供給業者から容易に入手可能である。
ｄ．ＰＣＲ
本発明の核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってゲノムＤＮＡまたは他の天然の供給源から増幅してもよい。ＰＣＲ法は、当業者に周知である。
ＰＣＲにより、対象の標的配列を増幅するための熱安定性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される複数のＤＮＡ複製サイクルの使用による特定のＤＮＡ配列の迅速な増幅法が得られる。ＰＣＲには、増幅すべき標的核酸、増幅すべき配列に隣接する２つの一本鎖オリゴヌクレオチドプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液、および塩の存在を必要とする。
ＰＣＲは、Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５、３５５（本明細書中で参照により組み込まれる）に記載のとおり行う。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術は、米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号、および同第４，８００，１５９号に開示されている。その最も単純な形態では、ＰＣＲは反対の鎖とハイブリダイズし、標的ＤＮＡ中の対象の領域に隣接する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる、特異的ＤＮＡ配列のインビトロ酵素合成法である。テンプレートの変性、プライマーアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼによるアニーリングプライマーの伸長を含む一連の連続反復ステップにより、末端がプライマーの５’末端によって定義される特異的フラグメントが指数関数的に蓄積される。ＰＣＲにより、特異的ＤＮＡ配列を１０９倍まで選択的に富化することができると報告されている。ＰＣＲ法はまた、Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３５０にも記載されている。
テンプレートＤＮＡ（少なくとも１ｆｇ；より通常には１〜１０００ｎｇ）および少なくとも２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲを行う。典型的な反応混合物は、以下を含む。２μｌのＤＮＡ、２５ｐｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマー、２．５μｌの適切な緩衝液、０．４μｌの１．２５μＭ ｄＮＴＰ、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および脱イオン水（総容積２５μｌ）。鉱物油を重層し、プログラム可能なサーマルサイクラーを用いてＰＣＲを行う。
ＰＣＲサイクルの各ステップの長さおよび温度、ならびにサイクル数を、有効なストリンジェンシー要件に従って調整する。プライマーがテンプレートにアニーリングすると予想される効率および許容されるミスマッチの程度によって、アニーリング温度およびタイミングを決定する。プライマーアニーリング条件のストリンジェンシーを至適化する能力は、十分に当業者の知識の範囲内である。３０℃〜７２℃のアニーリング温度を用いる。テンプレート分子の最初の変性は、通常、９２℃と９９℃との間で４分間で生じ、その後に、変性（９４〜９９℃で１５秒間〜１分間）、アニーリング（上記での考察によって決定した温度で１〜２分間）、および伸長（７２℃で１分間）からなる２０〜４０サイクルを続ける。一般に、７２℃で４分間の最終伸長ステップを行い、その後４℃での不確定（０〜２４時間）のステップを行ってもよい。
一般に、標準的ＰＣＲ技術で用いられる検出法は、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて、増幅ＤＮＡで標識した標識プローブを用いる。好ましくは、例えば３２Ｐ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などでプローブを標識して、ハイブリダイゼーションの検出を可能にする。
他の検出手段としては、フラグメント長多形（ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＰＣＲ ＦＬＰ）の使用、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブへのハイブリダイゼーション（Ｓａｉｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２４：１６３）、またはジデオキシ法による直接的配列決定（クローン化ＤＮＡよりもむしろ増幅ＤＮＡを用いる）が含まれる。標準的ＰＣＲ技術は、２つのプライマーの間に位置するＤＮＡ配列を複製すること、主要な反応産物としての各鎖の５’末端でプライマーで終結した個別の長さのＤＮＡ配列の獲得によって（本質的に）動作する。従って、プライマー間の挿入および欠失により、ＰＣＲ−ＦＬＰでの産物のサイズ決定により検出することができる異なる長さの産物配列が得られる。ＡＳＯハイブリダイゼーションの例では、一連の「ドットブロット」において増幅ＤＮＡをナイロンフィルタ（例えば、ＵＶ照射による）に固定し、次いで、ストリンジェントな条件下で、ＨＲＰで標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせる。洗浄後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）および過酸化水素を添加する。ＨＲＰは過酸化水素を酸化し、これが、ＴＭＢを青色沈殿に酸化し、これによってハイブリダイゼーションプローブが示される。
本発明による核酸の検出または測定アッセイ用のためのＰＣＲアッセイは、「使用法」というタイトルの項に記載されている。
２．ＲＮＡを含む核酸
本発明はまた、ＲＮＡを含む核酸を提供する。
ＲＮＡを含む核酸は、当分野で周知の方法に従って精製し得る（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。当分野で周知であり（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）、かつ以下に記載の方法に従って、細胞または組織から全ＲＮＡを単離することができる。
以下の方法に従って哺乳動物組織からＲＮＡを精製する。対象の組織を取り出した後、２ｇ以下の組織片を切断して、液体窒素中で急速凍結してＲＮＡの分解を防止する。適切な容積のグアニジニウム溶液（例えば、２ｇの組織あたり２０ｍｌのグアニジニウム溶液）の添加の際、組織サンプルをティッシューマイザー（ｔｉｓｓｕｅｍｉｚｅｒ）により２または３回の１０秒間のバーストで挽く。組織グアニジウム溶液（１Ｌ）を調製するために、５９０．８ｇのグアニジウムイソチオシアネートを約４００ｍｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解する。２５ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）（最終濃度０．０５Ｍ）および２０ｍｌ Ｎａ２ＥＤＴＡ（最終濃度０．０１Ｍ）を添加し、溶液を一晩撹拌し、その容積を９５０ｍｌに調整し、５０ｍｌの２−ＭＥを添加する。
ホモジナイズした組織サンプルを、１２，０００×ｇ、１２０Ｃで１０分間の遠心分離に供する。得られた上清を０．１容積の２０％Ｓａｒｋｏｓｙｌの存在下、６５０Ｃで２分間インキュベートし、９ｍｌの５．７ＭＣｓＣｌ溶液（０．１ｇ ＣｓＣｌ／ｍｌ）で重層し、２２０Ｃ、１１３，０００×ｇで一晩の遠心分離によって分離する。上清の慎重な除去後、試験管を反転して排出を行う。試験管の底（ＲＮＡペレットを含む）を、５０ｍｌのプラスチック製チューブに入れ、３ｍｌの組織再懸濁緩衝液（５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％（ｖ／ｖ）Ｓａｒｋｏｓｙｌ、５％（ｖ／ｖ）２−ＭＥ）の存在下で、４０Ｃで一晩（またはより長く）インキュベートして、ＲＮＡペレットを完全に再懸濁させる。得られたＲＮＡ溶液を２５：２４：１フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール、続いて２４：１のクロロホルム／イソアミルアルコールで連続的に抽出し、３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および２．５容積の１００％エタノールの添加によって沈殿させ、ＤＥＰＣ水に再懸濁する（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８：５２９４）。
あるいは、１ステッププロトコールに従って、哺乳動物組織からＲＮＡを単離する。１００ｍｇの組織あたり１ｍｌの変性溶液（４Ｍのグアニジニウムチオ硫酸、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、０．１Ｍの２−ＭＥ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｎ−ラウリルサルコシン）中でのガラステフロンホモジナイザーでの均質化によって対象の組織を調製する。ホモジネートを５ｍｌポリプロピレンチューブに移した後、０．１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１ｍｌの水飽和フェノール、および０．２ｍｌの４９：１クロロホルム／イソアミルアルコールを連続的に添加する。各成分の添加後にサンプルを混合し、全成分の添加後に０〜４０Ｃで１５分間インキュベートする。サンプルを４℃、１０，０００×ｇで２０分間の遠心分離によって分離し、１ｍｌの１００％イソプロパノールの添加によって沈殿させ、−２０℃で３０分間インキュベートし、４℃、１０，０００×ｇで１０分間の遠心分離によってペレット化する。得られたＲＮＡペレットを、０．３ｍｌの変性溶液に溶解し、微量遠心管に移し、−２０℃で３０分間の０．３ｍｌの１００％イソプロパノール添加によって沈殿させ、４℃、１０，０００×ｇで１０分間、遠心分離する。ＲＮＡペレットを７０％エタノール中で洗浄し、乾燥し、１００〜２００μｌのＤＥＰＣ処理水またはＤＥＰＣ処理０．５％ＳＤＳに再懸濁する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６）。
インビトロ転写法に従って、ＲＮＡを含む核酸を作製することができる。
インビトロ転写技術は当業者に周知である。要するに、対象の遺伝子をＳＰ６、Ｔ３、またはＴ７プロモーターを含むベクターに挿入する。ベクターを、コード配列の下流に存在する１つの部位でベクターを消化する適切な制限酵素で線状化する。フェノール／クロロホルム抽出後、ＤＮＡをエタノール沈殿し、７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、滅菌水に再懸濁する。直線化したＤＮＡと、転写緩衝液（２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、４０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン、２５０ ＮａＣｌ［Ｔ７またはＴ３］、または２００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３０ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭスペルミジン［ＳＰ６］）、ジチオスレイトール、ＲＮアーゼインヒビター、各々の４つのリボヌクレオシド三リン酸、およびＳＰ６、Ｔ７、またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼのいずれかとを、３７０Ｃで３０分間インキュベートすることによって、インビトロ転写反応を行う。ＲＮＡを含む放射性標識ポリヌクレオチドを調製するために、未標識ＵＴＰを省略し、３５Ｓ−ＵＴＰを反応混合物に含む。次いで、ＤＮＡテンプレートをＤＮアーゼＩとのインキュベーションにより取り除く。エタノール沈殿後、放射性標識ＲＮＡのアリコートを、シンチレーションカウンターで計数してｃｐｍ／μｌを決定する（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。
あるいは、ＲＮＡを含む核酸を、固相ホスホラミダイド（上記）などの化学合成技術によって調製する。
３．オリゴヌクレオチドを含む核酸
オリゴヌクレオチドを含む核酸は、市販されているオリゴヌクレオチド合成機の使用によって作製してもよい（上記）。
ＩＶ．切断構造
本発明は、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）で切断することができる切断構造を提供するので、切断構造を調製する方法を教示する。本発明はまた、標識された切断構造および標識された切断構造を調製する方法を提供する。
プローブを用いて、本発明による切断構造を調製する。
Ａ．切断構造の調製
一実施形態では、本発明による切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で１〜２分間、その後約４０〜７２℃の間への冷却）で、ａ）上流オリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの下流５０００ヌクレオチド以内に位置するオリゴヌクレオチドプローブ、およびｃ）標的配列が両プライマーに相補的である適切な標的核酸配列およびプローブ、ならびにｄ）適切な緩衝液（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な１０×Ｐｆｕ緩衝液（カタログ番号２００５３６））、または用いられる特定のポリメラーゼ（例えば、ＲＴ）と適合する緩衝液をインキュベートすることによって形成する。至適温度は、特異的プローブ、プライマーおよびポリメラーゼに依存して変化する。本発明のいくつかの実施形態では、切断構造は、重複フラップを含み、ここでは、標的核酸配列にハイブリダイズすることができる上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）が、標的核酸にアニーリングする下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）の１つ以上の塩基対に相補的である。
別の実施形態では、本発明による切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で１〜２分間、その後約４０〜６０℃の間への冷却）で、ａ）ＲＮＡポリメラーゼ合成のオリゴヌクレオチド、ｂ）プロモーターの下流５０００ヌクレオチド以内に位置するオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにｃ）標的配列がプロモーター領域を含み、かつ下流プローブに対して少なくとも部分的に相補的である適切な標的核酸、およびｄ）適切な緩衝液をインキュベートすることによって形成する。至適温度は、特異的プローブおよびＲＮＡポリメラーゼに依存して変化する。本発明のいくつかの実施形態では、切断構造は、重複フラップを含み、ここでは、標的核酸配列にハイブリダイズすることができる上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）が、標的核酸にアニーリングする下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）の１つ以上の塩基対に相補的である。
一実施形態では、本発明による切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、ａ）上流、好ましくは伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの下流５０００ヌクレオチド以内に位置する、標的核酸に対する結合に応じて変化する本明細書に記載のような二次構造を有し、かつ結合部分を含むオリゴヌクレオチドプローブ、ならびにｃ）標的配列が両プライマーに相補的である適切な標的核酸配列、ならびにｄ）適切な緩衝液（例えば、Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｅａｃｏｎ ＰＣＲコア緩衝液（カタログ番号６００５００）、またはＳｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な１０×Ｐｆｕ緩衝液（カタログ番号２００５３６））をインキュベートすることによって形成する。至適温度は、特異的プローブ、プライマー、およびポリメラーゼに依存して変化する。本発明の好ましい実施形態では、切断構造は、重複フラップを含み、ここでは、標的核酸にハイブリダイズすることができる上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）が、標的核酸にアニーリングされる下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）の１つ以上の塩基対に相補的であり、そして１塩基対の重複は一本鎖フラップの伸長のポイントの直ぐ下流である。
この実施形態によれば、上流オリゴヌクレオチドプライマーの３’末端は、本発明によるポリメラーゼの合成活性によって伸長され、その結果、上流オリゴヌクレオチドプライマーの新規に合成された３’が、下流オリゴヌクレオチドプローブの５’末端を部分的に置き換える。伸長は好ましくは、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で、７２℃で１５秒間行う。
本発明の別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、標的核酸に対する結合に応じて変化する本明細書に記載のような二次構造を有し、かつ標的核酸に対する結合部分を含む、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーとをインキュベートすることによって調製してもよく、この結果３’相補領域がこの標的核酸にアニーリングし、標的核酸配列にアニーリングしない非相補５’領域が５’フラップを形成する。アニーリングは好ましくは、適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）の存在下で、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で行う。
本発明の別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、この標的核酸にハイブリダイズできる上流プライマー、および標的核酸に対する結合に応じて変化する、本明細書に記載のような二次構造を有し、かつ結合部分を含む、部分的に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーとをインキュベートすることによって調製してもよく、この結果３’相補領域がこの標的核酸にアニーリングし、標的核酸配列にアニーリングしない非相補５’領域が５’フラップを形成する。アニーリングは好ましくは、適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の存在下で、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で行う。
Ｂ．標識された切断構造を調製する方法
本発明では、オリゴヌクレオチドプローブに標識を結合させる。本発明の一実施形態では、切断構造を含む、標的核酸に対する結合に応じて変化する本明細書に記載のような二次構造を有し、かつ結合部分を含むオリゴヌクレオチドプローブに対して標識を結合させる。別の実施形態では、二次構造を有さないプローブに対して標識が結合される。このように、フラップ特異性ヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性によって切断される切断モノヌクレオチドまたは小さなオリゴヌクレオチドを検出することができる。
本発明による標識された切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、約９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、ａ）上流の伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの下流５００ヌクレオチド以内に位置する標識されたプローブ、ｃ）標的配列がオリゴヌクレオチドに相補的である適切な標的核酸配列、およびｄ）適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）をインキュベートすることによって形成する。本発明による切断構造はまた、標的核酸配列にハイブリダイズすることができる上流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＡ）の３’末端が、標的核酸配列にアニーリングされる下流オリゴヌクレオチド（例えば、図３のＣ）の１塩基対に相補的であり、１つの塩基対の重複が一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流である重複フラップを含む。上流プライマーの３’末端は、ポリメラーゼ（例えば、逆転写酵素）の合成活性によって伸長され、その結果上流プライマーの新規に合成された３’末端が下流プローブの標識５’末端を部分的に置き換える。伸長は、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で７２℃で１５秒間行うことが好ましい。本発明による切断構造は、標的核酸配列と、この標的核酸配列にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補性標識５’領域およびこの標的核酸配列にアニーリングする相補３’領域を含むプローブとをインキュベートすることによって調製してもよい。アニーリングは、適切な緩衝液（例えば１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）の存在下で、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、行うことが好ましい。
一実施形態では、本発明による標識された切断構造を、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、約９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、ａ）上流の伸長可能な３’末端、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ）上流プライマーの下流５０００ヌクレオチド以内に位置する、標的核酸に対する結合に応じて変化する本明細書に規定のような二次構造を有し、かつ結合部分を含む標識されたプローブ、ｃ）標的配列がオリゴヌクレオチドに相補的である適切な標的核酸、およびｄ）適切な緩衝液（例えば、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）をインキュベートすることによって形成する。本発明による切断構造はまた、重複するフラップを含み、ここでは、標的核酸にハイブリダイズすることができる上流オリゴヌクレオチドの３’末端（例えば、図４のＡ）が、標的核酸にアニーリングされる結合部分（例えば、図４のＣ）を含む標的核酸に対する結合に応じて変化する本明細書に定義される二次構造を有する下流オリゴヌクレオチドプローブの１塩基対に相補的であり、かつこの１塩基対重複がこの一本鎖フラップの伸長点のすぐ下流である。上流プライマーの３’末端は、ポリメラーゼの合成活性によって伸長され、その結果この上流プライマーの新規に合成された３’末端が下流プローブの標識５’末端を部分的に置き換える。伸長は、好ましくは、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ 分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液の存在下において７２℃で１５秒間行う。
別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、本明細書に定義される標的核酸への結合に応じて変化する二次構造を有し、結合部分を含むプローブとを、インキュベートすることによって調製してもよく、そしてさらにこの標的核酸にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補な標識５’領域およびこの標的核酸にアニーリングする相補的３’領域を含む。アニーリングは好ましくは、適切な緩衝液（例えば１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）の存在下で、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で、行う。
別の実施形態では、本発明による切断構造は、標的核酸と、前記標的核酸にハイブリダイズできる上流プライマーと、本明細書に定義される標的核酸への結合に応じて変化する二次構造を有し、結合部分を含むプローブとを、インキュベートすることによって調製してもよく、そしてさらにこの標的核酸にアニーリングしないで５’フラップを形成する非相補な標識５’領域、およびこの標的核酸にアニーリングする相補的３’領域を含む。アニーリングは好ましくは、適切な緩衝液（例えば１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ 分子指標コア緩衝液または１×Ｐｆｕ緩衝液）の存在下で、核酸配列がオリゴヌクレオチドプライマーとハイブリダイズすることを可能にする条件下（例えば、９５℃で２〜５分間、その後約５０〜６０℃の間への冷却）で行う。
引き続いて、任意のいくつかのストラテジーを使用して、非切断標識核酸を、その切断フラグメントから識別してもよい。本発明は、固体支持体上での、捕獲エレメントに対する、結合部分またはタグの結合によって捕獲される、切断され、遊離された核酸フラグメントの量を検出するための方法を提供する。この様式では、本発明により、標的核酸配列を含むこれらのサンプルの同定が可能である。
オリゴヌクレオチドプローブを、下記のように、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、酵素または化学的手段による、検出可能な部分の組み込みによって標識する。オリゴヌクレオチドプローブへの標識の連結または抱合の方法は、当然ながら、用いた標識のタイプおよびプローブ上の標識の位置に依存する。本発明によって有用なプローブは５’末端で標識されても、３’末端で標識されても、またはプローブの長さ全体にわたって標識されてもよい。
本発明での使用に適切である種々の標識、ならびにプローブへの封入の方法は当分野で公知であり、そしてこれには、限定はしないが、互いに相互作用して、シグナルを増加、変化、または減少し得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ）および酵素基質、放射性原子、蛍光染料、発色団、化学発光標識、電気化学発光標識、例えば、ＯｒｉｇｅｎＴＭ（Ｉｇｅｎ）が含まれる。当然ながら、標識分子をサーマルサイクラー装置を用いて行うＰＣＲベースのアッセイで用いる場合、標識は、この自動化処理過程に必要な温度サイクリングに耐えることができなければならない。
放射性原子のうち、３３Ｐまたは３２Ｐが好ましい。核酸への３３Ｐまたは３２Ｐの導入のための方法は当分野で公知であり、これには、例えば、キナーゼでの５’標識またはニック翻訳による無作為挿入が含まれる。「特異的結合パートナー」とは、例えば、抗原およびそれに特異的なモノクローナル抗体の場合のように、高い特異性でリガンド分子を結合することができるタンパク質を言う。他の特異的結合パートナーとしては、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧとプロテインＡ、ならびに当分野で公知の多数のレセプター−リガンド結合が含まれる。上記は、種々の標識を別個のクラスに分類することを意味しない。なぜなら、同一の標識がいくつかの異なる様式で作用し得るからである。例えば、１２５Ｉは、放射性標識または電子密度試薬として作用し得る。ＨＲＰは、酵素またはモノクローナル抗体の抗原として作用し得る。さらに、所望の効果のために種々の標識を組み合わせてもよい。例えば、ビオチンでプローブを標識してもよく、１２５Ｉで標識したアビジンで、またはＨＲＰで標識した抗ビオチンモノクローナル抗体でプローブの存在を検出してもよい。他の置換および可能性は、当業者に容易に明らかであり、そして本発明の範囲内の等価物とみなされる。
本発明の標識プローブの構築における標識としての用途のフルオロフォアとしては、ローダミンおよび誘導体（テキサスレッドなど）、フルオレセインおよび誘導体（５−ブロモメチルフルオレセインなど）、ルシファー・イエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ）、ＩＡＥＤＡＮＳ、７−Ｍｅ２Ｎ−クマリン−４−アセテート、７−ＯＨ−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート、７−ＮＨ２−４−ＣＨ３−クマリン−３−アセテート（ＡＭＣＡ）、モノブロモビメイン、ピレントリスルホナート（カスケードブルーなど）、およびモノブロモリメチル−アンモニオビメインが含まれる。一般に、モノクロメーターよりもむしろフィルターを備える蛍光光度計を用いて、検出効率を増大させるために、広範なストークス・シフトを有するフルオロフォアが好ましい。
フルオロフォアで標識したプローブを、本発明による標識プローブを含む切断構造のヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）媒介切断に容易に用いることができる。標識がプローブの５’末端に存在する場合、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）によって生成された標識フラグメントを、当分野で周知の手順によってインタクトなハイブリダイゼーションプローブから分離する。
本発明の別の実施形態では、ハイブリダイズした、標識されたプローブの検出は、分子タンブリング（ｔｕｍｂｌｉｎｇ）に基づいて高分子と低分子との間を識別する技術である、例えば、蛍光分極を用いて達成できる。高分子（すなわち、インタクトな標識プローブ）は、溶液中で、低分子よりもかなり緩徐にタンブリングする。対象の分子上の適切な部位に対する蛍光部分の結合の際に、この蛍光部分は、分子タンブリングに基づいて測定（および識別）され得、これによってインタクトなプローブと消化プローブとの間が識別される。
いくつかの状況では、オリゴヌクレオチドプローブの未折り畳み（例えば、プローブの二次構造における変化に起因する）または加水分解の間に、オリゴヌクレオチド上の標識の適切な間隔を空けることを維持して標識の分離を可能にするためにもたらされる懸念を考慮して単一のオリゴヌクレオチドプローブ上の２つの相互作用標識（例えば、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴ対）を用いてもよい。本発明に従って有用な好ましい相互作用標識としては、限定はしないが、ローダミンおよび誘導体、フルオレセインおよび誘導体、テキサスレッド、クマリンおよび誘導体、クリスタルバイオレットが含まれ、そして限定はしないが、本明細書に記載のいずれかのＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴ標識に加えて、ＤＡＢＣＹＬ、ＴＡＭＲＡ、およびＮＴＢ（ニトロチアゾールブルー）が含まれる。
次いで、遊離された標識の蛍光を、標的に結合された残りの標識に比較する。プローブが、約２０ヌクレオチド隔てられるフルオロフォアおよびクエンチャーで合成される場合、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）が生成したフラグメント、およびヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）の存在下での切断後に標的に結合して残るプローブを分離する必要はない。あるいは、クエンチャーは、プローブが標的核酸にハイブリダイズしないとき蛍光を発しないように、位置決めされる。このような二重標識プローブは、インタクトである場合、または標的核酸にハイブリダイズしない場合、蛍光を発しない（または、プローブが解離されない場合は、二分子もしくは多分子プローブの場合）。なぜなら、色素から放射される光はクエンチャーによって消光されるからである。従って、インタクトなプローブによって放射される任意の蛍光は、バックグラウンド蛍光であると考えられる。一実施形態では、標識されたプローブがＦＥＮヌクレアーゼによって切断される場合、色素およびクエンチャーが分けられて、遊離されたフラグメントは蛍光を発する。あるいは、標識されたプローブが、標識核酸にハイブリダイズされる場合、色素とクエンチャーとの間の距離が増大して、蛍光のレベルが増大する。プローブが二分子または多分子である実施形態では、プローブを含む分子の解離によって、蛍光の増大が生じる。蛍光の量は、サンプルに存在する核酸標的配列の量に比例する。
さらに別の実施形態では、各々が二本鎖標的配列の別の鎖の別の領域に相補的であるが、互いには相補的ではなく、その結果標識核酸が各々のプライマーの下流にアニーリングする、２つの標識核酸を用いる。例えば、２つのプローブの存在により、シグナル標識から発生するシグナルの強度は潜在的に２倍になり得、そしてＰＣＲ増幅の間にしばしば起こるように産物の鎖の再アニーリングが減少するようにさらに機能し得る。プライマーが結合する位置に隣接する位置（下流）でプローブが結合するようにプローブを選択する。
他の利点を得るために本発明においては複数のプローブを用いてもよい。例えば、サンプル中の多数の病原性物質を、単に反応混合物中に所望の数のプローブを投入することによって試験してよく、検出を容易にするために、プローブは各々異なる標識を含んでもよい。
当業者は、例えば、異なるＴｍを有するプローブを用いること、および１つのみのプローブ／対立遺伝子二本鎖に特異的な温度でのアニーリング／切断反応を行うことによって、本発明の複数のプローブを用いて対立遺伝子特異的または種特異的識別を達成することもできる。１つだけのプローブを用いること、および生成された切断産物のタイプを検査することによって対立遺伝子特異的識別を達成することもできる。本発明の一実施形態では、１つの対立遺伝子の少なくとも５’末端領域に正確に相補的であるが、他の対立遺伝子には相補的ではないようにプローブを設計する。他の対立遺伝子に関しては、プローブの５’末端領域でプローブがミスマッチされ、その結果、プローブが正確に相補的な対立遺伝子とハイブリダイズする場合に生成される切断産物と比較して、異なる切断産物が生成される。
プローブ配列を選択して重要な利点を得ることができるが、本明細書に規定されるようなプローブ標識および／またはタグの選択によって、重要な利点を認識することもできる。標識を、種々の技術によって直接または間接的にオリゴヌクレオチドに結合させてもよい。用いた標識またはタグの正確なタイプに依存して、標識をプローブの５’または３’末端に位置付けるか、プローブ内部に位置付けるか、種々のサイズのスペーサーアームおよび組成物に結合させて、シグナル相互作用を促進させてもよい。市販のホスホラミダイド試薬を用いて、適切に保護したホスホラミダイドを介して５−または３末端のいずれかで官能基（例えば、チオールまたは１価のアミン）を含むオリゴマーを作製してもよく、例えば「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｄ．，１９９０に記載のプロトコールを用いて標識してもよい。
オリゴヌクレオチドプローブ配列の典型的には５’末端へ、１つ以上のスルフヒドリル、アミノ、または水酸部分を導入するためのオリゴヌクレオチド官能化試薬導入のための方法は、米国特許第４，９１４，２１０号に記載されている。ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ−３２Ｐ−ＡＴＰまたはγ−３３Ｐ−ＡＴＰの使用によって、放射線同位元素として５’リン酸基を導入して、レポーター基を得てもよい。アミノチミジン残基または合成中に導入された６−アミノヘキシル残基と、ビオチンのＮヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応によってビオチンを５’末端に付加してもよい。３’末端での標識には、所望の部分（例えば、コルダイセピン３５Ｓ−ｄＡＴＰおよびビオチン化ｄＵＴＰなど）を付加するためにポリヌクレオチド末端トランスメラーゼを使用してもよい。
オリゴヌクレオチド誘導体はまた、利用可能な標識である。例えば、エテノ−ｄＡおよびエテノ−Ａは、核酸プローブに組み込むことができる公知の蛍光アデニンヌクレオチドである。同様に、エテノ−ｄＣまたは２−アミノプリンデオキシリボシドは、プローブ合成に用いることができる別のアナログである。このようなヌクレオチド誘導体を含むプローブを加水分解して、フラップ特異的ヌクレアーゼ活性によってさらにより強力に蛍光モノヌクレオチドを放出してもよい。
Ｃ．切断構造の切断およびシグナルの発生
本発明による切断構造は、上記の「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に記載の方法によって切断してもよい。
Ｄ．遊離された標識フラグメントの検出
標識フラグメントの検出または検証は、当分野で周知の種々の方法によって達成してもよく、そして標識切断構造を含む標識部分の特徴に依存してもよい。
本発明の一実施形態では、遊離された標識フラグメントを含む反応産物をサイズ分析に供する。標識フラグメントのサイズを決定する方法は当分野で公知であり、これには、例えば、ゲル電気泳動、勾配沈殿法、ゲル排除クロマトグラフィー、質量分析、およびホモクロマトグラフィーが含まれる。別の実施形態では、検出可能なシグナルは、１対の相互作用標識の分離に基づいて生成される。
一実施形態では、遊離された標識フラグメントは、固体支持体に結合された捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される。
１．捕獲エレメント
本発明による捕獲エレメントとは、結合部分と捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として、結合部分を（例えば、水素結合を介して、または相互作用を介して（例えば、核酸結合タンパク質と核酸結合部位との間、または相補的な核酸の間））特異的に結合する、任意の部分であり得る。
本発明によれば、結合部分は、捕獲エレメントに結合するプローブの領域を含む。本発明による捕獲エレメントは、例えば、水素結合を介して、捕獲エレメントに結合するプローブの領域を含む結合部分に対して相補的であり、かつ結合する核酸配列であり得る。例えば、結合部分は、核酸配列５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含むプローブの領域であり、そして対応する捕獲エレメントは、核酸配列５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む。
本発明はまた、結合部分捕獲エレメントまたはタグ捕獲エレメントの対をもたらし、ここでこの結合部分またはタグは、ＤＮＡ結合タンパク質であり、そして対応する捕獲エレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識され、かつ結合されるＤＮＡ配列である。本発明はまた、結合部分−捕獲エレメントまたはタグ−捕獲エレメントの対をもたらし、ここでこの捕獲エレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質であり、そして対応する結合部分またはタグは、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識され、かつ結合されるＤＮＡ配列である。
本発明に従って有用なＤＮＡ配列／ＤＮＡ結合タンパク質の相互作用としては、限定はしないが以下が含まれる。ｃ−ｍｙｂ、ＡＡＦ、ａｂｄ−Ａ、Ａｂｄ−Ｂ、ＡＢＦ−２、ＡＢＦ１、ＡＣＥ２、ＡＣＦ、ＡＤＡ２、ＡＤＡ３、Ａｄｆ−１、Ａｄｆ−２ａ、ＡＤＲ１、ＡＥＦ−１、ＡＦ−２、ＡＦＰ１、ＡＧＩＥ−ＢＰ１、ＡｈＲ、ＡＩＣ３、ＡＩＣ４、ＡＩＤ２、ＡＩＩＮ３、ＡＬＦ１Ｂ、α−１、α−ＣＰ１、α−ＣＰ２ａ、α−ＣＰ２ｂ、α−因子、α−ＰＡＬ、α２ｕＮＦ１、α２ｕＮＦ３、αＡ−ＣＲＹＢＰ１、αＨ２−αＨ３、αＭＨＣＢＦ１、ａＭＥＦ−２、ＡＭＬ１、ＡｎＣＦ、ＡＮＦ、ＡＮＦ−２、Ａｎｔｐ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＡＰ−３、ＡＰ−５、ＡＰＥＴＡＬＡ１、ＡＰＥＴＡＬＡ３、ＡＲ、ＡＲＧ ＲＩ、ＡＲＧ ＲＩＩ、Ａｒｎｔ、ＡＳ−Ｃ Ｔ３、ＡＳ３２１、ＡＳＦ−１、ＡＳＨ−１、ＡＳＨ−３ｂ、ＡＳＰ、ＡＴ−１３Ｐ２、ＡＴＢＦ１−Ａ、ＡＴＦ、ＡＴＦ−１、ＡＴＦ−３、ＡＴＦ−３δＺＩＰ、ＡＴＦ−ａδ、ＡＴＦ−様、Ａｔｈｂ−１、Ａｔｈｂ−２、Ａｘｉａｌ、ａｂａＡ、ＡＢＦ−１、Ａｃ、ＡＤＡ−ＮＦ１、ＡＤＤ１、Ａｄｆ−２ｂ、ＡＦ−１、ＡＧ、ＡＩＣ２、ＡＩＣ５、ＡＬＦ１Ａ、α−ＣＢＦ、α−ＣＰ２ａ、α−ＣＰ２ｂ、α−ＩＲＰ、α２ｕＮＦ２、αＨ０、ＡｍｄＲ、ＡＭＴ１、ＡＮＦ−１、Ａｐ、ＡＰ−３、ＡＰ−４、ＡＰＥＴＡＬＡ２、ａＲＡ、ＡＲＧ ＲＩＩＩ、ＡＲＰ−１、Ａｓｅ、ＡＳＨ−３ａ、ＡＴ−ＢＰ１、ＡＴＢＦ１−Ｂ、ＡＴＦ−２、ＡＴＦ−ａ、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、Ａｔｏ、Ｂ因子、Ｂ”、Ｂ−Ｍｙｃ、Ｂ−ＴＦＩＩＤ、バンドＩ因子（ｂａｎｄ Ｉ ｆａｃｔｏｒ）、ＢＡＰ、Ｂｃｄ、ＢＣＦＩ、Ｂｃｌ−３、β−１、ＢＥＴＡ１、ＢＥＴＡ２、ＢＦ−１、ＢＧＰ１、ＢｍＦＴＺ−Ｆ１、ＢＰ１、ＢＲ−Ｃ Ｚ１、ＢＲ−Ｃ Ｚ２、ＢＲ−Ｃ Ｚ４、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、ＢＲＦ１、ＢｒｌＡ、Ｂｒｎ−３ａ、Ｂｒｎ−４、Ｂｒｎ−５、ＢＵＦ１、ＢＵＦ２、Ｂ−Ｍｙｂ、ＢＡＦ１、ＢＡＳ１、ＢＣＦＩＩ、β−因子、ＢＥＴＡ３、ＢＬｙＦ、ＢＰ２、ＢＲ−Ｃ Ｚ３、ｂｒａｈｍａ、ｂｙｒ３、ｃ−ａｂｌ、ｃ−Ｅｔｓ−１、ｃ−Ｅｔｓ−２、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍａｆ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｑｉｎ、ｃ−Ｒｅｌ、Ｃ／ＥＢＰ、Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、Ｃ／ＥＢＰδ、Ｃ／ＥＢＰε、Ｃ／ＥＢＰγ、Ｃ１、ＣＡＣ−結合タンパク質、ＣＡＣＣＣ−結合因子、Ｃａｃｔｕｓ、Ｃａｄ、ＣＡＤ１、ＣＡＰ、ＣＡｒＧ ｂｏｘ−結合タンパク質、ＣＡＵＰ、ＣＢＦ、ＣＢＰ、ＣＢＴＦ、ＣＣＡＡＴ−結合因子、ＣＣＢＦ、ＣＣＦ、ＣＣＫ−１ａ、ＣＣＫ−１ｂ、ＣＤ２８ＲＣ、ＣＤＣ１０、Ｃｄｃ６８、ＣＤＦ、ｃｄｋ２、ＣＤＰ、Ｃｄｘ−１、Ｃｄｘ−２、Ｃｄｘ−３、ＣＥＢＦ、ＣＥＨ−１８、ＣｅＭｙｏＤ、ＣＦ１、Ｃｆ１ａ、ＣＦ２−Ｉ、ＣＦ２−ＩＩ、ＣＦ２−ＩＩＩ、ＣＦＦ、ＣＧ−１、ＣＨＯＰ−１０、Ｃｈｏｘ−２．７、ＣＩＩＩＢ１、Ｃｌｏｘ、Ｃｎｃ、ＣｏＭＰ１、コア−結合因子、ＣｏＳ、ＣＯＵＰ、ＣＯＵＰ−ＴＦ、ＣＰ１、ＣＰ１Ａ、ＣＰ１Ｂ、ＣＰ２、ＣＰＢＰ、ＣＰＣ１、ＣＰＥ結合タンパク質ＣＰＲＦ−１、ＣＰＲＦ−２、ＣＰＲＦ−３、ＣＲＥ−ＢＰ１、ＣＲＥ−ＢＰ２、ＣＲＥ−ＢＰ３、ＣＲＥ−ＢＰａ、ＣｒｅＡ、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＢ−２、ＣＲＥＢω、ＣＲＥＭα、ＣＲＥＭβ、ＣＲＥＭδ、ＣＲＥＭε、ＣＲＥＭγ、ＣＲＥＭτα、ＣＲＦ、ＣＳＢＰ−１、ＣＴＣＦ、ＣＴＦ、ＣＵＰ２、Ｃｕｔ、Ｃｕｘ、Ｃｘ、サイクリン（ｃｙｃｌｉｎ）Ａ、ＣＹＳ３、Ｄ−ＭＥＦ２、Ｄａ、ＤＡＬ８２、ＤＡＰ、ＤＡＴ１、ＤＢＦ−Ａ、ＤＢＦ４、ＤＢＰ、ＤＢＳＦ、ｄＣＲＥＢ、ｄＤＰ、ｄＥ２Ｆ、ＤＥＦ、Ｄｅｌｉｌａｈ、δ因子、δＣＲＥＢ、δＥ１、δＥＦ１、δＭａｘ、ＤＥＮＦ、ＤＥＰ、ＤＦ−１、Ｄｆｄ、ｄＦＲＡ、ジオキシンレセプター、ｄＪＲＡ、Ｄ１、ＤＩＩ、Ｄｌｘ、ＤＭ−ＳＳＲＰ１、ＤＭＬＰ１、ＤＰ−１、Ｄｐｎ、Ｄｒ１、ＤＲＴＦ、ＤＳＣ１、ＤＳＰ１、ＤＳＸＦ、ＤＳＸＭ、ＤＴＦ、Ｅ、Ｅ１Ａ、Ｅ２、Ｅ２ＢＰ、Ｅ２Ｆ、Ｅ２Ｆ−ＢＦ、Ｅ２Ｆ−Ｉ、Ｅ４、Ｅ４７、Ｅ４ＢＰ４、Ｅ４Ｆ、Ｅ４ＴＦ２、Ｅ７、Ｅ７４、Ｅ７５、ＥＢＦ、ＥＢＦ１、ＥＢＮＡ、ＥＢＰ、ＥＢＰ４０、ＥＣ、ＥＣＦ、ＥＣＨ、ＥｃＲ、ｅＥ−ＴＦ、ＥＦ−１Ａ、ＥＦ−Ｃ、ＥＦ１、ＥＦγ、Ｅｇｒ、ｅＨ−ＴＦ、ＥＩＩａ、ＥｉｖＦ、ＥＫＬＦ、Ｅｌｆ−１、Ｅｌｇ、Ｅｌｋ−１、ＥＬＰ、Ｅｌｔ−２、ＥｍＢＰ−１、胎児ＤＮＡ結合タンパク質、Ｅｍｃ、ＥＭＦ、Ｅｍｓ、Ｅｍｘ、Ｅｎ、ＥＮＨ−結合タンパク質、ＥＮＫＴＦ−１、εＦ１、ＥＲ、Ｅｒｇ、Ｅｓｃ、ＥＴＦ、Ｅｖｅ、Ｅｖｉ、Ｅｖｘ、Ｅｘｄ、Ｅｙ、ｆ（α−ε）、Ｆ−ＡＣＴ１、ｆ−ＥＢＰ、Ｆ２Ｆ、因子１−３、因子Ｂ１、因子Ｂ２、因子δ、因子Ｉ、ＦＢＦ−Ａ１、Ｆｂｆ１、ＦＫＢＰ５９、Ｆｋｈ、Ｆ１ｂＤ、Ｆｌｈ、Ｆｌｉ−１、ＦＬＶ−１、Ｆｏｓ−Ｂ、Ｆｒａ−２、ＦｒａＩ、ＦＲＧ Ｙ１、ＦＲＧ Ｙ２、ＦＴＳ、Ｆｔｚ、Ｆｔｚ−Ｆ１、Ｇ因子、Ｇ６因子、ＧＡ−ＢＦ、ＧＡＢＰ、ＧＡＤＤ １５３、ＧＡＦ、ＧＡＧＡ因子、ＧＡＬ４、ＧＡＬ８０、γ−因子、γＣＡＡＴ、γＣＡＣ、γＯＢＰ、ＧＡＴＡ−１、ＧＡＴＡ−２、ＧＡＴＡ−３、ＧＢＦ、ＧＣ１、ＧＣＦ、ＧＣＦ、ＧＣＮ４、ＧＣＲ１、ＧＥ１、ＧＥＢＦ−Ｉ、ＧＦ１、ＧＦＩ、Ｇｆｉ−１、ＧＦＩＩ、ＧＨＦ−５、ＧＬ１、Ｇｌａｓｓ、ＧＬＯ、ＧＭ−ＰＢＰ−１、ＧＰ、ＧＲ、ＧＲＦ−１、Ｇｓｂ、Ｇｓｂｎ、Ｇｓｃ、Ｇｔ、ＧＴ−１、Ｇｔｘ、Ｈ、Ｈ１６、Ｈ１１ＴＦ１、Ｈ２Ｂａｂｐ１、Ｈ２ＲＩＩＢＰ、Ｈ２ＴＦ１、Ｈ４ＴＦ−１、ＨＡＣ１、ＨＡＰ１、Ｈｂ、ＨＢＬＦ、ＨＢＰ−１、ＨＣＭ１、熱誘導性因子、ＨＥＢ、ＨＥＦ−１Ｂ、ＨＥＦ−１Ｔ、ＨＥＦ−４Ｃ、ＨＥＮ１、ＨＥＳ−１、ＨＩＦ−１、ＨｉＮＦ−Ａ、ＨＩＰ１、ＨＩＶ−ＥＰ２、Ｈ１ｆ、ＨＭＢＩ、ＨＮＦ−１、ＨＮＦ−３、Ｈｏｘ１１、ＨＯＸＡ１、ＨＯＸＡ１０、ＨＯＸＡ１０ＰＬ２、ＨＯＸＡ１１、ＨＯＸＡ２、ＨＯＸＡ３、ＨＯＸＡ４、ＨＯＸＡ５、ＨＯＸＡ７、ＨＯＸＡ９、ＨＯＸＢ１、ＨＯＸＢ３、ＨＯＸＢ４、ＨＯＸＢ５、ＨＯＸＢ６、ＨＯＸＢ７、ＨＯＸＢ８、ＨＯＸＢ９、ＨＯＸＣ５、ＨＯＸＣ６、ＨＯＸＣ８、ＨＯＸＤ１、ＨＯＸＤ１０、ＨＯＸＤ１１、ＨＯＸＤ１２、ＨＯＸＤ１３、ＨＯＸＤ４、ＨＯＸＤ８、ＨＯＸＤ９、ＨＰ１サイトファクター（ｓｉｔｅ ｆａｃｔｏｒ）、Ｈｐ５５、Ｈｐ６５、ＨｒｐＦ、ＨＳＥ−結合タンパク質、ＨＳＦ１、ＨＳＦ２、ＨＳＦ２４、ＨＳＦ３、ＨＳＦ３０、ＨＳＦ８、ｈｓｐ５６、Ｈｓｐ９０、ＨＳＴ、ＨＳＴＦ、Ｉ−ＰＯＵ、ＩＢＦ、ＩＢＰ−１、ＩＣＥＲ、ＩＣＰ４、ＩＣＳＢＰ、Ｉｄ１、Ｉｄ２、Ｉｄ３、Ｉｄ４、ＩＥ１、ＥＢＰ１、ＩＥＦｇａ、ＩＦ１、ＩＦ２、ＩＦＮＥＸ、ＩｇＰＥ−１、ＩＫ−１、ＩκＢ、Ｉｌ−１ ＲＦ、ＩＬ−６ ＲＥ−ＢＰ、Ｉｌ−６ ＲＦ、ＩＬＦ、ＩＬＲＦ−Ａ、ＩＭＥ１、ＩＮＯ２、ＩＮＳＡＦ、ＩＰＦ１、ＩＲＢＰ、ＩＲＥ−ＡＢＰ、ＩＲＥＢＦ−１、ＩＲＦ−１、ＩＳＧＦ−１、Ｉｓｌ−１、ＩＳＲＦ、ＩＴＦ、ＩＵＦ−１、Ｉｘｒ１、ＪＲＦ、Ｊｕｎ−Ｄ、ＪｕｎＢ、ＪｕｎＤ、Ｋ−２、κｙ因子、ｋＢＦ−Ａ、ＫＢＦ１、ＫＢＦ２、ＫＢＰ−１、ＫＥＲ−１、Ｋｅｒ１、ＫＮ１、Ｋｎｉ、Ｋｎｏｘ３、Ｋｒ、ｋｒｅｉｓｌｅｒ、ＫＲＦ−１、Ｋｒｏｘ−２０、Ｋｒｏｘ−２４、Ｋｕ自己抗原、ＫＵＰ、Ｌａｂ、ＬＡＣ９、ＬＢＰ、Ｌｃ、ＬＣＲ−Ｆ１、ＬＥＦ−１、ＬＥＦ−１Ｓ、ＬＥＵ３、ＬＦ−Ａ１、ＬＦ−Ｂ１、ＬＦ−Ｃ、ＬＦ−Ｈ３β、ＬＨ−２、Ｌｉｍ−１、Ｌｉｍ−３、ｌｉｎ−１１、ｌｉｎ−３１、ｌｉｎ−３２、ＬＩＰ、ＬＩＴ−１、ＬＫＬＦ、Ｌｍｘ−１、ＬＲＦ−１、ＬＳＦ、ＬＳＩＲＦ−２、ＬＶａ、ＬＶｂ−結合因子、ＬＶｃ、ＬｙＦ−１、Ｌｙｌ−１、Ｍ因子、Ｍ−Ｔｗｉｓｔ、Ｍ１、ｍ３、Ｍａｂ−１８、ＭＡＣ１、Ｍａｄ、ＭＡＦ、ＭａｆＢ、ＭａｆＦ、ＭａｆＧ、ＭａｆＫ、Ｍａ１６３、ＭＡＰＦ１、ＭＡＰＦ２、ＭＡＳＨ−１、ＭＡＳＨ−２、ｍａｔ−Ｍｃ、ｍａｔ−Ｐｃ、ＭＡＴａ１、ＭＡＴα１、ＭＡＴα２、ＭＡＴＨ−１、ＭＡＴＨ−２、Ｍａｘ１、ＭＡＺ、ＭＢＦ−１、ＭＢＰ−１、ＭＢＰ−２、ＭＣＢＦ、ＭＣＭ１、ＭＤＢＰ、ＭＥＢ−１、Ｍｅｃ−３、ＭＥＣＡ、媒介性因子、ＭＥＦ−２、ＭＥＦ−２Ｃ、ＭＥＦ−２Ｄ、ＭＥＦ１、ＭＥＰ−１、Ｍｅｓｏｌ、ＭＦ３、Ｍｉ、ＭＩＦ、ＭＩＧ１、ＭＬＰ、ＭＮＢ１ａ、ＭＮＦ１、ＭＯＫ−２、ＭＰ４、ＭＰＢＦ、ＭＲ、ＭＲＦ４、ＭＳＮ２、ＭＳＮ４、Ｍｓｘ−１、Ｍｓｘ−２、ＭＴＦ−１、ｍｔＴＦ１、ｍｕＥＢＰ−Ｂ、ｍｕＥＢＰ−Ｃ２、ＭＵＦ１、ＭＵＦ２、Ｍｘｉ１、Ｍｙｅｆ−２、Ｍｙｆ−３、Ｍｙｆ−４、Ｍｙｆ−５、Ｍｙｆ−６、Ｍｙｎ、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＭＺＦ−１、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｏｃｔ−２、Ｎ−Ｏｃｔ−３、Ｎ−Ｏｃｔ−４、Ｎ−Ｏｃｔ−５、Ｎａｕ、ＮＢＦ、ＮＣ１、ＮｅＰ１、Ｎｅｔ、ＮｅｕｒｏＤ、ニューロゲニン、ＮＦ ＩＩＩ−ａ、ＮＦ−１、ＮＦ−４ＦＡ、ＮＦ−ＡＴ、ＮＦ−ＢＡ１、ＮＦ−ＣＬＥ０ａ、ＮＦ−Ｄ、ＮＦ−Ｅ、ＮＦ−Ｅ１ｂ、ＮＦ−Ｅ２、ＮＦ−ＥＭ５、ＮＦ−ＧＭａ、ＮＦ−Ｈ１、ＮＦ−ＩＬ−２Ａ、ＮＦ−ＩｎｓＥ１、ＮＦ−κＢ、ＮＦ−ｌａｍｂｄａ２、ＮＦ−ＭＨＣＩＩＡ、ＮＦ−ｍｕＥ１、ＮＦ−ｍｕＮＲ、ＮＦ−Ｓ、ＮＦ−ＴＮＦ、ＮＦ−Ｕ１、ＮＦ−Ｗ１、ＮＦ−Ｘ、ＮＦ−Ｙ、ＮＦ−Ｚｃ、ＮＦα１、ＮＦＡＴ−１、ＮＦβＡ、ＮＦδＥ３Ａ、ＮＦδＥ４Ａ、ＮＦｅ、ＮＦＥ−６、ＮＦＨ３−１、ＮＦＨ３−２、ＮＦＨ３−３、ＮＦＨ３−４、ＮＧＦＩ−Ｂ、ＮＧＦＩ−Ｃ、ＮＨＰ、Ｎｉｌ−２−ａ、ＮＩＰ、ＮＩＴ２、Ｎｋｘ−２．５、ＮＬＳ１、ＮＭＨ７、ＮＰ−ＩＩＩ、ＮＰ−ＩＶ、ＮＰ−ＴＣＩＩ、ＮＰ−Ｖａ、ＮＲＤＩ、ＮＲＦ−１、ＮＲＦ−２、Ｎｒｆ１、Ｎｒｆ２、ＮＲＬ、ＮＲＳＦ１型、ＮＴＦ、ＮＵＣ−１、Ｎｕｒ７７、ＯＢＦ、ＯＢＰ、ＯＣＡ−Ｂ、ＯＣＳＴＦ、Ｏｃｔ−１、Ｏｃｔ−１０、Ｏｃｔ−１１、Ｏｃｔ−２、Ｏｃｔ−２．１、Ｏｃｔ−２．３、Ｏｃｔ−４、Ｏｃｔ−５、Ｏｃｔ−６、Ｏｃｔ−７、Ｏｃｔ−８、Ｏｃｔ−９、Ｏｃｔ−Ｂ２、Ｏｃｔ−Ｒ、Ｏｃｔａ−因子、オクタマー（ｏｃｔａｍｅｒ）−結合因子、Ｏｄｄ、Ｏｌｆ−１、Ｏｐａｑｕｅ−２、Ｏｔｄ、Ｏｔｘ１、Ｏｔｘ２、Ｏｖｏ、Ｐ、Ｐ１、ｐ１０７、ｐ１３０、ｐ２８モジュレーター、ｐ３００、ｐ３８ｅｒｇ、ｐ４０ｘ、ｐ４５、ｐ４９ｅｒｇ、ｐ５３、ｐ５５、ｐ５５ｅｒｇ、ｐ５８、ｐ６５δ、ｐ６７、ＰＡＢ１、ＰａｃＣ、Ｐａｐ１、Ｐａｒａｘｉｓ、Ｐａｘ−１、Ｐａｘ−２、Ｐａｘ−３、Ｐａｘ−５、Ｐａｘ−６、Ｐａｘ−７、Ｐａｘ−８、Ｐｂ、Ｐｂｘ−１ａ、Ｐｂｘ−１ｂ、ＰＣ、ＰＣ２、ＰＣ４、ＰＣ５、Ｐｃｒ１、ＰＣＲＥ１、ＰＣＴ１、ＰＤＭ−１、ＰＤＭ−２、ＰＥＡ１、ＰＥＢ１、ＰＥＢＰ２、ＰＥＢＰ５、Ｐｅｐ−１、ＰＦ１、ＰＧＡ４、ＰＨＤ１、ＰＨＯ２、ＰＨＯ４、ＰＨＯ８０、Ｐｈｏｘ−２、Ｐｉｔ−１、ＰＯ−Ｂ、ポインテッド（ｐｏｉｎｔｅｄ）Ｐ１、Ｐｏｕ２、ＰＰＡＲ、ＰＰＵＲ、ＰＰＹＲ、ＰＲ、ＰＲ Ａ、Ｐｒｄ、ＰｒＤＩ−ＢＦ１、ＰＲＥＢ、Ｐｒｈタンパク質ａ、タンパク質ｂ、タンパク質ｃ、タンパク質ｄ、ＰＲＰ、ＰＳＥ１、ＰＴＦ、Ｐｕ ｂｏｘ 結合因子、ＰＵ．１、ＰＵＢ１、ＰｕＦ、ＰＵＦ−Ｉ、Ｐｕｒ因子、ＰＵＴ３、ｐＸ、ｑａ−１Ｆ、ＱＢＰ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２、ＲＡｄ−１、ＲＡＦ、ＲＡＰ１、ＲＡＲ、Ｒｂ、ＲＢＰ−Ｊκ、ＲＢＰ６０、ＲＣ１、ＲＣ２、ＲＥＢ１、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ＣＡＲ１発現のリプレッサー、ＲＥＸ−１、ＲＦ−Ｙ、ＲＦ１、ＲＦＸ、ＲＧＭ１、ＲＩＭ１、ＲＬＭ１、ＲＭＥ１、Ｒｏ、ＲＯＲα、Ｒｏｘ１、ＲＰＦ１、ＲＰＧα、ＲＲＥＢ−１、ＲＲＦ１、ＲＳＲＦＣ４、ｒｕｎｔ、ＲＶＦ、ＲＸＲ−α、ＲＸＲ−β、ＲＸＲ−β２、ＲＸＲ−γ、Ｓ−ＣＲＥＭ、Ｓ−ＣＲＥＭβ、Ｓ８、ＳＡＰ−１ａ、ＳＡＰ１、ＳＢＦ、Ｓｃ、ＳＣＢＰα、ＳＣＤ１／ＢＰ、ＳＣＭ−誘導性因子、Ｓｃｒ、Ｓｄ、Ｓｄｃ−１、ＳＥＦ−１、ＳＦ−１、ＳＦ−２、ＳＦ−３、ＳＦ−Ａ、ＳＧＣ１、ＳＧＦ−１、ＳＧＦ−２、ＳＧＦ−３、ＳＧＦ−４、ＳＩＦ、ＳＩＩＩ、Ｓｉ


ｍ、ＳＩＮ１、Ｓｋｎ−１、ＳＫＯ１、Ｓｌｐ１、Ｓｎ、ＳＮＰ１、ＳＮＦ５、ＳＮＡＰＣ４３、Ｓｏｘ−１８、Ｓｏｘ−２、Ｓｏｘ−４、Ｓｏｘ−５、Ｓｏｘ−９、Ｓｏｘ−ＬＺ、Ｓｐ１、ｓｐＥ２Ｆ、Ｓｐｈ因子、Ｓｐｉ−Ｂ、Ｓｐｒｍ−１、ＳＲＢ１０、ＳＲＥＢＰ、ＳＲＦ、ＳＲＹ、ＳＳＤＢＰ−１、ｓｓＤＢＰ−２、ＳＳＲＰ１、ＳＴＡＦ−５０、ＳＴＡＴ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ６、ＳＴＣ、ＳＴＤ１、Ｓｔｅ１１、Ｓｔｅ１２、Ｓｔｅ４、ＳＴＭ、Ｓｕ（ｆ）、ＳＵＭ−１、ＳＷＩ１、ＳＷＩ４、ＳＷＩ５、ＳＷＩ６、ＳＷＰ、Ｔ−Ａｇ、ｔ−Ｐｏｕ２、Ｔ３Ｒ、ＴＡＢ、全ＴＡＦ包含サブユニット（ａｌｌ ＴＡＦｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）、Ｔａｌ−１、ＴＡＲ因子、ｔａｔ、Ｔａｘ、ＴＢＦ１、ＴＢＰ、ＴＣＦ、ＴＤＥＦ、ＴＥＡ１、ＴＥＣ１、ＴＥＦ、ｔｅｌ、Ｔｆ−ＬＦ１、ＴＦＥ３、全ＴＦＩＩ関連タンパク質（ａｌｌ ＴＦＩＩ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、ＴＢＡ１ａ、ＴＧＧＣＡ−結合タンパク質、ＴＧＴ３、Ｔｈ１、ＴＩＦ１、ＴＩＮ−１、ＴＩＰ、Ｔ１１、ＴＭＦ、ＴＲ２、Ｔｒａ−１、ＴＲＡＰ、ＴＲＥＢ−１、ＴＲＥＢ−２、ＴＲＥＢ−３、ＴＲＥＦ１、ＴＲＥＦ２、Ｔｓｈ、ＴＴＦ−１、ＴＴＦ−２、Ｔｔｋ６９ｋ、ＴＴＰ、Ｔｔｘ、ＴＵＢＦ、Ｔｗｉ、ＴｘＲＥＢＰ、ＴｙＢＦ、ＵＢＰ−１、Ｕｂｘ、ＵＣＲＢ、ＵＣＲＦ−Ｌ、ＵＦ１−Ｈ３β、ＵＦＡ、ＵＦＢ、ＵＨＦ−１、ＵＭＥ６、Ｕｎｃ−８６、ＵＲＦ、ＵＲＳＦ、ＵＲＴＦ、ＵＳＦ、ＵＳＦ２、ｖ−ＥｒｂＡ、ｖ−Ｅｔｓ、ｖ−Ｆｏｓ、ｖ−Ｊｕｎ、ｖ−Ｍａｆ、ｖ−Ｍｙｂ、ｖ−Ｍｙｃ、ｖ−Ｑｉｎ、ｖ−Ｒｅｌ、Ｖａｂ−３、ワクシニアウイルスＤＮＡ−結合タンパク質、Ｖａｖ、ＶＢＰ、ＶＤＲ、ＶＥＴＦ、ｖＨＮＦ−１、ＶＩＴＦ、Ｖｍｗ６５、Ｖｐ１、Ｖｐ１６、Ｗｈｎ、ＷＴ１、Ｘ−ｂｏｘ 結合タンパク質、Ｘ−Ｔｗｉｓｔ、Ｘ２ＢＰ、ＸＢＰ−１、ＸＢＰ−２、ＸＢＰ−３、ＸＦ１、ＸＦ２、ＸＦＤ−１、ＸＦＤ−３、ｘＭＥＦ−２、ＸＰＦ−１、ＸｒｐＦＩ、ＸＷ、ＸＸ、ｙａｎ、ＹＢ−１、ＹＥＢ３、ＹＥＢＰ、Ｙｉ、ＹＰＦ１、ＹＹ１、ＺＡＰ、ＺＥＭ１、ＺＥＭ２／３、Ｚｅｎ−１、Ｚｅｎ−２、Ｚｅｓｔｅ、ＺＦ１、ＺＦ２、Ｚｆｈ−１、Ｚｆｈ−２、Ｚｆｐ−３５、ＺＩＤ、Ｚｍｈｏｘｌａ、Ｚｔａ、ならびにこれらのＤＮＡ結合タンパク質または活性に関連する、全ての関連の特徴づけられたおよび特徴づけられていないホモログおよびファミリーのメンバー、ならびに上述のＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるＤＮＡ配列。ＤＮＡ結合タンパク質によって認識されるＤＮＡ配列を同定する方法は、当分野で公知である（例えば、米国特許第６，１３９，８３３号を参照のこと）。
本発明はまた、限定はしないが、テトラサイクリン（ｔｅｔ）リプレッサー、βガラクトシダーゼ（ｌａｃリプレッサー）、トリプトファン（ｔｒｐ）リプレッサー、λ特異的リプレッサータンパク質、ＣＲＯ、およびカタボライト活性化タンパク質、ＣＡＰおよびこれらのＤＮＡ結合タンパク質の各々によって認識されかつ当分野で公知であるＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ配列／ＤＮＡ結合タンパク質の相互作用を考慮している。本発明によって有用なＤＮＡ／ＤＮＡ結合タンパク質相互作用としてはまた、好ましくは制限酵素のヌクレアーゼ活性が抑制される条件下での、制限酵素、および対応する制限部位が含まれる（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，９８５，５５０号）。
本発明に従って有用な他のＤＮＡ：タンパク質の相互作用としては以下が含まれる（ｉ）表１および２に列挙されるＤＮＡタンパク質相互作用、ならびに（ｉｉ）細菌、酵素およびファージ系、例えば、λＯＬ−ＯＲ／ＣｒＯ（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７２６，０１４号）。特定の認識配列および同種認識配列に結合するタンパク質を含む任意の対は、本発明に有用であり得る。
特異的な結合が、本明細書に規定される捕獲エレメントと本明細書に規定される結合部分との間で生じる反応を行う方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。本発明による捕獲エレメントはまた、結合部分またはタグと捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として、結合部分またはタグを特異的に結合する（例えば、共有結合もしくは水素結合もしくは静電気引力を介して、または例えば、タンパク質とリガンド、抗体と抗原、タンパク質サブユニット、核酸結合タンパク質および核酸結合部位の間の相互作用を介して）任意の部分であり得る。特異的な結合が、本明細書に規定される捕獲エレメントと本明細書に規定されるタグとの間で生じる反応を行う方法は、当分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと。結合部分を含むプローブの二次構造が本明細書に規定されるように「変化されている」場合、特異的な結合だけが生じる。本発明に従って有用な捕獲エレメントとしては、限定はしないが、核酸結合タンパク質またはヌクレオチド配列、ビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、タンパク質、ヌクレオチド配列または化学的に反応性の部分が含まれる。
本発明の一実施形態では、遊離された標識フラグメントを含む反応産物を、サイズ分析に供する。標識されたフラグメントのサイズを決定する方法は、当分野で公知であって、これには例えば、ゲル電気泳動、勾配沈殿法、ゲル排除クロマトグラフィー、質量分析、およびホモクロマトグラフィーが含まれる。
２．固体基質
本発明による固体基質は、分子（例えば、捕獲エレメント）が不可逆的に結合され得る任意の表面であり、これには、限定はしないが、膜、磁気ビーズ、組織培養プレート、シリカベースのマトリックス、膜ベースのマトリックス、限定はしないがスチレン、ラテックスまたはシリカベースの物質、および他のポリマー、例えば、酢酸セルロース、テフロン、ポリビニリデンジフルオリド、ナイロン、ニトロセルロース、ポリエステル、カルボネート、ポリスルホン、金属、ゼオライト、紙、アルミナ、ガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリアミド、プラスチック、濾紙、デキストラン、ゲルマニウム、シリコン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、ガリウムヒ素、ガリウムリン、酸化ケイ素、硝酸ケイ素およびそれらの組み合わせを含む表面を含むビーズが含まれる。
本発明による有用な固体基質はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）、米国特許第５，４２７，７７９号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５８９，５８６号、同第５，７１６，８５４号、および同第６，０８７，１０２号、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，２１：５およびＪｏｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４７：９６に記載される。
固体支持体に対する捕獲エレメントを結合する方法は、当分野で公知であり、そして、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）、米国特許第５，４２７，７７９号、同第５，５１２，４３９号、同第５，５８９，５８６号、同第５，７１６，８５４号、および同第６，０８７，１０２号に、そしてＳｏｕｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．（前出）およびＪｏｏｓ ｅｔ ａｌ．（前出）に記載される。固体支持体上に核酸配列を固定する方法はまた、固体支持体の製造によって提供される。例えば、膜については：Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，磁気ビーズについては；Ｄｙａｌ、培養プレートについては；Ｃｏｓｔａｒ，Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、そして本発明による有用な他の支持体については、ＣＰＧ，Ｉｎｃ。
固体支持体に結合された捕獲エレメントに結合される遊離された標識フラグメントの量は、標識フラグメントが捕獲エレメントに結合したまま測定されてもよいし、または捕獲エレメントからの標識フラグメントの遊離後に測定されてもよい。捕獲エレメントからの標識フラグメントの遊離は、過剰な量の競合する非標識フラグメントの存在下で、標識されたフラグメント捕獲エレメント複合体をインキュベートすることによって、または、捕獲エレメントに対する標識フラグメントの結合を阻害する緩衝液の添加によって、例えば、塩濃度もしくはｐＨの結果として行われる。
増幅の間または後に、例えば、ＰＣＲ混合物からの遊離された標識フラグメントの分離は、例えば、ＰＣＲと固相抽出剤（ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔ）（ＳＰＥ）とを接触させることによって達成できる。例えば、核酸塩基のサイズ、電荷、または相互作用に基づいて核酸を結合する能力を有する物質は、標識された、未切断の核酸が結合されかつ短く、標識されたフラグメントではない条件下でＰＣＲ混合物に添加されてもよい。このようなＳＰＥ物質としては、イオン交換樹脂またはビーズ、例えば、市販の結合粒子、Ｎｅｎｓｏｒｂ（ＤｕＰｏｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）、Ｎｕｃｌｅｏｇｅｎ（Ｔｈｅ Ｎｅｓｔ Ｇｒｏｕｐ）、ＰＥＩ、ＢａｋｅｒＢｏｎｄ（商標）ＰＥＩ、Ａｍｉｃｏｎ ＰＡＥ １，０００、Ｓｅｌｅｃｔａｃｅｌ（商標）ＰＥＩ、Ｂｏｒｏｎａｔｅ ＳＰＥ（３’−リボースプローブを有する）、プローブの３’末端に相補的なＳＰＥ含有配列、およびヒドロキシアパタイトが含まれる。特異的な実施形態では、ヌクレアーゼ感受性の切断部位によって５’標識から分離される３’ビオチン標識を含む二重標識オリゴヌクレオチドがシグナル方法として使用される場合、反応混合物、例えば、ＰＣＲ増幅混合物が、アビジンまたはストレプトアビジンのような特異的な結合エレメントを含む物質、またはビオチンに対する抗体もしくはモノクローナル抗体（磁気粒子を含む、ビーズおよび粒子のような固体支持体に結合された）と接触されてもよい。
反応混合物、例えば、ＰＣＲ混合物をＳＰＥと接触させるステップ後、ＳＰＥ物質は、未切断の、標識され、かつ検出に利用可能なオリゴヌクレオチドのない標識フラグメントを残して濾過、沈降、または磁力によって除去され得る。
３．結合部分
本発明による結合部分とは、ヌクレアーゼによるプローブの切断の際に遊離され、そして結合部分と捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として捕獲エレメントに対して（相補的な核酸との水素結合を介して、または結合タンパク質との相互作用を介して）特異的に結合する（ここで結合部分と捕獲エレメントとの間の特異的な結合は、プローブの二次構造が本明細書に規定のとおり「変化した」場合にのみ生じる）プローブの領域を言う。
「タグ」とは、プローブの５’末端に機能的に連結され（例えば、図１のＲ）、かつ、タグと捕獲エレメントとの間に存在する引力の結果として捕獲エレメントに特異的に結合する部分であって、前記タグと捕獲エレメントとの間の特異的な結合は、プローブの二次構造が（例えば、タグが捕獲エレメントに接近可能であるように）変化した場合にのみ生じる部分を言う。「特異的に結合する」とは、「タグ」および捕獲エレメントについていう場合、例えば、タンパク質とリガンド、抗体と抗原、タンパク質サブユニット、または核酸結合タンパク質と核酸結合部分との間で、共有結合または水素結合、または静電気引力を介すること、または相互作用を介することを意味する。第二の結合部分としては、限定はしないが、ビオチン、ストレプトアビジン、ハプテン、タンパク質または化学的に反応性の部分が含まれる。
本発明によれば、結合部分は、捕獲エレメントに結合するプローブの領域を含む。本発明による捕獲エレメントは、捕獲エレメントに結合するプローブの領域を含む結合部分に対して相補的であり、かつ例えば、水素結合を介して結合する核酸配列であり得る。例えば、結合部分は、核酸配列５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含むプローブの領域であり、そして対応する捕獲エレメントは、核酸配列５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む。
本発明はまた、結合部分捕獲エレメントまたはタグ捕獲エレメントの対をもたらし、ここでこの結合部分またはタグは、ＤＮＡ結合タンパク質であり、そして対応する捕獲エレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識されかつ結合されるＤＮＡ配列である。本発明はまた、結合部分捕獲エレメントまたはタグ捕獲エレメントの対をもたらし、ここでこの捕獲エレメントは、ＤＮＡ結合タンパク質であり、そして対応する結合部分またはタグは、ＤＮＡ結合タンパク質によって認識されかつ結合されるＤＮＡ配列である。
本発明に従って有用なＤＮＡ結合配列／ＤＮＡ結合タンパク質の相互作用は、「遊離された標識フラグメントの検出」というタイトルの項において上記される。
核酸（例えば、本発明によるプローブ）へ、本明細書に規定されるようなタグを組み込む方法は、当分野で周知であり、そしてＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）および米国特許第５，７１６，８５４号、および同第６，０８７，１０２号に記載される。
ＩＶ．プローブの二次構造の安定性を決定する
Ａ．融点アッセイ
融点アッセイは、二本鎖および一本鎖のＤＮＡの種々の吸収特性を利用する。すなわち、二本鎖ＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡであって、それ自体に折り畳まれて逆平行二本鎖構造を生成する核酸配列の一部であり、相補的配列（塩基対）が水素結合を介して結合される）は、分光光度測定によって決定された場合、２６０ｎｍの波長で、一本鎖ＤＮＡよりも吸収する光が少ない。
ＤＮＡの変性は、狭い温度範囲にわたって生じ、そしてＤＮＡの物理的特性の多くで著しい変化を生じる。特に有用な変化が、光学濃度で生じる。ヌクレオチドの複素環は、紫外線領域で強力に光を吸収する（各々の塩基について特徴的である２６０ｎｍに近い最大値を有する）。しかし、ＤＮＡの吸収は、同じ組成物の遊離のヌクレオチドの混合物によって提示されるよりも約４０％少ない。この効果は、ハイパークロミズム（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｓｍ）と呼ばれ、二重らせんの平行なアレイにおけるスタッキングによって作成可能である、塩基の電子系の間の相互作用から生じる。二本鎖状態からの逸脱は、この効果における減少によって直ちに反映される（すなわち、遊離塩基に特徴的な値に向かう光学密度における増大による）（図１２ａ）。従って、二本鎖ＤＮＡの変性には、このハイパークロミシティー（ｈｙｐｅｒｃｈｒｏｍｉｃｉｔｙ）が続き得る（図１２ｂおよび図１２ｃ）。
ＤＮＡの鎖が分離する温度範囲の中間点は、融点と呼ばれ、Ｔｍと印される。光学的吸収における変化によって決定された融解曲線の例を図１２ｃに示す。この曲線は常に、同じ形態をとるが、温度スケール（すなわち、そのＴｍ）に対するその絶対位置は、ＤＮＡの塩基組成と変性に使用される条件の両方によって影響される。
ＤＮＡ分子の融点は、その塩基組成に顕著に依存する。ＧＣ塩基対が豊富なＤＮＡ分子は、豊富なＡＴ塩基対を有するＤＮＡ分子よりも高いＴｍを有する（図１３ｂ）。多くの種由来のＤＮＡのＴｍは、ＧＣ含量とともに直線的に変化し、ＧＣ対の画分が２０％〜７８％に増大するにつれて７７℃から１００℃に上昇する。すなわち、塩基組成物に対するＴｍの依存性は、線形であり、Ｇ−Ｃ含量のあらゆるパーセントの増大について約０．４℃増大する。ＧＣ塩基対は、ＡＴ対よりも安定である。なぜなら、それらの塩基は、２つではなく３つの水素結合によって一緒に保持されるからである。さらに、隣接するＧＣ塩基対は、隣接するＡＴ塩基対よりも互いと強力に相互作用する。従って、ＤＮＡのＡＴリッチ領域が最初に融解される。
Ｔｍに対する主な効果は、溶液のイオン強度によって発揮される。Ｔｍは、一価陽イオン濃度での１０倍増大ごとに、１６．６℃増大する。最も一般的に用いられる条件は、０．１２Ｍリン酸緩衝液中でＤＮＡの操作を行うことであり、これによって０．１８Ｍの一価Ｎａ＋濃度および９０℃のＴｍが得られる。
Ｔｍは、水素結合を不安定にする、ホルムアミドのような試薬の存在下で反応を行うことによって、大きく変化され得る。これによって、Ｔｍは４０℃程度まで低く低下されて、これにはＤＮＡが高温に曝されることから生じ得る損害（例えば、鎖の破壊）を被らないという利点がある。（Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８、第３版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐｐ．８１−８２およびＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＩ，１９８５，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐ．６３−６４）。
本発明によるプローブの二次構造の安定性は、以下のような融点アッセイで決定される。
吸光度が温度に対してプロットされる、プローブの検量線（例えば、図１２ｃ）は、緩衝液中に約０．２μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌのプローブを含むサンプルをインキュベートし、これによってプローブの変性および再アニーリングを可能にするのに十分な時間、種々の温度でプローブを変性および再アニーリングさせること、そしてこの範囲の下限温度が、プローブのＴｍまたは予測Ｔｍを少なくとも５０℃下回り、かつこの範囲の上限温度がこれを少なくとも５０℃上回る、温度の範囲にわたって分光光度計において、石英キュベットにおけるサンプルの吸光度を測定すること（用いられる分光光度計に適切なパスレングス、例えば１−ｃｍ）によって調製される。このプローブのＴｍは、当分野で周知の方法に従って塩基対組成物に基づいて予測される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）を参照のこと）。種々の緩衝液（例えば、１×ＴＮＥ緩衝液（１０×−０．１ＭのＴｒｉｓ塩基、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、ＦＥＮ ヌクレアーゼ緩衝液（本明細書に記載される）、１×クローニング Ｐｆｕ緩衝液（本明細書に記載される）、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ 分子指標緩衝液（本明細書に記載される））（切断反応に使用されるべき特定のヌクレアーゼに可能であり、かつ選択的に至適である緩衝液を含む）を用いて、検量線を生成して比較する。緩衝液のｐＨを温度の上昇につれてモニターして、必要に応じて調節する。
このアッセイは、シングル・ビームの紫外−可視範囲（ＵＶ−ＶＩＳ）の分光光度計で行われる。好ましくは、このアッセイはダブルビームの分光光度計で行って、ブランクを含む参照キュベット（マッチしたキュベット）に対して、サンプル溶液を保持するキュベットを自動的に比較することによって測定を簡易にする。このブランクは、等容積のサンプル緩衝液である。
分光光度計の温度は、サンプルの吸光度が特定の温度で測定されるように制御され得る。本発明による有用な分光光度計としては限定はしないが、ＭｉｃｒｏＴｍ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）と組み合わせたＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＤＵ（登録商標）６００／７０００分光光度計が含まれる。
プローブの切断反応で使用されるべきヌクレアーゼについて可能であり、かつ優先的に至適である、特定の温度でかつ緩衝液中でのプローブの二次構造の安定性は、上記のように、特定の温度でプローブの吸光度を測定すること、および、上記のような検量線（検量線は、試験温度で用いられるのと同じ緩衝液、または匹敵する検量線を生じることが公知の緩衝液のいずれかを用いて生成される）から決定した場合、Ｔｍでの吸収よりも吸収の値が小さいか否かを決定することによって決定される。プローブの二次構造は、切断反応の温度以下の温度での光吸収のレベルが、プローブのＴｍに等しい温度での光吸収のレベルよりも少ない（すなわち、少なくとも５％、好ましくは２０％、そして最も好ましくは２５％以上）場合、切断反応の温度以下である温度（すなわち、切断が行われる）で、融点アッセイにおいて「安定」である（図１２ｃおよび図１２ｄを参照のこと）。
Ｂ．ＦＲＥＴ
ＦＲＥＴアッセイは、本発明において２つの目的について有用である。第一は、プローブの二次構造が、本明細書において規定されるように「安定」であるか否かを決定することである。第二は、プローブの二次構造が標的核酸に対するプローブの結合の際に「変化」を受けているか否かを決定することである。
「ＦＲＥＴ」は、励起がドナー分子からアクセプター分子に移される２つの色素分子の電子的励起状態の間の距離依存性の相互作用である。ＦＲＥＴは、相互作用する共鳴エネルギーアクセプター、いずれか別のフルオロフォア、発色団、またはクエンチャーから蛍光ドナー基を隔てる距離での変化によって生じる。ドナーおよびアクセプター部分の組み合わせは、「ＦＲＥＴ対」として公知である。効率的なＦＲＥＴ相互作用には、色素対の吸収および発光スペクトルが、高い程度の重複を有することが必要である。
ほとんどの実施形態では、ＦＲＥＴについてのドナーおよびアクセプター色素は異なり、この場合、ＦＲＥＴは、アクセプターの増感蛍光の出現によって、および／またはドナー蛍光の消光によって検出され得る。ドナーおよびアクセプターが同じである場合、ＦＲＥＴは、得られた蛍光脱分極によって検出される。ＦＲＥＴは、分子間分離の６乗の逆数に依存する（Ｓｔｒｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：８１９；Ｓｅｌｖｉｎ，１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２４６：３００）。
本明細書において用いる場合、「ドナー、供与体（ｄｏｎｏｒ）」という用語は、第一の波長で吸収し、かつ第二の、より長い波長で放射するフルオロフォアを言う。「アクセプター、受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ）」という用語は、ドナーの発光スペクトルに重複し、ドナー（供与）基に近い場合（典型的には１〜１００ｎｍ）ドナーから放射されるエネルギーのある程度またはほとんどを吸収できる吸収スペクトルを有する、フルオロフォア、発色団またはクエンチャーを言う。アクセプターが、ＦＲＥＴを示し得るフルオロフォアであるならば、これは三番目に、さらに長い波長を再放射し；アクセプターが発色団またはクエンチャーであるならば、光子を放射することなく、ドナーから吸収されるエネルギーを放出する。アクセプターの吸収スペクトルは、２つの基が近位である場合ドナーの発光スペクトルに重複するが、これは、溶液中で遊離する分子のスペクトルについての場合には必要はない。従って、アクセプターは、本明細書に規定される、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化するプローブ二次構造の存在に起因してドナーに対して、本明細書によるプローブ上で近位に配置された場合、ＦＲＥＴまたはクエンチングのいずれかを示す、フルオロフォア、発色団またはクエンチャーを含む。アクセプターは、ａ）Ｔｍ以上の温度（例えば、Ｔｍより５°大きい、例えば、Ｔｍより６°、１０°、２５°、５０°またはそれ以上大きい）で、またはｂ）標的核酸の存在下で、ＦＲＥＴまたはクエンチングを示す、フルオロフォア、発色団、またはクエンチャーを含まない。
本明細書での「蛍光」または「蛍光基」または「フルオロフォア」との言及には、それぞれ、発光、発光基、および適切な発色団を含む。適切な発光プローブとしては、限定はしないが、ランチウムキレートとして導入されたユーロピウムおよびテルビウムの発光イオンが含まれる（Ｈｅｙｄｕｋ ＆ Ｈｅｙｄｕｋ，１９９７）。ランタニドイオンはまた、蛍光基へのエネルギー移動のための良好なドナーである（Ｓｅｌｖｉｎ １９９５）。ランタニドイオンを含む発光基は、「オープン・ケージ（ｏｐｅｎ ｃａｇｅ）」キレーターホスホラミダイトを利用して核酸に組み込まれてもよい。
本明細書において用いる場合、「クエンチング」という用語は、ドナーによって示される蛍光の強度の減少に関連するドナーからアクセプターへのエネルギーの移動を言う。
ドナーおよびアクセプター基は独立して、適切な蛍光基、発色団およびクエンチング基から選択され得る。本発明によって有用なドナーおよびアクセプターとしては、限定はしないが以下が含まれる。５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセインとも呼ばれる；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）キサンテン）−５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソ−６−カルボキシフルオレセイン）とも呼ばれる；５−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイル−フルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；６−ヘキサクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，４’，５’，７’−ヘキサクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；５−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−５−カルボン酸］）；６−テトラクロロ−フルオレセイン（［４，７，２’，７’−テトラクロロ−（３’，６’−ジピバロイルフルオレセイニル）−６−カルボン酸］）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム（Ｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）、９−（２，４−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチル−アミノ）；６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン；キサンチリウム（Ｘａｎｔｈｙｌｉｕｍ）、９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）；ＥＤＡＮＳ（５−（（２−アミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；１，５−ＩＡＥＤＡＮＳ（５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸）；ＤＡＢＣＹＬ（４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸）Ｃｙ５（インドジカルボシアニン−５）Ｃｙ３（インド−ジカルボシアニン−３）；およびＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（２，６−ジブロモ−４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸）、ならびに、それらの適切な誘導体。
本発明の特定の実施形態では、プローブはまた、２つの発色団で標識されてもよく、そして標識対の吸収スペクトルの変化が、蛍光の変化を測定する代わりとして、検出シグナルとして用いられる。
本発明の方法では、プローブの蛍光強度は、当分野で公知の方法に従って、蛍光分光光度計またはマイクロタイタープレートリーダーを用いて１つ以上の波長で測定される。
Ｃ．蛍光クエンチングアッセイ
蛍光クエンチングアッセイは、本発明において２つの対象のために有用である。第一は、プローブの二次構造が、本明細書に定義されるとおり「安定」であるか否かを確定することである。第二は、このプローブの二次構造が、標的核酸に対するプローブの結合の際に「変化」を受けているか否かを確定することである。
本発明によるプローブは、１対の相互作用性標識（例えば、ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴの対）であって、この対の一方がフルオロフォアであり、かつこの対のもう一方がクエンチャーであるという標識で標識される。例えば、本発明によるプローブは、フルオロフォアおよびクエンチャーで標識され、蛍光は、標的核酸の非存在下で、ある範囲の温度にわたって測定され、例えば、この範囲の下限温度は、プローブのＴｍまたは予測Ｔｍを少なくとも５０℃下回り、この範囲の上限温度はこれを少なくとも５０℃上回る。
Ｄ．安定性
本発明によるプローブの二次構造の「安定性」は以下のとおり確定される。プローブは、当分野で周知の方法に従って本明細書に記載される、対の相互作用性標識（例えば、テトラメチルローダミンおよびＤＡＢＣＹＬ）、または任意の相互作用性標識（ＦＲＥＴまたは非ＦＲＥＴ対のいずれか）を用いて標識される（例えば、ＧｌａｚｅｒおよびＭａｔｈｉｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：９４；Ｊｕ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３１：１３１）に記載される）。プローブ上の相互作用性標識の位置は、標的核酸に対するプローブの結合後にプローブの二次構造が変化する場合、標識が分けられるような位置である。
温度に対して蛍光をプロットしている、プローブの検量線（例えば、図１２ｅ）は、典型的には１２５ｎＭのプローブを含むサンプルを、１×融解緩衝液（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ）（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＭｇＣｌ２）中で、あるいは５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、または他の適切な緩衝液中で、このプローブの変性および再アニーリングを可能にするのに十分な時間、インキュベートすることによって作成する（典型的には、この検量線は、１分に１℃の変化を受ける蛍光光度計または分光計を用い、かつある範囲の温度であって、この範囲の下限温度が、プローブのＴｍまたは予測Ｔｍを少なくとも５０℃下回り、この範囲の上限温度がこれを少なくとも５０℃上回る温度にわたって蛍光光度計または走査蛍光分光光度計で蛍光を測定して、作成される）。プローブのＴｍは、当分野で周知の方法に従って、塩基対組成物に基づいて予測される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）；Ａｕｓｕｂｅｌ（前出）を参照のこと）。
検量線は、種々の緩衝液（例えば、１×ＴＮＥ緩衝液（１０×−０．１Ｍのトリス塩基（Ｔｒｉｓ ｂａｓｅ）、１０ｍＭのＥＤＴＡ、２．０ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（本明細書に記載される）、１×Ｃｌｏｎｅｄ Ｐｆｕ緩衝液（本明細書に記載される）、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ 分子指標緩衝液（本明細書に記載される））であって、切断反応に使用されるべき特定のヌクレアーゼについて可能でありかつ優先的に至適である緩衝液を含む、緩衝液を用いて作成かつ比較される。この緩衝液のｐＨは、温度の上昇につれてモニターされ、かつ必要に応じて調節される。
蛍光計または分光光度計の温度は、サンプルの蛍光が特定の温度で測定されるように制御してもよい。蛍光は、例えば、温度調節可能な水槽と組み合わせたＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ５０Ｂ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能）を用いて測定してもよい。
特定の温度でのプローブの二次構造の安定性は、上記のように、特定の温度でプローブの蛍光を測定すること、および蛍光の値が、検量線から確定した場合、Ｔｍでの蛍光よりも低いか否かを確定することによって、測定される。プローブの二次構造は、ＦＲＥＴアッセイにおいて、切断反応以下の温度での蛍光のレベルが、プローブのＴｍに等しい温度での蛍光のレベルから変化している（すなわち、少なくとも５％、好ましくは２０％、最も好ましくは２５％程度）場合、この切断反応の温度（すなわち切断が行われる）以下の温度で、「安定」である。プローブの二次構造は、蛍光クエンチングアッセイにおいて、切断反応の温度以下の温度での蛍光のレベルが、プローブのＴｍに等しい温度での蛍光のレベルよりも低い（すなわち、少なくとも５％、好ましくは２０％、最も好ましくは２５％程度）場合、この切断反応の温度（すなわち切断が行われる）以下の温度で、「安定」である（図１２ｆおよび図１２ｇ）。
あるいは、プローブの二次構造の安定性は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１１３）の方法を改変することで判定して、本明細書に上記されるように、ある範囲の温度で１対の相互作用性標識を用いて標識されたプローブの蛍光を測定する。
Ｖ．二次構造を検出する
本発明による二次構造は、上記のように、ＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングアッセイにおいて、１対の相互作用性標識を含むプローブについて、蛍光対温度の検量線を作成することによって、検出する（図１２ｅを参照のこと）。温度の変化と相関する蛍光の変化を示すプローブ（図１２ｅを参照のこと）（例えば、蛍光は、ＦＲＥＴ反応の温度が上昇するにつれて増大する）は、二次構造を形成し得る。
ＶＩ．二次構造における変化を測定する
本発明による二次構造の「変化」は、１００ｎＭ〜１０μＭの標的核酸（典型的には、標的核酸は、プローブ濃度よりも２〜４モル過剰であり、すなわち、２５０〜５００ｎＭの標的核酸が用いられる）の有無において、上記のような、プローブのＴｍ未満の特定の温度（例えば、切断温度）でのＦＲＥＴまたは蛍光消光アッセイにおいて、１対の相互作用性標識を含むプローブを分析することによって検出する。
あるいは、プローブの二次構造における変化は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｅｌｆａｎｄ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：６１１３）の方法を改変することで判定して、本明細書に上記されるような標的核酸の有無において、１対の相互作用性標識を用いて標識されたプローブの蛍光を測定する。
本発明によるプローブが、標的核酸に結合する場合に生じる二次構造の「変化」とは、プローブのＴｍ未満の温度での標的核酸に対するプローブの結合の後の蛍光のレベルが、標的核酸の非存在下で観察された蛍光のレベルよりも大きい（例えば、少なくとも５％、好ましくは５〜２０％、さらに好ましくは２５％以上）ような、蛍光での増大として測定される（図１２ｇを参照のこと）。
ＶＩＩ．使用方法
本発明は、標的核酸とプローブとをインキュベートすることと、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）で切断構造を切断することによって、標識された切断構造を形成するステップとを含む、サンプル中の標的核酸の存在の指標であるシグナルを発生させる方法を提供する。本発明の方法は、下記のＰＣＲベースのアッセイで用いてもよい。
上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、図４のＡ）、５’末端標識下流オリゴヌクレオチドプローブ、および標的核酸（例えば、図４のＢ）を含む標識された切断構造を、「切断構造」というタイトルの項に上記されたとおり形成する。ある実施形態では、下流プローブは、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含む（例えば、図４のＣ）。要するに、標的核酸の存在下で、上流プライマー（例えば、図４のＡ）、本明細書に定義される標識下流プローブ（例えば、図４のＣ）、標的核酸に特異的な随意増幅プライマー、核酸ポリメラーゼ活性（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）および適切な緩衝液（例えば、１０×Ｐｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３６）の有無において、以下のサーマルサイクリングパラメータ（９５℃で２分間、ならびに９５℃で１５秒間（変性ステップ）、６０℃で６０秒間（アニーリングステップ）、および７２℃で１５秒間（伸長ステップ）という４０サイクル）をＰＣＲ反応で用いて、切断構造を形成して、切断する。この反応の間、上流のオリゴヌクレオチド（例えば、図４のＡ）が伸長され、その結果、オリゴヌクレオチドＡが、本発明による下流オリゴヌクレオチドプローブの５’標識末端を部分的に置換して（例えば、図４のオリゴヌクレオチドＣ）、得られた標識構造は、本発明によるヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）で切断される。あるいは、本明細書に規定される、二次構造を含む下流プローブ（ステム・ループ、ヘアピン、内部ループ、バルジ・ループ、分枝構造およびシュードノットを含む）、または複数の二次構造、クローバー葉構造、または本明細書に規定される任意の三次元構造が用いられてもよい。本明細書に規定されるような、二分子または多分子プローブも用いられてもよい。遊離された標識フラグメントは、当分野で周知の方法に従って、固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の特異的結合によって捕獲される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと）。あるいは、遊離された標識フラグメントまたは切断された下流プローブは、直接検出される（例えば、シグナル発生部分の相互作用性の対の間の下流プローブの切断）。
本発明の方法はまた、標的を固体支持体上で固定することができるような非ＰＣＲベースの適用に用いて、標的核酸を検出することができる。固体支持体上の核酸配列の固定法は当分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に、および製造者が供給しているプロトコール（例えば、膜については：Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、磁性ビーズについては：Ｄｙｎａｌ、培養プレートについては：Ｃｏｓｔａｒ、Ｎａｌｇｅｎｕｎｃ、本発明で有用な他の支持体については：ＣＰＧ，Ｉｎｃ．）に記載されている。本発明で有用な固体支持体としては、限定はしないがシリカベースのマトリックス、膜ベースのマトリックス、および表面を含むビーズが含まれ、これには限定はしないが、「切断構造」のタイトルの項で上記された任意の固体支持体が包含され、これにはスチレン、ラテックス、またはシリカベースの物質および他のポリマーが包含される。磁性ビーズも本発明で有用である。上記の製造者および他の公知の製造者から固体支持体を得てもよい。
本発明はまた、溶液中の標的核酸の検出用の非ＰＣＲベースのアッセイを提供する。本発明の方法を用いて、溶液中に天然に存在する標的核酸（細胞、組織、単細胞生物、細菌、またはウイルスから単離かつ精製したＲＮＡおよびＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない）を検出することができる。本発明の方法を用いて、溶液中の合成標的（ＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない）を検出することもできる。非ＰＣＲアッセイとしては、３’→５’合成活性によって合成された核酸の量が一次関数または指数関数的に増加する等温直線的または指数的増幅を含み、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）を用いて合成中の置換鎖を切断する、検出アッセイが含まれるが、これらに限定されない。このような例の１つは、ローリングサークル増幅を利用する。
本発明の一実施形態では、固定された核酸標的配列または溶液中の標的核酸と、前記標的核酸に相補的な上流オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、図４のＡ）と、前記標的核酸に相補的である、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含む下流オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、図４のＣ）と、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）と、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を保有するかまたは欠く核酸ポリメラーゼとのインキュベーションによって、固定されているか溶液中に存在する核酸標的配列の検出を行うことができる。下流プローブは、５’もしくは３’末端で末端標識されたものであるか、または内部標識されている。あるいは、本明細書に規定される、二次構造（ステム・ループ、ヘアピン、内部ループ、バルジ・ループ、分岐構造およびシュードノットを含む）、または複数の二次構造、クローバ葉構造、または本明細書に規定されるような任意の三次元構造を含む下流プローブを用いてもよい。本明細書に規定されるような二分子または多分子のプローブも用いられ得る。捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される遊離された標識フラグメントの検出は、プローブに組み込まれ特定の標識に適切な、アイソトープ的な方法、酵素的方法、または比色法に関与し、かつ当分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出））。本発明によって有用な標識および本発明によって有用な標識の検出方法は、「切断構造」というタイトルの項に記載されている。あるいは、下流プローブは、プローブがインタクトな場合に検出可能なシグナルが消光されるような位置にある相互作用性シグナル発生標識部分の対（例えば、色素およびクエンチャー）をさらに含み、この相互作用シグナル発生部分の対はヌクレアーゼ切断部位（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ切断部位）によって隔離されている。別の実施形態では、この下流プローブはさらに、プローブが標的核酸にハイブリダイズされない場合に検出可能なシグナルが消光されるような位置にある１対の相互作用性シグナル発生標識部分の対（例えば、色素およびクエンチャー）を含む。ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）による切断の際、この２つのシグナル発生部分は互いに隔てられ、検出可能なシグナルが発生される。上記のような１対の相互作用性シグナル発生標識部分の存在によって、捕獲エレメントに結合し得る、アニーリングされた、未切断のプローブと、捕獲エレメントに結合される遊離された標識フラグメントとの間の識別が可能になる。本発明の方法による、固定された核酸標的配列または溶液中の核酸標的配列の検出に有効な核酸ポリメラーゼとしては、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く中温性、好熱性、または超好熱性のＤＮＡポリメラーゼが含まれる（「核酸ポリメラーゼ」というタイトルの項に記載）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を保有する任意の核酸ポリメラーゼも本発明によって有用である。
非ＰＣＲベースの方法によれば、検出することができる標的核酸の量は、好ましくは約１ｐｇ〜１μｇ、より好ましくは約１ｐｇ〜１０ｎｇ、最も好ましくは約１ｐｇ〜１０ｐｇである。あるいは、この非ＰＣＲベースの方法により、好ましくは約１分子〜１０２０分子、より好ましくは約１００分子〜１０１７分子、最も好ましくは約１０００分子〜１０１４分子を測定または検出することができる。
本発明はまた、サンプル中の標的核酸を検出する方法であって、「切断構造」というタイトルの項に記載のように切断構造を形成し、非ＰＣＲベースの方法（等温法（例えば、ローリングサークル、自律配列複製増幅（３ＳＲ）、転写ベースの増幅系（ＴＡＳ）、および鎖置換増幅（ＳＤＡ））および非等温法、例えば、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない）によって標的核酸を増幅する、方法を提供する。非ＰＣＲ増幅法に有用なヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）は、使用される特定の増幅法に適切な温度範囲で活性である。
以下に記載の増幅プロトコールでは、標的を定量するために調製する必要があるサンプルとしては、以下が含まれる。サンプル、非テンプレートコントロール、および検量線作成用の反応物（規定の標的量を含めて６ケタの範囲におよぶ溶液希釈を含む）。
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、制限酵素がその認識部位のヘミホスホロチオエート型の非改変鎖にニックを形成する能力に基づく。適切なＤＮＡポリメラーゼは、このニックで複製を開始し、下流の非テンプレート鎖を置換する（Ｗａｌｋｅｒ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：３９２、およびＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，３：１−６，１９９３）。ＳＤＡ法に従って用いられるポリメラーゼ（ＢｃａおよびＢｓｔ）を、本発明によるヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）指向性切断に用いることもできる。本発明の方法によれば、分子指標を、４２℃で活性なヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）、および標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、さらに結合部分を含み、かつ本発明による切断構造を含む切断プローブによって置換する。
分子指標（Ｍｂ）は、溶液中でステム−ループ構造を形成する蛍光発生プローブである。典型的には：５’ステム領域（５〜７ｎｔ）、ループ領域（標的に相補的、２０〜３０ｎｔ）、３’ステム領域（５’ステム領域に相補的）、およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＣＹＬ）に結合した５’蛍光色素（例えば、ＦＡＭ）。標的が存在しない場合、ＭＢはステムを形成し、色素およびクエンチャーを近接させ、従って蛍光は発しない。ＭＢがその標的に結合した場合、ステムが開き、色素がクエンチャーから空間的に分離し、これによってプローブが蛍光を発する（Ｔｙａｇｉ Ｓ ａｎｄ Ｋｒａｍｅｒ ＦＲ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３０３−３０８、１９９６および米国特許第５，９２５，５１７号）。
鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、本質的にＳｐａｒｇｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，１０：２４７−２５６，１９９６に記載のとおり行う。用いた酵素としては、制限エンドヌクレアーゼＢｓｏＢＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＤＮＡポリメラーゼ５’−エキソ−Ｂｃａ（Ｐａｎ Ｖｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が含まれる。標的は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｂ）ゲノムに見出される挿入様エレメント（ＩＳ６１１０）である。用いたプライマーは、Ｂ１：ｃｇａｔｃｇａｇｃａａｇｃｃａ（配列番号３５）、Ｂ２：ｃｇａｇｃｃｇｃｔｃｇｃｔｇ（配列番号３６）、Ｓ１：ａｃｃｇｃａｔｃｇａａｔｇｃａｔｇｔｃｔｃｇｇｇｔａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃ（配列番号３７）およびＳ２：ｃｇａｔｔｃｃｇｃｔｃｃａｇａｃｔｔｃｔｃｇｇｇｔｇｔａｃｔｇａｇａｔｃｃｃｃｔ ａｃｃｇｃａｔｃｇａａｔｇｃａｔｇｔｃｔｃｇｇｇｔａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃ（配列番号３８）である。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのゲノムＤＮＡを、ヒト胎盤ＤＮＡ中で連続希釈する。０〜１０００Ｍｔｂのゲノム等価物、５００ｎｇのヒト胎盤ＤＮＡ、１６０単位のＢｓｏＢ１、８単位の５’−エキソ−Ｂｃａ、１．４ｍＭの各ｄＣＴＰαＳ、ＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、３５ｍＭのＫ２ＰＯ４（ｐＨ７．６）、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、３ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１１ｍＭのＮａＣｌ、０．３ｍＭのＤＴＴ、４ｍＭのＫＣｌ、４％グリセロール、０．００８ｍＭのＥＤＴＡ、５００ｎＭのプライマーＳ１およびＳ２ならびに５０ｎＭのプライマーＢ１およびＢ２（ＫＣｌ、グリセロールおよびＥＤＴＡは、ＢｓｏＢ１保存溶液の成分である）を含む５０μｌのサンプル中でＳＤＡを行う。サンプル（３５μｌ）を、煮沸した水浴中で３分間加熱後、ＢｓｏＢ１および５’−エキソ Ｂｃａ（１０．７単位／μｌのＢｓｏＢ１および０．５３単位／μｌの５’−エキソＢｃａを含む１５μｌのＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓの緩衝液２（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）を添加した。インキュベーションは６０℃で１５分間、その後煮沸した水浴中で５分間である。
５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各反応物は、１×クローニングＰｆｕ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇのＰｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇのＰＥＦ、３００ｎＭの各上流プライマー：ａａｇｇｃｇｔａｃｔｃｇａｃｃｔｇａａａ（配列番号３９）、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ａｃｃａｔａｃｇｇａｔａｇｇｇｇａｔｃｔｃ（配列番号４０）を含む。この反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する。９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を測定する。本発明の方法はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼ、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼで行ってもよい。
核酸配列ベースの増幅法（ＮＡＳＢＡ）によれば、分子指標を、リアルタイム分析におけるＮＡＳＢＡ ＲＮＡアンプリコンの定量に用いる（Ｌｅｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：２１５０）。本発明の方法によれば、分子指標プローブが、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部位を含み、さらに本発明による切断構造を含むヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）切断プローブ、ならびに４１℃で活性なヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）により置換される、ＮＡＳＢＡを行うことができる。
本質的にＬｅｏｎｅ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２１５０−２１５５（１９９８）に記載のようにＮＡＳＢＡ増幅を行う。ジャガイモハマキウイルス（ＰＬＲＶ）由来のゲノムＲＮＡを、ＰＤ４１５またはＰＤ４１６（アンチセンス）およびＰＤ４１７（センス）プライマーを用いて増幅する（これは、Ｌｅｏｎｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６６：１９−２７（１９９７）に詳述）。各々のＮＡＳＢＡ反応は、６μｌの滅菌水、４μｌの５×ＮＡＳＢＡ緩衝液（５×ＮＡＳＢＡ緩衝液は２００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、６０ｍＭのＭｇＣｌ２、３５０ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１０ｍＭの各ＡＴＰ、ＵＴＰ、およびＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、および２．５ｍＭのＩＴＰ）、４μｌの５×プライマーミックス（７５％ＤＭＳＯおよび１μＭの各アンチセンスおよびセンスプライマー）のプレミックスを含む。このプレミックスを１４μｌのアリコートに分け、これに１μｌのＰＬＲＶ標的を添加する。６５℃で５分間のインキュベーションおよび４１℃で５分間の冷却後、５μｌの酵素ミックスを添加する（反応あたり３７５ｍＭソルビトール、２．１μｇＢＳＡ、０．０８単位のＲＮアーゼＨ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、３２単位のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、および６．４単位のＡＭＶ−ＲＴ（Ｓｅｉｇａｋａｋｕ））。増幅は４１℃で９０分間である。
一実施形態では、５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各反応は、１×クローニングＰｆｕ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇのＰｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇのＰＥＦ、３００ｎＭの各上流プライマーＰＤ４１５またはＰＤ４１６、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｇｃａａａｇｔａｔｃａｔｃｃｃｔｃｃａｇ（配列番号４１）を含む。反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する。９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー、例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）で蛍光を決定する。
別の実施形態では、非ＰＣＲベースの増幅（例えば、ＮＡＳＢＡ）反応混合物に、蛍光発生プローブおよびＰｆｕ ＦＥＮ−１ヌクレアーゼを直接添加することによって、検出反応を行う。蛍光プローブは、プロモーター領域の下流の標的の領域に相補的であるように設計する。ＲＮＡポリメラーゼは、プロモーター領域に結合してＲＮＡを合成する。ＲＮＡの合成された３’末端によって、２つのオリゴヌクレオチドが十分に近い場合、下流プローブで切断構造が形成される。これによって、この方法では、増幅および切断が同時に生じる。蛍光は、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＭｘ３００５Ｐ ＱＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで決定され得る。
本発明のさらに別の方法では、上流オリゴヌクレオチドを含む標識された切断構造（例えば、ＲＮＡポリメラーゼによって合成されたＲＮＡ）（例えば、図４のＡ）、標識された下流オリゴヌクレオチドプローブ、および標的核酸（例えば、図４のＢ）は、「切断構造」というタイトルの項で上記されたように形成される。いくつかの実施形態では、下流プローブは、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含む（例えば、図４のＣ）。要するに、標的核酸の存在下で、（ＲＮＡ合成を開始するためにＲＮＡポリメラーゼがプロモーターを利用するかプライマーを利用するか次第で）上流プライマー（例えば、図４のＡ）、本明細書に記載の標識された下流プローブ（例えば、図４のＣ）、核酸ポリメラーゼ活性（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）および適切な緩衝液（例えば、１０×Ｐｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３６）の有無において、以下のサーマルサイクリングパラメータ（９５℃で１〜２分間、その後に約４０〜７２℃に冷却）を反応で用いて切断構造を形成して、切断する。この反応の間、上流のオリゴヌクレオチド（例えば、図４のＡ）がＲＮＡポリメラーゼによって伸長され、その結果、オリゴヌクレオチドＡが、本発明による下流オリゴヌクレオチドプローブの５’標識末端を部分的に置換して（例えば、オリゴヌクレオチドＣ、図４）、得られた標識構造は、本発明によるヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）で切断される。遊離された標識フラグメントは、当分野で周知の方法に従って、固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の特異的結合によって捕獲され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照のこと）。あるいは、遊離された標識フラグメントまたは切断された下流プローブは、直接検出される（例えば、シグナル発生部分の相互作用性の対の間の下流プローブの切断）。
一般には、増幅が非ＰＣＲベースの方法で生じるこれらの方法によれば、増幅は、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）の存在下で行ってもよく、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）による増幅および切断は同時に生じる。固体支持体上での捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される遊離された標識フラグメントの検出は、「切断構造」というタイトルの項で上記されたとおり行われ、増幅および切断のプロセスが終了するのと同時（リアルタイム）に起こっても、またはその後（エンドポイント）に起こってもよい。
エンドポイントアッセイを用いて、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）（上記）の存在下での増幅ステップを行う非ＰＣＲベースの方法によって得られた増幅された標的を定量することができる。
当業者は、反応中に存在するＤＮＡテンプレートからＲＮＡを合成するためにインビトロの転写反応を用い得る。Ｔ７型ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼまたはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼは、このような反応で共通して用いられるが、多くの他のＲＮＡポリメラーゼも用いられてもよい。通常、常にではないが、ＲＮＡの合成は新規（すなわち、アンプライム（ｕｎｐｒｉｍｅｄ））であり、通常は、常にではないが、転写は、「プロモーター」または「プロモーター領域」と名づけられた、ＲＮＡポリメラーゼによって特異的に認識されるテンプレートにおける配列で開始される。インビトロ転写の方法は本明細書に提示される。
ＲＮＡポリメラーゼは、標的配列を増幅するために用いられている（Ｋｒｕｐｐ，Ｇ．およびＳｏｌｌ，Ｄ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９８７）２１２：２７１−２７５）。このアプローチは、標的配列の二本鎖コピーの生成、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の挿入、コピーの転写、およびハイブリダイゼーションアッセイによる検出を含む（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８９）８６：１１７３−１１７７）。バクテリオファージＤＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６）はクローニングされた、または合成のオリゴヌクレオチドテンプレートからの特異的なＲＮＡ配列のインビトロでの調製のために以前に使用され、十分理解されている（Ｍｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８４）１２：７０３５−７０５６）；Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｍ． ａｎｄ Ｒｙａｎ，Ｔ．，（１９８２）ｉｎ「Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ」，Ｂｏｙｅｒ，Ｐ．Ｄ．，ｅｄｓ．１５：８７−１０８；Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｔ． ａｎｄ Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８７）２６：２６９０−２６９６）。これらのポリメラーゼは、極めてプロモーター特異的である。多数のＴ７プロモーター由来のＤＮＡ配列が公知であって、コンセンサス配列が推定されている（Ｏａｋｌｅｙ，Ｊ．Ｌ． ａｎｄ Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｊ．Ｅ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９７７）７４：４２６６−４２７０；Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｆ．Ｗ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）１６６：４７７−５３５）。これらのＲＮＡポリメラーゼに基づく方法は、ＦＥＮヌクレアーゼおよび検出可能に標識されたプローブが反応混合物に加えられて、増幅および検出の反応が同時に進行することを可能にするように改変され得る。検出可能な標識プローブは、標的プロモーター配列の下流にアニーリングするように設計される。従って、転写の際、下流プローブおよび合成されたＲＮＡが切断構造を形成する。次いでＦＥＮが下流オリゴヌクレオチドを切断する。
ある実施形態では、プロモーターはプロモーター−プライマーを介して標的に付加される。多数のＲＮＡポリメラーゼプロモーターがプロモーター−プライマーのプロモーター領域について用いられ得る。適切なプロモーター領域は、適切な条件下でリボヌクレオチドおよびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、機能的に連結された核酸配列から転写を開始することができる。プロモーター領域は通常は、Ａｌｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ，第２版．（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｉｎｃ．）に記載のとおり、天然に存在するＲＮＡポリメラーゼプロモーター、コンセンサスプロモーター領域、または人工的なプロモーター領域由来の、約１５〜２５０ヌクレオチド、好ましくは約１７〜６０ヌクレオチドを含む。特定の対象の代表的なプロモーター領域としては、ＣｈａｍｂｅｒｌｉｎおよびＲｙａｎ，Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅｓ（編集Ｐ．Ｂｏｙｅｒ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（１９８２）ｐｐ８７−１０８に記載のＴ７、Ｔ３およびＳＰ６が含まれる。
至適の転写のための正確なプロモーター内の配列の要件は一般に、米国特許第５，７６６，８４９号および同第５，６５４，１４２号などにおいて、種々のＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼについて以前に記載されたとおり当分野で公知であり、経験的にも決定できる。
上記されるプロモーター−プライマーオリゴヌクレオチドは、当分野で公知であり、かつ本明細書に記載される任意の適切な方法を用いて調製されてもよく、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザー、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）などで合成されてもよい。
さらなる別の態様では、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼによって伸長される上流プライマーおよび下流の標識プローブを利用して標的核酸を検出するための方法を提供する。この反応は一般に、標的核酸と、ＲＮＡポリメラーゼ、上流プライマーおよび下流プローブを含む反応混合物とを接触させるステップと、前記混合物を適切な時間、適切な条件下でインキュベートして、本明細書に記載される切断構造を生成するステップとを含む。２００５年８月３１日出願の米国特許出願第１１／２１７，９７２号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、ＲＮＡポリメラーゼによって伸長されるプライマーを利用するＲＮＡ増幅反応を記載している。このＲＮＡ増幅反応は、本発明における使用に採用され得る。例えば、下流の標識されたプローブおよびＦＥＮヌクレアーゼが、米国特許出願第１１／２１７，９７２号に記載の反応に加えられる。この例では、ＲＮＡポリメラーゼは、ハイブリダイズされたプライマーを伸長して、下流プローブを有する切断構造を形成する。
この配列特異的なＲＮＡ増幅／検出反応では、本明細書に詳述され、かつ当分野で公知であるとおり、適切なプライマーおよび標的ＲＮＡ配列に相補的なプローブを、ＦＥＮヌクレアーゼおよびプライミングされたＲＮＡ分子を認識し得る適切なＲＮＡポリメラーゼとともに使用する。次いで、増幅、切断構造の形成、および切断構造の切断を、温度サイクリング条件のもとで進行させる。
例えば、反応物を７０〜９５℃でインキュベートして、標的を変性し、続いて反応物を３５〜７２℃に冷却する。温度の低下の間、プライマーおよびプローブは、標的ＲＮＡ上の相補的な配列に結合する。一旦温度が最適の範囲に達すれば、ＲＮＡポリメラーゼは、プライマーを伸長して、下流プローブの少なくとも部分的な置換を生じ、これが切断構造を形成する。次いで切断構造はヌクレアーゼによって切断される。
エンドポイントアッセイとしては、限定はしないが、以下が含まれる。
Ａ．Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１０７７およびＢａｒａｎｙ，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，１：５−１６（１９９１）に記載のライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）。本発明で有用なＬＣＲ産物は、上流プライマーおよび標識下流プローブがヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）による効率的な切断を可能にするための８ヌクレオチドを超えるギャップによって隔てられるように十分に長い。
Ｂ．自律配列複製増幅（Ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）、Ｆａｈｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１：２５−３３（１９９１）。自律配列複製増幅（３ＳＲ）は、ＮＡＳＢＡに類似の技術である。Ｅｈｒｉｃｈｔ Ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：４６９７−４６９９（１９９７）は、３ＳＲ手順を協調的結合インビトロ増幅系（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＣＡＴＣＨ）に発展させた。したがって、本発明の一実施形態では、分子指標プローブを、ＣＡＴＣＨによるＲＮＡアンプリコンのリアルタイム分析に用いる。増幅した合成標的は、配列：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃａｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇａｔｃｔｇｃａｃｇｔａｔｔａｇｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔｃｇｔｃａｃａｇｃａａｇａａｔｔｃａｇｇ（配列番号４２）を有する。３ＳＲ反応は、４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＫＣｌ、３０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの各々のｄＮＴＰ、１ｎＭの二本鎖標的、２μＭのＰ１：ｃｃｔｃｔｇｃａｇａｃｔａｃｔａｔｔａｃ（配列番号４３）およびＰ２：ｃｃｔｇａａｔｔｃｔｔｇｃｔｇｔｇａｃｇ（配列番号４４）、５ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのスペルミジン、６単位／μｌのＨｉｓタグ化ＨＩＶ−１逆転写酵素、３単位／μｌのＴ７−ＲＮＡポリメラーゼ、および０．１６単位／μｌのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＮアーゼＨを含む。１００μｌの反応物を、４２℃で３０分間インキュベートする。
５μｌの２連の各サンプルを検出用に取り出す。各々の反応物は、１×クローニングＰｆｕ緩衝液、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇのＰｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇのＰＥＦ、３００ｎＭの各々の上流プライマーＰ１および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬ）：ｔａｇｇａａａｃａｃｃａａａｇａｔｇａｔａｔｔｔ（配列番号４５）を含む。反応物をサーマルサイクラーの以下の１サイクルに供する。９５℃で２分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間。次いで、蛍光プレートリーダー（ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）など）で蛍光を測定する。３ＳＲの方法はまた、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼ、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に記載された任意のヌクレアーゼで行われてもよい。
Ｃ．ローリンサークル増幅は、米国特許第５，８５４，０３３号および関連する分岐伸長増幅法（ＲＡＭ）（米国特許第５，９４２，３９１号）に記載されている。本発明に適合させたローリングサークル増幅は、以下に記載されている。
リアルタイムアッセイを用いて、増幅ステップをヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）（上記）の存在下で行う非ＰＣＲベースの方法によって得られた増幅標的を定量してもよい。ローリングサークル増幅の方法（米国特許第５，８５４，０３３号）を、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）、および標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含み、さらに本発明による切断構造を含む切断可能なプローブと組み合わせて、増幅および検出用の二次プライマーを含むように適応させて、５０〜６００Ｃの温度で行う。ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）の切断パターンを、プライマーの５’末端由来の１〜１５ヌクレオチドの間のいずれかに位置する単一のミスマッチ塩基の存在によって変化させることができる（ＤＮＡプライマーはそうでなければ完全にアニーリングされる）。典型的には、完全にアニーリングされた基質では、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）は、最も５’端のヌクレオチドをエキソヌクレアーゼ的に切断する。しかし、５’末端から１５ヌクレオチドまでの単一のヌクレオチドミスマッチにより、エンドヌクレアーゼ的切断が促進される。これは、５’プルーフリーディングプロセスを構成し、ここでは、ミスマッチがヌクレアーゼ作用を促進してミスマッチの除去がもたらされる。したがって、ヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）切断の機構は、単に単一のミスマッチ塩基対の存在により、主にエキソヌクレアーゼ的な切断から主にエンドヌクレアーゼ的な切断に変えられる。この変化はおそらくミスマッチにより短いフラップが作製されるために起こる（Ｒｕｍｂａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：１４６０２）。
本発明の方法を用いて、標的核酸配列中の配列バリエーションの存在の指標となるシグナルを発生させてもよく、ここで、標的核酸と、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含むプローブ（タイトル「切断構造」の項に記載）とをインキュベートすること、およびヌクレアーゼ（例えば、ＦＥＮヌクレアーゼ）によりこの標識された切断構造を切断することによって、完全にアニーリングしたＤＮＡプライマーを含む標識された切断構造が形成され、また、エンドヌクレアーゼ的な切断産物を含む標識されたフラグメントの遊離、および固体支持体上の捕獲エレメントに対する結合部分の結合によって捕獲される遊離されたフラグメントの検出が、配列バリエーションの存在の指標である。遊離された標識フラグメントは、「切断構造」というタイトルの項に記載のように検出する。
Ｖ．サンプル
本発明は、本明細書中で定義した、サンプル中の標的核酸の検出または測定の方法を提供する。本明細書において用いる場合、「サンプル」とは、対象の核酸（標的核酸）を含むかもしくは含むと予想されるか、またはそれ自体が対象の標的核酸を含むかもしくは含むと予想される標的核酸である、任意の物質を言う。したがって、「サンプル」という用語は、標的核酸（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ）、細胞、生物、組織、流体または物質（限定はしないが、例えば、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、便；皮膚、気管、腸および尿生殖路の外分泌物；唾液、血球、腫瘍、器官、組織、インビトロ細胞培養成分のサンプル、天然の単離物（飲料水、海水、固体物質など）、微生物試料、ならびに核酸トレーサー分子で「標識された（ｍａｒｋｅｄ）」対象物または試料を含む）のサンプルを含む。
［実施例］
本発明を、以下の物質および方法を使用する以下の非限定的な実施例によって例示する。本明細書において以降に引用した各文献の開示全体が本明細書中で参照により組み込まれる。
＜プローブの設計および調製＞
本発明は、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含むプローブを提供する。
本発明の一実施形態によるプローブは、５〜２５０ヌクレオチド長であり、かつ理想的には１７〜４０ヌクレオチド長であり、かつ７〜約１４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜約１４０ヌクレオチドである標的核酸結合配列を有する。プローブはさらに、非共有結合または共有結合したサブユニットを含んでもよい。
プローブの一実施形態は、第一の相補的な核酸配列（例えば、図４のｂ）および第二の相補的な核酸配列（例えば、図４のｂ’）を含む。プローブが単分子である一実施形態では、第一および第二の相補的な核酸配列は、同じ分子中である。一実施形態では、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミンおよびＤＡＢＣＹＬ）、または本明細書に記載される任意のフルオロフォアおよびクエンチャー分子（「標識された切断構造を調製する方法」というタイトルの項を参照のこと）で標識される。本発明によるプローブは、適切な対の相互作用性標識（例えば、ＦＲＥＴ対または非ＦＲＥＴ対）で標識される。プローブ上の相互作用性標識の位置は、プローブが標的核酸への結合の際にプローブの二次構造の変化を受けるとき、プローブ上の標識の適切な間隔が、標識の分離を可能にするように維持されるような位置である。例えば、ドナーおよびクエンチャー部分は、プローブが標的核酸に結合されないとき、検出可能なシグナルを消光するようにプローブ上に配置される。
このプローブはさらに結合部分（例えば、図４のａｂ、核酸配列、すなわち、５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含む）を含む。本発明の一実施形態では、標的核酸に対するハイブリダイゼーションの際、本発明によるプローブは、５’フラップを含む切断構造（例えば、図４のａｂ）を形成する。従って、切断構造のフラップは、プローブの結合部分を含む。切断は、切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。ヌクレアーゼによる、ハイブリダイズしたプローブの切断の際、結合部分は、遊離されて、核酸配列、すなわち、５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む捕獲エレメントに特異的に結合する。この実施形態によれば、結合部分は、２つの領域を含む（例えば、図４のａおよびｂ）。本明細書に規定される「相補的な核酸配列」ではない「結合部分」の領域（例えば、図４のａ）は、１〜６０ヌクレオチド、好ましくは１〜２５ヌクレオチド、最も好ましくは１〜１０ヌクレオチド長である。ｂ領域は、本明細書に規定されるようなプローブの少なくとも２つの相補的な核酸配列のうちの１つであり、その長さは、以下に詳述される。
一実施形態では、標的核酸の非存在下で、プローブは、それ自体折り畳まれて、逆平行二本鎖構造を生成し、ここで、第一および第二の相補的な核酸配列は水素結合の形成によってアニーリングして、二次構造を形成する。プローブの二次構造は、本明細書に規定されるような、プローブのＴｍより上および下の温度を含む種々の温度で、ＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングアッセイを行うことによって検出される。単にフルオロフォア発光の有効性に対する熱的効果に起因する蛍光変化よりも大きい、温度変化と相関した蛍光変化を示すプローブ（例えば、蛍光は、ＦＲＥＴ反応の温度が増大されるにつれて増大する）は、二次構造を有する。二次構造は、最大レベルの蛍光が検出される温度では排除される（例えば、蛍光は、上昇した温度ではこのレベルを超えては増大しない）。プローブの二次構造の安定性は、本明細書に記載されるような、融点アッセイにおいて、またはＦＲＥＴもしくは蛍光クエンチングアッセイにおいて決定される。
プローブの二次構造における変化の結果として、結合部分は、ヌクレアーゼによる切断についてアクセス可能になる。標的核酸の存在下で、かつ標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションの有効性および選択性に影響する因子（例えば、「本発明に従って有用なプライマーおよびプローブ」というタイトルの項に記載される、プライマー長、ヌクレオチド配列および／または組成物、緩衝液組成物）に従って選択される温度において、プローブおよび標的核酸の特異的な結合を可能にするために、プローブは、標的核酸に結合して、二次構造の変化を受ける。プローブの二次構造における変化は、本明細書に規定されるとおり、ＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングによって決定され得る。
一実施形態では、第一および第二の相補的な核酸配列は、３〜２５、好ましくは４〜１５、さらに好ましくは５〜１１ヌクレオチド長である。第一および第二の相補的な核酸配列の長さは、プローブが標的核酸に結合していないときのプローブの二次構造が、標的核酸に対して結合したプローブを含む切断構造の切断が行われる温度において安定であるように選択される。標的核酸結合配列のサイズが最大１００ヌクレオチドまで増大するにつれて、相補的な核酸配列の長さは、１５〜２５ヌクレオチドまで増大し得る。１００ヌクレオチドよりも大きい標的核酸結合配列については、相補的核酸配列の長さは、さらに増大されない。
あるいは、二次構造を有しかつ結合部分を含む対立遺伝子識別プローブが調製される。
一実施形態では、本発明による対立遺伝子識別プローブは好ましくは、６〜５０、好ましくは７〜２５ヌクレオチドの標的核酸結合配列、および３〜８ヌクレオチドの相補的核酸配列の配列を含む。二次構造のグアノシン−シチジン含量およびプローブ−標的ハイブリッド、塩、ならびにアッセイ温度を考慮し、例えば、マグネシウム塩は、短い対立遺伝子識別プローブを設計する場合、強力な安定化効果を有する。
５０ヌクレオチド長という上限に近い標的核酸結合配列を有する対立遺伝子識別プローブは、識別されるべき単一のヌクレオチドミスマッチが、標的核酸結合配列の真ん中またはその付近で生じるように、設計される。例えば、２１ヌクレオチド長である配列を含むプローブは好ましくは、ミスマッチが標的核酸結合配列の最も中央に位置する１４ヌクレオチドのうちの１つに対向して、最も好ましくは、最も中央に位置する７ヌクレオチドのうちの１つに対向して生じるように設計される。
＜プローブの設計および調製＞
本発明は、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分を含むプローブを提供する。
本発明の一実施形態によるプローブは、５〜２５０ヌクレオチド長、理想的には１７〜４０ヌクレオチド長であり、かつ７〜約１４０ヌクレオチド、好ましくは１０〜約１４０ヌクレオチドである標的核酸結合配列を有する。プローブはまた、非共有結合サブユニットまたは共有結合サブユニットを含んでもよい。
プローブの一実施形態は、第一の相補的な核酸配列（例えば、図４のｂ）および第二の相補的な核酸配列（例えば、図４のｂ’）を含む。プローブが単分子である一実施形態では、この第一および第二の相補的な核酸配列は、同じ分子中である。一実施形態では、プローブは、フルオロフォアおよびクエンチャー（例えば、テトラメチルローダミンおよびＤＡＢＣＹＬ）、または本明細書に記載される任意のフルオロフォアおよびクエンチャー分子（「標識された切断構造を調製する方法」というタイトルの項を参照のこと）で標識される。本発明によるプローブは、適切な対の相互作用性標識（例えば、ＦＲＥＴ対または非ＦＲＥＴ対）で標識される。プローブ上の相互作用性標識の位置は、プローブが標的核酸への結合の際にプローブの二次構造の変化を受けるとき、プローブ上の標識の適切な間隔が、標識の分離を可能にするように維持されるような位置である。例えば、ドナーおよびクエンチャー部分は、プローブが標的核酸に結合されないとき、検出可能なシグナルを消光するようにプローブ上に配置される。
このプローブはさらにｌａｃリプレッサータンパク質を含むタグを含む。本発明の一実施形態では、標的核酸に対するハイブリダイゼーションの際、このプローブは、５’フラップを含む切断構造（例えば、図４のａｂ）を形成する。切断は、切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、切断温度以下で安定である。ヌクレアーゼによる、ハイブリダイズしたプローブの切断の際、ｌａｃリプレッサータンパク質は、このｌａｃリプレッサータンパク質：ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（配列番号４）ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ（配列番号２８）によって認識されかつ特異的に結合される二本鎖ＤＮＡ配列を含む捕獲エレメントに対して特異的に結合する。
一実施形態では、標的核酸の非存在下で、プローブは、それ自体折り畳まれて、逆平行二本鎖構造を生成し、ここでは第一および第二の相補的な核酸配列が水素結合の形成によってアニーリングして、二次構造を形成する。プローブの二次構造は、本明細書に規定されるような、プローブのＴｍより上および下の温度を含む種々の温度で、ＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングアッセイを行うことによって検出される。フルオロフォア発光の有効性に対する熱的効果に単純に起因して蛍光の変化よりも大きい、温度の変化と相関する蛍光の変化を示すプローブ（例えば、蛍光は、ＦＲＥＴ反応の温度が増大されるにつれて増大する）は、二次構造を有する。二次構造は、最大レベルの蛍光が検出される温度では排除される（例えば、蛍光は、上昇した温度ではこのレベルを超えては増大しない）。プローブの二次構造の安定性は、本明細書に記載されるような、融点アッセイにおいて、またはＦＲＥＴもしくは蛍光クエンチングアッセイにおいて判定される。
プローブの二次構造における変化の結果として、タグは、ヌクレアーゼによる切断についてアクセス可能になる。標的核酸の存在下で、かつ、プローブおよび標的核酸の特異的な結合を可能にするために、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションの有効性および選択性に影響する要因（例えば、「本発明に従って有用なプライマーおよびプローブ」というタイトルの項に記載される、プライマー長、ヌクレオチド配列および／または組成物、緩衝液組成）に従って選択される温度において、プローブは、標的核酸に結合して、二次構造の変化を受ける。プローブの二次構造における変化は、本明細書に規定されるとおり、ＦＲＥＴまたは蛍光クエンチングによって判定され得る。
一実施形態では、第一および第二の相補的な核酸配列は、３〜２５、好ましくは４〜１５、さらに好ましくは５〜１１ヌクレオチド長である。第一および第二の相補的な核酸配列の長さは、プローブの二次構造が、標的核酸に結合しない場合、標的核酸に対して結合したプローブを含む切断構造の切断が行われる温度において安定であるように選択される。標的核酸結合配列のサイズが最大１００ヌクレオチドまで増大するにつれて、相補的な核酸配列の長さは、１５〜２５ヌクレオチドまで増大し得る。１００ヌクレオチドよりも大きい標的核酸結合配列については、相補的核酸配列の長さは、さらに増大されない。
あるいは、二次構造を有しかつ結合部分を含む対立遺伝子識別プローブが調製される。
一実施形態では、本発明による対立遺伝子識別プローブは好ましくは、６〜５０、好ましくは７〜２５ヌクレオチドの標的核酸結合配列、および３〜８ヌクレオチドの相補的核酸配列の配列を含む。二次構造のグアノシン−シチジン含量およびプローブ−標的ハイブリッド、塩、ならびにアッセイ温度を考慮し、例えば、マグネシウム塩は、短い対立遺伝子識別プローブを設計する場合、強力な安定化効果を有する。
５０ヌクレオチド長という上限に近い標的核酸結合配列を有する対立遺伝子識別プローブは、識別されるべき単一のヌクレオチドミスマッチが、標的核酸結合配列の真ん中またはその付近で生じるように、設計される。例えば、２１ヌクレオチド長である配列を含むプローブは好ましくは、ミスマッチが標的核酸結合配列の最も中央に位置する１４ヌクレオチドのうちの１つに対向して、最も好ましくは、最も中央に位置する７ヌクレオチドのうちの１つに対向して生じるように設計される。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造はＦＥＮヌクレアーゼの添加前に、９５℃で５分間加熱し、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）標的核酸に特異的にハイブリダイズする上流オリゴヌクレオチド（図４のＡ）と、（ｃ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分（例えば、図４のａｂ、核酸配列、すなわち、５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含む）を含み、ここで前記プローブは、オリゴヌクレオチドＡのハイブリダイズ領域の下流である標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズする）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’→５’ＤＮＡ合成活性を保有するポリメラーゼ、例えば、酵素ａ）Ｙａｑ エキソ−、（Ｔａｑポリメラーゼを改変するための、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、カタログ番号＃２００５１８（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４）を用いる突然変異誘発によって調製した）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの変異型、ｂ）Ｐｆｕ、またはｃ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの変異型（エキソ−Ｐｆｕ）を添加して、ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドＡを伸長し、その結果このオリゴヌクレオチドＡがオリゴヌクレオチドＣの５’末端を部分的に置換することを可能にする条件下（例えば、７２℃で１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中）で、５分〜１時間インキュベートする。オリゴヌクレオチドＣの置換された領域は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の際に切断される５’フラップを形成する。あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’→５’ＤＮＡ合成活性を保有するＴａｑポリメラーゼの変異型は、以下の変異を含む。
Ｄ１４４Ｓ／Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ（Ｄ１４４Ｓは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を除き、Ｆ６６７Ｙは、ｄｄＮＴＰ取り込みを改善する）。
ＰｏｌＩポリメラーゼのエキソ−変異体は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：２８４．の方法に従って調製され得る。
本発明による標識された切断構造は、ＰｆｕＦＥＮ−１（すなわち、実施例９で以下に記載されたとおり調製される、クローニングされたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのＦＥＮ１）の調製物で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１を添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）
２．００μｌのＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。結合部分を含む、遊離され、標識されたフラグメントは、固体支持体上で、核酸配列、すなわち、５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む捕獲エレメントに対する結合部分の結合を介して結合される。一実施形態では、この標識されたフラグメントは、例えば、塩濃度を低下させること（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む）によって、または過剰の未標識の競合フラグメントの添加によって、捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の前に、９５℃で５分間加熱すること、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）標的核酸に特異的にハイブリダイズする上流オリゴヌクレオチド（図４のＡ）と、（ｃ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつｌａｃリプレッサータンパク質タグを含み、ここで前記プローブは、オリゴヌクレオチドＡのハイブリダイズ領域の下流である標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズする）。５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’→５’ＤＮＡ合成活性を保有するポリメラーゼ、例えば、酵素ａ）Ｙａｑ エキソ−、（Ｔａｑポリメラーゼを改変するための、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット、カタログ番号＃２００５１８（Ｔａｂｏｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１０７４）を用いる突然変異誘発によって調製した）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの変異型、ｂ）Ｐｆｕ、またはｃ）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの変異型（エキソ−Ｐｆｕ）を添加して、ポリメラーゼがオリゴヌクレオチドＡを伸長し、その結果このオリゴヌクレオチドＡがオリゴヌクレオチドＣの５’末端を部分的に置換することを可能にする条件下（例えば、７２０Ｃで１×Ｐｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中）で、５分〜１時間インキュベートする。オリゴヌクレオチドＣの置換された領域は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の際に切断される５’フラップを形成する。あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くが、３’→５’ＤＮＡ合成活性を保有するＴａｑポリメラーゼの変異型は、以下の変異を含む。
Ｄ１４４Ｓ／Ｆ６６７Ｙ Ｔａｑ（Ｄ１４４Ｓは５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を除き、Ｆ６６７Ｙは、ｄｄＮＴＰ取り込みを改善する）。
ＰｏｌＩポリメラーゼのエキソ−変異体は、Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６８：２８４．の方法に従って調製され得る。
本発明による標識された切断構造は、ＰｆｕＦＥＮ−１（すなわち、実施例９で以下に記載されたとおり調製される、クローニングされたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのＦＥＮ−１）の調製物で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１を添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）
２．００μｌのＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。ｌａｃリプレッサータンパク質を含む、遊離され、標識されたフラグメントは、固体支持体上で、ｌａｃリプレッサータンパク質：
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（配列番号４）
ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ（配列番号２８）
によって認識される二本鎖ＤＮＡ配列を含む捕獲エレメントに対するｌａｃリプレッサータンパク質の結合を介して結合される。
一実施形態では、この標識されたフラグメントは、例えば、塩濃度を変更すること、すなわち、塩濃度を低下させること（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む）によって、または過剰の競合因子ａ）ｌａｃリプレッサータンパク質、またはｂ）このｌａｃリプレッサータンパク質によって認識される二本鎖ＤＮＡ配列の添加によって、捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８００Ｃ）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の前に９５℃で５分間アニーリングすること、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）標的核酸に特異的にハイブリダイズする上流オリゴヌクレオチドプライマー（図４のＡ）と、（ｃ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分（例えば、図４のａｂ、核酸配列、５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含む）を含み、ここで前記プローブは、オリゴヌクレオチドＡのハイブリダイズ領域に隣接する標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズし、かつさらに、標的核酸にハイブリダイズせず、５’フラップを形成する５’領域を含む）。アニーリングは、１×Ｓｅｎｔｉｎａｌ分子指標コア緩衝液または１０×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で行う。
本発明による標識された切断構造は、ＰｆｕＦＥＮ−１（すなわち、実施例９で以下に記載されたとおり調製される、クローニングされたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのＦＥＮ−１）の調製物で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１を添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）
２．００μｌのＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。結合部分を含む、遊離され、標識されたフラグメントは、固体支持体上で、配列５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む捕獲エレメントに対する結合部分の結合を介して結合される。一実施形態では、この標識されたフラグメントは、例えば、塩濃度を低下させること（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む）によって、または過剰の、標識されていない競合因子フラグメントの添加によって、捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸配列の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の前に９５℃で５分間アニーリングすること、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）標的核酸に特異的にハイブリダイズする上流オリゴヌクレオチドプライマー、（図４のＡ）、および（ｃ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブであって、標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつｌａｃリプレッサータンパク質タグを含むプローブ、ここでこのプローブは、オリゴヌクレオチドＡのハイブリダイズ領域に隣接する標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズし、かつさらに、標的核酸にハイブリダイズせず、５’フラップを形成する５’領域を含む。アニーリングは、１×Ｓｅｎｔｉｎａｌ分子指標コア緩衝液または１０×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で行う。
本発明による標識された切断構造は、ＰｆｕＦＥＮ−１（すなわち、実施例９で以下に記載されたとおり調製される、クローニングされたＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓのＦＥＮ−１）の調製物で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのＰｆｕＦＥＮ−１を添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液（１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液は５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２を含む）
２．００μｌのＰｆｕＦＥＮ−１酵素またはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。
ヌクレアーゼによる、ハイブリダイズしたプローブの切断の際、ｌａｃリプレッサータンパク質は、固体支持体上で、このｌａｃリプレッサータンパク質：
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（配列番号４）
ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ（配列番号２８）によって認識される二本鎖ＤＮＡ配列を含む捕獲エレメントに対して特異的に結合する。
一実施形態では、標識されたフラグメントは、上の実施例４に記載の捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加の前に９５℃で５分間アニーリングすること、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造および結合部分（例えば、図４のａｂ）を有し、核酸配列、すなわち、５’ＡＧＣＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＴ３’（配列番号２６）を含み、ここで前記プローブは、標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズし、かつ標的核酸にハイブリダイズせずに５’フラップを形成する５’領域を含む）。アニーリングは、１×Ｓｅｎｔｉｎａｌ分子指標コア緩衝液または１０×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で行う。
本発明による標識された切断構造は、この切断構造を切断し得るヌクレアーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのヌクレアーゼを添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ヌクレアーゼ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）
２．００μｌのヌクレアーゼまたはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。結合部分を含む、遊離され、標識されたフラグメントは、固体支持体上で、核酸配列、すなわち、５’ＴＣＧＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＡＧＴＧＣＡ３’（配列番号２７）を含む捕獲エレメントに対する結合部分の結合を介して結合される。一実施形態では、この標識されたフラグメントは、例えば、塩濃度を低下させること（ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、典型的には、約１Ｍ未満、より通常には約５００ｍＭ未満、好ましくは約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む）によって、または過剰の、未標識の競合因子フラグメントの添加によって、捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
標的核酸は、以下の方法によって検出および／または測定され得る。標識された切断構造は、ＦＥＮヌクレアーゼの添加前に、９５℃で５分間アニーリングすること、次いで約５０〜６０℃まで冷却することにより形成される（ａ）標的核酸を含むサンプル（図４のＢ）と、（ｂ）下流の、５’末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブ（標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造、およびｌａｃリプレッサータンパク質を含むタグを有し、ここで前記プローブは、標的核酸の領域に特異的にハイブリダイズし、かつ標的核酸にハイブリダイズせずに５’フラップを形成する５’領域を含む）。アニーリングは、１×Ｓｅｎｔｉｎａｌ分子指標コア緩衝液または１０×Ｐｆｕ緩衝液の存在下で行う。
本発明による標識された切断構造は、この切断構造を切断し得るヌクレアーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）で切断される。切断は切断温度で行われ、プローブの二次構造は、標的核酸に結合しない場合、この切断温度以下で安定である。切断は、以下を含む７μｌの反応混合物に２μｌのヌクレアーゼを添加することによって行われる。
３μｌの切断構造（１０ｎｇ〜１０μｇ）
０．７μｌの１０×ヌクレアーゼ緩衝液（５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭのＭｇＣｌ２）
２．００μｌのヌクレアーゼまたはＨ２Ｏ
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量で７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止染色溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｙｃｌｉｓｔ ＤＮＡ配列決定キット、カタログ番号２００３２６に含まれる）の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。ヌクレアーゼによる、ハイブリダイズしたプローブの切断の際、ｌａｃリプレッサータンパク質は、固体支持体上で、このｌａｃリプレッサータンパク質：
ＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴ（配列番号４）
ＴＴＡＡＣＡＣＴＣＧＣＣＴＡＴＴＧＴＴＡＡ（配列番号２８）によって認識される二本鎖ＤＮＡ配列を含む捕獲エレメントに対して特異的に結合する。
一実施形態では、標識されたフラグメントは、上の実施例４に記載の捕獲エレメントから溶出される。溶出された、標識されたフラグメントを含むサンプルを、以下のとおりゲル電気泳動によって分析する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素のゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎの３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆って、加熱吸引ゲルドライヤー中（約８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させて、標的核酸の存在の指標であるシグナルの存在を検出する。
あるいは、伸長は、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示すポリメラーゼを用いて、および「ヌクレアーゼ」というタイトルの項に含まれる任意のヌクレアーゼを用いて、行われる。
＜Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のクローニング＞
本発明で有用な熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ酵素は、以下の方法に従って調製し得る。
熱安定性ＦＥＮヌクレアーゼ遺伝子は、当分野で周知のＰＣＲクローニングの方法に従ってＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ＡＴＣＣ番号４３５８７）由来のゲノムＤＮＡから単離し得る。クローニングされたＰｆｕＦＥＮ−１は、当分野で周知でありかつ下記の方法に従って細菌細胞中で過剰発現し得る。
以下のｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫクローニングオリゴヌクレオチドを合成および精製した。
Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）タンパク質発現および精製システムは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手し、製造者のプロトコールに従って用いた。
＜増幅＞
インサートＤＮＡを、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクター一本鎖テールに相補的な５’末端で１２ヌクレオチドおよび１３ヌクレオチド配列を含み、これによってディレクショナル・クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）が可能な遺伝子特異的プライマー（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上記）を用いたＰＣＲ増幅によって調製した。ＦＥＮ−１配列は、以下：
５０μｌの１０×ｃＰｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
７．５μｌのＰｆｕゲノムＤＮＡ（約１００ｎｇ／μｌ）
７．５μｌのＰｆｕＴｕｒｂｏ（２．５ｕ／μｌ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号６００２５０）
１５μｌの混合プライマー対（各１００ｎｇ／μｌ）（オリゴヌクレオチドａおよびｂ、上記）
４μｌの１００ｍＭのｄＮＴＰ
４１６μｌのＨ２Ｏ
合計５００μｌ
を含む増幅反応物（５つ別々の１００μｌの反応物）の調製によってＰ．ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のゲノムＤＮＡから増幅して、
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラーを用いて以下の条件下で増幅を行った。
ウィンドウ１ ９５℃ １分 １サイクル
ウィンドウ２ ９５℃ １分
５０℃ １分 ３０サイクル
７２℃ ３分。
５つそれぞれの反応物由来のＰＣＲ産物を、１つのチューブで合わせ、ＳｔｒａｔａＰｒｅｐ ＰＣＲを用いて精製して、５０μｌの１ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）中で溶出した。ＦＥＮ−１のＰＣＲ産物を、ゲルで分析し、約１０００ｂｐと確定した。
ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物を、ライゲーションに依存しないクローニング末端（ＬＩＣ）を作製すること、ｆｅｎ−１遺伝子を含むＰＣＲ産物をｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へアニーリングすること、および以下の方法によるアニーリング混合物を用いて細胞を形質転換することによってｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングした。要するに、ＰＣＲ増幅後、ＰＣＲ産物を精製し、ｄＡＴＰの存在下でＰｆｕＤＮＡポリメラーゼで処理する（Ａｆｆｉｎｉｔｙ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（タンパク質発現および精製システム）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００３２６とともに含まれるマニュアルに従う）。ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰの非存在下で、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性によって、ＰＣＲ産物の各３’末端で少なくとも１２および１３ヌクレオチドが除去される。この活性は、最初のアデニンに遭遇するまで持続され、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫベクターの一本鎖テールに相補的な５’伸長一本鎖テールを有するＤＮＡフラグメントが得られる。
＜ＬＩＣ末端の作製＞
ＬＩＣ末端を以下の混合物の調製によって作製した。
４５μｌの精製ＰＣＲ産物（約０．５μｇ／μｌ）
２．５μｌの１０ｍＭのｄＡＴＰ
５μｌの１０×ｃＰｆｕ緩衝液
１μｌのｃＰｆｕ（２．５ｕ／μｌ）
０．５μｌのＨ２Ｏ
ｃＰｆｕおよびｃＰｆｕ緩衝液をＳｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる（ｃＰｆｕ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１５３およびｃＰｆｕ緩衝液、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３２）。
サンプルを７２℃で２０分間インキュベートし、産物を室温に冷却した。各サンプルに４０ｎｇの調製ｐＣＡＬｎＥＫＬＩＣベクター（調製ベクターはＳｔｒａｔａｇｅｎｅからＡｆｆｉｎｉｔｙ ＬＩＣ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（クローニングおよびタンパク質精製キット）（２１４４０５）で市販されている）を添加した。ベクターおよびインサートＤＮＡを合わせ、室温でアニーリングさせて、極めてコンピテントな細菌宿主細胞に形質転換させる（Ｗｙｂｏｒｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１０：１）。
＜ＦＥＮ産生用細胞の調製＞
２リットルのＬＢ−ＡＭＰに２０ｍｌのＦＥＮ−１クローン（クローン３）の一晩の培養物を接種した。約１１時間成長を進行させ、この時点で細胞はＯＤ６００＝０．９７４に達していた。細胞を１ｍＭのＩＰＴＧで一晩（約１２時間）誘導処理した。遠心分離によって細胞を回収し、得られた細胞ペーストを−２０℃で保存した。
＜タグ化ＦＥＮ−１の精製＞
細胞を２０ｍｌのカルシウム結合緩衝液に再懸濁した。
ＣａＣｌ２結合緩衝液
５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１５０ｍＭのＮａＣｌ
１．０ｍＭのＭｇＯＡｃ
２ｍＭのＣａＣｌ２
サンプルを、ミクロチップを用いたブランソン超音波処理器（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で超音波処理した。出力設定を５にし、負荷サイクルは９０％であった。サンプルを３回超音波処理し、処理の合間は氷上に静置した。超音波処理物を２６，８９０×ｇで遠心分離した。明澄化した上清を５０ｍｌコニカルチューブ（円錐管）中で１ｍｌの洗浄した（ＣａＣｌ２結合緩衝液中の）カルモジュリンアガロース（ＣＡＭアガロース）と混合し、低温室（４℃）で５時間ゆっくりと回転したホイール上でインキュベートした。ＣＡＭアガロースを低速の遠心分離（卓上型遠心分離機で５０００ｒｐｍ）によって回収した。
上清の除去後、ＣＡＭアガロースを５０ｍｌのＣａＣｌ２結合緩衝液で洗浄し、使い捨てのドリップカラムに移した。元の容器およびピペットを完全にリンスして、残りのアガロースを除去した。このカラムを約２００ｍｌのＣａＣｌ２結合緩衝液でリンスした。
１０ｍｌの５０ｍＭのＮａＣｌ溶出緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭのＥＧＴＡ）で溶出を行った。０．５ｍｌの画分を回収した。１Ｍ ＮａＣｌ溶出緩衝液で第２の溶出ステップを行い、０．５ｍｌの画分を回収した。
＜精製したタグ化ＦＥＮ−１の評価＞
１ＭのＮａＣｌ中に溶出されたＣＢＰタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１を含む画分を、ＳＤＳ中でボイルし、Ｓｙｐｒｏ Ｏｒａｎｇｅで染色した４〜２０％ゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した（図５）。
非切断ＦＥＮ−１のタンパク質濃度は、約１５０ｎｇ／μｌと定量した（下記）。
＜精製されたＦＥＮ−１のエンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫ）切断＞
画分３〜９を、５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、および２ｍＭのＣａＣｌ２に対して４℃で一晩透析した。
透析されたＦＥＮ−１において、不透明で非常に細かい沈殿が認められた。サンプルを１／２０で希釈し、沈殿を除去した。サンプルを１／３希釈しても、依然として不溶物質が検出可能であった。１／３の希釈物質を３７℃で２分間加熱し、Ｔｗｅｅｎ２０と混合して、最終濃度を０．１％とした。Ｔｗｅｅｎ２０の添加の際に、溶液中でほぼ直後に「ストリング」およびより粗大な固体が形成され、これは、溶液を１ＭのＮａＣｌに調整した後でさえも逆向することができなかった。
基質として１／２０に希釈したサンプルおよび１×ＥＫ緩衝液での透析バッグのリンスによって調製した希釈サンプルを用いて、ＥＫ切断を行った。ＥＫ切断は、室温で一晩（約１６時間）の１μｌのＥＫ（１ｕ／μｌ）の添加によって行った。
１００μｌのＣＡＭアガロースと組み合わせた１００μｌのＳＴＩアガロースを、１０ｍｌの１×ＳＴＩ緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＣａＣｌ２、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いて２回リンスした。ＮａＣｌを２つのＥＫサンプルに添加して、最終濃度を２００ｍＭのＮａＣｌにした。２つのサンプルを合わせて、リンスしたアガロースに添加した。サンプルを４℃のホイール上で３時間ゆっくりと回転させ、卓上型遠心分離機での低速の遠心分離によって分離した（上記）。上清を除去し、樹脂を５００μｌ×ＳＴＩを用いて２回リンスした。２つのリンス物を合わせ、元の上清とは別にとっておく。サンプルを４〜２０％のゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
約５０ｎｇ／ｍｌの濃度でＰｆｕ標準との比較によって測定したところ、消化産物の濃度は約２３ｎｇ／μｌであった。
＜ＦＥＮヌクレアーゼ活性＞
実施例２に記載のように調製したＦＥＮヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼ活性およびＦＥＮヌクレアーゼの切断構造の要件は、「ＦＥＮヌクレアーゼ」というタイトルの項または以下のいずれかに記載の方法に従って決定することができる。
要するに、３つのテンプレート（図２）を用いて、本発明によるＦＥＮヌクレアーゼ活性を評価する。テンプレート１は以下の配列を有する５’３３Ｐ標識オリゴヌクレオチド（Ｈｅｌｔｅｓｔ４）である。
５’ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴＧＧＧＡＡＧＧＧＣＧＡＴＣＧＧＴＧＣＧ３’（配列番号１）。
Ｈｅｌｔｅｓｔ４の下線部分は、Ｍ１３ｍｐ１８＋に相補的な領域に相当する。切断産物は、配列ＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴ（配列番号２）を有する１８ヌクレオチドのフラグメントである。Ｈｅｌｔｅｓｔ４は、Ｍ１３に結合して相補二本鎖ドメインおよび非相補的５’オーバーハングを生じる。この二本鎖により、テンプレート２（図２
）が形成される。テンプレート３（図２）はＨｅｌｔｅｓｔ４に直接隣接するＭ１３に結合したさらなるプライマー（ＦＥＮＡＳ）を有する。ＦＥＮＡＳの配列は、５’ＣＣＡＴＴＣＧＣＣＡＴＴＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＡ３’（配列番号３）である。テンプレート３の存在下で、ＦＥＮヌクレアーゼはＨｅｌｔｅｓｔ４の遊離の５’末端に結合し、接合点に移動し、Ｈｅｌｔｅｓｔ４を切断して１８ヌクレオチドのフラグメントを生じる。得られた切断産物を、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素シークエンシングゲル上で分離する。
テンプレートを下記のように調製する。
テンプレート１ テンプレート２ テンプレート３
Ｈｅｌｔｅｓｔ４ １４μｌ １４μｌ １４μｌ
Ｍ１３ ＊＊ １４μｌ １４μｌ
ＦＥＮＡＳ ＊＊ ＊＊ １４μｌ
Ｈ２Ｏ ２８μｌ １４μｌ ＊＊
１０×Ｐｆｕ緩衝液 ４．６μｌ ４．６μｌ ４．６μｌ
Ｐｆｕ緩衝液は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得ることができる（カタログ番号２００５３６）。
テンプレート混合物を、９５℃で５分間加熱し、室温に４５分間冷却し、４℃で一晩保存する。
酵素サンプルを以下に示す。
Ａ．Ｈ２Ｏ（コントロール）
Ｂ．２μｌ未希釈非切断ＦＥＮ−１（約４４５ｎｇ／μｌ）
Ｃ．２μｌの非切断ＦＥＮ−１の１／１０希釈（約４４．５ｎｇ／μｌ）
Ｄ．２μｌエンテロキナーゼプロテアーゼ（ＥＫ）切断ＦＥＮ−１（約２３ｎｇ／μｌ）
この４つの反応混合物を、以下の３つのテンプレートと混合する。
３μｌのテンプレート１、テンプレート２またはテンプレート３
０．７μｌの１０×クローニングＰｆｕ緩衝液
０．６μｌの１００ｍＭのＭｇＣｌ２
２．００μｌのＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ
０．７μｌのＨ２Ｏ
全量７．００μｌ
５０℃で３０分間この反応を進行させ、各サンプルへの２μｌのホルムアミド「シークエンシング停止」溶液の添加によって停止させる。サンプルを９５℃で５分間加熱し、６％アクリルアミドの７Ｍ尿素ＣａｓｔＡｗａｙゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にロードする。
あるいは、ＦＥＮヌクレアーゼ活性は、１時間のインキュベーション時間を利用する以下の緩衝液で分析してもよい。
１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液
５００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
１００ｍＭのＭｇＣｌ２
反応混合物を以下に示す。
３μｌのテンプレート１、テンプレート２またはテンプレート３
０．７μｌの１０×ＦＥＮヌクレアーゼ緩衝液
２．００μｌのＦＥＮ−１またはＨ２Ｏ（上記のＡ〜Ｄ）
１．３μｌのＨ２Ｏ
全量７．００μｌ
サンプルを、Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ９６ホット・トップ・サーマル・サイクラー中、５０℃で１時間インキュベートする。２μｌのシークエンシング停止（９５％ホルムアミド、２０ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノール、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）染色溶液の添加後、サンプルを９９℃で５分間加熱する。サンプルを、１１インチ長の、手で注いだ、２０％アクリルアミド／ビスアクリルアミドの７Ｍ尿素ゲルにロードする。このゲルを、ブロモフェノールブルーが全距離の約２／３移動するまで２０ワットで泳動する。このゲルをガラスプレートから取り出し、固定液（１５％メタノール、５％酢酸）に１０分間、次いで水に１０分間浸す。このゲルをＷｈａｔｍａｎｎ ３ｍｍ濾紙に置き、プラスチックラップで覆い、加熱吸引ゲルドライヤー中（〜８０℃）で２時間乾燥させる。このゲルを、Ｘ線フィルムに一晩感光させる。
テンプレート１、２、および３（上記のように調製）を、以下：
Ａ．Ｈ２Ｏ
Ｂ．２μｌのＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１
Ｃ．２μｌのＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１希釈物（１：１０）
Ｄ．２μｌのＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１
の添加によって切断するＦＥＮ−１ヌクレアーゼアッセイのオートラジオグラフを、図６に示す。
レーンを以下に示す。レーン１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、および１Ｄは、テンプレート１であって、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート１を示す。レーン２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、および２Ｄは、テンプレート２であって、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート２を示す。レーン３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、テンプレート３であって、それぞれＨ２Ｏ、未希釈のＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１、ＣＢＰタグ化ＰｆｕＦＥＮ−１の１：１０希釈物、およびＥＫ切断ＰｆｕＦＥＮ−１で切断したテンプレート３を示す。
タグ化したＰｆｕＦＥＮ−１は、Ｎ末端ＣＢＰ親和性精製タグを含む。ＦＥＮ−１のタグ化バージョンと非タグ化バージョンとの間の何らかの活性の差はタンパク質濃度差に起因し（酵素サンプルの濃度は上記）、これは、タグ化ＦＥＮ−１と非タグ化ＦＥＮ−１の量が等しくないからである。タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１および非タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１が両方とも切断活性を示す。
図６は、ＦＥＮ−１の非存在下での切断のバックグラウンドレベルを示す（レーン１Ａ、２Ａ、および３Ａ）。さらに、この図は、タグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１がテンプレート１と比較してテンプレート２を多く切断することを示す。詳細には、未希釈のタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１の存在下で最も大量のテンプレート２が切断される（レーン２Ｂ）。テンプレート３の分析では、未希釈のタグ化Ｐｆｕ ＦＥＮ−１によって最も大量のテンプレート３が切断され、希釈タグ化ＦＥＮ−１では最も少量のテンプレート３が切断されることが示される。標識されたプローブは、４０〜４３のヌクレオチドバンドとして移動する。ＦＥＮ−１は、テンプレート２よりもテンプレート３（上流プライマーを含む）を優先的に切断する。切断産物バンドは、１６〜２０ヌクレオチドで移動する主要なバンドである。標識された基質（使用前にゲル精製していない）が不均一である結果、標識された切断産物は不均一である。
＜ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼの存在下でのβアクチンのＰＣＲ増幅および検出＞
ＰＣＲアッセイを用いて標的核酸を検出する。このアッセイの方法によれば、標的核酸に対する結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分またはタグを含むプローブ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ（例えば、Ｙａｑエキソ−）、および熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（例えば、実施例２に記載のように調製したＰｆｕ ＦＥＮ−１）の存在下で、ＰＣＲ反応を行う。固体支持体上の捕獲エレメントに対して、結合部分またはタグの結合を介して結合する、蛍光標識したフラグメントの遊離の検出により、標的核酸の存在が示される。
二連のＰＣＲ反応物は、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標・コア緩衝液、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼ（約１．４５Ｕ）、Ｐｆｕ ＦＥＮ−１（約２３ｎｇ）、βアクチンプライマー（各３００ｎＭ）、およびβアクチン特異的蛍光発生プローブ（βアクチン標的配列に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分またはタグを含む）を含む。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒω）を、各反応における標的核酸として用いる。この反応を５０μｌの容積で行う。Ｐｆｕ ＦＥＮ−１のみ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＴａｑポリメラーゼのみ、またはヒトゲノムＤＮＡテンプレート以外の全ての成分を含む反応混合物を含む、ネガティブコントロールの反応物を調製する。２．５単位のＴａｑ２０００を含むポジティブコントロール反応物も調製する。ＰＣＲ反応の間に、切断構造の同時形成、βアクチン標的配列の増幅、および切断構造の切断がある。切断構造の切断が切断温度で行われ、かつプローブの二次構造が、標的核酸に結合されない場合、切断温度以下で安定であるようにサーモサイクリングパラメーターを選択する。分光蛍光光度サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物をアッセイする。サーモサイクリングパラメーターは、９５℃で２分間、ならびに９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、および７２℃で１５秒という４０サイクルである。アニーリングステップの間サンプルを調査する。
遊離した、蛍光標識されたフラグメントは、固体支持体に結合された捕獲エレメントに対して、プローブ上に存在する結合部分またはタグを介して結合される。
＜ＦＥＮ−１ヌクレアーゼおよび５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼの存在下でのβアクチンのＰＣＲ増幅および検出＞
ＰＣＲアッセイを用いて標的核酸を検出する。このアッセイの方法によれば、βアクチン標的核酸に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有し、かつ結合部分またはタグを含むプローブ、Ｐｆｕポリメラーゼ（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を天然に欠く）、または、さらに３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰｆｕポリメラーゼ（例えば、エキソ−Ｐｆｕ）、および熱安定性ＦＥＮ−１ヌクレアーゼ（Ｐｆｕ ＦＥＮ−１）の存在下でＰＣＲ反応を行う。固体支持体上の捕獲エレメントに対して、結合部分またはタグの結合を介して結合する、蛍光標識されたフラグメントの遊離の検出により、標的核酸の存在が示される。
１×クローニングＰｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００５３２から入手可能）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各々のｄＮＴＰ、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠く５単位のＰｆｕポリメラーゼ、タグ化または非タグ化のＰｆｕＦＥＮ−１（約２３ｎｇ）、ＰＥＦ（１ｎｇ）（ＷＯ９８／４２８６０に記載）、βアクチンプライマー（各３００ｎＭ）、および蛍光発生プローブ（標的βアクチン核酸配列に対するプローブの結合に応じて変化する二次構造を有する）を含む二連のＰＣＲ反応物を調製する。１０ｎｇのヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各反応における標的核酸として用いる。反応は５０μｌの容積で行う。５’→３’および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠くＰｆｕポリメラーゼのみを含むか、またはヒトゲノムＤＮＡテンプレート以外の全ての成分を含むネガティブコントロール反応物も調製する。２．５単位のＴａｑ２０００を含む反応混合物を調製して、ポジティブコントロールとして用いる。ＰＣＲ反応の間に、切断構造の同時形成、βアクチン標的配列の増幅、および切断構造の切断がある。切断構造の切断が切断温度で行われ、かつプローブの二次構造が、標的核酸に結合されない場合、切断温度以下で安定であるようにサーモサイクリングパラメーターを選択する。分光蛍光光度サーモサイクラー（ＡＢＩ７７００）で反応物を分析する。サーモサイクリングパラメーターは、９５℃で２分間、ならびに９５℃で１５秒、６０℃で６０秒、および７２℃で１５秒という４０サイクルである。
遊離した、蛍光標識されたフラグメントは、固体支持体に結合された捕獲エレメントに対して、プローブ上に存在する結合部分またはタグを介して結合される。
標準的な手順によってバフィーコートから抽出したヒトＤＮＡで検出されるヒトオルニチントランスカルバモイラーゼ遺伝子を標的として用いて、ローリングサークル増幅を含む本発明のアッセイを行う。標的（４００ｎｇ）は、９７℃で４分間熱変性し、２つの５’−リン酸化オリゴヌクレオチド（オープン・サークル・プローブおよび１つのギャップ・オリゴヌクレオチド）の存在下における、ライゲーション条件下でインキュベートする。オープン・サークル・プローブは、配列：ｇａｇｇａｇａａｔａａａａｇｔｔｔｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔｇｔｃｔｃａｇｃａｇｃｔｔｃｔａａｃｇｇｔｃａｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｔｔｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｇａａｃａｃ（配列番号４６）を有し、野生型配列のギャップヌクレオチドは：ｔａｇｔｇａｔｃである。図７および８は、ローリングサークルプローブおよびローリングサークル増幅を示す。反応緩衝液（４０μｌ）は、５単位／μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．２ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、８０ｎＭのオープン・サークル・プローブ、および１００ｎＭのギャップ・オリゴヌクレオチドを含む。３７℃で２５分間のインキュベーション後、２５μｌを取り出して、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、４００μＭの各ｄＴＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、０．２μＭのローリングサークル複製プライマー：ｇｃｔｇａｇａｃａｔｇａｃｇａｇｔｃ（配列番号４７）、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（１６０ｎｇ／５０μｌ）を含む２５μｌの溶液に添加する。このサンプルを３０℃で３０分間インキュベートする。
ＲＮＡを、以下の試薬濃度を得るように希釈している補償緩衝液（ストック溶液または濃縮物）の添加によってオープン・サークル・プローブ中に存在するＴ７プロモーターから作製する。３５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、２ｍＭのスペルミジン、１８ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＧＭＰ、１ｍＭのＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、３３３μＭのＵＴＰ、６６７μＭのビオチン−１６−ＵＴＰ、０．０３％のＴｗｅｅｎ２０、２単位／μｌのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ。米国特許第５，８５８，０３３号に記載のようにＲＮＡ作製を行う。３７℃で９０分間インキュベーションを進行させる。
５μｌの２連の各サンプル（実際の試験サンプル、（−）リガーゼコントロールサンプル、（−）ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼコントロール、および（−）Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼコントロール）を検出用に取り出す。逆転写の過程には、本発明に従って、Ａ）オープンサークルのライゲーション、Ｂ）ローリングサークル１本鎖ＤＮＡの合成、Ｃ）ＲＮＡの作製（オープン・サークル・プローブ中に存在するＴ７プロモーターより）、Ｄ）ＲＮＡの逆転写によるｃＤＮＡの作製、およびＥ）ＦＥＮ切断構造を検出するためのプライマーおよびプローブを用いるｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を行うというステップを含む。逆転写には、製造者が推奨する同量のＹａｑ ＤＮＡポリメラーゼのＴａｑ２０００ＤＮＡポリメラーゼへの置換以外は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｓｅｎｔｉｎｅｌ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｔｕｂｅ ＲＴ−ＰＣＲコア Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（カタログ番号６００５０５）から得られる試薬およびプロトコールを用いる。各反応物は、１×Ｓｅｎｔｉｎｅｌ分子指標ＲＴ−ＰＣＲコア緩衝液、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭの各ｄＮＴＰ、５単位のエキソ−Ｐｆｕ、２３ｎｇのＰｆｕ ＦＥＮ−１、１ｎｇＰＥＦ、５００ｎＭの各上流プライマー：ａａｇｔｔｔｃｔｃａｔａａｇａｃｔｃｇｔｃａｔ（配列番号４８）、逆プライマー：ａｇｇｃａｇａａｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔ（配列番号４９）、および蛍光発生プローブ（例えば、ＦＡＭ−ＤＡＢＣＹＬで標識）（標的核酸に対する結合に応じて変化する、本明細書に規定される、二次構造を有し、かつさらに結合部分を含む）を含む。４５℃で３０分間、９５℃で３分間、その後のサーマルサイクラー中で１サイクル：９５℃で２分間、５０℃で１分間、７２℃で１分間のインキュベーションにこの反応物を供する。次いで、蛍光プレートリーダー、例えば、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＦｌｕｏｒＴｒａｃｋｅｒまたはＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの７７００配列検出システム（プレート読み出しモード）で蛍光を測定する。
ローリングサークル増幅ＲＮＡ産物中のビオチン−１６−ＵＴＰの組み込みのおかげで、検出効率の照合が可能である。反応物のアリコートを、固定捕獲プローブを用いて、ガラススライド（あるいは、マイクロウェルプレート）に捕獲する。捕獲ＲＮＡアンプリコンの検出は、本明細書中で参照により組み込まれる米国特許第５，８５４，０３３号に詳細に記載されている。
＜他の実施形態＞
他の実施形態が当業者に明白である。明確にするために前記の詳細な説明を提供しているだけであり、単なる例示であると理解すべきである。本発明の趣旨および範囲は上記実施例には限定されず、以下の特許請求の範囲に含まれる。

Claims (53)

  1. 逆転写酵素と、切断手段と、第一のオリゴヌクレオチドと、第二のオリゴヌクレオチドとを含む組成物。
  2. 前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼがフラップ特異的ヌクレアーゼである、請求項３に記載の組成物。
  5. 前記ＦＥＮ−１ヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３に記載の組成物。
  6. 前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記対の相互作用性シグナル発生標識部分が消光部分および蛍光部分を含む、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記対の相互作用性シグナル発生標識部分のうちの少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記少なくとも１つの標識部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’領域に機能的に連結されている、請求項８に記載の組成物。
  13. 請求項１に記載の組成物とその包装材とを備えるキット。
  14. 前記切断手段が５’ヌクレアーゼを含む、請求項１３に記載のキット。
  15. 前記５’ヌクレアーゼがＦＥＮ−１ヌクレアーゼである、請求項１４に記載のキット。
  16. 前記第二のオリゴヌクレオチドの３’ヌクレオチドが保護基を有する、請求項１３に記載のキット。
  17. 前記第二のオリゴヌクレオチドがシグナルを提供し得る少なくとも１つの標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
  18. 前記第二のオリゴヌクレオチドが１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む、請求項１３に記載のキット。
  19. 前記対の相互作用性シグナル発生標識部分がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 前記対の相互作用性シグナル発生標識部分の少なくとも１つの部分が、前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１８に記載のキット。
  21. 前記少なくとも１つの標識された部分が前記第二のオリゴヌクレオチドの５’フラップに機能的に連結されている、請求項１７に記載のキット。
  22. 標的核酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
  23. （ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
    （ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
    （ｉｉｉ）５’領域および３’領域を含む第二のオリゴヌクレオチドであって、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、前記５’領域が前記標的核酸に対して相補的でない第二のオリゴヌクレオチドと、
    （ｉｖ）逆転写酵素と、
    （ｖ）切断手段と
    を含む組成物。
  24. 請求項２３の組成物と、その包装材とを備えるキット。
  25. （ｉ）３’から５’の順序に、第一の領域と、伸長領域と、第二の領域とを含む標的核酸と、
    （ｉｉ）前記標的核酸の前記第一の領域に対して少なくとも部分的に相補的である、第一のオリゴヌクレオチドと、
    （ｉｉｉ）前記標的核酸に対応する第二のオリゴヌクレオチドであって、前記第二のオリゴヌクレオチドは５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の前記第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ、前記５’領域が前記標的核酸の前記第一の領域の上流、下流、または前記第一の領域を含んでもよい領域に対して少なくとも部分的に相補的である第二のオリゴヌクレオチドと、
    （ｉｖ）逆転写酵素と、
    （ｖ）切断手段と
    を含む組成物。
  26. 請求項２５の組成物と、その包装材とを備えるキット。
  27. 前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項１、２３または２５に記載の組成物。
  28. サンプル中の標的核酸の存在の指標となるシグナルを発生させる方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断してシグナルを発生させるステップとを含み、前記シグナルの発生は、前記サンプル中の標的核酸配列の存在の指標である方法。
  29. 標的核酸配列を検出または測定する方法であって、標的核酸配列を含むサンプルと、逆転写酵素とをインキュベートすることによって切断構造を形成するステップと、切断剤を用いて切断構造を切断して核酸フラグメントを遊離するステップと、前記サンプル中の標的核酸の存在の指標として前記フラグメントの遊離を検出および／または測定するステップとを含む、方法。
  30. 前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項２８または２９に記載の方法。
  31. 前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項２８または２９に記載の方法。
  32. 前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項２８または２９に記載の方法。
  33. 前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３２に記載の方法。
  35. シグナルを提供し得る少なくとも１つの標識された部分を含む前記切断構造が形成される、請求項２８または２９に記載の方法。
  36. 請求項３２に記載の方法であって、検出可能なシグナルを消光するように効率的に位置決めされた１対の相互作用性シグナル発生標識部分を含む切断構造が形成され、前記標識部分がＦＥＮヌクレアーゼ切断に対して感受性の部位によって隔てられ、ＦＥＮヌクレアーゼのヌクレアーゼ活性が、ＦＥＮヌクレアーゼに感受性である部位を切断することにより、前記第二の相互作用性シグナル発生標識部分から第一の相互作用性シグナル発生標識部分を分離することを可能にし、これによって検出可能シグナルが発生する、方法。
  37. 前記相互作用性シグナル発生標識部分の対がクエンチャー部分と蛍光部分とを含む、請求項３６に記載の方法。
  38. サンプル中の標的核酸配列を検出するための方法であって、
    上流プライマーと、下流プローブと、逆転写酵素と、切断剤と、標的核酸とを以下のステップを可能にする条件下で混合するステップと、
    （ｉ）上流プライマーと下流プローブとのアニーリングステップと、
    （ｉｉ）上流プライマーを伸長するステップと、ここで、前記逆転写酵素がプライマー伸長産物を合成し、下流プローブとともに切断構造を形成し、
    （ｉｉｉ）前記切断剤で前記切断構造を切断して、検出可能シグナルを発生させるステップと、
    前記シグナルを検出および／または測定するステップと
    を含む方法。
  39. 前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記逆転写酵素が熱安定性である、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記ＦＥＮヌクレアーゼが熱安定性である、請求項３９に記載の方法。
  43. 前記ＦＥＮヌクレアーゼがフラップ特異的なヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
  44. 前記下流プローブが５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ前記５’領域がフラップを形成する、請求項３８に記載の方法。
  45. 標的核酸を検出するための方法であって、
    （ａ）標的核酸の第一の領域に対して少なくとも部分的に相補性である上流プライマーと、
    ５’領域および３’領域を含み、前記３’領域が前記標的核酸の第二の領域に対して少なくとも部分的に相補的である下流オリゴヌクレオチドと
    を提供するステップと、
    （ｂ）前記標的核酸と、上流プライマーと、下流オリゴヌクレオチドとを、標的核酸と上流プライマーと下流オリゴヌクレオチドの３’領域との間の二本鎖の形成を可能にする条件下で混合するステップと、
    （ｃ）逆転写酵素の重合化活性による相補的ＤＮＡ鎖の重合によって、標的の伸長領域が切断構造を形成するために十分な長さにまで上流プライマーを伸長することができる反応条件下で、前記二本鎖を逆転写酵素の重合化活性に対して供するステップと、
    （ｄ）第一の切断構造の形成に伴って、下流オリゴヌクレオチド内に位置する部位において前記切断構造の切断が生じるような条件下で切断剤を提供するステップと、これによって前記下流オリゴヌクレオチドの切断が可能となり、
    （ｅ）下流オリゴヌクレオチドの切断を検出するステップと
    を含む方法。
  46. 前記プライマーおよび下流オリゴヌクレオチドが、標的核酸の非重複領域にハイブリダイズする、請求項４５に記載の方法。
  47. 前記切断剤がＦＥＮヌクレアーゼである、請求項４５に記載の方法。
  48. 前記逆転写酵素の重合化活性が鎖置換活性を含む、請求項４５に記載の方法。
  49. 前記方法が、等温条件下で行われる、請求項４５に記載の方法。
  50. 前記逆転写酵素が、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）ＲＴ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＲＴ、トリ肉腫白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）ＲＴ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＲＴ、ニワトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）ＲＴ、ニワトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ骨髄球腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ ＲＴ、ニワトリ細網内皮症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ ＲＴ、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ ＲＴ、ラウス随伴ウイルス（ＲＡＶ）ＲＴ、および骨髄芽球症随伴ウイルス（ＭＡＶ）ＲＴからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
  51. 前記逆転写酵素の重合化活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記重合化された相補的核酸はその３’末端で二本鎖における下流オリゴヌクレオチドに対して隣接する、請求項４５に記載の方法。
  52. 前記逆転写酵素活性が、切断構造を形成するのに十分な長さの伸長領域に対して相補的なヌクレオチドを重合化し、前記伸長領域の長さは前記伸長領域の長さが完全な二本鎖核酸であるような長さである、請求項４５に記載の方法。
  53. 前記下流プローブの５’領域が５’フラップを形成する、請求項４５に記載の方法。
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