CN106913864A - 融合蛋白tat‑dcf1的新用途 - Google Patents

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文铁桥
王倩
王娇
周方方
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Abstract

本发明涉及一种融合蛋白TAT‑DCF1的新用途。本发明通过免疫电镜、原子力显微镜、CCK8增殖检测、JC‑1染色、裸鼠肿瘤异位移植等方法对dcf1诱导U251细胞系凋亡做出判断，结果表明dcf1通过定位于线粒体引起线粒体结构病变，膜电位下降，从而引起凋亡相关基因表达量发生改变，最终导致凋亡。裸鼠实验表明，dcf1能显著减小胶质瘤的肿瘤体积，抑制肿瘤生长。

Description

融合蛋白TAT-DCF1的新用途
技术领域
本发明涉及了一种融合蛋白TAT-DCF1的新用途。
背景技术
恶性胶质瘤是成年人中最具侵略性、最致命和最普遍的脑恶性肿瘤。即使外科技术、放射治疗、化学治疗已经有所进步，但是胶质瘤病人的生存中期依然仅维持在14个月。虽然基因治疗是很有潜力的治疗方法，但是对于安全有效的基因运输系统的发展仍然存在问题。此外，在这些治疗方法的途中，即使治疗效果不佳，但是病人仍将承受更多的痛苦，因此，开发低副作用的药物很有必要。
树突细胞因子（DCF1），也叫作跨膜蛋白59（TMEM59），是一种膜蛋白，早先发现它与神经干细胞的分化有关。新近研究结果表明，完整的dcf1基因在胶质瘤细胞中过表达DCF1蛋白，能够显著抑制细胞的增殖、存活并最终通过毁坏线粒体而导致细胞凋亡。人源TMEM59的胞内区域也包含19个氨基酸的肽段，这个肽段可以靶向特异性的膜成分致使自噬降解的发生。DCF1已经被证明可能是一种治疗胶质瘤病人的新途径。
然而，受血脑屏障及血脑间肿瘤障碍的影响，新药的开发比较慢。为了避开这些问题的一个途径是，使用HIV 反式转录激活因子TAT介导的蛋白转导。来源于人类免疫缺陷病毒1的TAT（47YGRKKRRQRRR57）是一种富含正电荷精氨酸的多肽，它不仅能将携带的货物转导进入细胞膜，还能进入线粒体。TAT将与其融合表达的蛋白高效地转导入体外培养的细胞，并表现出相应的生物活性。
DCF1蛋白是大分子膜蛋白，很难进入胶质瘤细胞。为了找到DCF1蛋白的功能结构域并阐述它在体外培养的胶质瘤U251细胞中的相互作用，通过使用TAT帮助DCF1的不同结构域穿透胶质瘤细胞膜，在原核细胞中表达这些融合蛋白并研究它们对U251细胞的作用。
发明内容
发明目的的目的之一在于外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备抑制U251胶质瘤细胞系迁移药物中的应用。
本发明的目的之二在于提供外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备诱导细胞凋亡药物中的应用。
本发明通过将转录反式激活因子TAT信号肽分别连在全长、胞内、胞外、19个氨基酸的DCF1不同结构域序列的N端，构建入pET30a(+)原核表达载体，于原核表达系统RosettaTM2(DE3)菌株中诱导表达融合蛋白，并优化最佳诱导表达的条件，亲和层析法大量纯化融合蛋白，再将融合蛋白与胶质瘤U251细胞或HEK293T细胞孵育，通过CCK8试剂盒检测细胞活力，细胞划痕实验检测细胞迁移速率，细胞免疫荧光法定位TAT-DCF1融合蛋白的亚细胞定位，流式分析细胞凋亡情况，western blot检测凋亡相关蛋白的表达变化，对融合蛋白引起U251细胞凋亡途径作出判断。
本发明通过原核表达融合蛋白、亲和层析纯化法，大量获取融合蛋白，继而采用CCK8活力检测、细胞划痕、细胞免疫荧光、流式凋亡检测、western blot等方法对融合蛋白对胶质瘤U251细胞的凋亡作用作出判断。结果表明，在最佳诱导条件下（0.2Mm IPTG、OD600=0.6、37℃诱导4h）可以获取大量融合蛋白，且结构完整的TAT-DCF1融合蛋白显著降低了U251细胞的细胞活力和细胞迁移速率，通过引起凋亡相关基因表达量发生改变而导致凋亡。
附图说明
图1为：重组质粒的构建。（A）TAT-EGFP, TAT-DCF1, TAT-DCF1(Cy) , TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP 的扩增产物克隆入pET30a载体的重组质粒示意图。（B）TAT-EGFP, TAT-DCF1, TAT-DCF1(Cy), TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白的示意图。
以质粒pEGFP-N2-DCF1为模板体外扩增的TAT-EGFP、TAT-DCF1、TAT-DCF1(Cy)、TAT-DCF1(Ex)、TAT-DCF1(19)-EGFP片段分子量大小理论值分别为762bp、1017bp、234bp、666bp、825bp。将扩增得到的大小正确的DNA片段与空载pET30a分别用限制性内切酶Nde I和Xho I双酶切，胶回收酶切后的片段与线性载体，连接，如图1（A）所示为重组质粒示意图。挑取阳性克隆进行测序，测序结果表明成功构建重组质粒pET30a-TAT-EGFP、pET30a-TAT-DCF1、pET30a-TAT-DCF1(Cy)、pET30a-TAT-DCF1(Ex)、pET30a-TAT-DCF1(19)-EGFP。后续实验诱导表达纯化的融合蛋白示意图如图1（B），将融合蛋白分别命名为TAT-EGFP、TAT-DCF1、TAT-DCF1(Cy)、TAT-DCF1(Ex)、TAT-DCF1(19)-EGFP。
图2为：融合蛋白诱导表达条件的优化及可溶性鉴定。所有融合蛋白均于大肠杆菌Rosetta菌株中，经过0.2mM IPTG诱导表达4h，并用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳对未诱导、诱导、不溶、可溶的蛋白提取物进行可溶性鉴定。（A）TAT-EGFP融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。（B）TAT-DCF1融合蛋白存在于不溶性的包涵体沉淀中。（C）TAT-DCF1(Cy)融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。（D）TAT-DCF1(Ex)融合蛋白存在于不溶性的包涵体沉淀中。（E）TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白存在于可溶性的上清溶液中。红色箭头指示诱导表达的蛋白。
大肠杆菌最适生长温度为37℃。起初，将TAT-DCF1的转化子在不同的IPTG浓度梯度（0.4、0.6、0.8、1mM），37℃诱导4h。但是，并没有检测到TAT-DCF1的表达，即使增长了诱导表达的时间。然后，将IPTG浓度减少为0.2mM，TAT-DCF1的表达得到增强。但是TAT-DCF1融合蛋白存在于包涵体中。随后，将诱导温度降至18、25、28℃，TAT-DCF1依然存在于包涵体中。最终，确定最佳的培养条件为0.2Mm IPTG、OD600=0.6、37℃诱导4h。如图2，考马斯亮蓝染色结果显示5种融合蛋白得到大量表达。纯化前，对它们的可溶性进行分析，结果显示，TAT-EGFP、TAT-DCF1(Cy)、TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白以可溶形式存在，而 TAT-DCF1和TAT-DCF1(Ex) 融合蛋白存在于包涵体中。
图3为：融合蛋白的纯化。所有融合蛋白均由Ni2+亲和层析柱经过不同浓度的洗涤和洗脱缓冲液处理后纯化得到，并进一步通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE电泳分析鉴定。（A）TAT-EGFP 融合蛋白可由60mM洗脱液洗脱得到。（B）TAT-DCF1融合蛋白可由1000mM洗脱液洗脱得到。（C）TAT-DCF1(Cy)融合蛋白可由500mM洗脱液洗脱得到。（D）TAT-DCF1(Ex)融合蛋白可由500mM洗脱液洗脱得到。（E）TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白可由500mM洗脱液洗脱得到。红色箭头指示纯化得到的融合蛋白。
为了获得纯净的目的蛋白，通过优化咪唑浓度来纯化蛋白。如图3，大部分大肠杆菌自身的杂蛋白被低浓度的咪唑溶液洗下，而目的蛋白却被高浓度的咪唑溶液洗脱。考马斯亮蓝检测结果显示，蛋白溶液经过纯化后，最终仅有一条带，即为纯化得到的目的蛋白产物。
图4为：Western blot鉴定融合蛋白。使用(His)6抗体的Western blot鉴定未诱导、诱导和纯化的蛋白。（A）TAT-EGFP融合蛋白。（B）TAT-DCF1融合蛋白。（C）TAT-DCF1(Cy)融合蛋白。（D）TAT-DCF1(Ex)融合蛋白。（E） TAT-DCF1(19)-EGFP 融合蛋白。
Western blot结果显示，在诱导及纯化的蛋白中均可检测到与理论值大小相符的蛋白条带。这些结果预示着5种融合蛋白被成功表达，同时也获取了大量的目的蛋白。
图5为：43.75mg/L至350mg/L的不同浓度的融合蛋白对细胞活力的影响。不同浓度的 TAT-EGFP, TAT-DCF1, TAT-DCF1(Cy), TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白分别处理 U251细胞（A）和293T细胞（B）12h，CCK8试剂盒检测细胞活力。全长的TAT-DCF1融合蛋白显著抑制U251细胞的细胞活力（A），但是对293T细胞无显著影响。分析数据方法为means ± SEM。U251, n=3; 293T, n=3。 ***, p<0.001 vs. TAT-EGFP; ns,不显著vs.TAT-EGFP。
5种融合蛋白对U251细胞活力的影响均为浓度依赖型的，与其他实验组相比，175mg/ml的TAT-DCF1蛋白显著降低U251细胞的细胞活力。然而，相同浓度的TAT-DCF1处理HEK293T细胞后，并没有发现显著的细胞活力降低的现象。
图6为：融合蛋白对U251细胞的细胞迁移的影响。175mg/L的TAT-EGFP, TAT-DCF1,TAT-DCF1(Cy), TAT-DCF1(Ex), TAT-DCF1(19)-EGFP融合蛋白分别处理U251细胞12h。TAT-DCF1融合蛋白显著抑制U251细胞的迁移速率。分析数据方法为means ± SEM。n=6, ***, p<0.001 vs. TAT-EGFP。
与其他实验组相比，TAT-DCF1融合蛋白显著地降低了细胞的迁移速率，揭示全长的TAT-DCF1比其它仅有部分DCF1结构域的蛋白能够表现出更为全面的功能，因此保持DCF1的完整性对于其功能的发挥十分重要。
图7为：TAT-DCF1融合蛋白于U251细胞的转导定位分析。U251细胞与175mg/L的TAT-DCF1融合蛋白共培养12h后进行免疫荧光（IF）染色分析蛋白的亚细胞定位。ATP1A1（红色，标记细胞膜）染细胞膜，His标签（绿色）标记TAT-DCF1融合蛋白，DAPI（蓝色）标记细胞核。TAT-DCF1融合蛋白大部分定位于细胞膜上，部分定位于细胞膜中。比例尺=100μm。
通过细胞免疫荧光的方法观察TAT-DCF1蛋白是否转导进入细胞，其中，使用ATP1A1作为细胞膜标记物，DAPI标记细胞核，抗6xHis标签的鼠单克隆抗体标记TAT-DCF1蛋白。ATP1A1是一种含有10个跨膜区段的膜蛋白，可以用来标记细胞膜。在蛋白孵育12h后，大部分TAT-DCF1蛋白主要存在于U251细胞的细胞膜上，少部分融合蛋白进入细胞质中。
图8为：TAT-DCF1融合蛋白对U251细胞的细胞凋亡的影响。（A）175mg/L TAT-EGFP和TAT-DCF1融合蛋白分别处理U251细胞12h后，流式检测细胞凋亡率。（B）采用means ±SEM对细胞凋亡率（早期和晚期凋亡）进行计量。n=3. *, p<0.05; ***, p<0.001 vs. TAT-EGFP。
利用流式技术，进一步分析完整的TAT-DCF1融合蛋白是否能进一步导致U251细胞的凋亡。在TAT-DCF1和TAT-EGFP蛋白孵育细胞后48h，TAT-DCF1处理的U251细胞中有大量的细胞发生凋亡，而TAT-EGFP处理的U251细胞中凋亡现象不明显。并且，TAT-DCF1蛋白处理的实验组中，有36.52%的细胞为早期凋亡，26.75%的细胞为晚期凋亡。
图9为：TAT-DCF1融合蛋白对U251细胞的Bcl-2, Bax和LC3蛋白表达的影响。U251细胞与175mg/L TAT-DCF1融合共培养12h后，Western blot分析Bcl-2, Bax和LC3蛋白的表达情况。柱状图显示3个组的Western blot的灰度值的数据分析结果。（A）TAT-DCF1融合蛋白降低Bcl-2蛋白的表达，增加Bax蛋白的表达。（B）TAT-DCF1融合蛋白显著促进LC3-Ⅱ 蛋白的增加。GAPDH作为上样量的对照标准。分析数据方法为means ± SEM，每组实验进行3次独立的实验。*, p<0.05; ***, p<0.001。
为了检测由TAT-DCF1蛋白的诱导导致的细胞凋亡信号机制，对TAT-DCF1和TAT-EGFP处理后的细胞的Bax、Bcl-2、LC3蛋白的表达改变情况进行评测。TAT-DCF1处理后，Bcl-2蛋白表达水平降低，而Bax蛋白表达水平增加，且LC3-II蛋白的含量也显著增加。揭示TAT-DCF1融合蛋白通过内源凋亡信号途径导致胶质瘤U251细胞的凋亡。
具体实施方式
实施例一：构建重组质粒
大肠杆菌的亚克隆培养和转化实验步骤参考分子克隆教材中的标准实验步骤。以pEGFP-N2-DCF1质粒为模板，利用聚合酶链式反应PCR体外扩增不同长度的DCF1目的基因（全长DCF1，胞内DCF1(Cy)，胞外DCF1(Ex)，自噬片段DCF1(19)）和EGFP基因，TAT目的片段通过引物复性的方法得到。将所有PCR产物和pET30a载体用限制性内切酶Nde I 和Xho I进行双酶切并连接，使构建的5种重组质粒的C末端均带有6xHis标签。将重组质粒分别命名为pET30a-TAT-EGFP，pET30a-TAT-DCF1，pET30a-TAT-DCF1(Cy)，pET30a-TAT-DCF1(Ex)，pET30a-TAT-DCF1(19)-EGFP，所有质粒均含有(His)6标签。挑取每种重组子的阳性克隆菌进行初步的PCR鉴定及双酶切鉴定，最终送到生物工程有限公司进行测序，测序结果正确，表明成功构建了原核表达重组载体（图1）。
实施例二：融合蛋白的诱导表达及可溶性鉴定
1、将重组质粒转化入RosettaTM2(DE3)感受态中，并于含有卡那霉素抗性的LB固体培养板上筛选转化子。挑取单菌落接种于3ml含50ug/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、210r/min摇床中培养过夜。吸取2.5ml培养好的菌液接种于250ml LB液体培养基中，37℃震荡培养，直至对数生长期OD600约为0.6，向溶液中分别加入IPTG诱导剂，使其终浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1mM，并于不同温度（18℃、25℃、28℃、37℃）下诱导4h，以此来优化诱导表达条件。为了分析诱导效率，需要同时设置未诱导的对照组。诱导结束后，4℃、8000g离心5分钟，收集菌体，用预冷的结合缓冲液（50Mm Tris-HCl，pH8.0，100mM NaCl，1mM PMSF）重悬菌体，冰浴超声30分钟破碎菌体，于4℃、11000g离心30分钟，分别收集菌体沉淀和上清溶液。未诱导、诱导、超声后上清、超声后菌体沉淀的样品经过5x上样缓冲液（1M Tris-HCl，pH6.8，10% SDS，0.5%溴酚蓝, 50%甘油，0.5%β-巯基乙醇）裂解后，用考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE胶鉴定诱导表达情况及分析蛋白的可溶性（图2）。
最终，将可溶的融合蛋白溶液转移入新的试管中，用于后续的纯化。不溶的包涵体沉淀则使用尿素溶解包涵体后，再进行下一步的纯化。
2、包涵体的溶解。用适量包涵体洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl, pH8.0, 0.5MNaCl, 2M urea）重悬包涵体沉淀，搅拌溶解25分钟，于4℃、8000g离心15分钟，用50mMTris-HCl (pH8.0)洗一遍。用适量包涵体溶解缓冲液（20mM Tris-HCl, pH8.0, 0.5MNaCl, 8M urea）重悬沉淀，室温溶解5h，于4℃、11000g离心30分钟，收集上清溶液于一只新的试管中。用透析液（50mM Tris-HCl, pH8.0, 0.5mM GSH, 0.05mM GSSG, 0.5mM L-精氨酸）于4℃透析上清溶液24h，再进一步用PBS透析6h，收集溶液于一只新的试管中，再进行后续的蛋白纯化实验。
实施例三：融合蛋白的纯化
使用Ni2+亲和层析柱纯化融合蛋白。简言之，用5倍柱体积的PBS平衡柱子，将蛋白溶液与His填料于4℃结合2h。依次用含有不同浓度咪唑的PBS洗涤缓冲液洗涤柱子，随后用含有不同浓度咪唑的PBS洗脱缓冲液依次洗脱目的蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒定量纯化的蛋白。使用考马斯亮蓝染色的PAGE电泳检测纯化的蛋白的纯度（图3）。
实施例四：融合蛋白的Western bolt鉴定
依据分子克隆教材中的Western blot的标准实验步骤对纯化的蛋白进行鉴定。简言之，使用半干转的方法将聚丙烯酰氨凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素NC膜上，用5% BSA-PBS封闭液于4℃封闭NC膜过夜，室温下用稀释比例为1:1000的(His)6鼠单抗孵育1h，再用含有0.1%吐温20的PBST溶液洗3次，每次5分钟。随后，用红外染料标记的700通道的山羊抗鼠的二抗室温孵育1h，用含有0.1%吐温20的PBST溶液洗3次，每次5分钟，最后，使用LI-COROdessey成像系统分析免疫反应的蛋白条带（图4）。
实施例五：CCK8检测细胞活力
于37℃、5% CO2的培养箱中，将HEK293T和U251细胞培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养基中。将细胞铺于96孔板，每孔1x104个细胞，放于37℃、5%CO2中培养24h。用含有不同浓度融合蛋白的培养基更换旧培养基，并于37℃、5% CO2处理12h。随后，弃去培养基，用PBS洗3次，按照说明书的步骤使用增强型CCK8试剂盒检测细胞活力。简言之，弃去培养基，加入含有10μl CCK8和90μl培养基的100μl混合物，于37℃、5% CO2孵育1h，检测450nm的吸光值，通过吸光值分析细胞活力（图5）。
实施例六：细胞迁移速率的检测
将U251细胞铺板于24孔板，每孔1x105个细胞，于37℃、5% CO2培养24h。分别加入含终浓度为175mg/ml的融合蛋白的新鲜培养基，于37℃、5% CO2处理12h。处理12h后，通过划痕实验观察细胞迁移的变化情况。简言之，将每孔的细胞通过划痕分开，于显微镜下每隔12h拍照观察细胞迁移。使用Image-Pro Plus软件对数据进行分析（图6）。
实施例七：细胞免疫荧光
将U251细胞铺板于24孔板，每孔1x105个细胞，于37℃、5% CO2培养24h。加入含终浓度为175mg/ml的TAT-DCF1融合蛋白的新鲜培养基，于37℃、5% CO2处理12h。PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛室温固定10分钟，0.1% Triton-X通透10分钟。2% BSA-PBS室温孵育1h，一抗（抗His鼠单抗，1:500；抗ATP1A1兔多抗，1:500）4℃孵育过夜。随后，PBS洗涤3次，二抗（山羊抗鼠和山羊抗兔，1:500）室温孵育1h，DAPI室温孵育5min，PBS洗涤3次。蔡司LSM710荧光显微镜下拍照观察荧光结果（图7）。
实施例八：流式
将U251细胞铺板于6孔板，每孔4x105个细胞，于37℃、5% CO2培养24h。将含终浓度为175mg/ml的TAT-DCF1和TAT-EGFP融合蛋白的新鲜培养基分别加入细胞，于37℃、5% CO2处理12h。弃去旧培养基，PBS洗两次，加入新鲜的培养基，于37℃、5% CO2培养48h。弃去培养基，PBS洗3次，用无EDTA的胰酶消化细胞，将细胞收集于10% FBS-DMEM的培养基中。PBS洗两次，重悬于100μl结合缓冲液中，然后，加入5μl Annexin V-PE和5μl 7-AAD溶液，轻轻混匀，室温静置15min。最后，加入400μl 结合缓冲液，轻轻混匀，将样品加入流式细胞仪进行检测分析（图8）。
实施例九：U251细胞中Bcl-2，Bax，LC3蛋白的表达
将U251细胞铺板于24孔板，每孔1x105个细胞，于37℃、5% CO2培养24h。将含终浓度为175mg/ml的TAT-DCF1和TAT-EGFP融合蛋白的新鲜培养基分别加入细胞，于37℃、5% CO2处理12h。处理12h后，弃去旧培养基，PBS洗细胞2次，加入新鲜的培养基，于37℃、5% CO2继续培养48h。用预冷的PBS洗细胞2次，按照蛋白抽提试剂盒的生产说明书步骤抽提全蛋白。用SDS-PAGE电泳分离全蛋白，并电转于硝酸纤维素膜上，用5% BSA-PBS室温孵育1h，分别用一抗GAPDH (1:1000)、Bcl-2 (1:1000)、Bax (1:1000)和 LC3 (1:1000)于4℃孵育过夜。然后，用红外染料700通道偶联的亲和纯化的山羊抗鼠IgG的二抗和红外染料800通道偶联的亲和纯化的山羊抗兔IgG的二抗于室温孵育1h。使用LI-COR Odessey红外成像系统和LI-COR软件同时对两种颜色的目的免疫条带进行检测和分析（图9）。

Claims (2)

1.一种外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备抑制U251胶质瘤细胞系迁移药物中的应用。
2.一种外源导入TAT-DCF1融合蛋白在制备诱导细胞凋亡药物中的应用。
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