CN105296506B - 以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法 - Google Patents
以硫磺菌蘑菇凝集素n-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人工合成的编码硫磺菌蘑菇凝集素N‑乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因以及含有LSL基因的表达载体、宿主细胞，LSL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。本发明还公开了一种以LSL作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，该方法具体涉及LSL基因合成、含LSL基因和目标蛋白基因的表达载体构建、含LSL基因和蛋白酶基因的表达载体构建、融合蛋白的表达与纯化、LSL蛋白标签去除和目标蛋白纯化等步骤。本发明方法简单易行，实现了目标蛋白一步纯化，可获得高纯度的目标蛋白，降低了蛋白纯化成本，可广泛用于生物医药、兽药等领域的活性蛋白质以及生物制品行业中疫苗抗原的规模化制备，具有较高的实用价值。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种以硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法。
背景技术
随着基因工程技术、基因组学和蛋白质学技术的发展，重组蛋白已经广泛应用于生物、医药、农业和畜牧兽医等多种领域。然而，大规模生产和纯化性状确切的蛋白仍然是重组蛋白技术中的难点。重组蛋白的表达系统有原核和真核两大类。真核表达体系有酵母、昆虫和哺乳动物细胞表达体系等。相对于真核表达体系的繁琐过程和较高的成本，以大肠杆菌为代表的原核表达体系具有宿主菌背景清晰、表达量高、易于操作和生产成本低等诸多优点。
在规模化生产重组蛋白过程中，合适的融合标签对于目标蛋白的可溶性表达和下游的蛋白纯化与检测均具有举足轻重的作用。常用的融合标签包括蛋白质标签和多肽片段标签。大的蛋白质标签有谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖结合蛋白(MBP)，硫氧还原蛋白A(TrxA)，葡萄球菌蛋白A(SPA)，小泛素相关修饰蛋白(SUMO)等，它们的使用会增加目标蛋白的溶解性，但在蛋白结晶和抗体产生等过程中，标签必须去除。常见的小的多肽标签有六聚组氨酸(6×His)、流感病毒血凝素表位(HA)、人c-myc蛋白表位(c-myc)、以及8个氨基酸(DYKDDDDK)组成的一个短肽FLAG标签等。利用上述标签，可以通过亲和层析技术纯化目标蛋白。虽然这些标签各具优点并得到广泛应用，但在规模化制备和纯化蛋白时，仍存在成本高的缺点。因此，研究和开发新的融合标签用于蛋白质的高效表达和纯化仍然很有必要。
凝集素是各种植物，无脊椎动物和高等动物均存在的一类对糖蛋白上的糖链具有高度特异性的结合蛋白。可专一识别某种糖并与之非共价地、可逆地结合，如刀豆素与α-D-吡喃糖基甘露糖(α-D-Mannopyranosy)结合；麦芽素与N-乙酰糖胺(N-acetylglucosamine)结合；菜豆凝集素与N-乙酰乳糖胺结合。利用凝集素与某种糖特异、可逆结合的特性，在实验室中，将凝集素与固相载体结合来纯化各种糖类和糖蛋白，同时也用偶联于固相介质上的某种糖来纯化凝集素。1994年Konska等人从硫磺菌中分离出能特异性结合N-乙酰氨基乳糖的溶血性凝集素--硫磺蘑菇菌凝集素(Konska G,Guillot J,Dusser M,etal.Isolation and Characterization of an N-Acetyllactosamine-Binding Lectinfrom the Mushroom Laetiporus sulfurous.J Biochem,1994,116(3):519-23)，Hiroaki等研究发现该凝集素可以结合琼脂糖(Sepharose)，并能用乳糖竞争性洗脱(Tateno H,Goldstein IJ.Molecular cloning,expression,and characterization of novelhemolytic lectins from the mushroom Laetiporus sulphureus,which show homologyto bacterial toxins.J Biol Chem.2003,278(42):40455-40463)。因此，本研究拟在利用硫磺菌蘑菇凝集素作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白表达与纯化的高效、廉价方法。但是，由于天然的硫磺菌蘑菇凝集素基因较长，完整的基因有900多个核苷酸，翻译成约300个氨基酸，不适于用作融合蛋白标签进行目标蛋白的高效表达。现有的研究表明，天然硫磺菌蘑菇凝集素与乳糖结合的功能域主要位于N端的第1-187为氨基酸，因此，本申请只表达硫磺菌蘑菇凝集素N端的第1-187个氨基酸组成的区域(简称为硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖结合域)作为蛋白表达和纯化的标签，建立目标蛋白高效表达与纯化的方法。该硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖结合域的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，大小为21.3kDa，编码该区域的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，长度为561bp。
此外，由于每种生物在对基因进行翻译时对密码子的利用率有较大差异，这种差异直接影响基因表达的水平。而蘑菇凝集素作为一种真菌蛋白，其密码子在大肠杆菌中的利用率较低，将直接导致后续的标签蛋白和目的蛋白的表达量较低，而且容易导致表达的蛋白不可溶。为了解决这个问题，本发明根据大肠杆菌密码子嗜好性，对天然的硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖结合域的基因序列进行优化，使其密码子在大肠杆菌中具有高利用率，使得硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域可在大肠杆菌中高水平、可溶性表达，从而提供一种以硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种人工优化合成的能够编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因；本发明的另一目的是提供含有上述人工合成的LSL基因的表达载体和宿主细胞；本发明的再一目的是提供一种以硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化的方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明首先提供了一种编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因，所述LSL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述LSL基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种包含所述的LSL基因的表达载体。
优选地，上述的包含LSL基因的表达载体为pET28a-LSL，所述表达载体pET28a-LSL是以pET28a(+)为起始质粒载体构建的，所述表达载体pET28a-LSL还包括Nco I限制性核酸内切酶识别位点、Kpn I限制性核酸内切酶识别位点、BamH I限制性核酸内切酶识别位点和蛋白酶识别位点。
进一步的，本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为包含上述的LSL基因(其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示)的宿主细胞，或者为包含上述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了一种利用上述LSL基因编码合成的硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，包括以下步骤：
(1)标签基因的构建：
人工合成编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因，所述LSL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后在LSL基因的5’端加上限制性核酸内切酶1的识别位点，在其3’端依次加上限制性核酸内切酶2的识别位点、蛋白酶识别位点和限制性核酸内切酶3的识别位点，形成标签基因；
(2)表达载体1的构建：
用限制性核酸内切酶1和3对标签基因进行双酶切处理，然后将双酶切后回收得到的含有LSL基因的基因片段用DNA连接酶与经过同样双酶切处理的大肠杆菌表达载体进行连接，得到含有LSL基因片段的表达载体1；
(3)表达载体2和表达载体3的构建：
a.目标蛋白基因序列的合成：参照目标蛋白的基因序列，人工合成目标蛋白基因，并在目标蛋白基因的5’端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，在其3’端加上限制性核酸内切酶4的识别位点；
b.用限制性核酸内切酶3和4分别对合成的目标蛋白基因序列、表达载体1进行双酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的目标蛋白基因序列和表达载体1进行连接，得到包含LSL基因和目标蛋白基因的表达载体2；
c.蛋白酶基因序列的合成：参照蛋白酶的基因序列，人工合成蛋白酶基因，并在蛋白酶基因的5’端加上限制性核酸内切酶2的识别位点，在其3’端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，其中，所述蛋白酶为与步骤(1)中蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶；
d.用限制性核酸内切酶2和3分别对合成的蛋白酶基因序列、表达载体1进行双酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的蛋白酶基因序列和表达载体1进行连接，得到包含LSL基因和蛋白酶基因的表达载体3；
(4)融合蛋白的诱导表达：
a.将表达载体2和3分别转化至宿主菌中，然后进行鉴定，挑选出含有表达载体2的阳性克隆菌和含有表达载体3的阳性克隆菌，分别进行发酵培养，并加入IPTG诱导重组蛋白的表达，所述IPTG的浓度为0.2-1.0mmol/L；
b.发酵培养结束后，将两种发酵产物分别进行离心处理，各自收集菌体沉淀；然后分别用细菌裂解液重悬菌体，超声破碎菌体，离心并收集上清，分别得到表达产物2和表达产物3
(5)融合蛋白的分离纯化：
a.融合蛋白2的分离纯化：将表达产物2上样至凝胶过滤层析柱上，静置3-10min，然后打开凝胶过滤层析柱的下水口，控制流速为0.5-1mL/min，然后向凝胶过滤层析柱中加入30-60倍柱床体积的PBS缓冲液进行洗涤处理，同时收集下水口流出的洗涤液并进行检测，当收集到的洗涤液中检测不到蛋白时，向凝胶过滤层析柱中加入洗脱液进行洗脱处理，控制洗脱液的流速为0.4-1mL/min，并收集洗脱液，得到纯化的融合蛋白2；
b.融合蛋白3的分离纯化：融合蛋白3的分离纯化方法与融合蛋白2相同，经过分离纯化，得到纯化的融合蛋白3；
(6)蛋白标签的切除：
按质量比(5-20)：1的比例取纯化后的融合蛋白2和融合蛋白3，加入到与步骤(1)中的蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶的酶切反应缓冲液中，进行酶切反应；其中，融合蛋白3可酶切融合蛋白2，形成游离的硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域标签蛋白和目标蛋白；
(7)目标蛋白的回收：
将酶切反应后的反应液上样至凝胶过滤层析柱，静置3-10min，融合蛋白3和硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域标签蛋白被结合至凝胶过滤层析柱上，目标蛋白不结合凝胶过滤层析柱而流出，收集流穿液，即得到纯化的目标蛋白。
根据上述的方法，所述限制性核酸内切酶1优选为Nco I；所述限制性核酸内切酶2优选为Kpn I；所述限制性核酸内切酶3优选为BamH I；所述限制性核酸内切酶4优选为HindIII。
根据上述的方法，步骤(2)中所述的大肠杆菌表达载体上含有限制性核酸内切酶1、3和4的识别位点。
根据上述的方法，步骤(2)中所述的大肠杆菌表达载体优选为pET系列载体；更优选的，所述的大肠杆菌表达载体为pET28a(+)。
根据上述的方法，优选地，步骤(3)中所述的蛋白酶为烟草蚀纹病毒病蛋白酶、肠激酶、凝血酶中的任意一种；其中，所述蛋白酶与蛋白酶的识别位点如表1所示。
表1 蛋白酶与蛋白酶识别位点
| 蛋白酶名称 | 大小(kDa) | 蛋白酶识别位点 |
| 烟草蚀纹病毒病蛋白酶(TEV) | 27 | GAAAATCTGTACTTTCAGGGA(21bp) |
| 肠激酶 | 26 | GACGACGACGACAAG(15bp) |
| 凝血酶 | 27 | CTGGTGCCACGCGGTTCT(18bp) |
根据上述的方法，步骤(3)中所述的蛋白酶更优选为烟草蚀纹病毒病蛋白酶。
根据上述的方法，步骤(4)中所述的宿主菌优选为大肠杆菌，更优选为Escherichia coli BL21(DE3)；含有表达载体2的阳性克隆菌和含有表达载体3的阳性克隆菌的发酵培养的培养基、培养条件与培养宿主菌的培养基和培养条件相同。
根据上述的方法，步骤(4)中所述IPTG的浓度优选为1.0mmol/L；诱导温度为20-37℃，优选为25℃；诱导时间为4-8h，优选为6h。
根据上述的方法，步骤(5)中所述洗脱液优选为乳糖，其浓度优选为0.1-0.4mol/L，其浓度更优选为0.2mol/L。
根据上述的方法，步骤(5)和步骤(7)中所述的凝胶过滤层析柱优选为琼脂糖凝胶过滤层析柱，其凝胶填料为Sepharose 4B。
根据上述方法，步骤(6)中所述的酶切反应的反应温度为4-30℃，优选反应温度为20-30℃；酶切反应时间为1-16h，优选为1-4h。
本发明的积极有益效果：
(1)本发明实现了目标蛋白的一步纯化：本发明的目标蛋白表达纯化方法是在需要纯化的目标蛋白的N端连接硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为蛋白纯化标签，实现重组蛋白的纯化。此体系的优点在于硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域可特异性结合琼脂糖，并能用乳糖竞争性洗脱，因此，利用硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为蛋白纯化标签，实现了目标蛋白的一步纯化，而且能形成一种简便、高效、经济的纯化所需目的重组蛋白的体系。
(2)本发明可以实现硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域蛋白标签一步法切割并除去，获得目标蛋白：利用本发明构建的重组蛋白表达纯化方法，还可以表达纯化带有LSL标签的蛋白酶，本发明在LSL标签和目标蛋白之间插入了与该蛋白酶相匹配的蛋白酶识别位点，因此，可以利用带LSL标签的蛋白酶将目标蛋白上的LSL标签切割下来；酶切反应后，只需经过琼脂糖凝胶过滤层析柱即可将带有LSL标签的蛋白酶和切下的LSL标签与目标蛋白分离开，最终得到单一组分的目标蛋白，而且得到的目标蛋白具有近乎天然N末端。
(3)本发明的方法大大降低了目标蛋白的纯化成本：蛋白表达和纯化的成本主要取决纯化用的介质，本发明中的目标蛋白表达纯化方法对纯化介质Sepharose-4B没有特殊要求，也无需经过特殊处理，使用过的Sepharose-4B经过乳糖洗脱液洗净残留的蛋白，随后用双蒸水冲洗，将柱中的乳糖洗净即可重复使用，因此，本发明方法中目标蛋白的纯化成本较目前商品化的蛋白质纯化方法的成本大大降低；而且，纯化等量的蛋白其成本约为常用商品化鎳柱纯化方法的1/10。
(4)本发明可以实现目标蛋白的规模化生产：本发明的目标蛋白表达纯化方法操作简单，标签易去除，洗脱方便，可获得高纯度的目标蛋白，实现了目标蛋白的一步纯化，极大地节省了蛋白纯化的时间，同时也节省了人力、物力，极大地降低了蛋白纯化的成本，可以广泛用于生物医药、兽药等领域中的活性蛋白质，以及生物制品行业中疫苗抗原的规模化制备，具有较高的实用价值和重要的经济意义。
附图说明
图1表达载体pET28a-LSL的酶切鉴定结果图(其中，M为DNA marker；1为pET28a(+)对照；2为Nco I和BamH I双酶切后的pET28a-LSL)；
图2表达载体pET28a-LSL-Cap和pET28a-LSL-TEV的酶切鉴定结果图(其中，M为DNAmarker；1为pET28a-LSL对照；2为Kpn I和BamH I双酶切后的pET28a-LSL-TEV；3为BamH I和HindⅢ双酶切后的pET28a-LSL-Cap)；
图3LSL-Cap融合蛋白的表达与纯化后的SDS-PAGE结果图(其中，M为低分子量蛋白marker；1为未经诱导培养的含有pET28a-LSL-Cap表达载体的宿主菌中LSL-Cap融合蛋白的表达；2为经诱导培养的含有pET28a-LSL-Cap表达载体的宿主菌中LSL-Cap融合蛋白的表达；3为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSL-Cap融合蛋白)；
图4LSL-TEV融合蛋白的表达与纯化后的SDS-PAGE结果图(其中，M为低分子量蛋白marker；1为未经诱导培养的含有pET28a-LSL-TEV表达载体的宿主菌中LSL-TEV融合蛋白的表达；2为经诱导培养的含有pET28a-LSL-TEV表达载体的宿主菌中LSL-TEV融合蛋白的表达；3为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSL-TEV融合蛋白)；
图5酶切反应后的反应液样品和反应液样品用琼脂糖凝胶柱纯化后得到的Cap蛋白样品的SDS-PAGE结果图(M为低分子量蛋白marker；1为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSL-Cap融合蛋白；2为琼脂糖凝胶柱纯化后的LSL-TEV融合蛋白；3为酶切反应后的反应液样品；4为酶切反应后的反应液样品用琼脂糖凝胶柱纯化后得到的Cap蛋白样品)。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应该理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
除非特别说明，本发明采用的除引物、探针之外的试剂、方法和设备为本领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明使用的试剂和试剂盒均为市购。
以下本发明以猪圆环病毒II型衣壳蛋白Cap(Cap蛋白的大小为24kDa，其Cap基因的长度为576bp)作为目标蛋白，来详细阐述本发明内容的具体实施。
菌种和试剂：
pET28a(+)质粒、Escherichia coli DH5α和BL21(DE3)均购自宝生物工程(大连)有限公司，DNA聚合酶、限制性内切酶Nco I、Kpn I、BamH I、Hind III和T4DNA连接酶购自NEB(北京)有限公司，质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自Qiagen公司，Sepharose-4B、卡那霉素、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Sigma公司。磷酸盐缓冲液(PBS)的组成：10mmol/L磷酸钠、0.15mol/L NaCl、0.04％叠氮钠，PH7.2。细菌裂解液：细菌裂解液为含有Nonidet P-40、PMSF和2-巯基乙醇三种成分的PBS缓冲液(pH7.2)，其中，Nonidet P-40的含量为1％，PMSF的浓度为1mmol/L，2-巯基乙醇的浓度为1mmol/L。10×TEV反应缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、0.5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT。LB固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，琼脂粉10g，加水至1000mL，pH调为7.2。LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，加水至1000mL，pH调为7.2。
实施例1：LSL基因的合成和标签基因的构建
对编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSLa基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)进行DNA分析及RNA结构预测，在不改变天然氨基酸序列的前提下人工合成编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因，该人工合成的LSL基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
在上述人工合成的LSL基因序列的5’端加上Nco I限制性核酸内切酶识别位点，在其3’端依次加上Kpn I限制性核酸内切酶识别位点、TEV蛋白酶识别位点和BamH I限制性核酸内切酶识别位点，形成标签基因，然后将标签基因克隆至pET32a(+)质粒上，获得包含标签基因的pET32a-LSL质粒。
实施例2：含有编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因的表达载体构建
1、pET28a-LSL表达载体的构建
将实施例1合成的包含标签基因的pET32a-LSL质粒用Nco I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收同时含有LSL基因和TEV蛋白酶识别位点的标签基因片段；用T4DNA连接酶将回收得到的同时含有LSL基因和TEV蛋白酶识别位点的标签基因片段连入同样用Nco I和BamH I双酶切后的pET28a(+)表达载体上；然后将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化后的DH5α涂布至含有卡那霉素的LB固体培养平板上，37℃过夜培养。次日挑取单菌落于5ml含卡那霉素LB液体培养基中，37℃200rpm培养12h，提取质粒DNA，用Nco I和BamH I双酶切鉴定标签基因的插入，并送测序公司进行测序。将连接入标签基因的测序正确的pET28a(+)质粒命名为pET28a-LSL，即获得同时含有LSL基因和TEV蛋白酶识别位点基因的表达载体pET28a-LSL。
本发明pET28a-LSL表达载体的双酶切鉴定图见附图1，由附图1可知，pET28a-LSL表达载体经Nco I和BamH I双酶切能切出约600bp的条带，该条带与标签基因(600bp)的大小相同，由此也可以说明pET28a-LSL表达载体构建成功。
2、pET28a-LSL-Cap表达载体的构建
参照Cap基因序列(GenBank Accession No.AB112940.1)，人工合成Cap基因，并在Cap基因序列的5’端加上BamH I限制性核酸内切酶识别位点，在其3’端加上Hind III限制性核酸内切酶识别位点，然后将人工合成的带有BamH I和Hind III限制性核酸内切酶位点的Cap基因克隆至pET32a(+)质粒上，获得包含Cap基因的pET32a-Cap质粒。
将上述合成的包含Cap基因的pET32a-Cap质粒用BamH I和Hind III双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收Cap基因片段，用T4DNA连接酶将回收得到的Cap基因片段连入同样用BamHI和Hind III双酶切后的pET28a-LSL表达载体上；然后将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化后的DH5α涂布至含有卡那霉素的LB固体培养平板上，37℃过夜培养。次日挑取单菌落于5ml含卡那霉素LB液体培养基中，37℃200rpm培养12h，提取质粒DNA，用BamH I和Hind III双酶切鉴定Cap基因的插入，并送测序公司进行测序。将连接入Cap基因的测序正确的pET28a-LSL质粒命名为pET28a-LSL-Cap，即获得同时含有LSL标签和Cap基因的表达载体pET28a-LSL-Cap。
本发明pET28a-LSL-Cap表达载体的双酶切鉴定图见附图2，由附图2可知，pET28a-LSL-Cap表达载体经BamH I和Hind III双酶切能切出约576bp的条带，该条带与Cap基因(576bp)的大小相同，由此也可以说明pET28a-LSL-Cap表达载体构建成功。
3、pET28a-LSL-TEV表达载体的构建
参照TEV蛋白酶的基因序列(GenBank Accession No.AB112940.1)，人工合成TEV蛋白酶基因，并在TEV蛋白酶基因序列的5’端加上Kpn I限制性核酸内切酶识别位点，在其3’端加上BamH I限制性核酸内切酶识别位点；然后将人工合成的带有Kpn I和BamH I限制性核酸内切酶位点的TEV蛋白酶基因克隆至pET32a(+)质粒上，获得含有TEV蛋白酶基因的pET32a-TEV质粒。
将上述合成的包含TEV蛋白酶基因的pET32a-TEV质粒用Kpn I和BamH I双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收TEV蛋白酶基因片段，用T4DNA连接酶将回收得到的TEV蛋白酶基因片段连入同样用Kpn I和BamH I双酶切后的pET28a-LSL表达载体上；然后将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α中，将转化后的DH5α涂布至含有卡那霉素的LB固体培养平板上，37℃过夜培养。次日挑取单菌落于5ml含卡那霉素LB液体培养基中，37℃200rpm培养12h，提取质粒DNA，用Kpn I和BamH I双酶切鉴定TEV蛋白酶基因的插入，并送测序公司进行测序。将连接入TEV蛋白酶基因的测序正确的pET28a-LSL质粒命名为pET28a-LSL-TEV，即获得同时含有LSL标签和TEV蛋白酶基因的表达载体pET28a-LSL-TEV。
本发明pET28a-LSL-TEV表达载体的双酶切鉴定图见附图2，由附图2可知，pET28a-LSL-TEV表达载体经Nco I和BamH I双酶切能切出约708bp的条带，该条带与TEV蛋白酶基因(708bp)的大小相同，由此也可以说明pET28a-LSL-TEV表达载体构建成功。
实施例3：含LSL蛋白标签的融合蛋白的表达
1、含LSL蛋白标签和Cap蛋白的融合蛋白(简称LSL-Cap融合蛋白)的表达
融合蛋白的表达方法：将表达载体pET28a-LSL-Cap转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌中，然后将转化后的E.coli BL21(DE3)涂布至含卡那霉素的LB固体培养平板，37℃过夜培养。次日挑取单菌落于5ml含卡那霉素LB液体培养基中，37℃200rpm培养12h；然后将培养的菌液按1:100比例转接新的含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养至菌液的OD600≈0.8时，加入终浓度为1.0mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，25℃200rpm诱导培养6h。将诱导培养后的菌液经8000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体沉淀，按比例(1g菌体沉淀加入30ml细菌裂解液的)向菌体沉淀中加入细菌裂解液重悬菌体，冰浴超声破碎菌体；然后经10000rpm离心10min收集上清，上清用0.45μm的滤膜过滤后进行SDS-PAGE(SDS-PAGE结果见附图3)，分析表达产物。
由图3可知，本发明含有pET28a-LSL-Cap表达载体的E.coli BL21(DE3)重组菌经诱导培养后，其诱导表达产物经SDS-PAGE后在44.68kDa处出现了特异性蛋白条带，与预计的长度为1176bp的LSL+Cap基因片段编码的392个氨基酸分子量一致，而未经诱导培养的含有pET28a-LSL-Cap表达载体的E.coli BL21(DE3)重组菌的表达产物在相应的位置没有出现明显条带，由此也可以说明与硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域蛋白标签融合的Cap蛋白能在诱导条件下特异性表达，所构建的pET28a-LSL-Cap表达载体构建成功，而且pET28a-LSL-Cap表达载体在大肠杆菌中能够成功表达。用Quantity One软件分析LSL-Cap融合蛋白的表达水平占菌体总蛋白的30％。
2、含LSL蛋白标签和TEV蛋白的融合蛋白(简称LSL-TEV融合蛋白)的表达
LSL-TEV融合蛋白的表达方法与LSL-Cap融合蛋白的表达方法相同。经过表达，获得LSL-TEV融合蛋白。本发明LSL-TEV融合蛋白的SDS-PAGE结果见附图4。
由图4可知，本发明含有pET-LSL-TEV表达载体的E.coli BL21(DE3)重组菌经诱导培养后，其诱导表达产物经在48kDa处出现了特异性蛋白条带，与预计的长度为1330bp的LSL+TEV蛋白酶基因片段编码的423个氨基酸分子量一致，而未经诱导培养的含有pET-LSL-TEV表达载体的E.coli BL21(DE3)重组菌的表达产物在相应的位置没有出现明显条带，由此也可以说明与硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域蛋白标签融合的TEV蛋白酶能在诱导条件下特异性表达，所构建的pET28a-LSL-TEV表达载体构建成功，而且在大肠杆菌中能够成功表达。用Quantity One软件分析LSL-TEV融合蛋白的表达水平占菌体总蛋白的27％。
实施例4：融合蛋白的亲和层析纯化
1、LSL-Cap融合蛋白的纯化
纯化方法：将琼脂糖凝胶Sepharose-4B装柱，用30倍柱床体积的超纯水进行洗涤，随后用20倍柱床体积的PBS平衡柱子。然后将LSL-Cap融合蛋白上样至琼脂糖凝胶柱上，静置5min，打开琼脂糖凝胶柱的下水口，控制流速为1mL/min。随后向琼脂糖凝胶柱中加入30-60倍柱床体积的PBS缓冲液，以自然流速进行洗涤处理，同时收集下水口流出的洗涤液并进行检测，直至在洗涤液中检测不到蛋白。当收集到的洗涤液中检测不到蛋白时，用0.2mol/L的乳糖作为洗脱液洗脱LSL-Cap融合蛋白，控制洗脱液的流速为控制流速为0.5mL/min，并收集洗脱液，得到纯化的LSL-Cap融合蛋白。
将纯化后的LSL-Cap融合蛋白样品进行SDS-PAGE分析，其SDS-PAGE结果见附图3。由附图3可知，将含有LSL-Cap融合蛋白的细菌裂解液上清通过琼脂糖凝胶柱，LSL-Cap融合蛋白可以特异性地被吸附到凝胶柱上，经洗去杂蛋白后，用0.2mol/L的乳糖洗脱，即可得到高纯度的LSL-Cap融合蛋白。
2、LSL-TEV融合蛋白的纯化
LSL-TEV融合蛋白的纯化方法与LSL-Cap融合蛋白的纯化方法相同。经过纯化，获得了纯化的LSL-TEV融合蛋白。
将纯化后的LSL-TEV融合蛋白样品进行SDS-PAGE分析，其SDS-PAGE结果见附图4。由附图4可知，将含有LSL-TEV融合蛋白的细菌裂解液上清通过琼脂糖凝胶柱，LSL-TEV融合蛋白可以特异性地被吸附到凝胶柱上，经洗去杂蛋白后，用0.2mol/L的乳糖洗脱，即可得到高纯度的LSL-TEV融合蛋白。
实施例5：LSL-Cap融合蛋白标签分子的去除和目标蛋白Cap的纯化
按质量比10：1的比例取纯化后的融合蛋白2和融合蛋白3，加入到TEV蛋白酶缓冲液中，25℃酶切反应时间为2h。然后将酶切反应后的反应液上样至Sepharose-4B琼脂糖凝胶柱，静置5min，LSL-TEV融合蛋白和被切下的LSL蛋白标签被结合至Sepharose-4B琼脂糖凝胶柱上，然后打开凝胶过滤层析柱的下水口，收集流穿液，即得到纯化的目标蛋白Cap。
将酶切反应后的反应液样品和收集的流穿液样品分别进行的SDS-PAGE分析，其结果见附图5。
由附图5可知，酶切后的酶切反应液经过SDS-PAGE，出现了三条蛋白条带，这三条蛋白条带与预计出现的三条蛋白条带：LSL蛋白标签(21.3kDa)、Cap蛋白(24kDa)和LSL-TEV融合蛋白(48kDa)大小一致，说明经过酶切反应，LSL-Cap融合蛋白上的LSL蛋白标签被成功切下；流穿液样品经过SDS-PAGE分析后，只出现了一条蛋白条带，该蛋白条带的大小与Cap蛋白(24kDa)一致，说明酶切反应后的反应液样品经过Sepharose-4B琼脂糖凝胶柱一步纯化即可得到纯化的单一组分的Cap蛋白。
Claims (7)
1.一种以硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域作为融合标签的目标蛋白表达与纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）标签基因的构建：
人工合成编码硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域的LSL基因，所述LSL基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，然后在LSL基因的5’端加上限制性核酸内切酶1的识别位点，在其3’端依次加上限制性核酸内切酶2的识别位点、蛋白酶识别位点和限制性核酸内切酶3的识别位点，形成标签基因；其中，所述限制性核酸内切酶1为NcoI；所述限制性核酸内切酶2为KpnI；所述限制性核酸内切酶3为BamH I；
（2）表达载体1的构建：
用限制性核酸内切酶1和3对标签基因进行双酶切处理，然后将双酶切后回收得到的含有LSL基因的基因片段用DNA连接酶与经过同样双酶切处理的大肠杆菌表达载体进行连接，得到含有LSL基因片段的表达载体1；其中，所述大肠杆菌表达载体为pET28a（+）；
（3）表达载体2和表达载体3的构建：
a. 目标蛋白基因序列的合成：参照目标蛋白的基因序列，人工合成目标蛋白基因，并在目标蛋白基因的5’端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，在其3’端加上限制性核酸内切酶4的识别位点；其中，所述限制性核酸内切酶4为Hind III；
b. 用限制性核酸内切酶3和4分别对合成的目标蛋白基因序列、表达载体1进行双酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的目标蛋白基因序列和表达载体1进行连接，得到包含LSL基因和目标蛋白基因的表达载体2；
c. 蛋白酶基因序列的合成：参照蛋白酶的基因序列，人工合成蛋白酶基因，并在蛋白酶基因的5’端加上限制性核酸内切酶2的识别位点，在其3’端加上限制性核酸内切酶3的识别位点，其中，所述蛋白酶为与步骤（1）中蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶；
d. 用限制性核酸内切酶2和3分别对合成的蛋白酶基因序列、表达载体1进行双酶切处理，然后用DNA连接酶将双酶切后回收得到的蛋白酶基因序列和表达载体1进行连接，得到包含LSL基因和蛋白酶基因的表达载体3；
（4）融合蛋白的诱导表达：
a. 将表达载体2和3分别转化至宿主菌中，然后进行鉴定，挑选出含有表达载体2的阳性克隆菌和含有表达载体3的阳性克隆菌，分别进行发酵培养，并加入IPTG诱导重组蛋白的表达，所述IPTG的浓度为0.2-1.0mmol/L；
b. 发酵培养结束后，将两种发酵产物分别进行离心处理，各自收集菌体沉淀；然后分别用细菌裂解液重悬菌体，超声破碎菌体，离心并收集上清，分别得到表达产物2和表达产物3
（5）融合蛋白的分离纯化：
a. 融合蛋白2的分离纯化：将表达产物2上样至凝胶过滤层析柱上，静置3-10min，然后打开凝胶过滤层析柱的下水口，控制流速为0.5-1mL/min，然后向凝胶过滤层析柱中加入30-60倍柱床体积的PBS缓冲液进行洗涤处理，同时收集下水口流出的洗涤液并进行检测，当收集到的洗涤液中检测不到蛋白时，向凝胶过滤层析柱中加入洗脱液进行洗脱处理，控制洗脱液的流速为0.4-1mL/min，并收集洗脱液，得到纯化的融合蛋白2；
b. 融合蛋白3的分离纯化： 融合蛋白3的分离纯化方法与融合蛋白2相同，经过分离纯化，得到纯化的融合蛋白3；
（6）蛋白标签的切除：
按质量比（5-20）：1的比例取纯化后的融合蛋白2和融合蛋白3，加入到与步骤（1）中的蛋白酶识别位点相匹配的蛋白酶的酶切反应缓冲液中，进行酶切反应；其中，融合蛋白3可酶切融合蛋白2，形成游离的硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域标签蛋白和目标蛋白；
（7）目标蛋白的回收：
将酶切反应后的反应液上样至凝胶过滤层析柱，静置3-10min，融合蛋白3和硫磺菌蘑菇凝集素N-乙酰氨基乳糖胺结合域标签蛋白被结合至凝胶过滤层析柱上，目标蛋白不结合凝胶过滤层析柱而流出，收集流穿液，即得到纯化的目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中所述的蛋白酶为烟草蚀纹病毒病蛋白酶、肠激酶、凝血酶中的任意一种。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述凝胶过滤层析柱为琼脂糖凝胶过滤层析柱，其凝胶填料为Sepharose 4B。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中所述洗脱液为乳糖，其浓度为0.1-0.4 mol/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）中，所述酶切反应的反应温度为4-30℃，酶切反应时间为1-16h。
6.一种利用权利要求1所述的方法构建的包含LSL基因的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为连接入标签基因的测序正确的pET28a(+) 质粒pET28a-LSL，所述表达载体pET28a-LSL还包括NcoI限制性核酸内切酶识别位点、KpnI限制性核酸内切酶识别位点、BamH I限制性核酸内切酶识别位点和蛋白酶识别位点；所述LSL基因的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包含权利要求6所述表达载体pET28a-LSL的宿主细胞。
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