CN116212042B - 一种负载rna的脑内递送系统及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物递送体系技术领域，具体涉及一种负载RNA的脑内递送系统及其制备方法。该负载RNA的脑内递送系统包括mDps蛋白纳米笼、ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；其中，ApoE短肽通过静电相互作用吸附RNA，形成ApoE短肽负载RNA体系，RNA是长度在20‑23个碱基的单链或者双链RNA序列；mDps蛋白纳米笼表面连接有若干ApoE短肽负载RNA和若干未负载RNA的ApoE短肽；ApoE短肽的氨基酸序列为LRKLRKRLLLRKLRKRLLK。本发明提出的负载RNA的脑内递送系统可以实现脑神经元靶向递送RNA，可以广泛应用于脑内疾病的治疗。

Description

一种负载RNA的脑内递送系统及其制备方法
技术领域
本发明属于药物递送体系技术领域，具体涉及一种负载RNA的脑内递送系统及其制备方法。
背景技术
载脂蛋白E(apolipoproteinE，ApoE)是一种多态性蛋白，是参与脂蛋白的转化与代谢过程，其基因可以调节许多生物学功能，载脂蛋白E的N端含有低密度脂蛋白受体结合域，因此载脂蛋白E可以与脑血管内皮细胞上的低密度脂蛋白受体结合，通过转饱吞机制，将大分子量物质递送到脑内，实现跨血脑屏障的递送。现有研究发现，由载脂蛋白E衍生出的ApoE短肽依然可以介导大分子物质实现跨血脑屏障的递送。因此，ApoE短肽在介导纳米颗粒实现跨血脑的药物递送领域被广泛应用。
然而，研究人员只关注到ApoE短肽可介导纳米载体跨血脑屏障的能力，却忽略了ApoE短肽作为一个带正电荷的氨基酸序列，其可以高效吸附RNA。截止目前，没有报道利用ApoE短肽负载RNA药物实现跨血脑递送的纳米载体构建方法。
RNA治疗由于其靶点特异性高和毒性低而被广泛用于脑内疾病的治疗，但是RNA作为带负电的大分子，其不易进入细胞，因此常需要递送载体。目前常用的RNA载体有胶束、腺病毒、脂质体、外泌体、无机纳米颗粒以及树枝状大分子，其中脂质体递送载体在很大程度上推动了基因治疗的临床转化，但是RNA递送在脑内疾病治疗方面还有诸多挑战，目前，利用如聚山梨酯80等化学物质修饰包载RNA的阳离子脂质纳米颗粒虽实现了脑内RNA的递送和治疗，但是其RNA载量仍有待优化和提高。除此之外，大部分RNA递送体系只是充当载体身份，其本身并没有治疗功能，这给机体带来了额外的毒性和免疫原性挑战。因此，构建一种无毒且能负载RNA的脑内递送系统是基因治疗领域迫切关注和亟需解决的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明发现了一种可跨血脑屏障的ApoE肽可负载RNA，并提供了一种负载RNA的脑内递送系统及其制备方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种负载RNA的脑内递送系统包括mDps蛋白纳米笼、ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；
其中，所述ApoE短肽通过静电相互作用吸附RNA，形成ApoE短肽负载RNA体系，所述RNA是长度在20-23个碱基的单链或者双链RNA序列；
所述mDps蛋白纳米笼表面通过马来酰亚胺和巯基的反应共价连接有若干ApoE短肽负载RNA体系，并且所述mDps蛋白纳米笼表面通过叠氮和环炔的点击化学反应连接有若干未负载RNA的ApoE短肽，所述ApoE短肽负载RNA体系与所述未负载RNA的ApoE短肽均分布于所述mDps蛋白纳米笼表面；
所述ApoE短肽的氨基酸序列为LRKLRKRLLLRKLRKRLLK；
所述mDps蛋白纳米笼为野生型Dps经过氨基酸突变制备所得，其基因序列如SEQID NO.1所示。
所述RNA长度在20-23个碱基的单链或者双链RNA序列。
本发明还提供该负载RNA的脑内递送系统的制备方法包括：
(1)mDps蛋白纳米笼的制备：获取野生型Dps的基因序列，其基因序列如SEQ IDNO.2，在该序列对应的氨基酸的N端添加6个组氨酸标签，同时将该序列对应的氨基酸的152位的色氨酸替换为半胱氨酸，得到mDps蛋白纳米笼；
(2)制备ApoE短肽负载RNA体系：通过静电相互作用将带负电的RNA吸附到马来酰亚胺活化的ApoE短肽上；
(3)mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米体系：通过共价连接的方式将负载RNA的带有马来酰亚胺活化基团的ApoE短肽修饰到mDps蛋白纳米笼152位的半胱氨酸上，mDps蛋白纳米笼表面再通过叠氮和环炔的点击化学反应修饰连接有未负载RNA末端带叠氮基团的ApoE短肽。
优选地，mDps蛋白纳米笼的制备的步骤如下：
S1、获取野生型Dps的基因序列，在蛋白N端添加6个组氨酸标签，同时将152位的色氨酸替换为半胱氨酸，得到突变体Dps，野生型Dps的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
S2、对大肠杆菌密码子进行优化，促进突变体Dps的基因序列在大肠杆菌中表达，将优化后的突变体mDps的基因序列连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
S3、抽提大肠杆菌穿刺菌Stab-Top10-PET28a-mDps质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建mDps表达菌，加入诱导剂IPTG诱导表达；
S4、收集mDps表达菌的菌体，重悬于20mMPB+100mMNaCl溶液中，冰水混合浴超声破碎后，采用镍柱纯化突变体mDps，纯化后得到mDps蛋白纳米笼，将其透析至PBS溶液中备用。
优选地，S3中，超声破碎的条件为：功率63W，间隔2s，共超声30min。
优选地，S3中，PBS溶液的组成成分为：137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，2mMKH2PO4，pH7.4。
优选地，ApoE短肽负载RNA体系的制备步骤如下：
S1、将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽以质量体积比1:10溶于DMSO中，得到末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶液；
S2、再用150mMNaCl的DEPC水将上述溶液按照1:100稀释至其中所含末端马来酰亚胺活化的ApoE肽的浓度为1mg/mL，得到末端马来酰亚胺活化的ApoE肽稀释液；
S3、按照末端马来酰亚胺活化的ApoE肽：RNA质量比为1:5～1:10的质量比，将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽稀释液加入至4μL20μM的RNA中，充分混匀后，于室温下放置15min，即得ApoE短肽负载RNA体系。
优选地，mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米体系的制备步骤如下：
S1、mDps蛋白纳米笼表面引入环炔基团：mDps蛋白纳米笼与NHS-环炔交联剂按照摩尔比为：1:(40～120)进行混合，于室温下反应后用DEPC水处理过的PBS于超滤管中换液，得到带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼；
S2、上述ApoE短肽负载RNA体系与带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼按照摩尔比为(48～120):1进行混合，于室温下反应，得到负载RNA的mDps蛋白纳米笼；
S3、末端带叠氮基团的ApoE肽与负载RNA的mDps蛋白纳米笼按照摩尔比为(20～120):1进行混合，于室温下反应，即得ApoE肽表面功能化的负载RNA的mDps蛋白纳米笼。
优选地，S1中，所用超滤管为30kDa截留分子量的超滤管。
优选地，S1中，mDps蛋白纳米笼与NHS-环炔交联剂于室温下反应4～5h。
优选地，S2中，ApoE短肽负载RNA体系与带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼混合后，于160rpm振荡反应1～2h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明发现了一种可跨血脑屏障的ApoE肽，并设计构建了一种ApoE肽高效负载RNA至脑神经元的mDps蛋白纳米笼递送系统，本发明构建的递送系统具有RNA载量高和纳米载体mDps可抗氧化的优点。本发明的优点在于ApoE可高效负载RNA，且易于修饰至纳米载体表面，从而实现RNA药物的跨血脑递送。本发明提出的一种负载RNA的脑内递送系统可以联合负载RNA的ApoE偶联蛋白纳米笼实现脑神经元靶向递送RNA，该递送系统可以广泛应用于脑内疾病的治疗。
附图说明
图1为本发明提出的蛋白纳米笼mDps表面修饰ApoE肽和负载RNA的表征；其中，a为：琼脂糖凝胶阻滞实验结果；b为：mDps表面修饰ApoE肽的琼脂糖凝胶表征；c为：共聚焦表征结果，Cy5标记的mDps(红色)和Cy3标记的RNA(绿色)共定位。
图2为本发明提出的跨血脑屏障递送RNA的蛋白纳米笼mDps细胞实验表征；其中，a为：体外血脑屏障示意图；b为：mDpsCy5-ApoE/RNACy3纳米体系在体外血脑屏障模型中的透过情况；c为：共聚焦表征mDpsCy5-ApoE/RNACy3纳米体系与脑血管内皮细胞(血脑屏障的主要组成细胞)的相互作用；d为：共聚焦表征mDpsCy5-ApoE/RNACy3纳米体系与神经母细胞瘤细胞(体外神经元模型)的相互作用，红色(Cy3标记)代表RNA，白色(Cy5标记)代表mDps。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
在下面的所有实施例部分使用的PBS溶液均为同一种溶液。
本发明所提供负载RNA的脑内递送系统可负载的RNA包括：
mmu-miR-124-3pmimic(sense：5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',如SEQ ID NO.3所示，antisense:5'-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3'，如SEQ IDNO.4所示)、
siCD73(sense：5'-CCAUCAAAGCAGACAUUAA(dT)(dT)-3',如SEQ IDNO.5所示，antisense:：UUAAUGUCUGCUUUGAUGG(dT)(dT)，如SEQ IDNO.6所示)、
siIRAKM(sense：5'-CAGCAGAGUUCUACCAUAA(dT)(dT)-3',如SEQ IDNO.7所示，antisense:：5'UUAUGGUAGAACUCUGCUG(dT)(dT)3'，如SEQ IDNO.8所示)、
siCsf1r(sense：5'GAGGGUUCAUUAUCCGCAA(dT)(dT)3',如SEQ IDNO.9所示，antisense:：5'UUGCGGAUAAUGAACCCUC(dT)(dT)3'，如SEQ IDNO.10所示)、
siCD274(sense：5'GGGAUGCUUCUCAAUGUGA(dT)(dT)3',如SEQ ID NO.11所示，antisense:：5'UCACAUUGAGAAGCAUCCC(dT)(dT)3'，如SEQ ID NO.,12所示)；
实施例1
一种负载RNA的脑内递送系统包括mDps蛋白纳米笼、ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；
其中，所述ApoE短肽通过静电相互作用吸附RNA，形成ApoE短肽负载RNA体系，所述RNA的基因序列为：mmu-miR-124-3pmimic(sense：5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',antisense:5'-GGCAUUCACCGCGUGCC UUA-3')；
所述mDps蛋白纳米笼表面通过马来酰亚胺和巯基的反应共价连接有若干ApoE短肽负载RNA体系，并且所述mDps蛋白纳米笼表面通过叠氮和环炔的点击化学反应连接有若干未负载RNA的ApoE短肽，所述ApoE短肽负载RNA体系与所述未负载RNA的ApoE短肽均分布于所述mDps蛋白纳米笼表面；
所述ApoE短肽的氨基酸序列为LRKLRKRLLLRKLRKRLLK；
所述mDps蛋白纳米笼为野生型Dps经过氨基酸突变制备所得，其基因序列如SEQID NO.1所示。
该负载RNA的脑内递送系统的制备方法，具体如下：
(1)mDps蛋白纳米笼的制备
S1、在NCBI中获取野生型Dps的基因序列，其基因序列如SEQ ID NO.2，在该序列对应的在蛋白N端加6个组氨酸标签，并将152位的色氨酸(W)替换为半胱氨酸(C)；
其中，野生型Dps的基因序列如下：
ATGAGTACCGCTAAATTAGTTAAATCAAAAGCGACCAATCTGCTTTAT
ACCCGCAACGATGTCTCCGACAGCGAGAAAAAAGCAACAGTAGAGTTGC
TGAATCGCCAGGTTATCCAGTTTATTGATCTTTCTTTGATTACCAAACAAG
CGCACTGGAACATGCGCGGCGCTAACTTCATTGCCGTACATGAAATGCTG
GATGGCTTCCGCACCGCACTGATCGATCATCTGGATACCATGGCAGAACG
TGCAGTGCAGCTGGGCGGTGTAGCTCTGGGGACCACTCAAGTTATCAACA
GCAAAACCCCGCTGAAAAGTTACCCGCTGGACATCCACAACGTTCAGGA
TCACCTGAAAGAACTGGCTGACCGTTACGCAATCGTCGCTAATGACGTAC
GCAAAGCGATTGGCGAAGCGAAAGATGACGACACCGCAGATATCCTGAC
CGCCGCGTCTCGCGACCTGGATAAATTCCTGTGGTTTATCGAGTCTAACAT
CGAATAA；
S2、对大肠杆菌密码子进行优化，促进突变体Dps的基因序列在大肠杆菌中表达，并将合成末端酶切位点为NcoI和XhoI的mDps片段(530nt)连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
经大肠杆菌密码子进行优化后，突变体mDps的基因序列如下：
ATGCATCATCATCATCATCATAGCACCGCCAAACTGGTTAAAAGCAAAGCCACCAACCTGCTGTATACCCGTAACGATGTTTCCGATTCAGAAAAAAAAGCAACCGTTGAACTGCTGAATCGTCAGGTTATTCAGTTTATTGATCTGAGCCTGATTACCAAACAGGCACATTGGAATATGCGTGGTGCAAATTTTATTGCAGTTCATGAAATGCTGGATGGTTTTCGTACCGCACTGATTGATCATCTGGATACAATGGCTGAACGTGCAGTTCAGCTGGGTGGTGTTGCACTGGGTACCACCCAGGTTATTAATAGCAAAACCCCGCTGAAAAGCTATCCGCTGGATATTCATAATGTTCAGGATCATCTGAAAGAACTGGCAGATCGTTATGCAATTGTTGCAAATGATGTTCGTAAAGCAATTGGTGAAGCAAAAGATGATGATACCGCAGATATTCTGACCGCAGCAAGCCGTGATCTGGATAAATTTCTGTGTTTTATTGAAAGCAATATTGAATAA；
S3、将上述Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌划线于37℃培养过夜，挑单菌抽提质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒PET28a-mDps转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建mDps表达菌E.coliRosetta-PET28a-mDps，加入500μL终浓度为1mM的IPTG诱导表达；
S4、收集经IPTG诱导表达后的Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌的菌体，于功率63W，间隔2s的条件下，共超声破碎30min后，采用镍柱纯化突变体mDps，纯化后得到mDps蛋白纳米笼，将其透析至PBS中用BCA法试剂盒测浓度备用。
其中，镍柱纯化的步骤如下：
经IPTG诱导表达后收集E.coliRosetta-PET28a-mDps的菌体经超声破碎后，于4℃下离心12000rpm，25min除去沉淀，同时用去离子水清洗镍柱，然后用含5mM咪唑的20mMPB溶液平衡镍柱；取离心后的蛋白上清用0.2μm的水系滤膜过滤后加入到平衡好的镍柱中，于4℃冰箱100rpm振荡孵育2h，然后垂直放置镍柱，使未结合的蛋白溶液通过重力流出，依次由5mM、80mM、100mM、150mM和1M浓度的咪唑梯度洗脱，1M的咪唑可全部洗脱目的蛋白；洗脱结束后，将目的蛋白透析到PBS溶液中，低温保存。
(2)mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米笼递送体系的制备
本部分所用的特殊材料来源如下：
NHS-环炔交联剂购买自Nanocs；
末端马来酰亚胺活化的ApoE肽购买自强耀生物公司；
末端带叠氮基团的ApoE肽购买自强耀生物公司；
DEPC水购买自生工生物工程有限公司；
30kDa截留分子量的超滤管购自Millipore公司。
S1、在mDps蛋白纳米笼表面引入环炔基团：将NHS-环炔交联剂与mDps蛋白纳米笼按照质量比60:1进行混合，于室温下160rpm振荡反应4h，反应后用DEPC水处理过的PBS于30kDa截留分子量的超滤管中换液，得到带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼；
S2、将0.3mg末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶于3μL100mg/mL的DMSO中，然后用297μL含150mMNaCl的DEPC水稀释至浓度为1mg/mL，然后按照末端马来酰亚胺活化的ApoE肽：RNA质量比为5:1，将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽加入至4μL20μM的RNA中，充分混匀后，于室温下放置15min，即得ApoE短肽负载RNA体系；
S3、所述ApoE短肽负载RNA体系与带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼按照48:1混合，于室温下160rpm振荡反应2h，得到负载RNA的mDps蛋白纳米笼；
S4、末端带叠氮基团的ApoE肽与得到负载RNA的mDps蛋白纳米笼按照120:1混合，于室温下160rpm振荡反应1h，即得ApoE肽表面功能化的负载RNA的mDps蛋白纳米笼。
实施例2
一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，与实施例1步骤基本相同，区别在于：
RNA的基因序列不同，本实施例中RNA的基因序列为：diMIA(sense:5'GAACGACUGAAGAUAGCAA(dT)(dT)3',antisense:5'UUGCUAUCUUCAG UCGUUC(dT)(dT)3')。
实施例3
一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，与实施例1步骤基本相同，区别在于：
RNA的基因序列不同，本实施例中RNA的基因序列为siNC(sense:5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，antisense:5'-ACGUCGCACGUUCGGAGAATT-3')。
实施例4
一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，与实施例1步骤基本相同，区别在于：
RNA的基因序列不同，本实施例中RNA的基因序列为：siDPP4(sense:5'-CCAAGAAAUAUCCUCUACUAUTT-3'，antisense:5'-AUAGUAGAGGAUAU UUCUUGGTT-3')。
对比例1
一种脑内递送系统包括ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；
其中，所述RNA的序列为：mmu-miR-124-3pmimic(sense：5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',antisense:5-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3')。
该脑内递送系统的制备方法，具体如下：
(1)mDps蛋白纳米笼的制备
S1、在NCBI中获取野生型Dps的基因序列，在蛋白N端加6个组氨酸标签，并将152位的色氨酸替换为半胱氨酸；
S2、将合成末端酶切位点为NcoI和XhoI的mDps片段(530nt)连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
S3、将上述Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌划线培养37℃过夜，挑单菌抽提质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒PET28a-mDps转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建mDps表达菌E.coliRosetta-PET28a-mDps，加入1mM IPTG诱导表达；
S4、收集表达后的菌体，超声破碎(超声条件为：功率63W，on:2s,off:2s，共30min)后，采用镍柱纯化突变体mDps，将纯化得到的mDps透析至PBS(1×)中测浓度备用。
(2)mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米笼递送体系的制备；
将0.3mg末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶于3μLDMSO中，得到ApoE肽的浓度为100mg/mL，然后用297μL含150mMNaCl的DEPC水将其稀释至所含ApoE肽的浓度为1mg/mL，然后按照末端马来酰亚胺活化的ApoE肽：RNA质量比为5:1，将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽加入至4μL20μM的RNA中，充分混匀后，于室温下放置15min，即得末端带有活化马来酰亚胺基团的ApoE肽/RNA复合物；末端带有活化马来酰亚胺基团的ApoE肽/RNA复合物与mDps蛋白纳米笼按照72:1混合，于室温下160rpm振荡反应1h，即得负载RNA的mDps蛋白纳米笼。
对比例1与实施例1相比，其所制备的递送系统虽然能负载RNA，但是不能实现RNA的跨血脑递送。
对比例2
一种脑内递送系统包括ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；
其中，所述RNA的序列为mmu-miR-124-3pmimic(sense5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',antisense:5'-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3')。
该脑内递送系统的制备方法，具体如下：
(1)mDps蛋白纳米笼的制备
S1、在NCBI中获取野生型Dps的基因序列，在蛋白N端加6个组氨酸标签，并将152位的色氨酸替换为半胱氨酸；
S2、将合成末端酶切位点为NcoI和XhoI的mDps片段(530nt)连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
S3、将上述Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌划线培养37℃过夜，挑单菌抽提质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒PET28a-mDps转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建Dps表达菌E.coliRosetta-PET28a-mDps，加入1mM IPTG诱导表达；
S4、收集表达后的菌体，超声破碎(超声条件为：功率63W，on:2s,off:2s，共30min)后，采用镍柱纯化突变体mDps，将纯化得到的mDps透析至PBS(1×)中测浓度备用。
(2)mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米笼递送体系的制备；
将0.3mg末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶于3μLDMSO中(得到100mg/mL的ApoE肽)，然后以末端带有活化马来酰亚胺基团的ApoE肽与mDps蛋白纳米笼按照72:1混合，于室温下160rpm振荡反应2h，得到表面ApoE肽功能化的mDps蛋白纳米笼；然后在上述产物mDps-ApoE肽中加入4μL，20μM的RNA，充分混匀后，于室温下放置15min，即得表面吸附RNA的mDps蛋白纳米笼；
对比例2与实施例1相比，其所制备的递送系统不能高效负载RNA，因此不能实现RNA的跨血脑递送。
对比例3
一种脑内递送系统包括ApoE短肽、mDps蛋白纳米笼和RNA；
其中，所述RNA的序列为mmu-miR-124-3pmimic(sense:5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',antisense:5'-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3')。
该脑内递送系统的制备方法，具体如下：
(1)mDps蛋白纳米笼的制备
S1、在NCBI中获取野生型mDps的基因序列，在蛋白N端加6个组氨酸标签，并将152位的色氨酸替换为半胱氨酸；
S2、将合成末端酶切位点为NcoI和XhoI的mDps片段(530nt)连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
S3、将上述Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌划线培养37℃过夜，挑单菌抽提质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒PET28a-mDps转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建mDps表达菌E.coliRosetta-PET28a-mDps，加入1mM IPTG诱导表达；
S4、收集表达后的菌体，超声破碎(超声条件为：功率63W，on:2s,off:2s，共30min)后，采用镍柱纯化突变体mDps，将纯化得到的mDps透析至PBS(1×)中测浓度备用。
(2)mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米笼递送体系的制备；
S1、在mDps蛋白纳米笼表面引入环炔基团：mDps蛋白纳米笼表面引入环炔基团：NHS-环炔交联剂与mDps蛋白纳米笼按照质量比60:1混合，于室温下120rpm振荡反应4h，反应后用DEPC水处理过的PBS于30kDa截留分子量的超滤管中换液；
S2、将0.3mg末端带叠氮基团的ApoE肽溶于3μL的DMSO中(得到100mg/mL的肽)，然后用含150mMNaCl的DEPC水稀释至浓度为1mg/mL，然后按照ApoE肽：RNA质量比为50:1，将末端带叠氮基团ApoE肽加入至4μL20μM的RNA中，充分混匀后，于室温下放置15min，即得末端带有叠氮基团的ApoE肽/RNA复合物；
S3、将末端带叠氮基团的ApoE肽/RNA复合物与mDps蛋白纳米笼按照120:1混合，于室温下100rpm振荡反应2h，即得负载RNA的mDps蛋白纳米笼。
对比例3与实施例1相比，其所制备的递送系统不能高效负载RNA，从而不能实现RNA的跨血脑递送。
下面通过实验对本发明实施例1所制备的一种负载RNA的脑内递送系统进行进一步的说明。本发明所制备的负载RNA的脑内递送系统是可跨血脑递送RNA药物的，因此下面的实验是关于本发明所提供的一种负载RNA的脑内递送系统在细胞和动物层面的递送情况。
琼脂糖凝胶阻滞实验
(1)实验方法
S1、首先配制5×TBE溶液(54gTris,、275g硼酸、20mLpH8.0的0.5MEDTA，补充去离子水至1000mL)，然后取200mL的5×TBE溶液加入到800mL去离子水稀释为1×TBE溶液备用；
S2、称取1g低熔点的琼脂糖粉加入到100mL的1×TBE溶液中，利用微波炉中高火加热1min，取出摇匀后继续中高火加热1min，然后加入10μL核酸染料gel-red，摇匀后分别倒入两块插入6孔梳子的胶板中，使其静置凝固40min；
S3、在20μL负载RNA的马来酰亚胺活化的ApoE肽和负载RNA的mDps蛋白纳米笼中分别加入2μL20mg/mL的蛋白酶K，对照组加入2μLPBS溶液，56℃加热30min，然后加入3μL5×RNAloading，充分混匀后加入到上样孔中，详见图1a与图1b，其中：
图1a中的上样顺序为：freeRNA、负载RNA的马来酰亚胺活化的ApoE肽和负载RNA的马来酰亚胺活化的ApoE肽+蛋白酶K；
图1b中的上样顺序为：freeRNA、负载RNA的mDps蛋白纳米笼和负载RNA的mDps蛋白纳米笼+蛋白酶K；
S4、于电泳槽中加入1×TBE溶液1000mL，电泳仪设置120V，20min；跑胶结束后利用Viber凝胶成像仪进行拍照，分别得到图1a和1b。
(2)实验结果
由图1a可知，当负载RNA的马来酰亚胺活化的ApoE肽不加蛋白酶K时泳道中没有RNA释放，而加入蛋白酶K后，释放的RNA条带和对照组条带大小和灰度基本相同，说明马来酰亚胺活化的ApoE肽可高效吸附RNA。
由图1b可知，负载RNA的mDps蛋白纳米笼+蛋白酶K的泳道中释放的RNA几乎和对照组RNA条带大小和灰度基本相同，这说明负载RNA的马来酰亚胺活化的ApoE肽成功修饰到了蛋白纳米笼表面。
共聚焦成像表征负载RNA的蛋白纳米笼
(1)实验方法
S1、在实施例1的S1中得到的带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼，在其基础上加入荧光试剂Cy5进行标记(每mg的mDps蛋白纳米笼加入1μL5mg/mL的荧光试剂Cy5)，将Cy5标记的带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼于室温下160rpm振荡反应4h；
S2、然后用30kDa截留分子量的超滤管于4℃，4000rpm，每15min离心换液一次(用DEPC水处理过的PBS)，得到荧光试剂Cy5标记的带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼；
S3、将0.3mg末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶于3μL100mg/mL的DMSO中，然后用297μL含150mMNaCl的DEPC水稀释至浓度为1mg/mL，然后按照ApoE肽：RNA质量比为5:1(该RNA是荧光试剂Cy3标记的)，将ApoE肽加入至4μL20μM的Cy3标记的RNA中，充分混匀后，于室温下放置15min，即得末端带有活化马来酰亚胺基团的ApoE肽/RNA-Cy3复合物；
S4、末端带有活化马来酰亚胺基团的ApoE肽/RNA-Cy3复合物与Cy5标记的带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼按照48:1混合，于室温下160rpm振荡反应1h，得到荧光标记的负载RNA的蛋白纳米笼mDpsCy5-ApoE/RNACy3；
S5、最后将末端带叠氮基团的ApoE肽与mDpsCy5-ApoE/RNACy3按照120:1混合，于室温下160rpm振荡反应1h，即得荧光标记的ApoE肽表面功能化的负载RNA的Dps蛋白纳米笼。
S6、取1μL的mDpsCy5-ApoE/RNACy3加入到玻璃底小皿，利用共聚焦显微镜在60倍油镜下观察荧光标记的负载RNA的蛋白纳米笼，Cy5用647nm激发，Cy3用561nm激发，详见图1c。
(2)实验结果
由图1c可知，荧光试剂Cy5标记的mDps蛋白纳米笼与Cy3标记的RNA共定位，说明蛋白纳米笼成功负载RNA。
跨血脑屏障递送RNA的蛋白纳米笼mDps细胞实验表征
(1)实验方法
将400μL鼠脑血管内皮细胞bEnd.3(1.5×105个/mL)加入到Transwell血脑屏障体外模型的上室中，每天更换一次新鲜培养基(培养基的配方为：DMEM+10％FBS+1％双抗)，连续培养7天，待上室细胞的跨内皮电阻值大于200Ω·cm2后，用PBS溶液清洗细胞两次，然后分别于50μL荧光标记的负载RNA的mDps蛋白纳米笼mDpsCy5-ApoE/RNACy3和游离RNA(Cy3标记)中加入200μLOPTI-MEM，充分混匀后加入到Transwell上室的bEnd.3细胞里，同时在下室中也加入200μLOPTI-MEM，37℃孵育4h后，取下室培养基150μL加入到黑色96孔板中，利用小动物成像仪进行观察Cy5标记的mDps蛋白纳米笼与Cy3标记的RNA跨过Transwell血脑屏障体外模型的情况。
(2)实验结果
由图2b可知，蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3孵育组在Transwell小室的下室有明显的Cy5和Cy3荧光，而游离的RNA组在Cy3通道下没有检测到荧光信号，说明蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3可以成功负载RNA跨bEnd.3细胞进入到下室中，表明蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3有望用于活体跨血脑屏障递送RNA。
共聚焦表征mDpsCy5-ApoE/RNACy3纳米体系与脑血管内皮细胞(血脑屏障的主要组成细胞)和神经母细胞瘤细胞的相互作用
(1)实验方法
消化脑血管内皮细胞bEnd.3和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y，用细胞计数仪分别测定其细胞浓度，用完全培养基DMEM调整细胞浓度至2.0×105cell/mL，分别取0.5mL的消化脑血管内皮细胞bEnd.3和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y铺在不同的15mm玻璃底小皿，每种细胞各铺两个小皿，过夜培养；用PBS溶液清洗细胞2次，分别在50μL荧光标记的负载RNA的mDps蛋白纳米笼mDpsCy5-ApoE/RNACy3和游离RNA(Cy3标记)中加入400μLOPTI-MEM，充分混匀后分别加入到消化脑血管内皮细胞bEnd.3和神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y中，37℃孵育3h，用PBS溶液清洗细胞3次，4％的PTA加入1mL常温固定20min，用PBS溶液清洗细胞2次，使用1mL终浓度为10μg/mL的DAPI染细胞核15min，用PBS溶液清洗细胞3次，用Nikon激光共聚焦显微镜60倍油镜观察样品，开启波长为405、561和647nm的激光器，拍照保存，后续用NISViewer导出各通道的图片。
(2)实验结果
由图2c共聚焦显微镜成像结果可知，蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3组与bEnd.3细胞孵育后，荧光Cy5标记的mDps蛋白纳米笼与Cy3标记的RNA共定位且分布于细胞核周围，而游离的RNA进细胞效率明显很低，充分说明蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3可以成功负载RNA进入bEnd.3细胞，这再次为蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3跨体外Transwell血脑屏障模型提供了证据。
由图2d共聚焦显微镜成像结果可知，蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3组与SH-SY5Y细胞孵育后，荧光Cy5标记的mDps蛋白纳米笼与Cy3标记的RNA也是共定位且分布于SH-SY5Y细胞核周围，而游离的RNA被SH-SY5Y细胞摄入的效率明显很低，充分说明蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3可以成功负载RNA进入SH-SY5Y细胞，这为蛋白纳米笼体系mDpsCy5-ApoE/RNACy3递送RNA到神经元提供了依据。
本发明使用的RNA为长度为20个碱基的双链RNA，名称为mmu-miR-124-3pmimic，其序列为(sense:5'-UAAGGCACGCGGUGAAUGCC-3',antisense:5'-GGCAUUCACCGCGUGCCUUA-3'),mmu-miR-124-3pmimic，其可以通过本发明制备的蛋白纳米笼体系跨血脑屏障递送至神经元，用于过表达神经元中的miR-124基因，起到减缓神经元凋亡的病理进程。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种负载RNA的脑内递送系统，其特征在于，包括mDps蛋白纳米笼、ApoE短肽和RNA；
其中，所述ApoE短肽通过静电相互作用吸附RNA，形成ApoE短肽负载RNA体系，所述RNA是长度在20-21个碱基的双链RNA序列；
所述mDps蛋白纳米笼表面通过马来酰亚胺和巯基的反应共价连接有若干ApoE短肽负载RNA体系，所述ApoE短肽为马来酰亚胺活化的ApoE肽，并且所述mDps蛋白纳米笼表面通过叠氮和环炔的点击化学反应连接有若干未负载RNA的ApoE短肽，所述未负载RNA的ApoE短肽为末端带叠氮基团的ApoE肽，所述ApoE短肽负载RNA体系与所述未负载RNA的ApoE短肽均分布于所述mDps蛋白纳米笼表面；所述ApoE短肽的氨基酸序列为LRKLRKRLLLRKLRKRLLK；
所述mDps蛋白纳米笼为野生型Dps经过氨基酸突变制备所得，其基因序列如SEQ IDNO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，包括：
mDps蛋白纳米笼的制备：获取野生型Dps的基因序列，其基因序列如SEQ ID NO.2，在该序列对应的氨基酸的N端添加6个组氨酸标签，同时将该序列对应的氨基酸的152位的色氨酸替换为半胱氨酸，得到mDps蛋白纳米笼；
（2）制备ApoE短肽负载RNA体系：通过静电相互作用将带负电的RNA吸附到马来酰亚胺活化的ApoE短肽上；
（3）mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米体系：通过共价连接的方式将负载RNA的带有马来酰亚胺活化基团的ApoE短肽修饰到mDps蛋白纳米笼152位的半胱氨酸上，mDps蛋白纳米笼表面再通过叠氮和环炔的点击化学反应修饰连接有未负载RNA末端带叠氮基团的ApoE短肽。
3.根据权利要求2所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，mDps蛋白纳米笼的制备步骤如下：
S1、获取野生型Dps的氨基酸序列，在蛋白N端添加6个组氨酸标签，同时将152位的色氨酸替换为半胱氨酸，得到突变体Dps，野生型Dps的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
S2、对大肠杆菌密码子进行优化，促进突变体Dps的基因序列在大肠杆菌中表达，将优化后的突变体mDps的基因序列连接到PET28a载体上，得到Stab-Top10-PET28a-mDps穿刺菌；
S3、抽提大肠杆菌穿刺菌Stab-Top10-PET28a-mDps质粒后进行测序，将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌的表达菌株Rosetta中，构建mDps表达菌，加入诱导剂IPTG诱导表达；
S4、收集mDps表达菌的菌体，重悬于20 mM PB+100 mM NaCl溶液中，冰水混合浴超声破碎后，采用镍柱纯化突变体mDps，纯化后得到mDps蛋白纳米笼，将其透析至PBS溶液中备用。
4.根据权利要求3所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，S4中，超声破碎的条件为：功率63W，间隔2s，共超声30min。
5.根据权利要求3所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，S4中，PBS溶液的组成成分为：137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，pH 7.4。
6.根据权利要求2所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，ApoE短肽负载RNA体系的制备步骤如下：
S1、将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽以质量体积比1:10溶于 DMSO中，得到末端马来酰亚胺活化的ApoE肽溶液；
S2、再用150 mM NaCl的DEPC水将上述溶液按照1:100稀释至其中所含末端马来酰亚胺活化的ApoE肽的浓度为1mg/mL，得到末端马来酰亚胺活化的ApoE肽稀释液；
S3、按照末端马来酰亚胺活化的ApoE肽：RNA质量比为1:5~1:10的质量比，将末端马来酰亚胺活化的ApoE肽稀释液加入至4μL 20μM的RNA中，充分混匀后，于室温下放置，即得ApoE短肽负载RNA体系。
7.根据权利要求2所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，mDps蛋白纳米笼联合ApoE肽负载RNA纳米体系的制备步骤如下：
S1、mDps蛋白纳米笼表面引入环炔基团：mDps蛋白纳米笼与NHS-环炔交联剂按照摩尔比为1:（40 ~ 120）进行混合，于室温下反应后用DEPC水处理过的PBS于超滤管中换液，得到带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼；
S2、上述ApoE短肽负载RNA体系与带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼按照摩尔比为（48~120）:1进行混合，于室温下反应，得到负载RNA的mDps蛋白纳米笼；
S3、末端带叠氮基团的ApoE肽与负载RNA的mDps蛋白纳米笼按照摩尔比为（20~120）:1进行混合，于室温下反应，即得ApoE肽表面功能化的负载RNA的mDps蛋白纳米笼。
8.根据权利要求7所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，S1中，所用超滤管为30kDa截留分子量的超滤管。
9.根据权利要求7所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，S1中，mDps蛋白纳米笼与NHS-环炔交联剂于室温下反应4~5h。
10.根据权利要求7所述的一种负载RNA的脑内递送系统的制备方法，其特征在于，S2中，ApoE短肽负载RNA体系与带有环炔基团的mDps蛋白纳米笼混合后，于160rpm振荡反应1~2h。
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