CN101962412A - 一种重组tat-xiap融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域与X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。与现有技术相比，本发明先利用大肠杆菌偏爱密码子对核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的原XIAP基因进行优化，使其在大肠杆菌高效表达，用人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域的转导能力来弥补X-连锁凋亡抑制蛋白不能跨过血脑屏障进入脑内发挥抗凋亡作用的不足，使得该基因的最终表达产物能够进入脑组织细胞中，产生抵抗细胞凋亡作用，用于中枢神经系统疾病的治疗与研究。

Description

一种重组TAT-XIAP融合蛋白

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白转导结构域与优化的X-连锁凋亡抑制蛋白融合形成的融合蛋白。

背景技术

基因治疗(gene therapy)是二十世纪八十年代以来发展起来的一项新技术，它主要是向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。

传统的基因治疗是将目的基因导入到细胞当中，并使其表达，但是这一技术存在着以下一些不足：首先是常规转基因方法操作繁琐，转染效率较低，转染后目的基因表达水平不足，基因表达调控较困难，其次是常用的病毒载体存在着安全性的问题。

蛋白质转导是近年发展起来的一种将外源蛋白导入细胞的方法。将某些特殊的多肽与靶物质共价相连后，这些多肽会连同靶物质一起，进入临近细胞。这种由多肽携带靶物质跨过细胞膜的阻挡，进入细胞质的过程称为蛋白转导(protein transduction)。这些能携带外源物质进入细胞的多肽成称蛋白转导结构域(proteintransduction domain，PTD)。人类I型免疫缺陷病毒(HIV-1)的转录反式激活因子(trans-activator of transcription，TAT)的47～57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)是转导功能较强而确切的一种蛋白转导结构域。研究表明，TAT-PTD能够将与之共价连接的生物大分子(如核酸、多肽、蛋白质等)转导入细胞内部，这种过程不依赖于受体和转运蛋白，能在无脂质体、磷酸钙、电转化、病毒载体等条件下直直接透过细胞膜甚至血脑屏障，并可在周围细胞间传递，被转导入细胞内的外源蛋白保留其原有的生物学活性与功能，与温度和能量无关，对宿主细胞几乎没有毒性。

在正常情况下，蛋白质由于分子量较大，是不能透过细胞膜阻挡，进入细胞质甚至细胞核中的，但是将富含赖氨酸、精氨酸的蛋白转导结构域多肤与共价的所需要的目的基因产物相连后，这些目的基因产物就会被带到细胞中，发挥应有的生物学功能。目前利用该方法已经高效地将EGFP、β-半乳糖苷酶、caspase-3、insulin等等多种蛋白质带到细胞中。目前最常用的蛋白转导结构域共价偶连方法是将目的基因与蛋白转导结构域基因相融合，最后产生赋予了新的转导能力的目的蛋白。

蛋白转导技术高效、快速，并且不受目的基因产物大小限制，因而有望成为一种新的基因治疗手段，目前正成为研究热点。

凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一类在结构上具有同源性的内源性凋亡抑制蛋白家族，对半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)诱发的细胞凋亡过程有明显的抑制效应。X-连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibotor ofapoptosis protein，XIAP)是IAP家族中最有效力的caspase抑制物，通过结合与抑制caspase-3、caspase-7、caspase-9的活性及减少细胞色素C从线粒体释放入胞浆而阻止细胞凋亡。

研究显示神经细胞凋亡是老年痴呆和帕金森病等神经退行性疾病的共同特征和结局。然而，XIAP是分子量57kDa的大分子物质，由于不易通过血脑屏障，使进一步研究和临床应用受到极大的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种重组TAT-XIAP融合蛋白及其制备方法。所述的融合蛋白能够进入脑细胞中，产生抵抗细胞凋亡的作用。

本发明所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域与优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述重组TAT-XIAP融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

所述优化的X-连锁凋亡抑制蛋白是利用大肠杆菌偏爱密码子对核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列进行优化，该X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列从美国国立生物信息中心(NCBI基因库)获得，生物体为褐家鼠(Rattus norvegicus)，最早由日本的Saito，N获得。优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

所述人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，从人类I型免疫缺陷病毒(HIV-1)获得，该人类I型免疫缺陷病毒(HIV-1)的TAT基因编码的蛋白转导结构域由美国NicholeLake赠送给申请人，所述人类I型免疫缺陷病毒(HIV-1)最早由法国巴斯德研究所的蒙塔尼教授获得。

本发明所述的融合蛋白含有：6His标签蛋白、肠激酶酶切位点、TAT-PTD蛋白转导结构域、X-连锁凋亡抑制蛋白及其它连接序列。6His标签蛋白用于融合蛋白的纯化，肠激酶酶切位点(5个氨基酸：DDDDK)通过肠激酶切除6His标签蛋白而释放TAT-XIAP融合蛋白。

上述重组TAT-XIAP融合蛋白的制备方法为：

1、构建TAT-XIAP融合蛋白原核表达载体

根据NCBI基因库提供的大鼠XIAP的DNA序列，按照大肠杆菌的偏爱密码子进行优化，由上海生工生物技术服务有限公司合成基因序列，两端分别带有NcoI和XhoI酶切位点。用NcoI和XhoI酶对pTAT-HA质粒进行双酶切，将XIAP基因插入NcoI和XhoI酶切位点之间，构建TAT-XIAP融合蛋白原核表达载体，上述载体经酶切及测序检测，序列正确。

2、转化大肠杆菌

取100μl感受态细胞表达菌株BL21(DE3)pLysS于冰水浴，向感受态细胞中加入10μl pTAT-XIAP质粒DNA，冰浴静置30min，将离心管置于42℃水浴90s，冰浴冷却2～3min，向离心管中加入900μl LB液体培养基(不含抗生素)，37℃摇床震荡培养45min。取100μl转化菌液加到LB固体培养基(含氨苄青霉素)，37℃培养12～16h。

3、IPTG诱导融合蛋白基因表达

挑取单个转化的阳性菌落于3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，取活化菌液10％接种于10ml LB(Amp 100mg/L)培养液中，当OD₆₀₀达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度1mmlol/L，30℃诱导表达4小时。SDS-PAGE电泳及Western blot证实，TAT-XIAP融合蛋白在BL21(DE3)pLysS感受态细胞中获得高效表达。

4、融合蛋白纯化

上述诱导表达的菌液经过超声破碎后，4℃10000rpm离心30min，表达产物存在于沉淀中，沉淀经2M、4M尿素洗涤后，加8M尿素溶解，取上清经镍柱亲和层析纯化，获得纯化后的融合蛋白，其纯度大于90％。

5、融合蛋白复性

纯化后的样品加入10％甘油，依次用5M、4M、2M、1M的尿素缓冲液透析，再用PBS、去离子水透析后，冻干，蛋白定量分析试剂盒测定重组蛋白浓度，0.22μm滤膜过滤除菌，小量分装后-80℃保存。

与现有技术相比，本发明将人免疫缺陷病毒TAT基因47～57位氨基酸(YGRKKRRQRRR)编码序列与优化后的X-连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)基因融合，利用人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域的转导能力来弥补X-连锁凋亡抑制蛋白不能跨过血脑屏障进入脑内发挥抗凋亡作用的不足，使得该基因的最终表达产物能够进入脑组织细胞中，产生抵抗细胞凋亡作用。

附图说明

图1为构建的pTAT-XIAP质粒载体示意图；

图2为pTAT-XIAP重组质粒载体的酶切鉴定图，其中1、DNA Marker，

2、pTAT-XIAP重组质粒，3、双酶切产物；

图3为pTAT-XIAP重组质粒在BL21(DE3)pLysS中表达产物的SDS-PAGE分析图，其中1、pTAT-HA转化菌经1mmol/L IPTG诱导，2、重组菌经1mmol/LIPTG诱导，3、重组菌未加IPTG诱导的对照，4、蛋白Marker；

图4为pTAT-XIAP重组质粒表达产物的Western blot分析图；

图5为TAT-XIAP融合蛋白纯化结果图，其中1、蛋白Marker，2～5、TAT-XIAP融合蛋白。

图6为不同浓度的TAT-XIAP融合蛋白抗神经细胞凋亡作用的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

实施例1TAT-XIAP融合蛋白的制备

1、pTAT-XIAP融合蛋白原核表达载体的构建

根据NCBI基因库提供的大鼠XIAP的DNA序列，按照大肠杆菌的偏爱密码子进行优化，由上海生工生物技术服务有限公司合成基因序列，两端分别带有NcoI和XhoI酶切位点。用NcoI和XhoI酶对pTAT-HA质粒进行双酶切，将XIAP基因插入NcoI和XhoI酶切位点之间，构建pTAT-XIAP融合蛋白原核表达载体，其质粒载体示意图如图1所示，另外构建pET-32a-XIAP表达载体，产生XIAP作为对照。

2、pTAT-XIAP重组质粒在大肠杆菌中的转化

取100μl DH5α感受态细胞于冰水浴，向感受态细胞中加入10μlpTAT-XIAP质粒DNA，冰浴静置30min，将离心管置于42℃水浴90s，冰浴冷却2～3min，向离心管中加入900μl LB液体培养基(不含抗生素)(配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水至1升)，37℃摇床震荡培养45min。取100μl转化菌液加到LB固体培养基(含氨苄青霉素)(配方：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，加蒸馏水至1升，临用前加氨苄青霉素至终浓度为100mg/L)，37℃培养12～16h。以未转化菌和转化pTAT-HA空载体的菌珠作为对照。

3、pTAT-XIAP重组质粒扩增及鉴定

取pTAT-XIAP质粒的单个转化菌落接种至LB液体培养基培养过夜，将1～1.5ml菌液加入1.5ml无菌EP管中，10000rpm离心30s，弃上清，加250μlResuspension Buffer重悬菌体，加250μl Lysis Buffer，轻柔颠倒4～6次，加350μl Neutralization Buffer，立即轻柔颠倒4～6次，12000rpm离心15min。将上清液转移到Spin column内，6000rpm离心1min，弃接液管液体，加650μl Wash Buffer，12000rpm离心30～60s，弃接液管液体，再次于12000rpm离心1min，将Spin column转移至1.5ml无菌EP管中。向Spin column内加TE溶液50μl，静置1min，于12000rpm离心1min。提取的pTAT-XIAP质粒经NcoI和XhoI双酶切，于150V电压1％琼脂糖凝胶上电泳，紫外透射仪观察，凝胶成像系统照相。质粒于-80℃保存备用。pTAT-XIAP质粒经NcoI和XhoI双酶切后，电泳结果显示重组pTAT-XIAP质粒约4500bp，酶切后可观察到pTAT-HA质粒约3000bp，XIAP目的基因条带1491bp(不含酶切位点)，大小与质粒图谱一致，如图2所示。提取的重组pTAT-XIAP质粒经上海生工生物技术服务有限公司测序显示序列正确。

4、pTAT-XIAP重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中的表达及鉴定

将pTAT-XIAP重组质粒转化感受态大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)pLysS，涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取转化的阳性菌落于3ml含氨苄青霉素的LB培养液中，37℃摇床培养过夜，取活化菌液10％接种于10ml LB(Amp 100mg/L)培养液中，当OD₆₀₀达0.6-0.8时，加IPTG至终浓度1mmlol/L，30℃诱导表达4小时。5000rpm，4℃离心15min，弃上清收集菌体。PBS洗涤菌体，在细菌裂解液中超声破菌，SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝R-250染色。以未加IPTG的菌株和pTAT-HA质粒转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞作对照。结果显示以1mmlol/L IPTG诱导的重组菌在63kD位置有明显条带，与理论值相符，对照菌均无明显条带，如图3所示。

5、pTAT-XIAP重组质粒表达产物的Western blot分析

将SDS-PAGE凝胶电泳结束后的蛋白样品电转移到硝酸纤维素膜上进行western blot分析，以小鼠抗6×His单克隆抗体作为一抗，HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体作为二抗，ECL发光试剂显色，X线曝光显影。结果显示以1mmlol/L IPTG诱导的重组菌在63kD处有明显条带，如图4所示。

6、TAT-XIAP融合蛋白的纯化、复性

将诱导表达后收集的菌体按5g/mL(M∶V)裂解于washing buffer中。冰浴超声破菌，4℃10000rpm离心30min，取沉淀。沉淀经2M、4M尿素洗涤后，加8M尿素冰浴溶解1h，4℃12000rpm离心20min取上清上柱，依次以20mM和50mM咪唑溶液各15mL[含50Mm NaH₂PO₄，300Mm NaCl，8M尿素，pH8.0]进行洗脱，用100mM咪唑溶液收集纯化的蛋白，SDS-PAGE分析，结果如图5所示。纯化后的样品加入10％甘油，依次用5M、4M、2M、1M的尿素缓冲液透析，再用PBS、去离子水透析后，冻干，蛋白定量分析试剂盒测定重组蛋白浓度，0.22μm滤膜过滤除菌，小量分装后-80℃保存。

实施例2TAT-XIAP融合蛋白穿神经细胞膜能力检测

取新生SD大鼠，在无菌条件下取脑，0.125％胰蛋白酶消化(37℃、30min)分散后，以DMEM培养基稀释成5×10⁵个细胞/ml密度的细胞液，接种于涂有多聚赖氨酸培养皿中，在培养液中加入1～2μl实施例1纯化后的TAT-XIAP融合蛋白(试验组)，轻柔混匀，培养6～12h后，制作细胞爬片，免疫细胞化学(SP法)检测XIAP，观察融合蛋白穿过细胞膜的能力。

结果显示，随着融合蛋白浓度增加，阳性染色随之增加，而用XIAP或PBS处理过的对照组未见明显阳性染色，说明含有TAT蛋白转导结构域的融合蛋白进入了脑细胞中。

实施例3TAT-XIAP融合蛋白穿血脑屏障能力检测

SD大鼠尾静脉分别注射10～20μl实施例1纯化后的TAT-XIAP融合蛋白(试验组)、XIAP(阴性对照组)、PBS(空白对照组)6～12h后，免疫组织化学(SP法)检测脑组织切片XIAP，观察融合蛋白通过血脑屏障的能力。

结果表明，试验组的阳性染色随TAT-XIAP融合蛋白浓度增加而增加，而对照组未见明显阳性染色。说明含有TAT结构域的融合蛋白透过血脑屏障进入了脑细胞中。

实施例4TAT-XIAP融合蛋白抗神经细胞凋亡能力检测

原代培养6周龄胎鼠海马神经元，接种于涂有多聚赖氨酸的96孔培养板，加入不同浓度的实施例1制得的TAT-XIAP融合蛋白作用48h后，MTT法检测神经元存活率，结果显示神经元存活率随融合蛋白浓度的增加而增加，说明TAT-XIAP融合蛋白发挥了抵抗神经细胞凋亡的作用，不同浓度的TAT-XIAP融合蛋白抗神经细胞凋亡作用的曲线图如图6所示。

序列表

(1)SEQ ID NO：1的信息

   (i)序列特征

     (A)长度：566个氨基酸残基

     (B)类型：氨基酸

    (C)拓扑类型：线性

   (ii)分子类型：蛋白质

   (iii)序列描述：SEQ ID NO：1

MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSKLGYGRKKRRQRRRGGSTMSGYPY 60

DVPDYAGSMAMTFNSFEGSRTVVPADTNKDEEFVEEFNRLKTFANFPSSSPVSASTLARA 120

GFLYTGEGDTVQCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRRISPNCRFINGFYFENGATQSTSPGI 180

QNGQYKSENCVGNRNHFALDRPSETHADYLLRTGQVVDISDTIYPRNPAMCSEEARLKTF 240

QNWPDYAHLSPRELASAGLYYTGIDDQVQCFCCGGKLKNWEPCDRAWSEHRRHFPNCFFV 300

LGRNVNVRSESGVSSDRNFPNSTNSPRNPAMAEYDARIVTFGTWLYSVNKEQLARAGFYA 360

LGEGDKYKCFHCGGGLTDWKPSEDPWEQHAKWYPGCKYLLDEKGQEYINNIHLTHSLGES 420

VVRTAEKTPSVTKKIDDTIFQNPMVQEAIRMGFNFKDIKKTMEEKLQTSGSNYLSLEVLI 480

ADLVSAQKDNSQDESSQTSLQKDISTEEQLRRLQEEKLCKICMDRNIAIVFVPCGHLVTC 540

KQCAEAVDKCPMCCTVITFKQKIFMS                                   566

 

(2)SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征

    (D)长度：1701个核苷酸

    (E)类型：DNA

    (F)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：核酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：2

atgcggggtt ctcatcatca tcatcatcat ggtatggcta gcatgactgg tggacagcaa     60

atgggtcggg atctgtacga cgatgacgat aaggatcgat ggggatccaa gcttggctac    120

ggccgcaaga aacgccgcca gcgccgccgc ggtggatcca ccatgtccgg ctatccatat    180

gacgtcccag actatgctgg ctccatggcc atgactttta attcttttga aggttctcgt    240

accgtagtgc cggctgacac caacaaagac gaagaattcg ttgaagaatt caaccgcctg    300

aaaactttcg ccaacttccc gtcttcttcc ccggttagcg catccactct ggctcgtgcc    360

ggctttctgt atacgggtga aggcgacacg gtccagtgct tttcctgtca tgctgccgtt    420

gatcgctggc aatatggcga ctctgcagtc ggccgtcacc gtcgtattag cccgaactgc    480

cgttttatca atggcttcta ctttgagaac ggtgcaactc agtctaccag cccaggcatc    540

cagaacggtc agtacaaatc cgaaaactgc gtaggtaacc gcaatcactt tgctctggat    600

cgcccgtctg aaacccacgc ggactatctg ctgcgcaccg gtcaggttgt agacatttcc    660

gataccatct atcctcgtaa cccggcgatg tgctctgaag aagcgcgtct gaaaaccttc    720

caaaactggc cggactacgc tcacctgagc ccgcgtgaac tggcctctgc tggtctgtat    780

tacaccggca ttgacgatca ggtgcagtgt ttctgttgcg gtggtaaact gaaaaattgg   840

gagccgtgcg atcgtgcgtg gtccgaacac cgtcgccact tcccgaactg cttcttcgtg   900

ctgggtcgca acgtgaatgt tcgttctgaa tctggtgtgt cctctgatcg caacttcccg   960

aacagcacga acagcccacg taacccagcg atggccgaat acgatgctcg tatcgtaacc  1020

ttcggcactt ggctgtactc cgttaacaag gaacagctgg ctcgtgcagg tttctacgcg  1080

ctgggcgaag gtgataaagt gaaatgcttc cattgtggcg gtggcctgac cgattggaaa  1140

ccgtctgaag acccgtggga gcagcatgcg aaatggtacc cgggctgcaa atatctgctg  1200

gacgagaaag gccaggaata cattaacaac atccacctga ctcactctct gggcgagagc  1260

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cagaacccga tggtacagga agcaatccgt atgggtttca acttcaaaga tatcaaaaag  1380

actatggaag aaaaactgca gacctccggt tccaactacc tgagcctgga ggttctgatc  1440

gctgacctgg tgtccgcaca aaaagacaac tcccaggacg aatcctctca gactagcctg  1500

cagaaggata tcagcaccga ggaacagctg cgccgtctgc aagaagaaaa gctgtgcaaa  1560

atctgtatgg atcgtaacat cgcgatcgtt tttgttccgt gtggccatct ggtgacctgc  1620

aaacagtgcg cggaagcggt cgacaaatgc ccgatgtgtt gtactgttat tacgttcaaa  1680

cagaagatct tcatgagcta a                                            1701

 

(3)SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征

    (G)长度：1491个核苷酸

    (H)类型：DNA

    (I)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：核酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：3

atgactttta acagttttga aggatctaga actgttgtac ctgcagacac caataaggat     60

gaagaatttg tagaagagtt taatagatta aaaacatttg ctaacttccc aagcagcagt    120

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ggaagacaca ggagaatatc cccaaattgc agatttatca atggttttta ttttgaaaac    300

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gtgggaaaca gaaatcattt tgctcttgac aggccgtcgg agactcatgc agattatctc    420

ctgagaactg gacaggttgt agatatttca gataccatat acccgaggaa cccggccatg    480

tgtagtgaag aagccagact gaagacgttt cagaactggc cagactatgc ccatttaagc    540

cccagagagt tagctagtgc tggactctac tacacgggga ttgatgatca agtgcaatgc    600

ttttgttgtg gtggaaaact gaaaaattgg gaaccctgtg accgtgcctg gtcagagcac    660

aggagacact ttcccaactg cttcttcgtt ttgggccgga atgttaatgt tcgaagtgag    720

tctggtgtga gttcagatag gaatttccca aattcaacaa attctccaag aaatccagcc    780

atggcagaat atgacgcacg gatcgttact tttggaacat ggctatactc agttaacaag    840

gagcagcttg caagagctgg attttatgct ttaggtgaag gtgataaagt gaagtgcttt    900

cactgtggag gagggctcac ggattggaag ccaagtgaag acccttggga acagcatgct    960

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aggcgcctac aagaggagaa gctttgcaaa atctgtatgg atagaaatat tgctatagtt  1380

tttgttcctt gtggacatct ggtcacttgt aaacagtgtg cggaagcagt tgacaaatgt  1440

cccatgtgct gcacagtcat tacgttcaag caaaaaattt ttatgtctta a           1491

 

(4)SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征

    (J)长度：1491个核苷酸

    (K)类型：DNA

    (L)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：核酸

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：4

atgactttta attcttttga aggttctcgt accgtagtgc cggctgacac caacaaagac     60

gaagaattcg ttgaagaatt caaccgcctg aaaactttcg ccaacttccc gtcttcttcc    120

ccggttagcg catccactct ggctcgtgcc ggctttctgt atacgggtga aggcgacacg    180

gtccagtgct tttcctgtca tgctgccgtt gatcgctggc aatatggcga ctctgcagtc    240

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ggtgcaactc agtctaccag cccaggcatc cagaacggtc agtacaaatc cgaaaactgc    360

gtaggtaacc gcaatcactt tgctctggat cgcccgtctg aaacccacgc ggactatctg    420

ctgcgcaccg gtcaggttgt agacatttcc gataccatct atcctcgtaa cccggcgatg    480

tgctctgaag aagcgcgtct gaaaaccttc caaaactggc cggactacgc tcacctgagc    540

ccgcgtgaac tggcctctgc tggtctgtat tacaccggca ttgacgatca ggtgcagtgt    600

ttctgttgcg gtggtaaact gaaaaattgg gagccgtgcg atcgtgcgtg gtccgaacac    660

cgtcgccact tcccgaactg cttcttcgtg ctgggtcgca acgtgaatgt tcgttctgaa    720

tctggtgtgt cctctgatcg caacttcccg aacagcacga acagcccacg taacccagcg    780

atggccgaat acgatgctcg tatcgtaacc ttcggcactt ggctgtactc cgttaacaag    840

gaacagctgg ctcgtgcagg tttctacgcg ctgggcgaag gtgataaagt gaaatgcttc    900

cattgtggcg gtggcctgac cgattggaaa ccgtctgaag acccgtggga gcagcatgcg    960

aaatggtacc cgggctgcaa atatctgctg gacgagaaag gccaggaata cattaacaac   1020

atccacctga ctcactctct gggcgagagc gttgttcgta ccgcagagaa aacccctagc   1080

gtaaccaaga aaattgatga caccattttc cagaacccga tggtacagga agcaatccgt   1140

atgggtttca acttcaaaga tatcaaaaag actatggaag aaaaactgca gacctccggt   1200

tccaactacc tgagcctgga ggttctgatc gctgacctgg tgtccgcaca aaaagacaac   1260

tcccaggacg aatcctctca gactagcctg cagaaggata tcagcaccga ggaacagctg   1320

cgccgtctgc aagaagaaaa gctgtgcaaa atctgtatgg atcgtaacat cgcgatcgtt   1380

tttgttccgt gtggccatct ggtgacctgc aaacagtgcg cggaagcggt cgacaaatgc   1440

ccgatgtgtt gtactgttat tacgttcaaa cagaagatct tcatgagcta a            1491

 

(5)SEQ ID NO：5的信息

  (i)序列特征

    (M)长度：11个氨基酸残基

    (N)类型：氨基酸

    (O)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：5

YGRKKRRQRRR

Claims (5)

1.一种重组TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于：它是人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域与优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列融合形成的融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.根据权利要求1所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于：所述重组TAT-XIAP融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求1或2所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于：所述优化的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列是利用大肠杆菌偏爱密码子对核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的X-连锁凋亡抑制蛋白核苷酸序列进行优化得到。

4.根据权利要求3所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于：优化的X-连锁凋亡抑制蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

5.根据权利要求1或2所述的重组TAT-XIAP融合蛋白，其特征在于：所述人免疫缺陷病毒HIV的TAT基因编码的蛋白转导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

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