CN112779240B

CN112779240B - Crispr家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途

Info

Publication number: CN112779240B
Application number: CN202011250901.8A
Authority: CN
Inventors: 刘涛; 凌鑫宇; 高小芹
Original assignee: Beijing Huida Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Huida Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-11-11
Filing date: 2020-11-11
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2040-11-11
Also published as: CN112779240A; WO2021093752A1

Abstract

本发明公开了CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途；所述定点偶联方法包括将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变，然后，再与核酸进行偶联；其中，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。本发明定点突变的CRISPR家族蛋白及其偶联物，及其提高基因切割、基因编辑效率及碱基编辑效率等方面的应用。

Description

CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途

技术领域

本申请属于但不限于生物医药领域，具体涉及CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途。

背景技术

CRISPR是细菌及古细菌中的依赖于RNA的后天免疫防御机制，该机制可以很有效的帮助细菌抵御外界如噬菌体等DNA的侵入，在特定位点高效准确切割外源基因，防止外源基因在体内扩增。细菌利用这种机制阻止病毒的感染，以此实现对自身的保护。SpCas9及AsCas12a分别来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和氨基酸球菌属(Acidaminococcus BV3L6)，是CRISPR系统的功能行使者。crRNA通过与靶DNA形成碱基配对，将Cas9或者Cas12a引导至靶区附近，并使之构象发生变化，成为具有DNA切割活性的核糖核蛋白复合体(RNP)，活化的Cas9或者Cas12a可以切割靶DNA，使之形成双链缺口(doublestrand break，DSB)。DNA双链缺口对于细胞而言非常致命，因而细胞会快速启动相应的修复机制，主要包括两种修复途径：非同源性末端结合(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组修复(Homologous directed repair，HDR)，前者由于不需要修复模板、响应速度快而被细胞广泛的应用于DNA损伤修复，因而引入缺失或者插入；HDR需要修复模板、且在细胞处于一定分裂周期时才可以启动该修复途径，从而完成DNA双链缺口的精确修复。科学家利用CRISPR系统所产生的DNA双链缺口并在模板DNA的指引下，完成对基因的正确编辑。自该系统被发现以来，因其高效、简捷、稳定的编辑效率，而广泛地被应用于畜牧业及农业的基因改造，有效提高了家畜和经济作物的产量与质量；在医疗健康方面，不仅为人类疾病尤其是遗传病的治愈带来希望，同时其广泛应用也促进了基础科研、基础医学及临床治疗的发展。

随着生物制药技术的发展与更新迭代，蛋白质的随机修饰由于批次生产的不均一性，质量可控性较差等原因逐渐被淘汰，定点修饰的蛋白质药物由于性质均一且可控，已成为现今生物技术制药的研发热点和发展方向。目前常见的蛋白质定点修饰技术主要为以下几类：一、依赖于酶促反应的转肽酶及内含肽技术可实现在蛋白质上特定序列上的定点修饰；二、依赖于糖基化修饰的基于糖基转移酶的定点标记技术，在蛋白上通过融合小蛋白或标签如Aldehyde Tag等实现定点标记；三、依赖于蛋白酶对特定序列的生物素标记。但这些标记均需要特定的序列，因而只能在目的蛋白N/C端添加这种特定序列，对于酶及许多蛋白很容易影响其稳定性和功能，可供选择的空间较小，不适用于对于Cas9及Cas12a的修饰。

当前CRISPR技术已经成功的应用于畜牧业及农业的基因改造以及生物医药如基因疾病的治疗，然而该技术却仍存在一些问题，比如：面对SpCas9在基因编辑中同源重组效率低，有文章报道指出，提高双链缺口处供体DNA的浓度会有利于提高基因编辑的效率(Ma,M.,Zhuang,F.,Hu,X.,Wang,B.,Wen,X.Z.,Ji,J.F.,and Xi,J.J.(2017).Efficientgeneration of mice carrying homozygous double-floxp alleles using the Cas9-Avidin/Biotin-donor DNA system.Cell research 27,578-581.)。因而科学家利用融合蛋白与其配体之间的亲和力，使供体DNA与Cas9蛋白紧密相连，因而在发生切割后，可以快速到达DSB处，指导同源重组修复的完成(Carlson-Stevermer,J.,Abdeen,A.A.,Kohlenberg,L.,Goedland,M.,Molugu,K.,Lou,M.,and Saha,K.(2017).Assembly ofCRISPR ribonucleoproteins with biotinylated oligonucleotides via an RNAaptamer for precise gene editing.Nature communications 8,1711.；Hemphill,J.,Borchardt,E.K.,Brown,K.,Asokan,A.,and Deiters,A.(2015).Optical Control ofCRISPR/Cas9 Gene Editing.Journal of the American Chemical Society137,5642-5645.；Savic,N.,Ringnalda,F.C.,Lindsay,H.,Berk,C.,Bargsten,K.,Li,Y.,Neri,D.,Robinson,M.D.,Ciaudo,C.,Hall,J.,et al.(2018).Covalent linkage of the DNArepair template to the CRISPR-Cas9 nuclease enhances homology-directedrepair.eLife 7.)。虽然这几种方案确实使同源重组修复效率得以提升，但是，在Cas9蛋白上融合一个蛋白会使转染难度增加，影响有效被递送至细胞内的RNP复合物；在一段较长的供体DNA上标记化学修饰，也大大增加了合成成本并极大限制了其广泛应用。以上科学研究尚不能有效而广泛的解决这一根本问题。又例如，AsCas12a因为与Cas9拥有不同的PAM识别区，以及切割后产生的粘性末端更利于发生同源重组，在基因编辑领域也得到了广泛重视。但是其递送至细胞后的切割效率极其低下，推测与AsCas12a与其crRNA的亲和力较低，在递送过程中发生解离，有效被递送至靶区DNA的RNP太少，因而切割效率低下。此外，单碱基基因编辑技术由于其不需要在细胞中产生双链断裂就可以实现基因单位点的碱基修复受到人们的广泛关注，但目前碱基编辑仍存在编辑位点窗口较大，无法实现精准编辑，编辑效率较低等问题限制其在生物医药领域的应用。当前CRISPR技术虽然在多个领域已经取得了较好的应用成果，然而仍存在诸如上述的同源重组效率和切割效率不足所引起的问题，因而本领域迫切需要提供解决这些问题的方案。

发明内容

以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。

鉴于以上迫切需要解决的问题，本发明人研发了一种将CRISPR家族蛋白定点与核酸通过化学共价键偶联的方式，将蛋白与核酸作为一个整体递送至细胞内发挥其基因编辑功能。本申请通过将CRISPR家族蛋白与供体DNA共价偶联后，CRISPR蛋白在gRNA的引导下到达靶DNA位置进行切割，而蛋白上偶联的供体DNA可以在切割完成后，在同源重组修复蛋白酶的作用下，完成正确的修复。又如Cas12a体内切割效率低的问题，通过提高Cas12a蛋白与crRNA亲和力，提高靶DNA附近有效RNP复合物浓度提高切割效率同时可以提高碱基编辑效率，从而解决现有技术中精准基因编辑效率低下的问题。

本发明人利用多特异性甲烷球菌的TyrRS(MjPolyRS)/tRNA^CUA，PylRS或者LeuRS的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到蛋白质中，从而得到定点突变的CRISPR蛋白。同时，通过基因密码子扩展技术，在CRISPR家族蛋白定点引入含有生物正交反应基团如叠氮、炔基、醛基、酮基、环丙烯四嗪等结构的非天然氨基酸，通过点击化学反应与相应的修饰的核酸偶联，来解决CRIPSR家族蛋白在基因编辑应用中所存在的一些问题。

本申请提供了一种CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法，首先将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变，然后，再与核酸进行偶联；其中，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。

另一方面，本申请还提供了非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白；其中，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。

第三方面，本申请还提供了CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，其中，所述CRISPR家族蛋白为非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，而且，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性。

第四方面，本申请还提供了上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸的定点偶联物的制备方法，以及所述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白相应的核酸序列及其载体、宿主表达细胞。

第五方面，本申请提供了上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸的定点偶联物的用途。

在本申请的实施方案中，本申请提供了一种将CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法，所述方法包括：

(a)将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变；

(b)将步骤(a)得到的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白与核酸进行偶联，从而得到CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物；

其中，所述的非天然氨基酸具有正交化学反应活性，这里，所述的正交化学反应活性是指但不限于所述非天然氨基酸包含叠氮、炔基、醛基、酮基、四嗪或环丙烯等基团。

在本申请的实施方案中，所述CRISPR家族蛋白包括但不限于不同种属来源的Cas9蛋白、Cas12a蛋白、CasX蛋白、Casφ蛋白、Cas12g蛋白、或其相关不具有切割活性但保留结合活性的失活的同种蛋白(例如dCas9蛋白，dCas12a蛋白，或ddCas12a蛋白等)；这里，所述Cas9蛋白可以是来源自Streptococcus pyogenes strain SF370的SpCas9、来源自Staphylococcus aureus的SauCas9、来源自Neisseria meningitidis的NmeCas9、或者来源自S.thermophilus 1的St1Cas9。所述Cas12a蛋白可以选自来源自Francisella novicidaU112的FnCas12a、来源自细菌毛螺菌科(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCas12a、来源自氨基酸球菌Acidaminococcus sp.BV3L6的AsCas12a、或来源自Moraxellabovoculi 237的MbCas12a。所述CasX蛋白可以是来源自Deltaproteobacteria CasX的DpbCasX、或来源自Planctomycetes CasX的PlmCasX。优选地，所述CRISPR家族蛋白为Cas9蛋白或Cas12a蛋白，优选地，为SpCas9或AsCas12a。在本申请中，Cas12a与Cpf1是互换的关系。

在本申请的一些实施方案中，所述非天然氨基酸可以选自下列化合物中的一种：

-pAcF

-AeF

-NAEK

-p-AzF

-o-AzbK

-AzK

-ACPK

-PrpF

-PrpK

-CpOK

-TetF

-Tet1

-Tet2

-Tet3

优选地为pAcF、AeF、PrpF、NAEK或TetF。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白；其中，所述的非天然氨基酸带有叠氮、炔基、醛基、酮基、环丙烯或四嗪等基团；

可选地，在SpCas9上为以下位点突变：SEQ ID NO.1的第K3位，D39位，H41位，H116位，D576位，E945位，K1151位，G1367位中的一个或多个位点；

在AsCas12a上为以下位点突变：SEQ ID NO.3的第M806位，L834,S835,K860,K1086位中的一个或多个位点。

在本申请的实例中，本申请提供了非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白；其中，所述的非天然氨基酸优选地为pAcF、AeF、PrpF、NAEK或TetF；

在SpCas9上为以下位点突变：SEQ ID NO.1的第K3位，D39位，H41位，H116位，D576位，E945位，K1151位，G1367位中的一个或多个位点。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，其中，与野生型的CRISPR家族蛋白区别在于，将SEQ ID NO.1及NO.3中所示的序列的第N位氨基酸被突变为AeF，所述突变氨基酸残基与野生型蛋白序列的连接方式如下所示：

从R₁到R₂为所述蛋白的氨基酸序列由N端到C端，其中第N位氨基酸为所选的位点，包括SpCas9的第3位，39位，41位，116位，576位，945位，1151位，1367位氨基酸中的一个；或者AsCas12a的806位，834位，835位，860位，1086位氨基酸中的一个；R₁为第N-1位氨基残基，R₂为第N+1位氨基残基。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，其中，与野生型的CRISPR家族蛋白区别在于，将SEQ ID NO.1及NO.3中所示的序列的第N位氨基酸被突变为NAEK，所述突变氨基酸残基与野生型蛋白序列的连接方式如下所示：

从R₁到R₂为所述蛋白的氨基酸序列由N端到C端，其中第N位氨基酸为所选的位点，包括SpCas9的第3位，39位，41位，116位，576位，945位，1151位和1367位氨基酸中的一个；或者AsCas12a的806位，834位，835位，860位，1086位氨基酸中的一个；R₁为第N-1位氨基残基，R₂为第N+1位氨基残基。

在本申请的实施方案中，SpCas9分子量为158.46kDa，由1368个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码SpCas9的碱基序列为SEQ ID NO.2；AsCas12a分子量为143.56kDa，由1227个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.3；编码AsCas12a的碱基序列为SEQ ID NO.4，AsCas12-BE分子量为188.78kDa，由1638个氨基酸残基组成，其氨基酸序列为SEQ ID NO.6；编码AsCas12-BE的碱基序列为SEQ ID NO.7。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，其中，所述CRISPR家族蛋白为上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，而且，所述的非天然氨基酸带有叠氮、炔基、醛基、酮基、环丙烯或四嗪等基团；

这里，所述核酸带有DBCO(双苯环辛炔)或下列Nor、BCN、TCO或sTCO基团：

所述非天然氨基酸与上述核酸进行正交化学反应，从而得到CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物。

在本申请的一些实例中，本申请提供了CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，其中，所述定点突变的CRISPR家族蛋白，与DBCO修饰的核酸以如下的连接方式偶联：

这里，R₃为不同序列的DNA或者RNA；

在本申请的一些实施方案中，所述CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物中核酸可以是oligo DNA、供体DNA、或crRNA及其相关修饰核酸。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸的定点偶联物的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

(1)位点选择：根据所述CRISPR家族蛋白例如SpCas9或者AsCas12a的结构信息，在所述CRISPR家族蛋白氨基酸序列中选择一个或者多个特定的氨基酸位点；

(2)基因突变：将编码步骤(1)中所选择位点的氨基酸的密码子利用基因工程方法突变为密码子TAG，得到突变的CRISPR蛋白基因；

(3)表达载体构建：将步骤(2)通过基因工程得到的突变的CRISPR蛋白基因通过分子克隆的方式与表达质粒相连接，得到含突变序列的突变型表达载体质粒；

(4)蛋白表达：将(3)得到的突变型表达载体质粒与非天然氨基酸工具质粒(例如pUltra-MjPolyRS质粒)共同转染到相同的宿主细胞中，在转染成功后的宿主细胞培养液中添加含有非天然氨基酸例如pAcF、AeF或者NAEK的条件下培养，并诱导宿主细胞表达突变蛋白；

这里，所述非天然氨基酸工具质粒含有tRNA及氨酰-tRNA合成酶，可以特异性识别TAG，并在该密码子对应的位置插入非天然氨基酸例如AeF或者NAEK。

在本申请的一些实施方案中，所述制备方法可以进一步包括：

对于能够表达突变蛋白的宿主，对CRISPR蛋白进行表达产量的评估及活性检测，对于能保留野生型80％以上产量及活性的突变体设定为定点改良候选对象。

在本申请的一些实施方案中，所述制备方法还可以包括：

表达满足上述条件要求的突变蛋白，并对其产物进行进一步的纯化；

对于含有非天然氨基酸的CRISPR家族蛋白进行活性检测。

在本申请的一些实例中，所述制备方法还可以包括：

对含有非天然氨基酸的SpCas9蛋白，加入DBCO修饰的单链供体DNA，使蛋白上的叠氮基团与DNA上的DBCO发生点击化学反应，之后检测其体外及体内活性；

对含有非天然氨基酸的SpCas9蛋白，加入DBCO修饰的adaptor-DNA，制备形成稳定的蛋白核酸接头复合物，之后检测其体外及体内活性；

对于不影响SpCas9活性的突变体，加入与adaptor部分碱基配对的供体DNA，使之组合形成RNP-adaptor-供体DNA复合物，并转染到体内。相比野生型，得到提高同源重组修复效率的SpCas9-ssODN复合物。

在本申请的一些实例中，所述制备方法还可以包括：

对含有非天然氨基酸的AsCas12a蛋白，加入DBCO修饰的crRNA，蛋白与crRNA先通过亲和力，形成正确的结合构象之后，靠近DBCO修饰的含有叠氮基团的非天然氨基酸通过邻近效应发生点击化学反应，使二者形成共价RNP复合物，之后检测其体外活性；

对于不影响AsCas12a活性的突变体，转染到体内；相比野生型，得到提高基因切割效率的AsCas12a突变体蛋白为改良的AsCas12a蛋白。

在上述的实例中，所述DBCO修饰的adaptor DNA可以为针对任意靶区DNA的核酸序列，长度约为18-30碱基，与对应供体DNA同源臂互补配对，通过化学反应对其3’端进行DBCO修饰。

在上述的实例中，所述供体DNA与所述adaptor DNA在其5’端通过碱基互补配对可以被招募。

在上述的实例中，所述DBCO修饰的crRNA及改良型crRNA可以为针对任意靶区DNA的核酸序列，对其5’端进行DBCO修饰。

在本申请的一些实施方案中，本申请提供了编码上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白相应的核酸序列，其中，例如编码SpCas9的碱基序列为SEQ ID NO.2，该碱基序列中对应于突变氨基酸的密码子为TAG、TAA或TGA，优选地，为TAG；例如编码AsCas12a的碱基序列为SEQ ID NO.4，该碱基序列中对应于突变氨基酸的密码子为TAG、TAA或TGA，优选地，为TAG。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了用于制备上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸偶联物的载体，该载体包含上述编码上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白相应的核酸序列。

在本申请的一些实例中，所述用于制备上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸偶联物的质粒，包括但不限于pET28a-Cas9-K3、pET28a-Cas9-D39、pET28a-Cas9-H116、pET28a-Cas9-H41、pET28a-Cas9-D576、pET28a-Cas9-E945、pET28a-Cas9-K1151或pET28a-Cas9-G1367；pET22b-Cas12a-M806,pET22b-Cas12a-K1086。

在本申请的一些实施方案中，本申请还提供了用于制备上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸偶联物的宿主细胞，所述宿主细胞包含上述的辅助质粒与非天然氨基酸工具质粒，这里，所述辅助质粒为表达(tRNA^tyr)和氨酰-tRNA合成酶的质粒；可选地，所述宿主细胞为真核宿主细胞或者原核宿主细胞。

在本申请的实施方案中，本申请提供了上述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白或其与核酸的定点偶联物的用途，包括但不限于如在体外及体内提高基因编辑效率，提高同源重组效率，提高碱基编辑效率，以及在小鼠胚胎干细胞中提高基因编辑效率的应用。

本发明在CRISPR家族蛋白引入非天然氨基酸，由于这种非天然氨基酸的存在，通过点击化学反应可以使化学修饰的核酸定点锚定在蛋白定点修饰的非天然氨基酸上，而不会锚定在其他位置。这对于保证该家族蛋白功能的完整性至关重要。

具体地，在本发明的一个具体的实施案例中，提供了引入非天然氨基酸的CRISPR家族蛋白，主要通过两个步骤：

1)构建含有在选定氨基酸位点被突变为TAG的编码CRIPSR家族蛋白的载体；

2)需要非天然氨基酸工具质粒，将步骤1)构建的质粒与该质粒正在合适的宿主菌中共表达，且在培养基中添加需要的非天然氨基酸，可获得引入非天然氨基酸的CRISPR家族蛋白。

在本发明的一个具体的实施案例中，通过将带有琥珀密码子TAG的SpCas9或者AsCas12a基因插入到载体(pET28a-Cas9质粒，pET22b-Cas12a质粒,pET22b-Cas12a-BE质粒)中，将所述的表达质粒与非天然氨基酸工具质粒一起转化到大肠杆菌工程菌，即可通过在培养液中添加非天然氨基酸如pAcF、AeF或者NAEK获得定点突变的SpCas9或者AsCas12a蛋白。

在本发明的一个具体实施方案中，本发明提供了一种定点引入含有叠氮基团非天然氨基酸的SpCas9蛋白，该定点突变的蛋白可以与DBCO修饰的oligo DNA发生点击化学反应，将oligo-DNA锚定在SpCas9蛋白的特定位置。该DNA可以通过碱基互补配对招募供体DNA到Cas9附近，形成RNP-oligo DNA-供体DNA复合物，从而在递送过程中，可以提高DSB附近供体DNA浓度，可以提高体内同源重组修复效率。

在本发明中的一个实施案例中，本发明提供了一种定点引入含有叠氮基团非天然氨基酸的AsCas12a蛋白，该定点突变蛋白上的叠氮基团可以与DBCO修饰的crRNA发生点击化学反应，将crRNA锚定在AsCas12a蛋白上，形成RNP复合物，在递送过程中，不会因为二者的解离造成靶区DNA的RNP浓度不够，可以实现提高体内切割效率，同源重组效率及碱基编辑效率。

在本发明中提供了一种可在大肠杆菌中重组表达的，定点引入非天然氨基酸的突变的CRISPR家族蛋白，并且这种定点突变的引入并不影响该家族蛋白的体外及体内功能。同时，偶联oligo DNA并招募供体DNA的SpCas9蛋白在体内体外的切割活性均不受影响；偶联crRNA的AsCas12a在体外的切割活性不受影响，在递送至细胞时，切割效率，同源重组效率及碱基编辑效率得以提升。

本发明提供了定点共价锚定核酸的一种方法，该方法通过利用生物正交反应，在蛋白定点引入可反应基团，在核酸上进行化学修饰，二者通过生物正交反应而共价偶联，这些生物正交反应，包括但不局限于叠氮与DBCO的1,3-偶极环加成反应(又称无铜点击化学)，四嗪与环状烯烃或环状炔烃的狄尔斯-阿尔德反应。

在本申请中，采用的基因密码子扩展技术可以参见Peter Schultz教授于2001年提出的在蛋白质中插入人工合成的非天然氨基酸的技术。自然界中所有的蛋白都是由61个密码子编码20种氨基酸组成，其中TAG、TAA和TGA三个终止密码子执行蛋白翻译的终止。该技术的关键则是改变TGA及TAG的生物功能，将人工合成的具有特殊物理和化学特性的“人造氨基酸”插入到任何选定蛋白的任何选定位点。借住这些人造氨基酸可以将功能各异、具有特殊化学、物理或者生物活性官能团定点引入到蛋白质之中，例如，羰基、炔基和叠氮基团等特殊化学基团，这些基团能够有效地且选择性地形成共价键，更加有利于蛋白质的定点特异性修饰，从而改善蛋白的性质或者增加蛋白质的功能。到目前为止，该技术已经成功的将几十种非天然氨基酸定点表达在活细胞蛋白质中，赋予了这些蛋白质新的物理、化学、生理性质。这种定点修饰既不同于随机修饰的无质控标准，也不同于上述三种定点修饰，需要在被修饰蛋白上添加特定氨基酸序列。

关于“生物正交反应”的概念参见：Hang,H.C.,Yu,C.,Kato,D.L.,and Bertozzi,C.R.(2003).A metabolic labeling approach toward proteomic analysis of mucin-type O-linked glycosylation.Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 100,14846-14851.。该反应是指能在生物系统中发生而且不干扰内源性生物化学过程的化学反应。相对于传统的标记方式，如荧光蛋白标记，以化学小分子作为标记物好处在于他们更容易进入细胞，且具备高选择性。生物正交反应使得对生物体内的生物分子(如糖类、蛋白质和脂类)的实时研究成为可能。经过十多年的努力，一系列生物正交反应被广泛应用于细胞标记、抗体修饰、高通量测序、蛋白质组学等领域。目前已发展了大量满足生物正交性的化学偶联策略，如叠氮化合物与环炔烃的1,3-偶极环加成反应(又称无铜点击化学)(Baskin,J.M.,Prescher,J.A.,Laughlin,S.T.,Agard,N.J.,Chang,P.V.,Miller,I.A.,Lo,A.,Codelli,J.A.,and Bertozzi,C.R.(2007).Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.Proceedings of theNational Academy of Sciences 104,16793-16797.)、硝酮与环炔烃的反应(Ning,X.,Temming,R.P.,Dommerholt,J.,Guo,J.,Ania,D.B.,Debets,M.F.,Wolfert,M.A.,Boons,G.-J.,and van Delft,F.L.(2010).Protein Modification by Strain-PromotedAlkyne-Nitrone Cycloaddition.Angewandte Chemie International Edition 49,3065-3068.)、醛或酮形成肟或腙的反应、四嗪与环状烯烃或环状炔烃的狄尔斯-阿尔德反应(Blackman,M.L.,Royzen,M.,and Fox,J.M.(2008).Tetrazine Ligation:FastBioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels-AlderReactivity.Journal of the American Chemical Society 130,13518-13519.)、基于异氰化物的点击反应(

H.,Neves,A.A.,Stairs,S.,Brindle,K.M.,and Leeper,F.J.(2011).Exploring isonitrile-based click chemistry for ligation withbiomolecules.Organic&biomolecular chemistry 9.)，以及四环烷偶联反应(Sletten,E.M.,and Bertozzi,C.R.(2011).A Bioorthogonal Quadricyclane Ligation.Journalof the American Chemical Society 133,17570-17573.)。上述文献全部内容引入本申请中作为参考。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。

附图说明

附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。

图1：非天然氨基酸AeF在SpCas9-G1367的表达与镍柱亲和层析纯化。

图2：SpCas9-G1367-AeF蛋白经过镍柱纯化后，进一步通过阳离子交换纯化。其中左图箭头所指的为梯度盐浓度条件下洗脱的SpCas9-G1367-AeF蛋白；右图为箭头所收集的蛋白组分用于SDS-PAGE鉴定。

图3：经过离子交换后的SpCas9-G1367-AeF再经分子筛纯化。其中左图箭头所指的为单体的SpCas9-G1367-AeF蛋白；右图为箭头所收集的蛋白组分用于SDS-PAGE鉴定，可见该蛋白纯度在95％以上。

图4：SpCas9-G1367-AeF体外切割效率的评价。对照代表未切割的模板DNA，SpCas9-WT为野生型蛋白与gRNA，G1367-AeF为SpCas9-G1367-AeF蛋白与gRNA。其中黑线所指为RNP切割后的所形成的2条DNA。根据结果可看到，SpCas9-G1367-AeF蛋白的体外活性与野生型基本没有差别。

图5：SpCas9-G1367-AeF蛋白与DBCO修饰的DNA反应条件的摸索。泳道1-4的反应时间分别为0h，1h，2h，3h。可以看到在3小时的时候，点击化学反应基本上100％完成。

图6：偶联oligo DNA的SpCas9-G1367-AeF，SpCas9-K1151-AeF的体外活性评价。

图7：偶联crRNA的AsCas12a-M806-AeF的体外活性评价。

图8：偶联oligo DNA的SpCas9-G1367-AeF体内活性评价。其中对照代表未处理组，G1367-AeF代表SpCas9-G1367-AeF蛋白与gRNA转染进入细胞，G1367-AeF-NH₂-oligo,代表SpCas9-G1367-AeF蛋白与gRNA形成RNP后，加入NH₂修饰的oligo DNA及供体DNA。G1367-AeF-DBCO-oligo,代表SpCas9-G1367-AeF蛋白与gRNA形成RNP后，加入DBCO修饰的oligoDNA及供体DNA。

图9：偶联crRNA的AsCas12a-M806-AeF的体内活性评价。

图10：共价偶联oligo DNA的RNP与供体DNA孵育后对基因切割效率的影响。

图11：共价偶联crRNA的Cas12a的RNP后对精准敲入短片段实现精准基因修复的影响。根据结果可以看到偶联组复合物可以显著提高编辑效率。

图12：构建含有dAsCas12a的碱基编辑系统如图A所示，靶向编辑区域用红色标出，图B显示为共价偶联crRNA的Cas12a的RNP后，能够实现定点碱基编辑效率的有效提升。

具体实施方式

为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。

实施例所用试剂包括如下：

Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase(诺唯赞)，KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO)，DpnI(New England Biolabs,NEB)，壮观霉素(Sigma)，卡那霉素(Sigma)，氨苄霉素(Sigma)，DMEM培养基(Macgene)，1XTrypsin-EDTA 0.25％(Macgene)，1XPBS(Macgene)，镍介质(GE healthcare)

实施例所用仪器包括如下：

PCR仪(Biorad)，电泳仪(Tanon)，天能凝胶成像系统(Tanon)，超声破碎仪(SONICS)，高压灭菌锅(STIK)，纯水仪(Millipore)，Nanodrop(Thermo)，台式离心机(Thermo)，亚超速离心机(Beckman)，AKTA蛋白纯化系统(GE healthcare)，流式细胞仪(Beckman CytoFLEX)细胞培养箱(Thermo)

实施例1：包含定点突变的SpCas9及AsCas12a的基因载体的构建

(1)辅助质粒的获得

pUltra-MjPolyRS(由Addgene公司购买)(以下简称辅助质粒)，该质粒可以表达用于特异性识别及插入非天然氨基酸AeF的tRNA和tRNA合成酶。

(2)含SpCas9、AsCas12a的质粒的获得

pET28a-SpCas9质粒(Liang,Z.,Chen,K.,Li,T.,Zhang,Y.,Wang,Y.,Zhao,Q.,Liu,J.,Zhang,H.,Liu,C.,Ran,Y.,et al.(2017).Efficient DNA-free genome editingof bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes.Naturecommunications 8,14261.)，可以在大肠埃希氏菌中重组表达SpCas9蛋白。pET22b-AsCas12a质粒中蛋白序列由Addgene质粒#102565中通过PCR获得，进而利用PCR引物在末端引入酶切5’Nde1，3’Xho1，通过酶切连接构建得到完整质粒序列，可以在大肠埃希氏菌中重组表达AsCas12a蛋白。

所用引物序列如下：

(3)定点突变位点的选择及突变质粒的构建

根据对SpCas9蛋白晶体结构进行解析的结果进行分析，发明人选择了第3位，39位，41位，116位，576位，945位，1151位，1367位这几个位点，作为定点突变的靶氨基酸，用含有叠氮基团的非天然氨基酸置换这几个特定的氨基酸残基，然后可以以此为原料，对SpCas9进行定点偶联供体DNA，使二者及gRNA形成RNP-DNA复合物，在递送到细胞靶区DNA位置时，可以保持足够的供体DNA浓度，从而提高同源重组修复效率。

根据对AsCas12a蛋白晶体结构进行解析的结果进行分析，本发明人选择了M806位，K1086位这几个位点，作为定点突变的靶氨基酸，用含有叠氮基团的非天然氨基酸置换这几个特定的氨基酸残基，然后可以以此为原料，对AsCas12a进行定点偶联crRNA，使二者形成共价复合物，因而解决了在递送过程中，AsCas12a和crRNA因解离而导致的靶区DNA附近RNP浓度不够造成的切割效率低下的问题。

本发明人针对以上两个蛋白，SpCas9的3位，39位，41位，116位，576位，945位，1151位，1367位，以及AsCas12a的M806位及K1086位这几个位点，分别设计能够使编码所述氨基酸的相应密码子突变为TAG的引物，具体引物如下表所示。

表1：突变引物列表

以pET28a-Cas9质粒为模板，使用以上引物及KOD酶进行扩增，并将所获得的PCR产物进行DpnI消化，所得到的产物转化DH5α菌株，复苏后涂在相应抗性的平板上，次日挑取单克隆测序，以得到pET28a-Cas9-K3,pET28a-Cas9-D39,pET28a-Cas9-H41,pET28a-Cas9-H116,pET28a-Cas9-D576，pET28a-Cas9-E945 pET28a-Cas9-K1151,pET28a-Cas9-G1367的质粒。

(4)定点突变的SpCas9表达菌株的构建

将步骤(1)所得到的辅助质粒pULTRA-Ambrx(壮观霉素抗性)和步骤(3)所获得的表达质粒pET28a-Cas9-G1367(卡那霉素抗性)两个质粒同时转化到大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)亚型，经双抗性平板(壮观霉素和卡那霉素抗性)筛选出同时转化了两种质粒的阳性菌株，命名为表达菌株pET28a-Cas9-G1367。

依照同样的方法，获取其余各个突变位点的表达菌株，分别为表达株：pET28a-Cas9-K3,pET28a-Cas9-D39,pET28a-Cas9-H41,pET28a-Cas9-H116,pET28a-Cas9-D576，pET28a-Cas9-E945,pET28a-Cas9-K1151。

实施例2：点突变的SpCas9的表达和纯化

1：氨基酸来于商品化购买

2：SpCas9蛋白定点插入非天然氨基酸AeF的表达

将实施案例1步骤(4)获得的表达株pET28a-Cas9-G1367在2YT培养基(含有100ug/ul壮观霉素和100ug/ul卡那霉素)中37℃过夜培养。次日按照1：100接种到新鲜培养基中至OD值为0.3时，加入1mM AeF继续培养，待OD值为0.6-1.0时，加入0.2mM IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside)，于18-20℃诱导表达16-18小时后收集菌体。此表达试验采用的阳性对照为野生型的pET22b-Cas9(实施案例1步骤2获得)表达菌株，除接种菌不同外，其余条件均与突变菌相同。

其他各突变体表达菌，均按照以上条件进行表达。

3：AeF突变蛋白的纯化

1)将上述收集的表达菌体用高盐缓冲buffer(20mM Tris，pH8.0，1M KCl)重悬，利用超声破碎。

2)将步骤1)破碎产物进行高速离心，吸取上清作为可溶性成分。

3)将步骤2)的产物上清样品与Ni亲和柱纯化，并用高浓度咪唑洗脱，结果见图1。

4)将步骤3)的纯化产物置换到低盐缓冲液(20mM Tris，pH8.0，300mM KCl)，通过阳离子交换进行进一步纯化，洗脱缓冲液为20mM Tris，pH8.0，1M KCl。收集目的蛋白组分，结果见图2。

5)将步骤4)的纯化产物利用分子筛层析进一步纯化，使用Superdex 200(GEhealthcare)柱子，洗脱缓冲液为20mM Tris,pH8.0,150mM KCl，收集目的蛋白组分，结果见图3。

经过上述三种工艺途径的纯化，可以成功获得电泳电泳纯级(>95％)的目的蛋白样品(图3)，为后续活性验证以及功能探索提供足够的实验样品。

4：其他各AeF突变蛋白质的纯化

用表达菌pET28a-Cas9-K3,pET28a-Cas9-D39,pET28a-Cas9-H41,pET28a-Cas9-D576，pET28a-Cas9-E945,pET28a-Cas9-K1151，按照上述步骤2-3的方式进行培养，纯化，分离得到用非天然氨基酸AeF定点突变SpCas9第3位，39位，41位，116位，576位，945位，1151位，1367位氨基酸的突变体蛋白纯品，简称K3AeF-Cas9，D39AeF-Cas9，H41AeF-Cas9,H116AeF-Cas9,D576AeF-Cas9,E945AeF-Cas9,K1151AeF-Cas9，G1367AeF-Cas9。

5：SpCas9蛋白定点插入非天然氨基酸NAEK的表达及纯化

1)非天然氨基酸NAEK直接商品化购买。

2)除了用NAEK替换AeF,用WT PylRS替换MjPolyRS外，其他条件与前述步骤2-4相同，对SpCas9进行各个位点的NAEK插入表达及纯化试验。并得到用非天然氨基酸NAEK定点突变的SpCas9第3位，39位，41位，116位，576位，945位1151位，1367位氨基酸的突变体蛋白纯品，简称K3NAEK-Cas9，D39NAEK-Cas9,H41NAEK-Cas9,H116NAEK-Cas9,D576NAEK-Cas9,E945NAEK-Cas9,K1151NAEK-Cas9,G1367NAEK-Cas9。

6：突变SpCas9活性的验证

为验证插入有非天然氨基酸的SpCas9及AsCas12a在高效表达的同时，在gRNA的引导下，具有切割双链DNA的功能，本发明人对其活性进行了检测。以SpCas9第1367位插入非天然氨基酸AeF为例对其进行活性检测，其余个点的突变体的检测手段与此类似。

取3pmol蛋白(野生型与突变型)与9pmol gRNA在室温孵育10分钟，使之形成RNP复合物，将事先准备好的模板双链DNA(100μg)与RNP加入到含有NEB3.1缓冲液的反应体系中，在37℃下孵育1个小时，并在65℃条件下进行热失活。随后将反应产物用于核酸胶分离，结果见图4：证明了突变的SpCas9及AsCas12a具有与野生型一致的切割活性，该结果表明，非天然氨基酸的插入并不会影响蛋白对双链DNA的识别以及切割活性。

所使用的gRNA以及模板DNA扩增引物序列如下

模板DNA(SEQ ID NO.5)序列如下：

TCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGAgCcACGGCGTcCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACAT。

实施例3：突变体与DBCO修饰核酸分子的共价偶联

当在SpCas9及AsCas12a中掺入含有叠氮基团的非天然氨基酸之后，可以通过点击化学(click chemistry)反应的方式与DBCO修饰的核酸分子进行偶联，下面对这种偶联方式进行了试验。

1)DBCO修饰核酸的合成

DBCO修饰的单链DNA或者RNA均为商品化产品，从安徽通用生物合成公司及美国IDT公司(Integrated DNA Technologies,Inc.)购买获得。

序列如下：

2)通过点击化学反应偶联核酸

按照1：1将突变的蛋白与DBCO修饰的核酸进行混匀，在室温及4℃等条件下进行反应条件的摸索，隔一定的时间取样，SDS-PAGE鉴定，结果见图5，由图可知，点击化学反应速度比较快，在4℃，3小时以内，可以达到平衡，而长时间进行反应则大大增加蛋白降解。根据实验结果，确定反应时间为3小时，大约95％以上的蛋白可以偶联核酸。

其他位点AeF或者NAEK的突变体蛋白与DBCO修饰的核酸偶联方法与上同，可得到近似产率的偶联产物。

实施例4：定点修饰核酸的CRISPR家族蛋白体外活性评价

1)取上述3pmol偶联单链DNA的突变体蛋白SpCas9-G1367-AeF(对照组为野生型蛋白)与9pmolgRNA在室温孵育10分钟，使之形成RNP复合物，将事先准备好的模板双链DNA(100μg)与RNP加入到含有NEB3.1缓冲液的反应体系中，在37℃下孵育1个小时，并在65℃条件下进行热失活。随后将反应产物用于核酸胶分离，结果见图6：证明了偶联单链DNA的SpCas9具有与野生型一致的切割活性，该结果表明，非天然氨基酸的插入及偶联单链DNA并不会影响蛋白对双链DNA的识别以及切割活性。

其余插入AeF及NAEK的突变体蛋白与单链DNA偶联后的体外活性检测方法与前述一致，可得到近似的切割效率。

2)取3pmol突变体蛋白AsCas12a-M806-AeF,与3pmol DBCO修饰的crRNA在4℃反应3小时(对照组为野生型蛋白与crRNA室温孵育10分钟)，使之形成RNP复合物，并将事先准备好的模板双链DNA(100μg)与RNP加入到含有NEB3.1缓冲液的反应体系中，在37℃下孵育1个小时，并在65℃条件下进行热失活。随后将反应产物用于核酸胶分离，结果见图7：证明了偶联crRNA的AsCas12a具有与野生型一致的切割活性，该结果表明，非天然氨基酸的插入及偶联crRNA并不会影响AsCas12a蛋白对双链DNA的识别以及切割活性。

其余插入AeF及NAEK的突变体蛋白与crRNA偶联后的体外活性检测方法与前述一致，可得到近似的切割效率。

实施例5：定点修饰核酸的CRISPR家族蛋白体内活性评价

具体过程如下：先将贴壁的报告细胞株进行胰酶消化，并用PBS悬浮后计数，根据计数结果收集1x10⁶个细胞，用20μL电转缓冲液(Celetrix公司生产，在使用前将A液和B液进行等比例混合后使用)悬浮。将18pmol的RNP或者偶联核酸的RNP与细胞轻轻混匀后，放到专用的电转杯中，按照优化的参数(420V，30ms)进行电击。电击结束后，迅速将转染后的细胞加入到2ml预热的DMEM中，放入37℃培养箱在六孔板中中进行培养。24小时后，加入终浓度为10ug/ml的多西环素盐酸盐溶液。48小时后，将细胞消化悬浮，置换到PBS缓冲液中进行流式分析。结果如图8显示：偶联核酸的SpCas9在细胞内的GFP荧光淬灭率基本上可以达到野生型的80-90％左右；野生型AsCas12与不同RNA组合可以实现约20％左右的编辑效率，偶联crRNA的AsCas12a在细胞内的GFP荧光淬灭率是野生型的4-5倍(图9)，表明这种crRNA偶联到AsCas12a蛋白上可以提高切割效率。

本发明人为此构建了一个报告细胞株评价体系，利用慢病毒系统pLV包装含有Teton启动子下游为EGFP基因的慢病毒，并用其侵染293T细胞，通过流式分选，分选绿色荧光强阳性细胞得到单克隆化的细胞株。该体系是利用GFP蛋白的荧光淬灭作为表征，与直接表达GFP蛋白的细胞株不同之处在于，本发明人的报告细胞株GFP的表达是由Teton操纵子控制的，只有在加入多环西素(Doxycycline，Dox)才会诱导性表达。该报告细胞株可以大大缩短GFP荧光淬灭的观测时间。该试验就是通过将偶联核酸的RNP通过电转的方式递送至细胞内，通过RNP对GFP基因的切割，扰乱其后续的转录及翻译，从而观测GFP的淬灭率来检测RNP对基因的编辑效率。

实施例6：定点偶联oligoDNA的SpCas9在细胞内基因编辑效率的评价

本例通过对细胞内保守基因GAPDH TAG密码子前基因进行切割，通过供体DNA插入一个含有13个氨基酸的HiBiT基因，该基因可以编码在GAPDH蛋白后融合表达HiBiT。HiBiT与LgBiT可以形成完整的nanoluciferase，在底物的参与下释放荧光。通过荧光的释放与否评估基因编辑效率。对于RNP-Oligo DNA复合物的转染，使用18pmol Cas9野生型/突变体蛋白与24pmol sgRNA首先在室温混合并孵育5min，后向复合物中加入18pmol核酸匹配接头Adaptor，在4度孵育3h，在转染前将18pmol单链供体DNA(ssODN)加入到混合物进行下一步的转染。转染使用的是CTX-1500A LE型号电转仪，根据说明书按照buffer A及B等比例混合配置，对于单次反应使用20ul电转buffer重悬1*10⁶个细胞，将预先配置好的偶联复合物加入到细胞悬液中进行电转，电转条件为420V 30ms，电转后立刻将细胞吸出置于预热的DMEM培养基中继续培养48h。在转染后48小时，将细胞收集裂解，使用Promega公司提供的

HiBiT Lytic Detection System试剂盒检测荧光发生，评价偶联RNP-DNA后，对基因编辑效率的影响。结果如图10所示，偶联oligo DNA的RNP可以显著提高基因编辑效率，证明了发明人所创立的这套RNP上定点偶联oligo DNA招募供体DNA的方法确实可以提高基因编辑中的同源重组修复效率。

在本例中所用的核酸序列如下表所示：

实施例7：定点偶联crRNA的AsCas12a在细胞内进行同源重组水平的评价

本例通过对人源细胞内保守基因HPRT基因进行切割，在切割位点处引入含有左右各40bp同源臂6个bp特定序列，该序列为EcoR1特异性识别位点，如果成功实现基因编辑并且发生精准同源重组可以通过基因组特异性扩增对应片段，进而进行片段酶切评价。EcoR1切割的效率可以直接反应同源重组的水平。具体操作如下，使用40/60pmol AsCas12a蛋白与对应的crRNA(1.2倍当量)在体外孵育10分钟形成RNP后，置于4度反应3小时后，加入0.6倍当量的单链供体DNA形成复合物进行后续的转染。转染使用的是CTX-1500A LE型号电转仪，根据说明书按照buffer A及B等比例混合配置，对于单次反应使用20ul电转buffer重悬1*10⁶个细胞，将预先配置好的偶联复合物加入到细胞悬液中进行电转，电转条件为420V30ms，电转后立刻将细胞吸出置于预热的DMEM培养基中继续培养48h。在转染后48小时，将细胞收集，使用诺唯赞公司提供的基因组提取试剂盒提取细胞基因组，对目标区域进行PCR扩增后，扩增得到的产物使用Cycle pure纯化试剂盒纯化后进行定量。同源重组效率的评价利用酶切进行鉴定，具体操作如下，按照PCR产物200ng/反应进行加样，酶切体系为10ul，加入1ul Cutsmart溶液，200ng模板及1ul EcoRI-HF酶，用水补齐至10ul，在37度反应1h后使用1％琼脂糖凝胶电泳进行产物的鉴定，并对条带进行定量分析。结果如图11所示，在40pmol及60pmol的RNP切割浓度下均可以看到偶联组(cCas12a)能够显著提高7-8倍同源重组效率，证明了发明人所创立的这套RNP上定点偶联crRNA方法确实可以提高基因编辑中的同源重组修复效率。

在本例中所用的核酸序列如下表所示：

实施例8：定点偶联crRNA的AsCas12a碱基编辑器在细胞内碱基编辑效率的评价

本例首先进行含有AsCas12a的碱基编辑器(AsCas12a-BE)的蛋白的表达和纯化，突变体的突变位点为M806AeF,质粒构建及蛋白表达纯化与上述实例2相同。蛋白获得后进行细胞水平碱基编辑效率的评价，本例中所用的评价系统针对人源细胞293T的内源基因FANCF进行编辑，具体操作如下，使用200pmol AsCas12a-BE蛋白与对应的crRNA(1.2倍当量)在体外孵育10分钟形成RNP后，置于4度反应3小时后，形成复合物进行后续的转染。转染使用的是CTX-1500A LE型号电转仪，根据说明书按照buffer A及B等比例混合配置，对于单次反应使用20ul电转buffer重悬1*106个细胞，将预先配置好的偶联复合物加入到细胞悬液中进行电转，电转条件为420V 30ms，电转后立刻将细胞吸出置于预热的DMEM培养基中继续培养48h。在转染后48小时，将细胞收集，使用诺唯赞公司提供的基因组提取试剂盒提取细胞基因组，对目标区域进行PCR扩增进行sanger测序，利用在线EditR工具进行分析，结果如图12所示，在不同浓度下均能够看到偶联组碱基编辑效率能够显著的优于野生型蛋白，证明了发明人所创立的这套RNP上定点偶联crRNA方法确实可以提高碱基编辑效率。

在本例中所用的核酸序列如下表所示：

crRNA靶向human FANCF序列	UCCGUGUUCCUUGACUCUGG
		PCR正向引物	GAAGGCCCAGAATTCAGCATAGCGC
PCR反向引物	GTCCCAGGTGCTGACGTAGGTAG

虽然本申请所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本申请而采用的实施方式，并非用以限定本申请。任何本申请所属领域内的技术人员，在不脱离本申请所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本申请的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

序列表

<110> 北京大学

<120> CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法及其偶联物和用途

<130> 012028676

<150> CN201911092554.8

<151> 2019-11-11

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> PRT

<213> Streptococcus pyogenes strain SF370

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

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Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

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His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

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Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

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Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

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Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

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Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

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Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

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Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

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Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

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Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

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Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

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Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

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Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

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Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

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Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

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Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

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Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

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Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

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Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

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Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

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Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

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Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

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Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

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Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

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Glu Lys Leu Phe Lys Asn Phe Asp Glu Tyr Ser Ser Ala Gly Ile Phe

325 330 335

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675 680 685

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690 695 700

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705 710 715 720

Met Tyr Phe Lys Leu Leu Phe Asp Glu Asn Asn His Gly Gln Ile Arg

725 730 735

Leu Ser Gly Gly Ala Glu Leu Phe Met Arg Arg Ala Ser Leu Lys Lys

740 745 750

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Pro Asp Asn Pro Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Val Tyr Lys

770 775 780

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atcgctcttg aggacctcaa ctcgggcttt aagaattcta gagttaaagt ggagaagcag 2820

gtctatcaaa agttcgagaa gatgcttata gataagctca actacatggt cgataagaaa 2880

tcgaacccat gtgccaccgg cggcgcactc aaaggttacc aaataacaaa caaattcgag 2940

tccttcaaat cgatgagtac tcagaatggg ttcatatttt atataccggc gtggcttacg 3000

tctaagatcg acccgtcaac tggttttgtc aacctgttga agacgaaata cacgtccatt 3060

gccgattcga aaaagttcat atctagtttt gatcgtatta tgtacgtccc agaggaagat 3120

cttttcgagt ttgctctcga ctacaaaaac ttttcgcgga ccgatgcgga ttacattaaa 3180

aaatggaaac tctattcgta cggcaacaga atcaggattt ttcgcaaccc taagaagaat 3240

aacgtctttg attgggagga agtttgcttg actagcgcgt acaaggagct ctttaataag 3300

tatggcatta actaccaaca gggtgatatc agagcactgc tttgcgaaca atctgacaag 3360

gctttctact catccttcat ggctttgatg agcctgatgc tccagatgag aaattcaatt 3420

acaggcagaa ccgacgtgga tttcttgatc tccccggtta aaaattctga tggcatcttt 3480

tacgatagca ggaactatga agcgcaagag aatgcgattc tgccaaaaaa tgcagacgcc 3540

aacggtgcct ataacatcgc caggaaagtc ctgtgggcga tcggccagtt caaaaaggcc 3600

gaagacgaaa aattggacaa ggtcaaaatc gctatcagca acaaagagtg gctggagtat 3660

gctcagacat ccgtaaagca t 3681

<210> 5

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg 60

ggaggtctat ataagcagag ctctctggct aactagagaa cccactgctt actggcttat 120

cgaaattaat acgactcact atagggagac ccaagctggc tagcgtttaa acgggccctc 180

tagactcgag atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt 240

cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga 300

tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc 360

ctggcccacc ctcgtgacca ccctgagcca cggcgtccag tgcttcagcc gctaccccga 420

ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg 480

caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg 540

cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat 600

<210> 6

<211> 1638

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Ala Ser Pro Ala Ser Gly Pro Arg His Leu Met Asp Pro His

1 5 10 15

Ile Phe Thr Ser Asn Phe Asn Asn Gly Ile Gly Arg His Lys Thr Tyr

20 25 30

Leu Cys Tyr Glu Val Glu Arg Leu Asp Asn Gly Thr Ser Val Lys Met

35 40 45

Asp Gln His Arg Gly Phe Leu His Gln Gln Ala Lys Asn Leu Leu Cys

50 55 60

Gly Phe Tyr Gly Arg His Ala Glu Leu Arg Phe Leu Asp Leu Val Pro

65 70 75 80

Ser Leu Gln Leu Asp Pro Ala Gln Ile Tyr Arg Val Thr Trp Phe Ile

85 90 95

Ser Trp Ser Pro Cys Phe Ser Trp Gly Cys Ala Gly Glu Val Arg Ala

100 105 110

Phe Leu Gln Glu Asn Thr His Val Arg Leu Arg Ile Phe Ala Ala Arg

115 120 125

Ile Tyr Asp Tyr Asp Pro Leu Tyr Lys Glu Ala Leu Gln Met Leu Arg

130 135 140

Asp Ala Gly Ala Gln Val Ser Ile Met Thr Tyr Asp Glu Phe Lys His

145 150 155 160

Cys Trp Asp Thr Phe Val Asp His Gln Gly Cys Pro Phe Gln Pro Trp

165 170 175

Asp Gly Leu Asp Glu His Ser Gln Ala Leu Ser Gly Arg Leu Arg Ala

180 185 190

Ile Leu Gln Asn Gln Gly Asn Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser

195 200 205

Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Met Thr Gln Phe Glu Gly Phe Thr Asn

210 215 220

Leu Tyr Gln Val Ser Lys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Ile Pro Gln Gly

225 230 235 240

Lys Thr Leu Lys His Ile Gln Glu Gln Gly Phe Ile Glu Glu Asp Lys

245 250 255

Ala Arg Asn Asp His Tyr Lys Glu Leu Lys Pro Ile Ile Asp Arg Ile

260 265 270

Tyr Lys Thr Tyr Ala Asp Gln Cys Leu Gln Leu Val Gln Leu Asp Trp

275 280 285

Glu Asn Leu Ser Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Lys Glu Lys Thr Glu

290 295 300

Glu Thr Arg Asn Ala Leu Ile Glu Glu Gln Ala Thr Tyr Arg Asn Ala

305 310 315 320

Ile His Asp Tyr Phe Ile Gly Arg Thr Asp Asn Leu Thr Asp Ala Ile

325 330 335

Asn Lys Arg His Ala Glu Ile Tyr Lys Gly Leu Phe Lys Ala Glu Leu

340 345 350

Phe Asn Gly Lys Val Leu Lys Gln Leu Gly Thr Val Thr Thr Thr Glu

355 360 365

His Glu Asn Ala Leu Leu Arg Ser Phe Asp Lys Phe Thr Thr Tyr Phe

370 375 380

Ser Gly Phe Tyr Arg Asn Arg Lys Asn Val Phe Ser Ala Glu Asp Ile

385 390 395 400

Ser Thr Ala Ile Pro His Arg Ile Val Gln Asp Asn Phe Pro Lys Phe

405 410 415

Lys Glu Asn Cys His Ile Phe Thr Arg Leu Ile Thr Ala Val Pro Ser

420 425 430

Leu Arg Glu His Phe Glu Asn Val Lys Lys Ala Ile Gly Ile Phe Val

435 440 445

Ser Thr Ser Ile Glu Glu Val Phe Ser Phe Pro Phe Tyr Asn Gln Leu

450 455 460

Leu Thr Gln Thr Gln Ile Asp Leu Tyr Asn Gln Leu Leu Gly Gly Ile

465 470 475 480

Ser Arg Glu Ala Gly Thr Glu Lys Ile Lys Gly Leu Asn Glu Val Leu

485 490 495

Asn Leu Ala Ile Gln Lys Asn Asp Glu Thr Ala His Ile Ile Ala Ser

500 505 510

Leu Pro His Arg Phe Ile Pro Leu Phe Lys Gln Ile Leu Ser Asp Arg

515 520 525

Asn Thr Leu Ser Phe Ile Leu Glu Glu Phe Lys Ser Asp Glu Glu Val

530 535 540

Ile Gln Ser Phe Cys Lys Tyr Lys Thr Leu Leu Arg Asn Glu Asn Val

545 550 555 560

Leu Glu Thr Ala Glu Ala Leu Phe Asn Glu Leu Asn Ser Ile Asp Leu

565 570 575

Thr His Ile Phe Ile Ser His Lys Lys Leu Glu Thr Ile Ser Ser Ala

580 585 590

Leu Cys Asp His Trp Asp Thr Leu Arg Asn Ala Leu Tyr Glu Arg Arg

595 600 605

Ile Ser Glu Leu Thr Gly Lys Ile Thr Lys Ser Ala Lys Glu Lys Val

610 615 620

Gln Arg Ser Leu Lys His Glu Asp Ile Asn Leu Gln Glu Ile Ile Ser

625 630 635 640

Ala Ala Gly Lys Glu Leu Ser Glu Ala Phe Lys Gln Lys Thr Ser Glu

645 650 655

Ile Leu Ser His Ala His Ala Ala Leu Asp Gln Pro Leu Pro Thr Thr

660 665 670

Leu Lys Lys Gln Glu Glu Lys Glu Ile Leu Lys Ser Gln Leu Asp Ser

675 680 685

Leu Leu Gly Leu Tyr His Leu Leu Asp Trp Phe Ala Val Asp Glu Ser

690 695 700

Asn Glu Val Asp Pro Glu Phe Ser Ala Arg Leu Thr Gly Ile Lys Leu

705 710 715 720

Glu Met Glu Pro Ser Leu Ser Phe Tyr Asn Lys Ala Arg Asn Tyr Ala

725 730 735

Thr Lys Lys Pro Tyr Ser Val Glu Lys Phe Lys Leu Asn Phe Gln Met

740 745 750

Pro Thr Leu Ala Arg Gly Trp Asp Val Asn Arg Glu Lys Asn Asn Gly

755 760 765

Ala Ile Leu Phe Val Lys Asn Gly Leu Tyr Tyr Leu Gly Ile Met Pro

770 775 780

Lys Gln Lys Gly Arg Tyr Lys Ala Leu Ser Phe Glu Pro Thr Glu Lys

785 790 795 800

Thr Ser Glu Gly Phe Asp Lys Met Tyr Tyr Asp Tyr Phe Pro Asp Ala

805 810 815

Ala Lys Met Ile Pro Lys Cys Ser Thr Gln Leu Lys Ala Val Thr Ala

820 825 830

His Phe Gln Thr His Thr Thr Pro Ile Leu Leu Ser Asn Asn Phe Ile

835 840 845

Glu Pro Leu Glu Ile Thr Lys Glu Ile Tyr Asp Leu Asn Asn Pro Glu

850 855 860

Lys Glu Pro Lys Lys Phe Gln Thr Ala Tyr Ala Lys Lys Thr Gly Asp

865 870 875 880

Gln Lys Gly Tyr Arg Glu Ala Leu Cys Lys Trp Ile Asp Phe Thr Arg

885 890 895

Asp Phe Leu Ser Lys Tyr Thr Lys Thr Thr Ser Ile Asp Leu Ser Ser

900 905 910

Leu Arg Pro Ser Ser Gln Tyr Lys Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Ala Glu

915 920 925

Leu Asn Pro Leu Leu Tyr His Ile Ser Phe Gln Arg Ile Ala Glu Lys

930 935 940

Glu Ile Met Asp Ala Val Glu Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Phe Gln Ile

945 950 955 960

Tyr Asn Lys Asp Phe Ala Lys Gly His His Gly Lys Pro Asn Leu His

965 970 975

Thr Leu Tyr Trp Thr Gly Leu Phe Ser Pro Glu Asn Leu Ala Lys Thr

980 985 990

Ser Ile Lys Leu Asn Gly Gln Ala Glu Leu Phe Tyr Arg Pro Lys Ser

995 1000 1005

Arg Met Lys Arg Met Ala His Arg Leu Gly Glu Lys Met Leu Asn Lys

1010 1015 1020

Lys Leu Lys Asp Gln Lys Thr Pro Ile Pro Asp Thr Leu Tyr Gln Glu

1025 1030 1035 1040

Leu Tyr Asp Tyr Val Asn His Arg Leu Ser His Asp Leu Ser Asp Glu

1045 1050 1055

Ala Arg Ala Leu Leu Pro Asn Val Ile Thr Lys Glu Val Ser His Glu

1060 1065 1070

Ile Ile Lys Asp Arg Arg Phe Thr Ser Asp Lys Phe Phe Phe His Val

1075 1080 1085

Pro Ile Thr Leu Asn Tyr Gln Ala Ala Asn Ser Pro Ser Lys Phe Asn

1090 1095 1100

Gln Arg Val Asn Ala Tyr Leu Lys Glu His Pro Glu Thr Pro Ile Ile

1105 1110 1115 1120

Gly Ile Ala Arg Gly Glu Arg Asn Leu Ile Tyr Ile Thr Val Ile Asp

1125 1130 1135

Ser Thr Gly Lys Ile Leu Glu Gln Arg Ser Leu Asn Thr Ile Gln Gln

1140 1145 1150

Phe Asp Tyr Gln Lys Lys Leu Asp Asn Arg Glu Lys Glu Arg Val Ala

1155 1160 1165

Ala Arg Gln Ala Trp Ser Val Val Gly Thr Ile Lys Asp Leu Lys Gln

1170 1175 1180

Gly Tyr Leu Ser Gln Val Ile His Glu Ile Val Asp Leu Met Ile His

1185 1190 1195 1200

Tyr Gln Ala Val Val Val Leu Glu Asn Leu Asn Phe Gly Phe Lys Ser

1205 1210 1215

Lys Arg Thr Gly Ile Ala Glu Lys Ala Val Tyr Gln Gln Phe Glu Lys

1220 1225 1230

Met Leu Ile Asp Lys Leu Asn Cys Leu Val Leu Lys Asp Tyr Pro Ala

1235 1240 1245

Glu Lys Val Gly Gly Val Leu Asn Pro Tyr Gln Leu Thr Asp Gln Phe

1250 1255 1260

Thr Ser Phe Ala Lys Met Gly Thr Gln Ser Gly Phe Leu Phe Tyr Val

1265 1270 1275 1280

Pro Ala Pro Tyr Thr Ser Lys Ile Asp Pro Leu Thr Gly Phe Val Asp

1285 1290 1295

Pro Phe Val Trp Lys Thr Ile Lys Asn His Glu Ser Arg Lys His Phe

1300 1305 1310

Leu Glu Gly Phe Asp Phe Leu His Tyr Asp Val Lys Thr Gly Asp Phe

1315 1320 1325

Ile Leu His Phe Lys Met Asn Arg Asn Leu Ser Phe Gln Arg Gly Leu

1330 1335 1340

Pro Gly Phe Met Pro Ala Trp Asp Ile Val Phe Glu Lys Asn Glu Thr

1345 1350 1355 1360

Gln Phe Asp Ala Lys Gly Thr Pro Phe Ile Ala Gly Lys Arg Ile Val

1365 1370 1375

Pro Val Ile Glu Asn His Arg Phe Thr Gly Arg Tyr Arg Asp Leu Tyr

1380 1385 1390

Pro Ala Asn Glu Leu Ile Ala Leu Leu Glu Glu Lys Gly Ile Val Phe

1395 1400 1405

Arg Asp Gly Ser Asn Ile Leu Pro Lys Leu Leu Glu Asn Asp Asp Ser

1410 1415 1420

His Ala Ile Asp Thr Met Val Ala Leu Ile Arg Ser Val Leu Gln Met

1425 1430 1435 1440

Arg Asn Ser Asn Ala Ala Thr Gly Glu Asp Tyr Ile Asn Ser Pro Val

1445 1450 1455

Arg Asp Leu Asn Gly Val Cys Phe Asp Ser Arg Phe Gln Asn Pro Glu

1460 1465 1470

Trp Pro Met Asp Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys

1475 1480 1485

Gly Gln Leu Leu Leu Asn His Leu Lys Glu Ser Lys Asp Leu Lys Leu

1490 1495 1500

Gln Asn Gly Ile Ser Asn Gln Asp Trp Leu Ala Tyr Ile Gln Glu Leu

1505 1510 1515 1520

Arg Asn His Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Ser Gly Gly Ser

1525 1530 1535

Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val

1540 1545 1550

Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile

1555 1560 1565

Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu

1570 1575 1580

Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr

1585 1590 1595 1600

Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile

1605 1610 1615

Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Leu Glu

1620 1625 1630

His His His His His His

1635

<210> 7

<211> 4917

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atggaagcaa gtccagcctc gggccctcgt cacttaatgg atccgcatat cttcacgtcc 60

aacttcaaca atggcatcgg ccgtcacaag acctatcttt gctatgaagt cgaacgtctg 120

gataacggca cgagcgtaaa gatggatcaa caccgtggtt tccttcacca acaggctaag 180

aacttattat gtgggttcta cggtcgtcac gcagagttgc gcttccttga cctggtacct 240

tcccttcaac tggatcctgc acaaatctac cgcgttacct ggttcatttc ttggagtcca 300

tgcttttctt ggggctgtgc tggcgaagta cgtgcatttt tgcaagagaa tacgcatgtt 360

cgtttgcgta tcttcgcggc ccgcatttat gattatgacc cgctttataa ggaggcttta 420

cagatgttac gtgacgctgg cgcacaggtt tcaattatga cctacgacga gttcaaacac 480

tgctgggaca cattcgtcga tcatcaaggt tgtccctttc aaccctggga tgggttagac 540

gaacacagcc aggcgttgtc gggacgcctg cgtgcgattc ttcaaaatca aggtaacagc 600

gggtccgaga cacccggaac atcggaaagt gccactcctg agtctatgac acagttcgag 660

ggctttacca acctgtatca ggtgagcaag acactgcggt ttgagctgat cccacagggc 720

aagaccctga agcacatcca ggagcagggc ttcatcgagg aggacaaggc ccgcaatgat 780

cactacaagg agctgaagcc catcatcgat cggatctaca agacctatgc cgaccagtgc 840

ctgcagctgg tgcagctgga ttgggagaac ctgagcgccg ccatcgactc ctatagaaag 900

gagaaaaccg aggagacaag gaacgccctg atcgaggagc aggccacata tcgcaatgcc 960

atccacgact acttcatcgg ccggacagac aacctgaccg atgccatcaa taagagacac 1020

gccgagatct acaagggcct gttcaaggcc gagctgttta atggcaaggt gctgaagcag 1080

ctgggcaccg tgaccacaac cgagcacgag aacgccctgc tgcggagctt cgacaagttt 1140

acaacctact tctccggctt ttatcgcaac aggaagaacg tgttcagcgc cgaggatatc 1200

agcacagcca tcccacaccg catcgtgcag gacaacttcc ccaagtttaa ggagaattgt 1260

cacatcttca cacgcctgat caccgccgtg cccagcctgc gggagcactt tgagaacgtg 1320

aagaaggcca tcggcatctt cgtgagcacc tccatcgagg aggtgttttc cttccctttt 1380

tataaccagc tgctgacaca gacccagatc gacctgtata accagctgct gggaggaatc 1440

tctcgggagg caggcaccga gaagatcaag ggcctgaacg aggtgctgaa tctggccatc 1500

cagaagaatg atgagacagc ccacatcatc gcctccctgc cacacagatt catccccctg 1560

tttaagcaga tcctgtccga taggaacacc ctgtctttca tcctggagga gtttaagagc 1620

gacgaggaag tgatccagtc cttctgcaag tacaagacac tgctgagaaa cgagaacgtg 1680

ctggagacag ccgaggccct gtttaacgag ctgaacagca tcgacctgac acacatcttc 1740

atcagccaca agaagctgga gacaatcagc agcgccctgt gcgaccactg ggatacactg 1800

aggaatgccc tgtatgagcg gagaatctcc gagctgacag gcaagatcac caagtctgcc 1860

aaggagaagg tgcagcgcag cctgaagcac gaggatatca acctgcagga gatcatctct 1920

gccgcaggca aggagctgag cgaggccttc aagcagaaaa ccagcgagat cctgtcccac 1980

gcacacgccg ccctggatca gccactgcct acaaccctga agaagcagga ggagaaggag 2040

atcctgaagt ctcagctgga cagcctgctg ggcctgtacc acctgctgga ctggtttgcc 2100

gtggatgagt ccaacgaggt ggaccccgag ttctctgccc ggctgaccgg catcaagctg 2160

gagatggagc cttctctgag cttctacaac aaggccagaa attatgccac caagaagccc 2220

tactccgtgg agaagttcaa gctgaacttt cagatgccta cactggcccg tggctgggac 2280

gtgaatcgcg agaagaacaa tggcgccatc ctgtttgtga agaacggcct gtactatctg 2340

ggcatcatgc caaagcagaa gggcaggtat aaggccctga gcttcgagcc cacagagaaa 2400

accagcgagg gctttgataa gatgtactat gactacttcc ctgatgccgc caagatgatc 2460

ccaaagtgca gcacccagct gaaggccgtg acagcccact ttcagaccca cacaaccccc 2520

atcctgctgt ccaacaattt catcgagcct ctggagatca caaaggagat ctacgacctg 2580

aacaatcctg agaaggagcc aaagaagttt cagacagcct acgccaagaa aaccggcgac 2640

cagaagggct acagagaggc cctgtgcaag tggatcgact tcacaaggga ttttctgtcc 2700

aagtatacca agacaacctc tatcgatctg tctagcctgc ggccatcctc tcagtataag 2760

gacctgggcg agtactatgc cgagctgaat cccctgctgt accacatcag cttccagaga 2820

atcgccgaga aggagatcat ggatgccgtg gagacaggca agctgtacct gttccagatc 2880

tataacaagg actttgccaa gggccaccac ggcaagccta atctgcacac actgtattgg 2940

accggcctgt tttctccaga gaacctggcc aagacaagca tcaagctgaa tggccaggcc 3000

gagctgttct accgccctaa gtccaggatg aagaggatgg cacaccggct gggagagaag 3060

atgctgaaca agaagctgaa ggatcagaaa accccaatcc ccgacaccct gtaccaggag 3120

ctgtacgact atgtgaatca cagactgtcc cacgacctgt ctgatgaggc cagggccctg 3180

ctgcccaacg tgatcaccaa ggaggtgtct cacgagatca tcaaggatag gcgctttacc 3240

agcgacaagt tctttttcca cgtgcctatc acactgaact atcaggccgc caattcccca 3300

tctaagttca accagagggt gaatgcctac ctgaaggagc accccgagac acctatcatc 3360

ggcatcgcgc ggggcgagag aaacctgatc tatatcacag tgatcgactc caccggcaag 3420

atcctggagc agcggagcct gaacaccatc cagcagtttg attaccagaa gaagctggac 3480

aacagggaga aggagagggt ggcagcaagg caggcctggt ctgtggtggg cacaatcaag 3540

gatctgaagc agggctatct gagccaggtc atccacgaga tcgtggacct gatgatccac 3600

taccaggccg tggtggtgct ggagaacctg aatttcggct ttaagagcaa gaggaccggc 3660

atcgccgaga aggccgtgta ccagcagttc gagaagatgc tgatcgataa gctgaattgc 3720

ctggtgctga aggactatcc agcagagaaa gtgggaggcg tgctgaaccc ataccagctg 3780

acagaccagt tcacctcctt tgccaagatg ggcacccagt ctggcttcct gttttacgtg 3840

cctgccccat atacatctaa gatcgatccc ctgaccggct tcgtggaccc cttcgtgtgg 3900

aaaaccatca agaatcacga gagccgcaag cacttcctgg agggcttcga ctttctgcac 3960

tacgacgtga aaaccggcga cttcatcctg cactttaaga tgaacagaaa tctgtccttc 4020

cagaggggcc tgcccggctt tatgcctgca tgggatatcg tgttcgagaa gaacgagaca 4080

cagtttgacg ccaagggcac ccctttcatc gccggcaaga gaatcgtgcc agtgatcgag 4140

aatcacagat tcaccggcag ataccgggac ctgtatcctg ccaacgagct gatcgccctg 4200

ctggaggaga agggcatcgt gttcagggat ggctccaaca tcctgccaaa gctgctggag 4260

aatgacgatt ctcacgccat cgacaccatg gtggccctga tccgcagcgt gctgcagatg 4320

cggaactcca atgccgccac aggcgaggac tatatcaaca gccccgtgcg cgatctgaat 4380

ggcgtgtgct tcgactcccg gtttcagaac ccagagtggc ccatggacgc cgatgccaat 4440

ggcgcctacc acatcgccct gaagggccag ctgctgctga atcacctgaa ggagagcaag 4500

gatctgaagc tgcagaacgg catctccaat caggactggc tggcctacat ccaggagctg 4560

cgcaaccatg gatcacccaa gaagaaacgg aaagtgtctg gtggttctac taatctgtca 4620

gatattattg aaaaggagac cggtaagcaa ctggttatcc aggaatccat cctcatgctc 4680

ccagaggagg tggaagaagt cattgggaac aagccggaaa gcgatatact cgtgcacacc 4740

gcctacgacg agagcaccga cgagaatgtc atgcttctga ctagcgacgc ccctgaatac 4800

aagccttggg ctctggtcat acaggatagc aacggtgaga acaagattaa gatgctctct 4860

ggtggttctc ccaagaagaa gaggaaagtc ctcgagcacc accaccacca ccactga 4917

Claims

1.一种将CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联方法，所述方法包括：

(a)将CRISPR家族蛋白进行非天然氨基酸的定点突变；

(b)将步骤(a)得到的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白与二苯并环辛炔修饰的核酸进行偶联，从而得到CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物；

其中，所述的非天然氨基酸为

-AeF；

所述CRISPR家族蛋白为SpCas9，在SEQ ID NO.1的第G1367位突变；

或所述CRISPR家族蛋白为AsCas12a，在SEQ ID NO.3的第M806位突变。

2.一种非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白，其中，所述非天然氨基酸为

-AeF；

所述CRISPR家族蛋白为SpCas9，在SEQ ID NO.1的第G1367位突变；

或所述CRISPR家族蛋白为AsCas12a，在SEQ ID NO.3的第M806位突变。

3.如权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，包括如下步骤：

(1)位点选择：根据所述CRISPR家族蛋白的SpCas9或者AsCas12a的结构信息，在所述SpCas9蛋白氨基酸序列中选择第G1367位氨基酸位点，在所述AsCas12a蛋白氨基酸序列中选择第M806位氨基酸位点；

(2)基因突变：将编码步骤(1)中所选择位点的氨基酸的核苷酸利用基因工程方法将突变位点的密码子突变为TAG、TAA或TGA，得到突变的CRISPR蛋白基因；

(3)突变型表达载体构建：将步骤(2)通过基因工程得到的突变的CRISPR蛋白基因通过分子克隆的方式与表达质粒相连接，得到含突变序列的表达载体质粒；

(4)蛋白表达：将(3)得到的表达载体质粒与用于非天然氨基酸插入的工具质粒共同转染到相同的宿主细胞中，在转染成功后的宿主细胞培养液中添加含有所述非天然氨基酸的条件下培养，并诱导宿主细胞表达突变蛋白。

4.如权利要求3所述非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，其中，所述用于非天然氨基酸插入的工具质粒含有tRNA及氨酰-tRNA合成酶，可以特异性识别TAG，并在该密码子对应的位置插入所述非天然氨基酸。

5.如权利要求3所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的制备方法，其中，在步骤(2)中：将SEQ ID NO.1所示蛋白的第G1367位氨基酸的核苷酸的密码子突变为TAG；或将SEQ ID NO.3所示蛋白的第M806位氨基酸的核苷酸的密码子突变为TAG。

6.用于制备权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白的载体，该载体包含编码权利要求2中任一项非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白相应的核酸序列。

7.一种CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，其中，所述CRISPR家族蛋白为权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白。

8.如权利要求7所述的CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物，所述核酸可以是oligoDNA、供体DNA、crRNA及其相关修饰核酸。

9.权利要求2所述的非天然氨基酸定点突变的CRISPR家族蛋白、或者权利要求7或8所述CRISPR家族蛋白与核酸的定点偶联物提高基因编辑效率和/或降低脱靶效应的应用。