CN104593313A - 用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用，涉及微生物生物技术领域。所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。制备细菌素durancin GL方法如下，诱导重组菌表达融合蛋白，破碎得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去纯化标签，得到细菌素durancin GL。本发明重组菌构建方便，能够高效表达重组细菌素durancin GL，通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。
Description
技术领域
本发明涉及微生物生物技术领域，具体涉及用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用。
背景技术
细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。在对化学防腐剂的安全隐患越来越重视的今天，食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合消费者对于安全、健康和天然的要求。
来源于耐久肠球菌、能够专一性抑制李斯特菌的细菌素durancin GL，在食品工业中具有重要的潜在应用价值。采用耐久肠球菌发酵制备细菌素durancin GL，发酵液中目标产物浓度较低，发酵液成分复杂，因此分离有活性细菌素的过程耗时费力，成本高，且纯度难以保证。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于制备细菌素durancin GL的重组菌，该重组菌构建方便，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。
本发明的另一目的是提供所述重组菌的制备方法，该方法简单，效率高。
本发明的再一目的是提供制备细菌素durancin GL的方法，诱导培养重组菌后，仅需要通过简单的亲和色谱就能够高效分离重组细菌素durancin GL，水解后除去标签蛋白，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
本发明提供用于制备细菌素durancin GL的重组菌，所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
在本发明中，所述纯化标签通过酶切位点连接在细菌素durancin GL的一端或两端。
优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明还提供所述重组菌的制备方法，将由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。
优选的技术方案中，所述重组载体是将由细菌素durancin GL、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。
本发明还提供制备细菌素durancin GL的方法，诱导所述重组菌表达由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解所述由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，除去酶解液中的纯化标签，得到细菌素durancin GL。
本发明巧妙构建了制备细菌素durancin GL的重组菌，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。
本发明制备细菌素durancin GL的方法，是通过诱导重组菌表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，然后采用亲和色谱分离，水解并除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素，该细菌素的结构和功能与天然durancin GL完全一致。携带有GST标签和His标签的重组细菌素durancin GL的分离纯化效果显著好于仅含有GST标签的重组细菌素durancin GL，前者得到的具有活性的细菌素durancin GL的纯度也显著大于后者所得细菌素durancin GL。
以下结合说明书附图对本发明作进一步的描述。
附图说明
图1为携带有细菌素durancin GL基因的重组表达载体构建过程，其中durAB为细菌素durancin GL的基因（包括结构和免疫基因），Ptac为乳糖操纵子和色氨酸操纵子的杂合启动子；GST为GST标签编码基因的缩写，His是His标签编码基因的缩写。
图2 重组菌1的重组durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱分离纯化的色谱图。图中横坐标为流过色谱柱的流动相体积，单位为mL；纵坐标为流出液在280 nm波长下的吸收值，单位为mAU。箭头所示吸收峰的出现表明重组durancin GL被有效的分离出来。
图3 HisTrap HP柱或GSTrap 4B柱一步分离纯化重组细菌素durancin GL的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液，泳道2为重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液经HisTrap HP柱一步分离纯化得到的重组细菌素durancin GL，泳道3为重组菌2的重组细菌素durancin GL粗提液经GSTrap 4B柱一步分离纯化得到的重组细菌素durancin GL。图中箭头所示的条带为目标蛋白所在的位置，其余条带为杂蛋白。
图4 经HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱两步纯化获得的重组菌1的重组细菌素durancin GL的SDS-PAGE电泳结果。泳道2为蛋白质Marker，从上到下各条带分子量依次为97.4 kDa，66.2 kDa，43 kDa，31 kDa。
图5是重组细菌素durancin GL切除纯化标签后的活性检测结果。
具体实施方式
下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；
下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下面以pGEX-6p-1载体为例，对本发明作进一步的详细说明。pGEX-6P-1载体（可以通过商业途径购买获得）由本实验室保藏，pGEX-6P-1载体携带有GST标签的编码基因。
实施例1
1、细菌素durancin GL基因的克隆
根据GenBank数据库中细菌素durancin GL基因的序列（HQ696461.1），设计引物dur1（SEQ ID NO:5）：5′-ggg agg caa tta tat gaa gaa aaa att tgt tag tat t-3′和dur2（SEQ ID NO:6）：5′-CCA gTg CCC CCA TAA ACT ATA CAC CC-3′，从耐久肠球菌41D（是已经公开的细菌）中扩增细菌素durancin GL的基因片段，该片段由结构基因和免疫基因组成，序列如SEQ ID NO:1所示。
细菌素durancin GL的基因也可以采用化学合成的方法制备。
2、细菌素durancin GL基因片段的序列验证
将扩增的durancin GL基因片段回收，然后和pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（购自北京全式金生物技术有限公司）连接，获得重组质粒pEASY/durAB。连接过程中，插入片段与线性载体物质的量之比约为7:1，连接温度为25℃。将重组质粒pEASY/durAB，转化到Trans1-T1感受态细胞（购自北京全式金生物技术有限公司）中，挑选阳性克隆，过夜培养后送上海生物工程有限公司测序，序列与预期相同。
3、构建重组菌
（1）构建重组菌1
重组菌1表达由GST标签、His标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancin GL相连形成的重组细菌素durancin GL。重组细菌素durancin GL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。重组菌1的构建过程如下。
第一步，构建重组表达载体，具体过程见图1。
以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物GST1和下游引物GST2，扩增由His标签、肠激酶酶切位点和durancin GL的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物GST1带His标签和肠激酶酶切位点的编码基因，GST1的序列（SEQ ID NO:7）为：5′-CTGGGATCCCACCATCATCATCATCATGACGACGACGACAAGGCAACTTATTATGGAAATGGTGTTTATTG-3′；下游引物GST2序列（SEQ ID NO:8）为:5′-AAACTCGAGT TTAACTCCAA ATACCGATAG ACGCCCATCC CC-3′。
使用BamH I 和Xho I分别双酶切pGEX-6p-1载体和融合基因PCR产物，胶回收线性载体和PCR产物，按照插入片段与线性载体物质的量之比约为3:1的比例在16℃进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌，挑选阳性重组子，双酶切鉴定序列正确的重组表达载体命名为pGEX-6p-1/durAB。
第二步，构建重组菌1。将重组表达载体pGEX-6p-1/durAB转化大肠杆菌表达菌株 Rosetta(DE3)，得到重组菌1。
（2）构建重组菌2
重组菌2表达由GST标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancin GL相连形成的重组细菌素durancin GL。重组细菌素durancin GL的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。重组菌2的构建过程如下：以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物GST01和下游引物GST2，扩增由肠激酶酶切位点和durancin GL的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物GST01带肠激酶酶切位点的编码基因，GST01的序列（SEQ ID NO:9）为：5′-CTGGGATCCGACGACGACGACAAGGCAACTTATTATGGAAATGGTGTTTATTG -3′；下游引物GST2的序列同上。融合基因PCR扩增片段和pGEX-6p-1载体经BamH I 和Xho I双酶切后，进行连接。鉴定正确后，重组载体命名为pGEX-6p-1/durAB-GST，转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3)表达菌株，获得重组菌2。
（3）构建重组菌3
重组菌3表达由His标签、肠激酶酶切位点和细菌素durancin GL相连形成的重组细菌素durancin GL。重组细菌素durancin GL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。重组菌3的构建过程如下：以pEASY/durAB质粒为模板，设计上游引物GST001和下游引物GST2，扩增由His标签、肠激酶酶切位点和durancin GL的编码基因相连形成的融合基因。其中，上游引物GST001带His标签和肠激酶酶切位点的编码基因，GST001的序列（SEQ ID NO:10）为：5′-AGGCCATGGCAACTTATTATGGAAATGGTGTTTATTG-3′；下游引物GST2的序列同上。使用Nco I 和Xho I分别双酶切pET30a载体和纯化后的融合基因PCR产物，然后将酶切产物进行连接。鉴定正确后，重组载体命名为pET/durAB-His，转化入大肠杆菌 Rosetta(DE3) 表达菌株，获得重组菌3。
4、重组细菌素durancin GL的分离纯化
（1）IPTG诱导重组细菌素durancin GL的表达及重组细菌素durancin GL粗提液的制备
分别诱导表达重组菌1、2和3，并提取重组细菌素durancin GL粗提液。具体方法如下：
a 挑取重组菌的单菌落，接种于装有 LB液体培养基（含终浓度为50 μg/mL的氨苄青霉素）的三角瓶中，37℃、200 r/min条件下振荡培养，直至OD600在0.6到0.8之间。
b 向三角瓶中加入终浓度为1 mM的IPTG进行诱导，继续培养5 h，然后将培养液在8 000 g条件下离心5 min收集菌体，用生理盐水清洗菌体3次。用发酵液体积1%的结合缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和20 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）悬浮菌体，置于冰水混合物中超声破碎菌体细胞，直至菌悬液澄清，得到菌体裂解液。将菌体裂解液在4℃条件下离心（15 000 g，30 min），取上清，用0.22 μm的滤膜过滤，得到重组细菌素durancin GL粗提液。
（2）HisTrap HP柱(购自GE公司）对重组细菌素durancin GL的纯化（使用蛋白纯化系统进行）
对重组菌1和3的重组细菌素durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱进行分离，具体方法如下：
a 用去离子水充满管路，对各个接头进行湿接，以免引入气泡。
b 去掉柱子的上、下堵头，用3～5个柱体积的ddH2O替换柱子中的乙醇，然后用至少5个柱体积的结合缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和20 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）平衡柱子。流速为1 mL/min。
c 上样。
d 用结合缓冲液洗到基线稳定。
e 用5～10个柱体积的洗脱缓冲液（含有500 mM NaCl、20 mM Na3PO4和500 mM 咪唑的水溶液，pH 7.4）洗脱结合到柱子上的蛋白。
使用紫外检测器，波长为280nm。重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱分离的色谱图如图2所示，收集洗脱峰进行脱盐处理，并进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图3泳道2。重组菌3的重组细菌素durancin GL粗提液在色谱分离过程中，无洗脱峰出现。上述结果说明，只携带His标签的重组细菌素durancin GL不存在于上述粗提液中。进一步对重组菌3的裂解液沉淀进行SDS-PAGE检测，也未发现有重组蛋白条带出现，表明只携带His标签的重组细菌素durancin GL未被表达。
（3）脱盐
重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱分离所得洗脱峰，采用如下方法脱盐：
a：用结合缓冲液（含有140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH2PO4的水溶液，pH7.4）平衡HiTrapTM Desalting 5ml柱（购自GE公司）。
b：取1.5 mL样品上样，使用紫外和电导检测器监测流出液，保持流速在1~10 mL/min，收集洗脱峰。取洗脱峰采用GSTrap 4B柱进行纯化。
（4）GSTrap 4B柱（购自GE公司）对重组细菌素durancin GL的纯化
将重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱分离、脱盐后采用GSTrap 4B柱进行分离。将重组菌2的重组细菌素durancin GL粗提液采用GSTrap 4B柱进行分离。具体方法如下：
a 用结合缓冲液（含有140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4和1.8 mM KH2PO4的水溶液，pH7.4）充满管路，对各个接头进行湿接。
b 去掉柱子上下堵头。
c 用至少5个柱子体积的结合缓冲液平衡柱子。
d 以1 mL/min的流速上样。
e 用结合缓冲液洗到基线稳定。
f 用5～10个柱体积的洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl缓冲液中含有10 mM还原型谷胱甘肽，pH8.0）洗脱结合到柱子上的蛋白，收集洗脱峰。重组菌1和2的重组细菌素durancin GL的分离色谱图与图2类似。
（5）脱盐
重组菌1和2的重组细菌素durancin GL采用GSTrap 4B柱分离得到的洗脱峰分别采用如下方法进行脱盐：
a用裂解缓冲液（含有25 mM Tris-HCl、2 mM CaCl2和50 mM NaCl的水溶液，pH 7.6）平衡HiTrapTM Desalting 5ml柱（购自GE公司）。
b 上样品1.5 mL，使用紫外和电导检测器监测流出液，保持流速在1~10 mL/min，收集洗脱峰作为重组细菌素。取洗脱峰进行SDS-PAGE电泳，其中重组菌2的重组细菌素durancin GL的电泳结果见图3泳道3；重组菌1的重组细菌素durancin GL的电泳结果见图4。
5、重组细菌素durancin GL标签的切除与细菌素durancin GL的抑菌活性检测
将本实施例标题4中步骤（5）脱盐后得到的重组菌1的重组细菌素durancin GL，采用肠激酶在25℃条件下酶切16 h，将酶切反应后的混合物通过HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱除去其中的His标签和GST标签，收集最后一个柱子中的流出液即得细菌素durancin GL，经质谱鉴定，其纯度为96%，且氨基酸序列与天然细菌素durancin GL完全一致，并且对指示菌（无害李斯特菌）具有抑制活性（图5）。重组菌1的重组细菌素durancin GL分离纯化及细菌素durancin GL活性效果见表1。
将本实施例标题4中步骤（5）脱盐后得到的重组菌2的重组细菌素durancin GL，采用肠激酶在25℃条件下酶切16 h，将酶切反应后的混合物通过GSTrap 4B柱除去其中的GST标签，收集流出液即得细菌素durancin GL，经质谱鉴定，其纯度为80%，且氨基酸序列与天然细菌素durancin GL完全一致，并且对指示菌（无害李斯特菌）具有抑制活性（图5）。重组菌2的重组细菌素durancin GL分离纯化及细菌素durancin GL活性效果见表1。
细菌素durancin GL的活性通过二倍稀释法进行检测确定，具体方法见参考文献（Lihui Du, George A. Somkuti, John A. Renye Jr. Guicheng Huo. 2012. Properties of Durancin GL, a new antilisterial bacteriocin produced by Enterococcus Durans 41D. Journal of food safety, 32:74-83.）。抑菌圈的出现表明切除纯化标签后的细菌素durancin GL同样具有抑制李斯特菌生长的活性。
表1 重组菌1和2的重组细菌素durancin GL的分离纯化及细菌素durancin GL活性效果
注意：表中“相对得率”指以重组菌2纯化获得的细菌素durancin GL总活力为参照的相对比值；“N”代表不能进行相应操作。“纯度”是通过BIO-RAD ChemiDoc XRS 凝胶成像系统软件直接分析SDS-PAGE电泳图片的条带相对亮度获得。“第一次”是指酶切之前的亲和层析。
表1中的细菌素durancin GL是指经纯化、酶切后除去纯化标签所得，其氨基酸序列与天然细菌素durancin GL一致。若将得到的细菌素durancin GL活性换算到单位发酵液体积，则重组菌1和2单位发酵液体积获得的细菌素活性分别是76.8AU/mL和64AU/mL。由表1可以看出：携带有两种纯化标签的重组细菌素durancin GL经分离纯化后，纯度达到了90.6%，酶切后纯化得到的细菌素durancin GL纯度达到96%；仅携带由单一GST标签的重组细菌素durancin GL经分离纯化后，纯度仅仅只有72.3%，酶切后得到的细菌素durancin GL纯度仅仅只有80%。携带有两种纯化标签的重组细菌素durancin GL并未影响该重组细菌素的外源表达效果。因此，采用重组菌1制备得到细菌素durancin GL，不仅单位体积发酵液获得了大量的细菌素durancin GL，而且纯度非常高。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京财经大学
<120> 用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用
<130> 201502062
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
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Val Asn Gly Trp Val Gln His Gly Pro Trp Ala Pro Arg
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Claims (8)
1.用于制备细菌素durancin GL的重组菌，其特征在于所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于所述纯化标签通过酶切位点连接在细菌素durancin GL的一端或两端（N端或C端或者同时连接在N和C端）。
3.根据权利要求2所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
4.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.权利要求1-5之一所述重组菌的制备方法，其特征在于将由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。
7.根据权利要求6所述重组菌的制备方法，其特征在于所述重组载体是将由细菌素durancin GL、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。
8.制备细菌素durancin GL的方法，其特征在于诱导权利要求1-5之一所述重组菌表达由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解所述由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，除去酶解液中的纯化标签，得到细菌素durancin GL。
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