CN114292313B

CN114292313B - 猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗

Info

Publication number: CN114292313B
Application number: CN202111660705.2A
Authority: CN
Inventors: 牛旻; 杨瑞华; 贾宾; 乔洋洋
Original assignee: Henan Xinghua Biotechnology Co ltd
Current assignee: Henan Xinghua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-12-30
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2024-01-26
Anticipated expiration: 2041-12-30
Also published as: CN114292313A

Abstract

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗。本发明提供了如SEQ ID NO:1所示的巴氏杆菌毒素的抗原片段，该片段为截短的巴氏杆菌毒素蛋白片段，其能够在大肠杆菌中高水平可溶性表达，表达产物不仅具有较高的收率，且具有良好的免疫原性能够起到良好的免疫效果。

Description

猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗。

背景技术

猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis of swine，AR)，是一种慢性传染病。本病的主要是支气管败血波氏杆菌的I相菌，其次是产毒素的多杀性巴氏杆菌(主要是D型)感染形成。前者单独感染时，鼻腔病变较轻，如果两者混合感染或继发感染时，则鼻腔病变很重。有时还可分离到绿脓杆菌、放线菌、毛滴虫及猪细胞巨化病毒。支气管败血波氏杆菌是小杆菌或球杆菌，革兰氏阴性，有两极着染的特点，有荚膜，能产生强坏死毒素。本菌的抵抗力不强，一般消毒药均可杀死。外表表现是以鼻甲骨(特别是下卷曲)萎缩、颜面部变形、慢性鼻炎为特征。

猪萎缩性鼻炎我国许多养猪业发达的省市也普遍存在，其发病率正在逐年升高，猪感染猪萎缩性鼻炎病原后，猪只的上呼吸道的正常结构和功能受到损害，导致机体对呼吸道病原的抵抗能力显著降低，使一些致病性强的呼吸道病原微生物容易感染受损伤的猪群，最终使猪群出现猪呼吸道综合征，猪的死亡率增加，严重危害猪群健康。

疫苗免疫是预防和控制PAR的主要手段，目前行业普遍流行的做法为巴氏杆菌分离培养后，采用规模扩大培养，然后使用灭活剂灭活后添加免疫佐剂使用的方案，但该方案总蛋白含量大，存在免疫应激，其次过多无效蛋白的引入导致免疫效果不佳；另有方案表达巴氏杆菌蛋白，但基因工程亚单位疫苗的开发中主要问题为目的蛋白的不可溶表达限制了基因工程疫苗的应用，包涵体蛋白不具备生物活性难以发挥免疫效应所以目前市面上此类疫苗基本没有或者为大量大白促成的疫苗，免疫效果差。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高效可溶表达的猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗。

本发明提供了巴氏杆菌毒素的抗原片段，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的巴氏杆菌毒素的抗原片段来源于生产分离株，更加贴近生产需求与生产毒株更为吻合，有利于后续免疫效果提升。通过对序列的截短表达，筛选出毒素蛋白中具备高效免疫原性的片段，提高生产效力。

本发明还提供了编码本发明所述抗原片段的核酸。

本发明所述核酸经密码子优化，具体实施例中，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

通过密码子优化，本发明进一步提高了抗原片段的可溶性表达效率，为疫苗的产出提供重要材料。

本发明还提供了一种表达载体，其包括本发明所述的核酸。

本发明中，所述表达载体的骨架载体为pET系列载体，一些具体实施例中，所述的表达载体中骨架载体为pET-21a。本发明实施例中，所述表达载体中，核酸片段的插入位点为BamHI和XhoI之间。

本发明还提供了转化或转染所述表达载体的宿主。

一些实施例中，所述宿主为大肠杆菌。一些具体实施例中，本发明所述的宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明所述宿主的构建方式包括将本发明所述的表达载体转化入宿主感受态细胞。

本发明抗原片段的制备方法，其包括培养本发明所述的的宿主，诱导表达获得含有所述抗原片段的表达产物。

在本发明具体实施例中，所述宿主为大肠杆菌，所述表达载体的骨架载体为pET-21a，所述诱导的诱导剂为IPTG。

所述诱导获得含有抗原片段的表达产物后，还包括蛋白纯化的步骤。所述纯化采用亲和层析柱法。所述亲和层析柱为Ni-NTA重力柱。

本发明所述的抗原片段、所述的核酸、所述的表达载体、所述的宿主，在制备防治猪萎缩性鼻炎的产品中的应用。

本发明还提供了防治猪萎缩性鼻炎的产品，其包括所述抗原片段。

本发明所述的防治猪萎缩性鼻炎的产品为疫苗。

本发明所述的防治猪萎缩性鼻炎的产品中还包括疫苗佐剂。

所述疫苗佐剂为gel佐剂，具体为gel01佐剂。

本发明所述的疫苗中，佐剂的质量分数为15％，本发明所述的抗原片段的质量分数为100μg/mL。

本发明还提供了一种防治猪萎缩性鼻炎的方法，其包括给予本发明所述的疫苗。所述给予的方式包括皮下注射。

本发明提供了如SEQ ID NO:1所示的巴氏杆菌毒素的抗原片段，该片段为截短的巴氏杆菌毒素蛋白片段，其能够在大肠杆菌中高水平可溶性表达，表达产物不仅具有较高的收率，且具有良好的免疫原性能够起到良好的免疫效果。

附图说明

图1示各组蛋白表达效果；

图2示各组样品经SDS-PAGE分析纯化效果；

图3示小鼠免疫攻毒有效性实验结果(攻毒后存活率)。

具体实施方式

本发明提供了猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

野生型巴氏杆菌毒素记为PM3，其氨基酸序列为：

MKTKHFFNSDFTVKGKSADEIFRRLCTDHPDKQLNNVKWKEVFINRFGQMMLDTPNPRKIVEKIINEGLEKQGLKNIDPETTYFNIFSSSDSSDGNVFHYNSLSESYRVTDACLMNIFVERYFDDWDLLNSLASNGIYSVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQIYHSRVIADILYARSVWDEFKKYFMEYWQKYAQLYTEMLSDTFLAMAIQQYTRQTLTDEGFLMVCNTYYGNKEEVQITLLDIYGYPSTDIICIEQKGLPTPKVILYIPGGTQPFVEFLNTDDLKQWIAWHLKDNKHMVAFRKHFSLKQRQEGETFTGIDKALQYIAEESPEWPANKYILYNPTHLETENLFNIMMKRTEQRMLEDSDVQIRSNSEATRDYALSLLETFISQLSAIDMLVPAVGIPINFALSATALGLSSDIVVNGDSYEKRKYGIGSLVQSALFTGINLIPVISETAEILSSFSRTEEDIPAFFTEEQALAQRFEIVEEELHSISPDDPPREITDENLHKIRLVRLNNENQPLVVLRRLGGNKFIRIEPITFQEIKGSLVSEVINPVTNKTYYVSNAKLLGGSPYSPFRIGLEGVWTPEVLKARASVIGKPIGESYKRILAKLQRIHNSNILDERQGLMHELMELIDLYEESQPSSERLNAFRELRTQLEKALYLPEMEALKKQILQIPNKGSGAARFLLRTAMNEMAGKTSESTADLIRFALQDTVISAPFRGYAGAIPEAIDFPVKYVIEDISVFDKIQTNYWELPAYESWNEGSNSALLPGLLRESQSKGMLSKCRIIENSLYIGHSYEEMFYSISPYSNQVGGPYELYPFTFFSMLQEVQGDLGFEQAFATRNFFNTLVSDRLSLMENTMLLTESFDYTPWDAIYGDINYDEQFAAMSINERIEKCMNTYRGVAFQNSSKSIDFFLNNLTTFIDNGLTEIAISDLPYDIVQQEISQFLQGSNEWKTLDAMLFNLDKGDINGAFRKLLQSAKDNNIKFRAIGHSDNSVPPFNNPYKSLYYKGNIIAEAIEKLDREGQKFVVFADSSLLNSTPGTGRPMPGLVQYLKIPATVVDSDGAWQFLPDVASSRVPIEVTELENWQVLTPPQGKILGLKQFKLTAGFPTEQSRLPLLENSVSEDLREELMQKIDAIKNDVKMNSLVCMEAGSCDSVSPKVAARLKDMGLEAGMGASITWWRREGGMEFSHQMHTTASFKFAGKEFAVDASHLQFVHDQLDTTILILPVDDWALEIAQRNRAINPFVEYVSKTGNMLALFMPPLFTKPRLTRAL。

其中，巴氏杆菌毒素N端1～506aa的野生型片段+6×His标签序列为：

MKTKHFFNSDFTVKGKSADEIFRRLCTDHPDKQLNNVKWKEVFINRFGQMMLDTPNPRKIVEKIINEGLEKQGLKNIDPETTYFNIFSSSDSSDGNVFHYNSLSESYRVTDACLMNIFVERYFDDWDLLNSLASNGIYSVGKEGAYYPDHDYGPEYNPVWGPNEQIYHSRVIADILYARSVWDEFKKYFMEYWQKYAQLYTEMLSDTFLAMAIQQYTRQTLTDEGFLMVCNTYYGNKEEVQITLLDIYGYPSTDIICIEQKGLPTPKVILYIPGGTQPFVEFLNTDDLKQWIAWHLKDNKHMVAFRKHFSLKQRQEGETFTGIDKALQYIAEESPEWPANKYILYNPTHLETENLFNIMMKRTEQRMLEDSDVQIRSNSEATRDYALSLLETFISQLSAIDMLVPAVGIPINFALSATALGLSSDIVVNGDSYEKRKYGIGSLVQSALFTGINLIPVISETAEILSSFSRTEEDIPAFFTEEQALAQRFEIVEEELHSISPDDPPRHHHHHH*。

其中，巴氏杆菌毒素C端505～1285aa片段，记为PM2或PMD(505-1285aa)，其N端添加6×His标签的氨基酸序列具体为：

MHHHHHHPREITDENLHKIRLVRLNNENQPLVVLRRLGGNKFIRIEPITFQEIKGSLVSEVINPVTNKTYYVSNAKLLGGSPYSPFRIGLEGVWTPEVLKARASVIGKPIGESYKRILAKLQRIHNSNILDERQGLMHELMELIDLYEESQPSSERLNAFRELRTQLEKALYLPEMEALKKQILQIPNKGSGAARFLLRTAMNEMAGKTSESTADLIRFALQDTVISAPFRGYAGAIPEAIDFPVKYVIEDISVFDKIQTNYWELPAYESWNEGSNSALLPGLLRESQSKGMLSKCRIIENSLYIGHSYEEMFYSISPYSNQVGGPYELYPFTFFSMLQEVQGDLGFEQAFATRNFFNTLVSDRLSLMENTMLLTESFDYTPWDAIYGDINYDEQFAAMSINERIEKCMNTYRGVAFQNSSKSIDFFLNNLTTFIDNGLTEIAISDLPYDIVQQEISQFLQGSNEWKTLDAMLFNLDKGDINGAFRKLLQSAKDNNIKFRAIGHSDNSVPPFNNPYKSLYYKGNIIAEAIEKLDREGQKFVVFADSSLLNSTPGTGRPMPGLVQYLKIPATVVDSDGAWQFLPDVASSRVPIEVTELENWQVLTPPQGKILGLKQFKLTAGFPTEQSRLPLLENSVSEDLREELMQKIDAIKNDVKMNSLVCMEAGSCDSVSPKVAARLKDMGLEAGMGASITWWRREGGMEFSHQMHTTASFKFAGKEFAVDASHLQFVHDQLDTTILILPVDDWALEIAQRNRAINPFVEYVSKTGNMLALFMPPLFTKPRLTRALHHHHHH*。

不添加6×His标签的C端505～1285aa的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还对编码上述片段的核酸进行了密码子优化。其中：

编码巴氏杆菌毒素N端1～506aa的野生型片段的核酸序列为：

atgaaaacaaagcactttttcaattcagatttcaccgttaaaggtaaaagcgcagacgagatatttagacgtctttgcaccgaccatccggataagcagctgaacaacgttaagtggaaagaagtcttcatcaaccgtttcggtcagatgatgctggatactccgaatccgcgcaagatcgtagagaagattatcaacgagggtctggagaagcagggcctgaagaacatcgatccagagactacgtacttcaacatcttctctagctctgacagcagcgacggtaatgtttttcattataacagcctgtccgaaagttaccgtgtgaccgacgcatgtctgatgaatattttcgtggaacgttattttgatgactgggatctgttgaactccctggcgagcaacggcatctactccgtgggtaaagagggcgcatattacccggaccacgattatggtccggagtataatccggtgtggggtccgaacgaacaaatctaccattctcgcgtgattgcggatatcttgtacgcgcgttcggtttgggatgagttcaaaaaatatttcatggaatactggcagaaatacgcccaactgtacaccgagatgctcagcgacaccttcctggctatggcaattcagcagtataccagacaaaccctgaccgacgagggctttctgatggtgtgcaatacctactacggcaacaaagaagaggtccaaattaccttgttagatatctacggttatccgagcaccgacatcatctgcatcgaacagaagggcctgccgaccccgaaagttatcctgtatattccaggtggcacccagccgtttgttgagtttctcaacaccgacgacctgaaacaatggattgcgtggcatctgaaggacaacaagcacatggttgctttccgcaaacacttttctctgaagcaacgtcaagaaggcgaaacgttcaccggtattgacaaagcgctgcagtatattgccgaagagagcccggaatggcctgctaataagtacatcctatacaacccgacgcacctggagacagaaaatctgttcaacatcatgatgaaacgtaccgaacagcgcatgcttgaagattctgatgttcagatccgtagcaatagcgaagcaacccgtgattatgcgctgtcgttgctggagacgttcattagccagttgtccgcgattgacatgctggttccggcggtgggcatcccgattaactttgcactttccgcgactgcgctgggtttgagctccgacattgtcgtgaatggtgatagctatgaaaagcgcaagtacggcataggctccctggtgcagtctgcgttgtttacgggtattaacctgattccggttattagcgagactgctgagatcttgtcgagcttttcacgtaccgaagaagatatcccggcgttcttcaccgaggagcaagcgttagcccaacgttttgagattgtcgaggaagagctgcattcaatcagccccgacgaccctccgcgc。

编码巴氏杆菌毒素C端505～1285aa的野生型片段(PM2或PMD(505-1285aa))的核酸序列具体为：

atgcatcaccaccaccaccatcccagggagataacagatgaaaatctacacaaaatccgactggttcgtttgaataacgagaatcagccgctggtcgtgctgcgtcgtctgggcggaaacaagttcatccgcatcgagccgatcacctttcaagagatcaaaggctcgctggtatccgaggttattaacccggtgaccaacaaaacgtactacgtgtccaatgcgaagctgctgggcggtagcccgtacagcccgtttcgcatcggcttggagggcgtttggacccctgaagtgttgaaggccagagcgagcgttatcggcaagccgatcggtgaatcttacaaacgtatactggcaaagctgcaacgcattcataattctaacattctagacgaacgtcagggtctgatgcatgaattgatggaattaattgacctgtatgaagagtcgcaaccgtcatccgagcgcttgaatgcgtttcgtgagctgcgtacccagttggagaaagccctgtacctgcctgagatggaagcgttgaagaagcaaattctgcaaattccgaataaaggcagcggtgcggcgcgtttcctcctgcgtaccgctatgaacgaaatggcaggcaagaccagcgagagcacggctgacctcatccgttttgcgttgcaagataccgtgatttctgctccgttccgtggttatgcaggcgcgattccggaagccatcgactttccggttaagtatgtgattgaagatatttcggtcttcgacaaaatccaaaccaattactgggaattgccggcgtacgagagctggaatgaaggctctaacagtgctctgctgccgggccttttgcgtgagtcccagagcaaaggaatgttaagcaaatgccgcattatcgagaactccctgtacatcggtcacagctacgaggagatgttttatagtatctcaccgtacagcaaccaggttggtggtccgtacgagctctacccgttcacctttttcagcatgctgcaagaagttcagggcgacctcggttttgaacaggcattcgccacccgcaacttctttaacaccctggtgtcggatcgcctgagcctgatggagaacacgatgctgttgactgagagcttcgattataccccgtgggatgcgatttatggtgacattaattatgatgaacaattcgcagctatgagcatcaacgagcgcattgaaaagtgcatgaatacgtaccggggtgttgccttccaaaactcctccaaaagcatcgactttttcctgaacaacctgaccacgtttatcgacaacggtctgaccgagatcgcgatctccgaccttccgtacgatatcgtgcagcaagaaattagccaatttctgcagggctctaacgaatggaagactctggatgctatgctgtttaacctggacaaaggtgacattaacggtgcgttccgcaaactgctgcaaagcgcgaaagataacaatattaagttccgcgcgattggccacagcgacaactccgtaccaccgtttaataatccgtacaagagcctgtattacaagggtaacatcattgcggaagctatcgagaagctggaccgtgaaggccagaaattcgtggtgttcgcagacagctccctgctgaattccaccccgggcaccggtcgtccgatgccgggccttgtgcaatatctgaagatcccggcgaccgttgttgactcggacggcgcgtggcaattcctgccggatgttgcttccagccgtgttccgatcgaggtcaccgaattggagaactggcaggttctgacgccaccacagggtaagatcttgggcctgaagcagttcaaacttaccgcgggtttcccgaccgaacagagccgtctgccgctgttagaaaacagcgttagcgaagatttgcgcgaggaactgatgcagaaaatcgatgcaatcaaaaatgatgttaagatgaactctttggtctgcatggaagcgggttcttgtgatagcgtgtctccgaaggtggccgcgcgtttaaaggacatgggtctggaggcgggcatgggtgcgtctattacctggtggcgtagagagggtggtatggagtttagccaccagatgcacacgacagccagctttaaattcgctggcaaagagttcgccgttgacgcaagccatctgcagttcgtgcatgatcagctggacaccaccattctgatcctgccagtggatgattgggcattggaaattgcgcagcgtaaccgtgccatcaacccgttcgttgaatatgtgagcaagacgggtaacatgctggcgctgtttatgcctccgctattcacgaaaccgcgtttgacacgcgcgctgcatcaccaccaccaccattaactcgag(SEQ ID NO:2)。

编码野生型巴氏杆菌毒素PM3的核酸序列为：

atgaaaacaaagcactttttcaattcagatttcaccgttaaaggtaaaagcgcagacgagatatttagacgtctttgcaccgaccatccggataagcagctgaacaacgttaagtggaaagaagtcttcatcaaccgtttcggtcagatgatgctggatactccgaatccgcgcaagatcgtagagaagattatcaacgagggtctggagaagcagggcctgaagaacatcgatccagagactacgtacttcaacatcttctctagctctgacagcagcgacggtaatgtttttcattataacagcctgtccgaaagttaccgtgtgaccgacgcatgtctgatgaatattttcgtggaacgttattttgatgactgggatctgttgaactccctggcgagcaacggcatctactccgtgggtaaagagggcgcatattacccggaccacgattatggtccggagtataatccggtgtggggtccgaacgaacaaatctaccattctcgcgtgattgcggatatcttgtacgcgcgttcggtttgggatgagttcaaaaaatatttcatggaatactggcagaaatacgcccaactgtacaccgagatgctcagcgacaccttcctggctatggcaattcagcagtataccagacaaaccctgaccgacgagggctttctgatggtgtgcaatacctactacggcaacaaagaagaggtccaaattaccttgttagatatctacggttatccgagcaccgacatcatctgcatcgaacagaagggcctgccgaccccgaaagttatcctgtatattccaggtggcacccagccgtttgttgagtttctcaacaccgacgacctgaaacaatggattgcgtggcatctgaaggacaacaagcacatggttgctttccgcaaacacttttctctgaagcaacgtcaagaaggcgaaacgttcaccggtattgacaaagcgctgcagtatattgccgaagagagcccggaatggcctgctaataagtacatcctatacaacccgacgcacctggagacagaaaatctgttcaacatcatgatgaaacgtaccgaacagcgcatgcttgaagattctgatgttcagatccgtagcaatagcgaagcaacccgtgattatgcgctgtcgttgctggagacgttcattagccagttgtccgcgattgacatgctggttccggcggtgggcatcccgattaactttgcactttccgcgactgcgctgggtttgagctccgacattgtcgtgaatggtgatagctatgaaaagcgcaagtacggcataggctccctggtgcagtctgcgttgtttacgggtattaacctgattccggttattagcgagactgctgagatcttgtcgagcttttcacgtaccgaagaagatatcccggcgttcttcaccgaggagcaagcgttagcccaacgttttgagattgtcgaggaagagctgcattcaatcagccccgacgaccctccgcgcgagataacagatgaaaatctacacaaaatccgactggttcgtttgaataacgagaatcagccgctggtcgtgctgcgtcgtctgggcggaaacaagttcatccgcatcgagccgatcacctttcaagagatcaaaggctcgctggtatccgaggttattaacccggtgaccaacaaaacgtactacgtgtccaatgcgaagctgctgggcggtagcccgtacagcccgtttcgcatcggcttggagggcgtttggacccctgaagtgttgaaggccagagcgagcgttatcggcaagccgatcggtgaatcttacaaacgtatactggcaaagctgcaacgcattcataattctaacattctagacgaacgtcagggtctgatgcatgaattgatggaattaattgacctgtatgaagagtcgcaaccgtcatccgagcgcttgaatgcgtttcgtgagctgcgtacccagttggagaaagccctgtacctgcctgagatggaagcgttgaagaagcaaattctgcaaattccgaataaaggcagcggtgcggcgcgtttcctcctgcgtaccgctatgaacgaaatggcaggcaagaccagcgagagcacggctgacctcatccgttttgcgttgcaagataccgtgatttctgctccgttccgtggttatgcaggcgcgattccggaagccatcgactttccggttaagtatgtgattgaagatatttcggtcttcgacaaaatccaaaccaattactgggaattgccggcgtacgagagctggaatgaaggctctaacagtgctctgctgccgggccttttgcgtgagtcccagagcaaaggaatgttaagcaaatgccgcattatcgagaactccctgtacatcggtcacagctacgaggagatgttttatagtatctcaccgtacagcaaccaggttggtggtccgtacgagctctacccgttcacctttttcagcatgctgcaagaagttcagggcgacctcggttttgaacaggcattcgccacccgcaacttctttaacaccctggtgtcggatcgcctgagcctgatggagaacacgatgctgttgactgagagcttcgattataccccgtgggatgcgatttatggtgacattaattatgatgaacaattcgcagctatgagcatcaacgagcgcattgaaaagtgcatgaatacgtaccggggtgttgccttccaaaactcctccaaaagcatcgactttttcctgaacaacctgaccacgtttatcgacaacggtctgaccgagatcgcgatctccgaccttccgtacgatatcgtgcagcaagaaattagccaatttctgcagggctctaacgaatggaagactctggatgctatgctgtttaacctggacaaaggtgacattaacggtgcgttccgcaaactgctgcaaagcgcgaaagataacaatattaagttccgcgcgattggccacagcgacaactccgtaccaccgtttaataatccgtacaagagcctgtattacaagggtaacatcattgcggaagctatcgagaagctggaccgtgaaggccagaaattcgtggtgttcgcagacagctccctgctgaattccaccccgggcaccggtcgtccgatgccgggccttgtgcaatatctgaagatcccggcgaccgttgttgactcggacggcgcgtggcaattcctgccggatgttgcttccagccgtgttccgatcgaggtcaccgaattggagaactggcaggttctgacgccaccacagggtaagatcttgggcctgaagcagttcaaacttaccgcgggtttcccgaccgaacagagccgtctgccgctgttagaaaacagcgttagcgaagatttgcgcgaggaactgatgcagaaaatcgatgcaatcaaaaatgatgttaagatgaactctttggtctgcatggaagcgggttcttgtgatagcgtgtctccgaaggtggccgcgcgtttaaaggacatgggtctggaggcgggcatgggtgcgtctattacctggtggcgtagagagggtggtatggagtttagccaccagatgcacacgacagccagctttaaattcgctggcaaagagttcgccgttgacgcaagccatctgcagttcgtgcatgatcagctggacaccaccattctgatcctgccagtggatgattgggcattggaaattgcgcagcgtaaccgtgccatcaacccgttcgttgaatatgtgagcaagacgggtaacatgctggcgctgtttatgcctccgctattcacgaaaccgcgtttgacacgcgcgctgcatcaccaccaccaccattaactcgagcaccaccaccaccaccactga。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

一、菌株构建

1、猪场病料基因组提取后，使用特异性引物PCR鉴定巴氏杆菌毒素阳性后，送测序获得序列。

2、获得巴氏杆菌毒素全序列之后，根据氨基酸兼并偏好，优化了分离的原始序列以便于在mRNA水平促使蛋白的更好翻译与表达。

3、根据蛋白全序列做不同片段的截短，分别使用引物进行扩增，扩增序列为PM1、PM2、PM3。

4、通过BamH I和Xho I两种限制性内切酶对上述PM1、PM2、PM3三种片段进行酶切后经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段。

5、实验室原有载体pET-21a进行质粒提取制备后，同样使用BamHI和XhoI两种限制性内切酶进行酶切，后经琼脂糖凝胶电泳分离匹配片段回收。

6、将上述三种片段PM1、PM2、PM3分别与载体pET-21a进行连接。

7、连接未T4连接酶在16℃条件下连接12-16h。

8、次日将连接产物转化BL21感受态细胞，涂布氨苄抗性平板进行筛选。

9、14-16h后用特异性引物进行鉴定。

10、鉴定正确的单克隆菌株送测序公司测序。

二、诱导表达

将鉴定测序正确pET-21a-PM1、pET-21a-PM2、pET-21a-PM3质粒转化感受态细胞表达菌株BL21(DE3)后。

①阳性单克隆扩大培养后，保存甘油菌或用于扩大诱导表达。诱导表达过程中实时监测OD₆₀₀的数值，当数值在0.6～0.7时，冷却后向培养基中加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG，然后分别在25℃，180rpm条件下诱导12-16h，同时设置未加IPTG的作为阴性对照。

②当OD₆₀₀数值在0.6～0.8时，取1ml阴性对照菌液作为未诱导样品；另取诱导后的菌液1ml作为诱导后样品。8000g，离心3min，弃上清，用OD₆₀₀值×100倍的PBS重悬菌体，吸取30μL重悬菌体于新的离心管中，加入等体积的2×蛋白上样缓冲液混匀，99℃金属浴10min充分变性后，瞬离，做SDS-PAGE检测。

三、菌体处理

①将50ml菌液8000g，离心20min，弃上清，菌体用重悬液(20mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L NaCl，pH＝7.4)清洗三次，8000g，离心20min，弃上清，沉淀用10ml裂解液(20mmol/LTris-HCl，150mmol/L NaCl，2％Triton X-100，0.1mM PMSF，pH＝7.4)重悬进行超声破碎(超声破碎前可选择性加入溶菌酶或者反复冻融处理)。

②为防止破坏蛋白，整个超声过程中重悬液必须放置在冰水混合物中。超声破碎仪的参数设置为on 5s；off 7s；total 5～10min；功率为35％×100W。

③破碎结束后，12000g，4℃离心30min。取上清液30μL加30μL 2×loading buffer进行制样(99℃金属浴10min)，沉淀用10ml的裂解液重悬(此处可取30μL混合液加30μL 2×loading buffer进行制样，99℃金属浴10min)。做SDS-PAGE检测。

3、SDS-PAGE检测

将上面四次制样的样品，各取10μL蛋白点样。在进行蛋白质电泳时，样品首先在5％的浓缩胶中于80V电压下电泳进行浓缩，然后在10％的分离胶中于120V电压下进行蛋白分离。跑胶结束后，放入考马斯亮蓝染色液中进行染色2h，染色结束后，将考马斯亮蓝染色液进行回收，然后将蛋白凝胶放入脱色液中进行脱色，及时更换脱色液直至洗去底色。通过Image J软件对条带进行灰度扫描，，结果如图1。由图1蛋白电泳图可以看出PM1片段、PM2片段皆存在于菌体破碎后离心上清中，即PM1、PM2蛋白皆为可溶表达。但全长PM3片段则不在上清液中表达。因此后续不再叙述。经检测，PM1和PM2片段的表达量可以达到50mg/L以上。

四、蛋白纯化

(1)采用亲和层析法(Ni-NTA重力柱)进行蛋白纯化，纯化步骤(全程低温处理)如下：

①配液：

平衡液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH＝7.4

洗杂液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，20mM咪唑，pH＝7.4

洗脱液：20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，500mM咪唑，pH＝7.4

②用5-10CV纯水冲洗柱子；

③用5-10CV平衡液平衡柱子；

④加入蛋白样品(不超过10CV)收集流穿液；

⑤用5-10CV平衡液平衡柱子；

⑥用5-10CV洗杂液冲洗柱子(此步需要摸索洗杂浓度)；

⑦用0.5CV洗脱液冲洗柱子，收集洗脱液；

⑧Ni柱使用完后用5-10CV洗脱液冲洗柱子，再用5-10CV纯水冲洗柱子，最后用20％乙醇进行封存，4℃保存。

过程中样品经SDS-PAGE分析纯化效果图2，如图所示：PM蛋白可以经Ni-NAT纯化获得，回收效率可已经条件优化后进一步提高。

⑨根据使用情况进行镍柱的脱镍再生：

a.用5-10CV纯水冲洗柱子。

b.用5-10CV 0.02M Tris-HCl、0.1M EDTA、pH＝7.4冲洗，再用5-10CV纯水冲洗柱子。

c.用5-10CV1.0M NaOH冲洗，静置10小时后再用纯化水冲洗至中性。

d.用5-10CV0.1 M NiSO₄冲洗，静置0.5小时后再用纯化水冲洗，直至流下来的液体里面不含有硫酸镍(绿色液体)为止。

e.用5-10CV的20％乙醇冲洗后保存

五、免疫检测

按照15％gel佐剂和150μg蛋白(分别为PM1和PM2，在疫苗中的浓度为100μg/mL)充分混匀后，做为试验疫苗免疫小鼠，分别在攻毒前4、8、9、10或11天接种，然后进行攻毒实验，结果表明N端片段PM1对攻毒后动物的保护率较差，几乎为0。而C端片段PM2对攻毒后动物的保护率较好，继续进行下一步实验。

将PM2复合水佐剂，免疫小鼠记为16-1。

表1小鼠免疫攻毒有效性实验方案

注射方式变更：由于16-1、海博莱，采用小鼠腹腔注射的方式均会发生死亡，故一免选择皮下免疫，但会导致抗原注入量不一致，因此二免选择肌肉注射方式，注入抗原量一致。

通过小鼠免疫攻毒后5天内的存活率，本发明实施例制备的16-1疫苗100％，大于其他各组对照，说明本发明提供的疫苗对动物起到良好的保护作用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 河南兴华生物技术有限公司

<120> 猪巴氏杆菌毒素亚单位疫苗

<130> MP21033707

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 781

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Arg Glu Ile Thr Asp Glu Asn Leu His Lys Ile Arg Leu Val Arg

1 5 10 15

Leu Asn Asn Glu Asn Gln Pro Leu Val Val Leu Arg Arg Leu Gly Gly

20 25 30

Asn Lys Phe Ile Arg Ile Glu Pro Ile Thr Phe Gln Glu Ile Lys Gly

35 40 45

Ser Leu Val Ser Glu Val Ile Asn Pro Val Thr Asn Lys Thr Tyr Tyr

50 55 60

Val Ser Asn Ala Lys Leu Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Ser Pro Phe Arg

65 70 75 80

Ile Gly Leu Glu Gly Val Trp Thr Pro Glu Val Leu Lys Ala Arg Ala

85 90 95

Ser Val Ile Gly Lys Pro Ile Gly Glu Ser Tyr Lys Arg Ile Leu Ala

100 105 110

Lys Leu Gln Arg Ile His Asn Ser Asn Ile Leu Asp Glu Arg Gln Gly

115 120 125

Leu Met His Glu Leu Met Glu Leu Ile Asp Leu Tyr Glu Glu Ser Gln

130 135 140

Pro Ser Ser Glu Arg Leu Asn Ala Phe Arg Glu Leu Arg Thr Gln Leu

145 150 155 160

Glu Lys Ala Leu Tyr Leu Pro Glu Met Glu Ala Leu Lys Lys Gln Ile

165 170 175

Leu Gln Ile Pro Asn Lys Gly Ser Gly Ala Ala Arg Phe Leu Leu Arg

180 185 190

Thr Ala Met Asn Glu Met Ala Gly Lys Thr Ser Glu Ser Thr Ala Asp

195 200 205

Leu Ile Arg Phe Ala Leu Gln Asp Thr Val Ile Ser Ala Pro Phe Arg

210 215 220

Gly Tyr Ala Gly Ala Ile Pro Glu Ala Ile Asp Phe Pro Val Lys Tyr

225 230 235 240

Val Ile Glu Asp Ile Ser Val Phe Asp Lys Ile Gln Thr Asn Tyr Trp

245 250 255

Glu Leu Pro Ala Tyr Glu Ser Trp Asn Glu Gly Ser Asn Ser Ala Leu

260 265 270

Leu Pro Gly Leu Leu Arg Glu Ser Gln Ser Lys Gly Met Leu Ser Lys

275 280 285

Cys Arg Ile Ile Glu Asn Ser Leu Tyr Ile Gly His Ser Tyr Glu Glu

290 295 300

Met Phe Tyr Ser Ile Ser Pro Tyr Ser Asn Gln Val Gly Gly Pro Tyr

305 310 315 320

Glu Leu Tyr Pro Phe Thr Phe Phe Ser Met Leu Gln Glu Val Gln Gly

325 330 335

Asp Leu Gly Phe Glu Gln Ala Phe Ala Thr Arg Asn Phe Phe Asn Thr

340 345 350

Leu Val Ser Asp Arg Leu Ser Leu Met Glu Asn Thr Met Leu Leu Thr

355 360 365

Glu Ser Phe Asp Tyr Thr Pro Trp Asp Ala Ile Tyr Gly Asp Ile Asn

370 375 380

Tyr Asp Glu Gln Phe Ala Ala Met Ser Ile Asn Glu Arg Ile Glu Lys

385 390 395 400

Cys Met Asn Thr Tyr Arg Gly Val Ala Phe Gln Asn Ser Ser Lys Ser

405 410 415

Ile Asp Phe Phe Leu Asn Asn Leu Thr Thr Phe Ile Asp Asn Gly Leu

420 425 430

Thr Glu Ile Ala Ile Ser Asp Leu Pro Tyr Asp Ile Val Gln Gln Glu

435 440 445

Ile Ser Gln Phe Leu Gln Gly Ser Asn Glu Trp Lys Thr Leu Asp Ala

450 455 460

Met Leu Phe Asn Leu Asp Lys Gly Asp Ile Asn Gly Ala Phe Arg Lys

465 470 475 480

Leu Leu Gln Ser Ala Lys Asp Asn Asn Ile Lys Phe Arg Ala Ile Gly

485 490 495

His Ser Asp Asn Ser Val Pro Pro Phe Asn Asn Pro Tyr Lys Ser Leu

500 505 510

Tyr Tyr Lys Gly Asn Ile Ile Ala Glu Ala Ile Glu Lys Leu Asp Arg

515 520 525

Glu Gly Gln Lys Phe Val Val Phe Ala Asp Ser Ser Leu Leu Asn Ser

530 535 540

Thr Pro Gly Thr Gly Arg Pro Met Pro Gly Leu Val Gln Tyr Leu Lys

545 550 555 560

Ile Pro Ala Thr Val Val Asp Ser Asp Gly Ala Trp Gln Phe Leu Pro

565 570 575

Asp Val Ala Ser Ser Arg Val Pro Ile Glu Val Thr Glu Leu Glu Asn

580 585 590

Trp Gln Val Leu Thr Pro Pro Gln Gly Lys Ile Leu Gly Leu Lys Gln

595 600 605

Phe Lys Leu Thr Ala Gly Phe Pro Thr Glu Gln Ser Arg Leu Pro Leu

610 615 620

Leu Glu Asn Ser Val Ser Glu Asp Leu Arg Glu Glu Leu Met Gln Lys

625 630 635 640

Ile Asp Ala Ile Lys Asn Asp Val Lys Met Asn Ser Leu Val Cys Met

645 650 655

Glu Ala Gly Ser Cys Asp Ser Val Ser Pro Lys Val Ala Ala Arg Leu

660 665 670

Lys Asp Met Gly Leu Glu Ala Gly Met Gly Ala Ser Ile Thr Trp Trp

675 680 685

Arg Arg Glu Gly Gly Met Glu Phe Ser His Gln Met His Thr Thr Ala

690 695 700

Ser Phe Lys Phe Ala Gly Lys Glu Phe Ala Val Asp Ala Ser His Leu

705 710 715 720

Gln Phe Val His Asp Gln Leu Asp Thr Thr Ile Leu Ile Leu Pro Val

725 730 735

Asp Asp Trp Ala Leu Glu Ile Ala Gln Arg Asn Arg Ala Ile Asn Pro

740 745 750

Phe Val Glu Tyr Val Ser Lys Thr Gly Asn Met Leu Ala Leu Phe Met

755 760 765

Pro Pro Leu Phe Thr Lys Pro Arg Leu Thr Arg Ala Leu

770 775 780

<210> 2

<211> 2391

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcatcacc accaccacca tcccagggag ataacagatg aaaatctaca caaaatccga 60

ctggttcgtt tgaataacga gaatcagccg ctggtcgtgc tgcgtcgtct gggcggaaac 120

aagttcatcc gcatcgagcc gatcaccttt caagagatca aaggctcgct ggtatccgag 180

gttattaacc cggtgaccaa caaaacgtac tacgtgtcca atgcgaagct gctgggcggt 240

agcccgtaca gcccgtttcg catcggcttg gagggcgttt ggacccctga agtgttgaag 300

gccagagcga gcgttatcgg caagccgatc ggtgaatctt acaaacgtat actggcaaag 360

ctgcaacgca ttcataattc taacattcta gacgaacgtc agggtctgat gcatgaattg 420

atggaattaa ttgacctgta tgaagagtcg caaccgtcat ccgagcgctt gaatgcgttt 480

cgtgagctgc gtacccagtt ggagaaagcc ctgtacctgc ctgagatgga agcgttgaag 540

aagcaaattc tgcaaattcc gaataaaggc agcggtgcgg cgcgtttcct cctgcgtacc 600

gctatgaacg aaatggcagg caagaccagc gagagcacgg ctgacctcat ccgttttgcg 660

ttgcaagata ccgtgatttc tgctccgttc cgtggttatg caggcgcgat tccggaagcc 720

atcgactttc cggttaagta tgtgattgaa gatatttcgg tcttcgacaa aatccaaacc 780

aattactggg aattgccggc gtacgagagc tggaatgaag gctctaacag tgctctgctg 840

ccgggccttt tgcgtgagtc ccagagcaaa ggaatgttaa gcaaatgccg cattatcgag 900

aactccctgt acatcggtca cagctacgag gagatgtttt atagtatctc accgtacagc 960

aaccaggttg gtggtccgta cgagctctac ccgttcacct ttttcagcat gctgcaagaa 1020

gttcagggcg acctcggttt tgaacaggca ttcgccaccc gcaacttctt taacaccctg 1080

gtgtcggatc gcctgagcct gatggagaac acgatgctgt tgactgagag cttcgattat 1140

accccgtggg atgcgattta tggtgacatt aattatgatg aacaattcgc agctatgagc 1200

atcaacgagc gcattgaaaa gtgcatgaat acgtaccggg gtgttgcctt ccaaaactcc 1260

tccaaaagca tcgacttttt cctgaacaac ctgaccacgt ttatcgacaa cggtctgacc 1320

gagatcgcga tctccgacct tccgtacgat atcgtgcagc aagaaattag ccaatttctg 1380

cagggctcta acgaatggaa gactctggat gctatgctgt ttaacctgga caaaggtgac 1440

attaacggtg cgttccgcaa actgctgcaa agcgcgaaag ataacaatat taagttccgc 1500

gcgattggcc acagcgacaa ctccgtacca ccgtttaata atccgtacaa gagcctgtat 1560

tacaagggta acatcattgc ggaagctatc gagaagctgg accgtgaagg ccagaaattc 1620

gtggtgttcg cagacagctc cctgctgaat tccaccccgg gcaccggtcg tccgatgccg 1680

ggccttgtgc aatatctgaa gatcccggcg accgttgttg actcggacgg cgcgtggcaa 1740

ttcctgccgg atgttgcttc cagccgtgtt ccgatcgagg tcaccgaatt ggagaactgg 1800

caggttctga cgccaccaca gggtaagatc ttgggcctga agcagttcaa acttaccgcg 1860

ggtttcccga ccgaacagag ccgtctgccg ctgttagaaa acagcgttag cgaagatttg 1920

cgcgaggaac tgatgcagaa aatcgatgca atcaaaaatg atgttaagat gaactctttg 1980

gtctgcatgg aagcgggttc ttgtgatagc gtgtctccga aggtggccgc gcgtttaaag 2040

gacatgggtc tggaggcggg catgggtgcg tctattacct ggtggcgtag agagggtggt 2100

atggagttta gccaccagat gcacacgaca gccagcttta aattcgctgg caaagagttc 2160

gccgttgacg caagccatct gcagttcgtg catgatcagc tggacaccac cattctgatc 2220

ctgccagtgg atgattgggc attggaaatt gcgcagcgta accgtgccat caacccgttc 2280

gttgaatatg tgagcaagac gggtaacatg ctggcgctgt ttatgcctcc gctattcacg 2340

aaaccgcgtt tgacacgcgc gctgcatcac caccaccacc attaactcga g 2391

Claims

1.编码巴氏杆菌毒素的抗原片段的核酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。

2.表达载体，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，其骨架载体为pET-21a。

4.转化或转染权利要求2或3所述表达载体的宿主。

5.根据权利要求4所述的宿主，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌。

6.巴氏杆菌毒素抗原片段的制备方法，其特征在于，包括培养权利要求2或3所述的宿主，诱导表达获得含有巴氏杆菌毒素抗原片段的表达产物。

7.权利要求1所述核酸、权利要求2或3所述表达载体、权利要求4或5所述宿主，在制备防治猪萎缩性鼻炎的产品中的应用。

8.防治猪萎缩性鼻炎的产品，其特征在于，原料包括：

权利要求1所述核酸；

权利要求2或3所述表达载体；

权利要求4或5所述宿主；

权利要求6所述制备方法制得的产品。