CN114836456B

CN114836456B - 一种用于新型冠状病毒检测的表达载体、微生物及应用

Info

Publication number: CN114836456B
Application number: CN202110133810.4A
Authority: CN
Inventors: 丁辰; 杜威; 李焱剑; 郑培宣; 李金泽; 刘京京; 刘畅晓风
Original assignee: 东北大学
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN114836456A

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒检测的表达载体、转入了该表达载体的微生物，以及转入了表达载体的微生物在新型冠状病毒检测中的应用。本发明的目的是提供一种包含ACE2(血管紧张素转换酶2)蛋白的核心结合区域DNA序列和绿色荧光蛋白(GFP)DNA序列的质粒表达载体，及转入了该表达载体的微生物，特别是大肠杆菌基因工程菌株(PmrB‑ACE2‑GFP菌株)，该菌株能够表达人类ACE2蛋白，特异性的识别与结合新型冠状病毒蛋白壳上的S蛋白，并激活下游报道基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达，从而快速、准确的筛选环境中的病毒S蛋白。该基因工程菌株成本低，繁殖快，有利于大规模生产，此外，ACE2蛋白与S蛋白的结合特异性强，灵敏度高，便于实现产业化。

Description

一种用于新型冠状病毒检测的表达载体、微生物及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于新型冠状病毒检测的表达载体、转入了该表达载体的微生物，以及转入了表达载体的微生物在新型冠状病毒检测中的应用。

背景技术

目前对于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法主要有两种。第一种被称为病毒核酸检测，原理是通过提取病人样本中的所有的遗传物质(包括细胞与可能存在的病毒)，然后进行定量实时PCR技术检测样本中是否存在新型冠状病毒的RNA遗传物质，从而确认该病人是否被感染；第二种是提取病人体内的血液样本，利用特异性抗体检测病人体内是否存在受新冠病毒蛋白刺激而产生的免疫球蛋白(例如，IgM和IgG)，研究证明，感染新型冠状病毒的患者体内含有大量的IgM和IgG。然而这两种检测方法存在很多限制因素。核酸检测方法操作复杂，等待时间较长，不利于用于突发性疫情筛查；然而新冠病毒蛋白抗原检测方法需要的实验条件较为苛刻，此外，每个人在感染新型冠状病毒的免疫反应是不同的，其产生的免疫球蛋白数量也是存在较大差异，因此该方法较容易出现假阳性。最后，这两种检测方法的实施成本都较高，不利于用于大范围的疫情筛查工作。

通过对病毒结构的解析与之前的研究，新型冠状病毒的入侵方式是利用其蛋白壳上面的S蛋白特异性识别与结合人肺部上皮细胞表面的ACE2蛋白受体，从而完成病毒蛋白外壳与宿主细胞膜的融合，进而开始病毒对于宿主细胞的侵染。因此病毒蛋白壳上面的S蛋白是新型冠状病毒进行侵染和复制不可或缺的生化组件。新型冠状病毒S蛋白按照功能可以分为三个部分：信号肽，S1部分和S2部分。其中，S1蛋白能够特异性被ACE2受体识别与结合，该区域的核心结合亚基位于S1蛋白的第333号氨基酸到526号氨基酸之间(苏氨酸333～甘氨酸526)。此外，ACE2受体蛋白的核心结合区域位于ACE2受体蛋白第20号氨基酸与第90号氨基酸之间(苏氨酸20～天冬酰胺酸90)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种包含ACE2(血管紧张素转换酶2)蛋白的核心结合区域DNA序列和绿色荧光蛋白(GFP)DNA序列的质粒表达载体，及转入了该表达载体的微生物，特别是大肠杆菌基因工程菌株(PmrB-ACE2-GFP菌株)，该菌株能够表达人类ACE2蛋白，特异性的识别与结合新型冠状病毒蛋白壳上的S蛋白，并激活下游报道基因绿色荧光蛋白(GFP)的表达，从而快速、准确的筛选环境中的病毒S蛋白。该基因工程菌株成本低，繁殖快，有利于大规模生产，此外，ACE2蛋白与S蛋白的结合特异性强，灵敏度高，便于实现产业化。

本发明首先包括一种用于新型冠状病毒检测的质粒表达载体，所述质粒表达载体整合有人类肺上皮细胞ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列和表达绿色荧光蛋白GFP的DNA序列，所述ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列为第20号氨基酸与第90号氨基酸之间(苏氨酸20～天冬酰胺酸90)区域；所述ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列和绿色荧光蛋白GFP的DNA序列受表达载体上游调节子和启动子的调控，所述绿色荧光蛋白GFP的DNA序列处于ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列的下游。

当病毒的S蛋白与质粒表达载体表达的ACE2受体蛋白(至少包括ACE2受体蛋白的核心结合区域)结合，能够特异性地激活下游通路，从而激活GFP蛋白的表达。GFP蛋白表达后可在荧光显微镜中观察到绿色荧光，即本发明中质粒表达载体的表达信号蛋白为GFP。

优选的，本发明提供了一种上述的质粒表达载体的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤一：利用基因合成的方式获得沙门氏菌的PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列，通过PCR技术扩增所述PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列，利用overlapping PCR技术将所述PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列按PmrB-PmrA-PmrC的顺序整合成一段完整的cDNA序列，将TAA终止密码子通过PCR的方式加入到所述完整的cDNA序列的PmrA序列后面，形成PmrB-PmrA-PmrC重组序列。

步骤二：利用基因合成的方式获得ACE2受体蛋白的核心结合区域(ACE2受体蛋白的20号氨基酸到90号氨基酸区域)的cDNA序列，然后利用PCR对其进行大量扩增后，将ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列插入所述PmrB-PmrA-PmrC重组序列中PmrB的cDNA序列，替换掉PmrB原来的第34号氨基酸至第64号氨基酸的区域(色氨酸34～谷氨酸64)，从而得到PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列。其中插入了ACE2受体蛋白核心区域cDNA序列的PmrB序列称为PmrB-ACE2序列。

步骤三：将所述PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列插入到pETDuet-1质粒上的LacUV5启动子下游，从而得到包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒；

步骤四：将绿色荧光蛋白GFP的cDNA序列插入到步骤三得到的包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒的PmrC启动子下游，GFP的cDNA序列受PmrC启动子调控，获得包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组序列的pETDut-1质粒。

上述质粒也可以采用先将步骤一中的PmrB-PmrA-PmrC重组序列插入到pETDuet-1质粒上的LacUV5启动子下游，再在PmrB序列中插入ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列的方式合成，具体步骤如下：

步骤二：将所述PmrB-PmrA-PmrC重组序列插入到pETDuet-1质粒上的LacUV5启动子下游；

步骤三：利用基因合成的方式获得ACE2受体蛋白的核心结合区域(ACE2受体蛋白的20号氨基酸到90号氨基酸区域)的cDNA序列，然后利用PCR对其进行大量扩增后，将ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列插入所述步骤二中得到的pETDuet-1质粒上的PmrB-PmrA-PmrC重组序列中PmrB的cDNA序列，替换掉PmrB原来的第34号氨基酸至第64号氨基酸的区域(色氨酸34～谷氨酸64)，从而得到包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒；同样的，其中插入了ACE2受体蛋白核心区域cDNA序列的PmrB序列称为PmrB-ACE2序列。

上述方法中，插入DNA序列的方法可以为酶切-连接方式。

pETDut-1质粒具有抵抗环境中氨苄青霉素的抗性基因，在上述方法中，在步骤三和步骤四进行完毕后，可以分别将获得的包含重组序列(分别为PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列和PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组序列)的pETDut-1质粒转入大肠杆菌BL-21菌株中，并将菌株培养在带有氨苄青霉素的LB培养平板上(LB+AmP)，在获得菌落后，将菌落中的质粒提取出来进行Sanger测序，确保获得的包含重组序列的pETDut-1质粒无任何突变。

为了实现本发明中表达载体的蛋白表达，可以将所述用于新型冠状病毒检测的质粒表达载体转化到微生物细胞中。对于上述的包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP序列的pETDut-1质粒，可将其转入基础菌株，即大肠杆菌(Escherichia)感受态细胞BL-21中，对大肠杆菌进行基因改造，转入方法可采用CaCl₂介导的热刺激法，获得的基因改造后的大肠杆菌菌株记为PmrB-ACE2-GFP菌株。

如前文所述，本发明的微生物转入了包含ACE2蛋白核心结合区域DNA序列和GFP的DNA序列的表达载体(例如上述包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP序列的pETDut-1质粒)，新型冠状病毒蛋白壳上的S蛋白的核心区域与ACE2蛋白核心结合区域的结合可以激活下游GFP蛋白的表达，因此本发明中的微生物，特别是上述经过基因改造后的大肠杆菌PmrB-ACE2-GFP菌株可以应用于新型冠状病毒的检测。

本发明还提出了一种用上述PmrB-ACE2-GFP菌株进行新型冠状病毒检测的方法，具体如下：

将所述用PmrB-ACE2-GFP菌株在新鲜的LB液体培养基中于37℃培养至OD600在0.2以上，然后在培养基中加入待检测样品进行共培养，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白GFP的表达情况，如出现绿色荧光则说明GFP成功表达，待测样品为新型冠状病毒阳性，否则为阴性。

优选的，用于培养大肠杆菌的液体LB培养基包括以下成分：按质量分数计，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％；pH为7.0～7.2。

本发明的利用遗传分子生物工程技术中的基因定向突变构建质粒表达载体，并采用质粒表达载体改造微生物(优选大肠杆菌)，使其能够至少表达人源肺部表皮细胞ACE2受体蛋白的核心结合区域，从而能够特异性结合新型冠状病毒蛋白壳外层的S蛋白、激活GFP的表达，进而可用于新型冠状病毒的检测。

本发明提供的PmrB-ACE2-GFP菌株能够提高新型冠状病毒的检测灵敏度，同时本发明还提供了一种灵敏、节本的、高效的新型冠状病毒体外检测技术，对于我国应对新型冠状病毒的大范围检测与筛查，应对疫情防控具有重要意义。

附图说明

图1为实施例1中的荧光显微镜观察结果：左图为EV+EV(empty vector)组；中图为EV+Detection bacteria组；右图为S Protein+Detection bacteria组。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明中的方案进行进一步说明，实施例不作为对本发明的限定。如果无特殊说明，实施例中的实验操作均采用分子生物学领域成熟的现有技术，所用的原料和试剂等均可通过市购获得。

本实施例中，ACE2受体采用PmrA-PmrB-PmrC表达系统。该系统最早是发现于沙门氏菌(Salmonella)中，PmrB是一段356个氨基酸的跨膜蛋白，第34到64个氨基酸位于细胞膜外，其功能为识别胞外环境中的三价铁离子。当三价铁离子被特异性的识别与结合后，能够引起PmrB构象变化从而激活其携带的组氨酸激酶，造成PmrA的磷酸化。磷酸化的PmrA进一步磷酸化PmrC启动子从而激活下游蛋白的表达。因此，该基于沙门氏菌中的环境因子识别与下游蛋白表达系统可以用于外界分子与蛋白的识别，例如新型冠状病毒的S蛋白。

因此，我们通过基因工程手段将S蛋白与ACE2受体的核心结合区域分别插入到不同的表达载体中，制备能够表达ACE2受体蛋白和GFP的菌株PmrB-ACE2-GFP菌株，并制备S蛋白，用于验证PmrB-ACE2-GFP菌株对于S蛋白的特异性结合和检测效果。本实施例中所用到的引物的组序号和DNA序列如表1所示。

表1实施例所用引物的DNA序列和酶切位点，从左至右为5’-3’

在此发明中，首先使用pETDuet-1质粒来构建PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组蛋白表达系统。具体操作如下：

步骤一：首先通过检索NCBI GenBank查找cDNA序列，利用基因合成的方式获得沙门氏菌的PmrA(SEQ ID NO：1)、PmrB(SEQ ID NO：2)、PmrC(SEQ ID NO：3)的cDNA序列，并将这些cDNA序列通过PCR技术大量扩增出来(PmrA、PmrB、PmrC分别使用表1中的第2、1、3组引物)，利用overlapping PCR技术将所述PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列按PmrB-PmrA-PmrC的顺序整合成一段完整的cDNA序列(分别使用表1中第1组中的FWD引物和第3组中的REV引物)，TAA终止密码子通过PCR的方式加入到其中PmrA序列后面，形成PmrB-PmrA-PmrC重组序列。

步骤二：与步骤一相类似的，采用基因合成的方式获得ACE2受体蛋白的核心结合区域(ACE2受体蛋白的20号氨基酸到90号氨基酸)的cDNA序列(SEQ ID NO：4)，然后利用PCR对其进行大量扩增，同时加入PmrB插入位点的上下游同源臂引物(使用表1中的第4组引物)。利用overlapping PCR技术将PmrB-PmrA-PmrC重组序列中的PmrB与ACE2受体蛋白核心结合区域片段进行链接(分别使用表1中第1组引物中的FWD和第3组引物中的REV)，将ACE2蛋白核心结合区域的cDNA序列插入PmrB-PmrA-PmrC重组序列中的PmrB序列。ACE2蛋白核心结合区域插入的位置能够替换掉原来的第34号氨基酸至第64号氨基酸的区域(色氨酸34～谷氨酸64)，从而得到PmrB-ACE2-PmrA-PmrB重组序列。其中ACE2蛋白核心结合区域序列插入PmrB序列后形成的PmrB-ACE2序列见SEQ ID NO：5。

步骤三：利用酶切-连接(酶切采用XbaI和SalI限制性内切酶)的方式将该段PmrB-ACE2-PmrA-PmrB重组cDNA序列插入到pETDuet-1质粒上面，位于LacUV5启动子下游，从而得到包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒。将包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒利用CaCl₂热介导方式转入到大肠杆菌BL-21质粒表达菌株当中，由于pETDuet-1质粒中携带有氨苄青霉素抗性基因，因此转化后的BL-21质粒表达菌株培养在LB+Amp培养基上面，通过Sanger测序的方式确定PmrB-ACE2-PmrA-PmrC DNA序列没有突变(测序使用表1中的第7号引物)。从而获得正确的、携带有PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组DNA序列的重组pETDut-1质粒。在此基因改造过得大肠杆菌中，PmrB-ACE2和PmrA能够同时表达，当环境中存在S蛋白时，能够被插入的ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列识别并结合，激活PmrB蛋白，被激活的PmrB蛋白能够磷酸化PmrA，进而激活PmrC启动子。

步骤四：利用基因合成的方式获得GFP的cDNA序列(SEQ ID NO：6)，采用PCR技术(使用表1中的第5组引物)对其进行大量扩增。将绿色荧光蛋白GFP的cDNA序列利用酶切-连接的方法(酶切采用SalI和HindIII限制性内切酶)插入到步骤三得到的包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒的PmrC启动子下游，使GFP表达受到PmrC启动子调控，获得包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组序列的pETDut-1质粒。由于GFP cDNA被插入到PmrC下游，受该启动子调控，因此，绿色荧光蛋白(GFP)可作为检测环境中S蛋白的报告基因。包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组序列的pETDut-1质粒可以采用和包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒同样的引物和方法进行Sanger测序，确定其中的PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP重组DNA序列没有发生突变。

本领域技术人员可以知晓，在上述步骤二和步骤三，也可以采用先将PmrB-PmrA-PmrC重组序列插入pETDuet-1，再将ACE2蛋白核心结合区域序列插入PmrB的顺序进行。

下一步，构建好的pETDuet-1质粒通过CaCl₂介导的热刺激法转入到大肠杆菌感受态细胞BL-21中，获得PmrB-ACE2-GFP菌株。

下一步，为了得到新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的S蛋白，并验证上述PmrB-ACE2-GFP菌株对于新型冠状病毒S蛋白的检测效果，我们利用pET15b质粒构建S蛋白的核心结合亚基表达系统。首先利用基因合成的方式将S蛋白核心结合亚基位于第333号氨基酸到526号氨基酸之间(苏氨酸333～甘氨酸526)的cDNA(SEQ ID NO：7)合成出来，通过PCR对其进行大量扩增(采用的引物为表1中第6组引物)。该段cDNA序列利用酶切-连接的方式(酶切使用BamHI与NdeI限制性内切酶)插入到pET15b质粒T7启动子下游，pET15b质粒存在6个组氨酸序列，用于S蛋白的亲和层析纯化。

pET5b携带有抵抗环境中氨苄青霉素的抗性基因，将重组后的pET5b质粒转入到大肠杆菌BL-21菌株中，并将菌株培养在带有氨苄青霉素的LB培养平板上(LB+AmP)，在获得菌落后，将菌落中的质粒提取出来进行Sanger测序(使用表1中第8号引物进行测序)，确保包含S蛋白核心结合亚基的pET5b质粒无任何突变。

下一步，将构建好的正确的pET15b质粒通过CaCl₂介导的热刺激法转入到大肠杆菌感受态细胞BL-21中，获得S蛋白表达菌株。将S蛋白表达菌株在LB+Amp平板培养基中培养后提取外排物，纯化后获得S蛋白。对于S蛋白的纯化，我们使用金属螯合亲合层析技术(多聚组氨酸镍离子金属亲和层析技术)。

上述方法中，LB+Amp平板培养基具有以下组成：按质量分数计，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％，氨苄青霉素0.1g/L，琼脂1.5％，pH为7.0～7.2。

下一步，用获得的S蛋白验证S蛋白与ACE2核心结合区域的结合，从而验证采用本实施例中获得的PmrB-ACE2-GFP菌株进行新型冠状病毒检测的有效性：将PmrB-ACE2-GFP菌株在新鲜的LB液体培养基(包括以下成分：按质量分数计，蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠0.5％；培养基的pH为7.0～7.2)中于37℃培养至OD600≥0.2，然后在培养基中加入从S蛋白表达菌株的提取并纯化后的S蛋白进行共培养2个小时，所形成的样品为S Protein+Detection bacteria组，即S蛋白和PmrB-ACE2-GFP菌株共培养后的实验组。

为验证效果，本实施例还设立了在S Protein+Detection bacteria组实验组外的两个对照组：EV+EV(empty vector)组：把S Protein+Detection bacteria实验组中LB液体培养基中的PmrB-ACE2-GFP菌株替换成包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP序列的pETDut-1质粒，液体培养基中加入的S蛋白替换成包含S蛋白核心结合亚基的pET15b质粒，其他保持一致；EV+Detection bacteria组：把S Protein+Detection bacteria实验组中液体培养基中加入的S蛋白替换成包含S蛋白核心结合亚基的pET15b质粒，其他保持一致。采用荧光显微镜观察各组中绿色荧光蛋白的表达情况，如图1所示，只有S Protein+Detection bacteria组这一实验组中的绿色荧光蛋白获得了表达，证明在PmrB-ACE2-GFP菌株中，S蛋白成功与ACE2蛋白核心结合区域相结合，并且激活了下游GFP蛋白的表达，证明本实施例中的大肠杆菌可以用于新型冠状病毒的检测。

序列表

<110> 东北大学

<120> 一种用于新型冠状病毒检测的表达载体、微生物及应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 679

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaagatac tgattgttga agacgacacg ctattattac aggggttaat actcgccgcg 60

caaactgaag gttacgcctg cgatggcgtt tcgacagcac gtgctgccga acatagtctg 120

gagtcaggtc attacagtct gatggtgctg gatttagggt tgcccgatga ggacggcctg 180

cactttctgg cacgggtgcg acagaaaaaa tatactctgc cggtactcat tctgaccgcc 240

cgcgatacgc tcaatgaccg catcaccggg ctggacgtcg gcgcggacga ttacctggtt 300

aaacccttcg ccctggagga gttgcacgcc cgtatccgcg cgctgctgcg ccgccataat 360

aatcagggcg aaagtgaact gacagtcggc aaactgacgc ttaatatggg acggcaccag 420

gtctggatgg acggccagga gctaaccctg acgcctaaag agtacgccct gctgtcacgg 480

ttgatgctca aagcgggcag cccggtacac cgggagattc tgtataacga tatctacaac 540

tgggataacg aaccttcgac caacactctg gaagtgcata ttcataactt gcgcgacaaa 600

gtcggtaaag cgcgcattcg cacggttcgc gggtttggct acatgctggt tgccactgag 660

gaaagctaaa tcgtatgaa 679

<210> 2

<211> 1071

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcgttttc ggcaaagagc gatgaccctt cgccagcgtt taatgctgac aattgggctc 60

attctgctga tattccagtt aatcagcacc ttctggctat ggcatgaaag caccgaacaa 120

atccagctgt tcgagcaggc attgcgggat aatcgcaaca acgatcgcca tatcatgcac 180

gaaattcgcg aagcggtcgc cagtctgatc gtccctggcg tatttatggt tagcctgacg 240

ctgctgattt gctaccaggc ggtacggcgt attacccgcc cgctggccga tctgcaaaaa 300

gagctggaag cacgaacggc agacaatctg gcgccaatcg ctattcacag ctccacactt 360

gagattgagt ccgtcgtctc cgcgctcaat caactggtga cgcgcttgac caccacgctc 420

gacaatgaac gcctttttac cgccgatgta gcccatgagc tacgtacccc actggcgggg 480

gtgcgtttgc atctggagtt attgtcaaaa tcccacaata ttgatgtcgc gccgcttatc 540

gcccgtcttg accagatgat ggatagtgtc tcccaacttc tgcaactggc gcgcgtgggc 600

cagtcattct cttccggtaa ttatcaggaa gtaaaactgc tggaagatgt gattctcccc 660

tcctacgatg agctgaacac catgctggaa acgcgccagc aaacgctatt gctgccggaa 720

agcgcggcgg atgtggtggt acgcggcgac gcgacgttac tgcgtatgct gctgcgaaac 780

ctggtagaaa atgcgcaccg ctacagtccg gaaggaaccc atatcaccct ccatattagc 840

gccgatcccg acgctatcat ggcggtcgaa gacgaggggc caggtattga tgaaagcaaa 900

tgcgggaagt taagcgaggc gtttgtacga atggacagcc gttatggcgg tattgggctg 960

ggactaagca tcgttagccg catcactcaa ctgcatcagg gacagttttt cctgcaaaac 1020

cgtaccggta caacaggcac ccgcgcctgg gtgctgttga aaaaggcata a 1071

<210> 3

<211> 407

<212> DNA

<213> 人工序列( Artificial Sequence)

<400> 3

tcaccctggt gccttatctt tacacctgtg cggcgttact gctgctcgga cacggtcact 60

ttggtaaagc acgcccggca tatctggcag ttactaccat tgccttcctc tactgcatct 120

gggccgtggt ggggtccgga gcgaaagagg ttatgtggtc atttgtcacc ctgatggtca 180

tcaccgccat gtatgcgctg aattacaacc ggctacataa aaacccgtat cccttagatg 240

caccaataag caaagattaa ttccccttaa tccagcaaac ataaaagcca accttaagaa 300

cttaaggttg gcttaatttt gctttgcgag catatgcgca ctttgttcga tggaaacacc 360

gtggtacccg gggatcctct ataattaaag aggagaaatt aagctaa 407

<210> 4

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tccaccattg aggaacaggc caagacattt ttggacaagt ttaaccacga agccgaagac 60

ctgttctatc aaagttcact tgcttcttgg aattataaca ccaatattac tgaagagaat 120

gtccaaaaca tgaataacgc tggggacaaa tggtctgcct ttttaaagga acagtccaca 180

cttgcccaaa tgtatccact acaagaaatt cagaatctca cagtc 225

<210> 5

<211> 1203

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgcgttttc ggcaaagagc gatgaccctt cgccagcgtt taatgctgac aattgggctc 60

attctgctga tattccagtt aatcagcacc ttctggctat ccaccattga ggaacaggcc 120

aagacatttt tggacaagtt taaccacgaa gccgaagacc tgttctatca aagttcactt 180

gcttcttgga attataacac caatattact gaagagaatg tccaaaacat gaataacgct 240

ggggacaaat ggtctgcctt tttaaaggaa cagtccacac ttgcccaaat gtatccacta 300

caagaaattc agaatctcac agtcgcggtc gccagtctga tcgtccctgg cgtatttatg 360

gttagcctga cgctgctgat ttgctaccag gcggtacggc gtattacccg cccgctggcc 420

gatctgcaaa aagagctgga agcacgaacg gcagacaatc tggcgccaat cgctattcac 480

agctccacac ttgagattga gtccgtcgtc tccgcgctca atcaactggt gacgcgcttg 540

accaccacgc tcgacaatga acgccttttt accgccgatg tagcccatga gctacgtacc 600

ccactggcgg gggtgcgttt gcatctggag ttattgtcaa aatcccacaa tattgatgtc 660

gcgccgctta tcgcccgtct tgaccagatg atggatagtg tctcccaact tctgcaactg 720

gcgcgcgtgg gccagtcatt ctcttccggt aattatcagg aagtaaaact gctggaagat 780

gtgattctcc cctcctacga tgagctgaac accatgctgg aaacgcgcca gcaaacgcta 840

ttgctgccgg aaagcgcggc ggatgtggtg gtacgcggcg acgcgacgtt actgcgtatg 900

ctgctgcgaa acctggtaga aaatgcgcac cgctacagtc cggaaggaac ccatatcacc 960

ctccatatta gcgccgatcc cgacgctatc atggcggtcg aagacgaggg gccaggtatt 1020

gatgaaagca aatgcgggaa gttaagcgag gcgtttgtac gaatggacag ccgttatggc 1080

ggtattgggc tgggactaag catcgttagc cgcatcactc aactgcatca gggacagttt 1140

ttcctgcaaa accgtaccgg tacaacaggc acccgcgcct gggtgctgtt gaaaaaggca 1200

taa 1203

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 7

<211> 582

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

acaaacttgt gcccttttgg tgaagttttt aacgccacca gatttgcatc tgtttatgct 60

tggaacagga agagaatcag caactgtgtt gctgattatt ctgtcctata taattccgca 120

tcattttcca cttttaagtg ttatggagtg tctcctacta aattaaatga tctctgcttt 180

actaatgtct atgcagattc atttgtaatt agaggtgatg aagtcagaca aatcgctcca 240

gggcaaactg gaaagattgc tgattataat tataaattac cagatgattt tacaggctgc 300

gttatagctt ggaattctaa caatcttgat tctaaggttg gtggtaatta taattacctg 360

tatagattgt ttaggaagtc taatctcaaa ccttttgaga gagatatttc aactgaaatc 420

tatcaggccg gtagcacacc ttgtaatggt gttgaaggtt ttaattgtta ctttccttta 480

caatcatatg gtttccaacc cactaatggt gttggttacc aaccatacag agtagtagta 540

ctttcttttg aacttctaca tgcaccagca actgtttgtg ga 582

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 8

nnnntctaga atgcgttttc ggcaaagagc 30

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tgcctttttc aacagcaccc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgaagatac tgattgttga 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttcatacgat ttagctttcc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcaccctggt gccttatctt 20

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 13

nnnngagctc gcttaatttc tcctctttaa 30

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gttaatcagc acttctggct atccaccatt gaggaacagg c 41

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccagggacg atcagactgg cgaccgcgac tgtgagattc tgaattt 47

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 16

nnnngtcgac atggtgagca agggcgagg 29

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 17

nnnnaagctt cttgtacagc tcgtccatgc cg 32

<210> 18

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 18

nnnncatatg acaaacttgt gcccttttgg tgaagt 36

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (1)..(4)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 19

nnnnggatcc tccacaaaca gttgctggtg cat 33

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgaaacaagc gctcatgagc 20

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

attaatacga ctcactatag g 21

Claims

1.一种用于新型冠状病毒检测的表达载体，其特征在于，所述用于新型冠状病毒检测的表达载体为质粒表达载体，所述质粒表达载体整合有人类肺上皮细胞ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列和表达绿色荧光蛋白GFP的DNA序列，所述ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列为20号氨基酸到90号氨基酸区域；所述ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列和绿色荧光蛋白GFP的DNA序列受表达载体上游启动子调控，所述绿色荧光蛋白GFP的DNA序列处于ACE2蛋白的核心结合区域DNA序列的下游；

所述用于新型冠状病毒检测的表达载体的构建方法包括以下步骤：

步骤一：利用基因合成的方式获得沙门氏菌的PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列，通过PCR技术扩增所述PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列，利用overlapping PCR技术将所述PmrA、PmrB、PmrC的cDNA序列按PmrB-PmrA-PmrC的顺序整合成一段完整的cDNA序列，将TAA终止密码子通过PCR的方式加入到所述完整的cDNA序列的PmrA序列后面，形成PmrB-PmrA-PmrC重组序列；

步骤二：利用基因合成的方式获得ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列，然后利用PCR对其进行扩增后，将ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列插入所述PmrB-PmrA-PmrC重组序列中PmrB的cDNA序列，替换掉PmrB原来的第34号氨基酸至第64号氨基酸的区域，从而得到PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列；

步骤三：将所述PmrB-ACE2-PmrA-PmrC重组序列插入到pETDuet-1质粒上的LacUV5启动子下游，从而得到包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒；

步骤四：将绿色荧光蛋白GFP的cDNA序列插入到步骤三得到的包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒的PmrC启动子下游，GFP的cDNA序列受PmrC启动子调控，获得包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC-GFP重组序列的pETDut-1质粒；

或者包括以下步骤：

步骤二：将所述PmrB -PmrA-PmrC重组序列插入到pETDuet-1质粒上的LacUV5启动子下游；

步骤三：利用基因合成的方式获得ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列，然后利用PCR对其进行扩增后，将ACE2受体蛋白的核心结合区域的cDNA序列插入所述步骤二得到的pETDuet-1质粒上的PmrB-PmrA-PmrC重组序列中PmrB的cDNA序列，替换掉PmrB原来的第34号氨基酸至第64号氨基酸的区域，从而得到包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒；

步骤四：将绿色荧光蛋白GFP的cDNA序列插入到步骤三得到的包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC重组序列的pETDut-1质粒的PmrC启动子下游，GFP的cDNA序列受PmrC启动子调控，获得包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC-GFP重组序列的pETDut-1质粒。

2.权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

或者包括以下步骤：

3.一种用于新型冠状病毒检测的微生物，其特征在于，转入了如权利要求1所述的用于新型冠状病毒检测的表达载体。

4.根据权利要求3所述的用于新型冠状病毒检测的微生物，其特征在于，采用以下方法制备：将如权利要求1中所述的包含PmrB-ACE2-PmrA-PmrC-GFP序列的pETDut-1质粒通过CaCl₂介导的热刺激法转入大肠杆菌的感受态细胞BL-21中，获得的菌株记为PmrB-ACE2-GFP菌株。

5.权利要求3所述的用于新型冠状病毒检测的微生物的制备方法，其特征在于，将如权利要求1中所述的包含PmrB-ACE2- PmrA-PmrC-GFP序列的pETDut-1质粒通过CaCl₂介导的热刺激法转入大肠杆菌的感受态细胞BL-21中，获得的菌株记为PmrB-ACE2-GFP菌株。

6.权利要求1所述用于新型冠状病毒检测的表达载体或权利要求3或4所述的用于新型冠状病毒检测的微生物在制备新型冠状病毒检测试剂盒中的应用。