CN113388008B

CN113388008B - 一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体lca2及其应用

Info

Publication number: CN113388008B
Application number: CN202110714475.7A
Authority: CN
Inventors: 刘地; 武晓英; 乔宏萍; 李娜; 李美艳; 苏瑞军; 张椰莉
Original assignee: Taiyuan Normal University
Current assignee: Taiyuan Normal University
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113388008A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体公开了一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2，所述蛋白运输载体LCA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述LCA2载体作为一种内质网靶向的蛋白和药物分子的自释放型运输载体，能够用于运送融合在其N端或与其偶联的蛋白药物。

Description

一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2及其应用。

背景技术

随着生物医药领域的不断发展，新技术的持续突破，生物药物得到了飞速发展。与化学药物相比，生物药物具有活性高、特异性强、靶向性好、毒副作用少等特点。而蛋白药物又是生物药物的主体，新品种蛋白药物数量呈指数级增长，在药物市场所占比例也逐年增加。

目前已有的细胞内药物递送方式主要有细胞膜电穿孔、细胞膜机械穿孔、细胞穿膜肽、两性离子聚合物载体、病毒载体以及纳米微粒载体等等。相较于电穿孔或机械穿孔，亦或通过两性化学分子或病毒载体这些递送方式，使用细胞穿膜肽作为运输蛋白的载体更适用于临床研究和治疗。细胞穿膜肽是一种能够自发穿过质膜的短链多肽，可通过共价或非共价结合，将与之连接的物质(如：寡核苷酸DNA、RNA，肽，蛋白质，纳米颗粒，脂质体等)送入细胞，甚至直接运送到亚细胞器。

内质网是单层膜形成的囊状、泡状和管状膜结构,并相互连接形成连续的网膜系统。通常它内层与核膜相连，外层与质膜相连，系统的联系了细胞核、细胞质和细胞膜这三大细胞结构，是细胞内蛋白质合成、脂质合成、物质运输和糖类代谢的主要场所。此外，它还参与细胞骨架形成、细胞内物质的传送、药物代谢及解毒过程。研究表明内质网功能的紊乱与许多人类疾病的发病机制相关，如癌症、炎症性疾病、代谢性疾病、骨质疏松症及神经退行性疾病等。

蛋白类药物往往是大分子，无法同小分子化学药物一样直接穿过细胞膜进入病变细胞进行治疗，因其缺乏有效的胞质递送策略，对于细胞内的靶标往往无法发挥其功效。因此，开发安全有效的细胞内药物递送载体尤为重要。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2，所述载体LCA2作为一种内质网靶向的蛋白和药物分子的自释放型运输载体，能够用于运送融合在其N端或与其偶联的蛋白药物。

本发明提供了自释放酶敏感位点Cs，所述自释放酶敏感位点Cs的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示

本发明还提供了包含上述位点Cs的细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2，所述蛋白运输载体LCA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述蛋白运输载体LCA2由连接子Linker、自释放酶敏感位点Cs与穿模结构域A2组成。

进一步地，所述连接子Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，所述穿模结构域A2的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了上述细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2的构建方法，所述蛋白运输载体LCA2可采用多肽的化学合成方法构建，或是以LCA2融合蛋白的获取与检测的方法通过基因工程技术构建。

进一步地，所述LCA2融合蛋白的获取与检测的方法包括载体蛋白LAC2的制备、LCA2融合蛋白的表达纯化、LCA2融合蛋白的细胞内定位和模式靶蛋白在细胞内的分离检测。

进一步地，所述LCA2融合蛋白可通过但不限于大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞及昆虫细胞等利用基因工程技术获取。

本发明还提供了上述细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2在运载生物活性蛋白或蛋白药物中的应用

进一步地，所述蛋白药物包括但不限于多肽、基因工程蛋白药物、单克隆抗体、基因工程抗体和重组疫苗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中蛋白运输载体LCA2的结构示意图；

图2为本发明实施例1中mCherry-LCA2融合蛋白的凝胶电泳图；

图3为本发明LCA2融合蛋白的细胞定位的荧光显微镜图；

其中，图3(a)表示细胞融合图；

图3(b)表示mCherry-LCA2融合蛋白进入细胞内部显色图；

图3(c)表示内质网ER-Tracker Green荧光染料染色图；

图3(d)表示细胞核用Hoechst 33342荧光染料标记染色图；

图4为本发明不同浓度的mCherry-LCA2融合蛋白在细胞内，模式靶蛋白mCherry与LCA2载体分离情况的检测结果图；

图5为本发明实施例1中融合蛋白mCherry-LCA2的不同作用浓度在不同时间的细胞相对活力影响的柱形统计图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明各实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

一、细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2：

所述蛋白运输载体LCA2由连接子Linker(氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)、自释放酶敏感位点Cs(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)与穿模结构域A2(氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示)；如图1所示。

SEQ ID NO.3：GGGGS

SEQ ID NO.1：CGNAPRSSMSNTC

SEQ ID NO.4：

DEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDEL

所述蛋白运输载体LCA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

SEQ ID NO.2：

GGGGS-CGNAPRSSMSNTC-DEKTQSLGVKFLDEYQSKVKRQIFSGYQSDIDTHNRIKDEL

二、所述蛋白运输载体LCA2的制备方法

1、LCA2载体可采用多肽的化学合成方法制备，或是以融合表达的方式通过基因工程技术制备。

2、本实施例以樱桃红荧光蛋白mCherry为模式靶蛋白，采用融合表达的方式制备模式融合蛋白mCherry-LCA2，具体步骤如下：

(1)融合蛋白的表达与纯化

将重组质粒转入大肠杆菌表达宿主菌中，从抗性平板上挑取单克隆，接种到含LB培养基的试管中，37℃，200rpm振荡培养过夜。取1mL菌液加入到含100mL LB培养基的锥形瓶中，37℃，200rpm振荡培养约2.5h。菌液OD600达到约0.6时，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导剂，30℃诱导表达10h。蛋白表达结束后4℃离心15min收集菌体，采用Tris缓冲体系进行亲和纯化与凝胶层析，获得高纯度的mCherry-LCA2重组蛋白，使用SDS-PAGE进行分析。

结果如图2所示：mCherry片段的理论分子量为27.0kDa，LCA2片段的理论分子量为6.8kDa，mCherry-LCA2重组蛋白理论分子量为33.8kDa，经Ni聚合材料亲和纯化后，其他杂蛋白被有效地除去，仅留有一条杂带，经过凝胶层析的二次纯化后，杂蛋白被除去，仅剩目标蛋白，获得了高纯度的目标蛋白。

(2)融合蛋白的细胞定位检测

将细胞消化后，按照2×10⁴的密度，接种到35mm的共聚焦培养皿中，在37℃，5％CO₂条件下培养24h。将终浓度20μg/mL的mCherry-LCA2融合蛋白加入到培养皿中，在37℃孵育12h。随后弃去培养液，加入1mL ER-Tracker Green荧光染料，37℃孵育20min。最后加入1mLHoechst 33342荧光染料，孵育10min，用PBS溶液洗涤细胞2次，使用激光共聚焦显微镜进行成像。

结果如图3所示：细胞核被Hoechst 33342荧光染料标记，呈现蓝色；mCherry-LCA2融合蛋白进入细胞内部，其所在区域呈现红色；ER-Tracker Green荧光染料将内质网标记为绿色，细胞内绿色荧光和红色荧光的亮斑出现在相同的位置，且紧邻细胞核，该结果证明了LCA2运输载体能将靶蛋白运输至内质网。

(3)模式靶蛋白与载体在细胞内的分离检测

将mCherry-LCA2融合蛋白作用后的细胞用PBS清洗3次，加入适量的细胞裂解液，冰上裂解30min，4℃离心15min，收集上清液。通过SDS-PAGE分离蛋白，将蛋白转印至PVDF膜上，放入5％的脱脂奶粉中，室温封闭1h，加入稀释后的一抗溶液4℃孵育过夜。将PVDF膜取出后，用TBST缓冲液漂洗3次后，转入稀释后的二抗溶液中，室温孵育1h。最后用TBST缓冲液漂洗3次，加入ECL试剂，暗处静置5min，使用凝胶成像系统进行显影分析。

结果如图4所示：Western blot结果显示，在mCherry-LCA2融合蛋白实验组中，通过mCherry抗体能够检测出较低含量的mCherry-LCA2蛋白与较高含量的mCherry片段，提高作用浓度后(40μg/mL)，能够检测到更高含量的mCherry片段，结果证明了LCA2结构域在细胞内被相关蛋白酶有效切割，模式靶蛋白被释放出来。

(4)融合蛋白对细胞活力影响的检测

将细胞消化后，按照1×10⁴的密度接种至96孔板。在37℃，5％CO₂条件下培养24h。向样品孔中加入不同浓度的mCherry-LCA2融合蛋白(0μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)，与细胞在37℃共孵育一段时间(6h、12h、18h、24h)，最后向孔中加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育1h，用酶标仪测量450nm处的吸光度。

结果如图5所示：细胞活力的CCK-8法检测结果表明，随着融合蛋白mCherry-LCA2作用浓度的提高(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL)与作用时间的延长(6h、12h、18h和24h)，细胞活力并没有明显降低，不呈现浓度依赖与时间依赖。当作用浓度低于40μg/mL时，各实验组细胞的存活率均高于95％；当作用浓度为40μg/mL时，仅在作用时间为24h时，细胞存活率有略微下降，但仍然高于90％，结果表明融合蛋白mCherry-LCA2对细胞活力几乎没有影响，安全性好。

本发明中的LCA2载体可以作为一种内质网靶向的蛋白和药物分子的自释放型运输载体，该载体的运载过程是沿着细胞膜-高尔基体-内质网的行进路径进行的，A2结构域末端的内质网定位序列KDEL使其驻留在内质网，通过细胞内已有的酶对酶敏感位点的切割，将偶联的靶蛋白释放出来。根据其结构与转运机制，LCA2特别适合运送那些融合在其N端的蛋白药物，相比于传统的C端融合穿膜肽，这种优势为重组蛋白药物的设计提供了更多的选择，可广泛应用于科学研究和疾病治疗领域。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 太原师范学院

<120> 一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Cys Gly Asn Ala Pro Arg Ser Ser Met Ser Asn Thr Cys

1 5 10

<210> 2

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 2

Gly Gly Gly Gly Ser Cys Gly Asn Ala Pro Arg Ser Ser Met Ser Asn

1 5 10 15

Thr Cys Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu

20 25 30

Tyr Gln Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp

35 40 45

Ile Asp Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu

50 55

<210> 3

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 4

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 4

Asp Glu Lys Thr Gln Ser Leu Gly Val Lys Phe Leu Asp Glu Tyr Gln

1 5 10 15

Ser Lys Val Lys Arg Gln Ile Phe Ser Gly Tyr Gln Ser Asp Ile Asp

20 25 30

Thr His Asn Arg Ile Lys Asp Glu Leu

35 40

Claims

1.一种细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2，其特征在于，所述蛋白运输载体LCA2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2的构建方法，其特征在于，所述蛋白运输载体LCA2采用多肽的化学合成方法构建，或是以融合表达的方式通过基因工程技术构建。

3.权利要求2所述的细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2的制备方法，其特征在于，所述融合表达的方式包括制备融合蛋白、融合蛋白的表达纯化、融合蛋白的细胞定位和模式靶蛋白在细胞内的分离。

4.如权利要求1所述的细胞内质网靶向的自释放型蛋白运输载体LCA2在运载生物活性蛋白或蛋白药物中的应用。