CN110041437B

CN110041437B - 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白

Info

Publication number: CN110041437B
Application number: CN201910352988.0A
Authority: CN
Inventors: 杜吉革; 刘莹; 张莹辉; 陈小云; 李旭妮; 李启红; 薛麒; 朱真; 王磊; 印春生; 姚文生
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN110041437A

Abstract

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白。本发明制备的重组融合蛋白，系采用经过密码子优化、破伤风毒素C片段与诺维梭菌α毒素的C末端以及N端的无毒性抗原表位的重组融合蛋白生产，即最大限度地保留两种毒素蛋白的免疫原性，又避免了天然毒素的生物安全隐患。该重组融合蛋白可用来制备破伤风梭菌和诺维梭菌亚单位疫苗，与我国目前商品化的破伤风梭菌和诺维梭菌天然毒素灭活疫苗相比，具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，并大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是上述两种梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

Description

一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白。属于生物制品领域。

背景技术

破伤风梭菌和诺维梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，而这两种梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。其中，破伤风梭菌只含有一种外毒素，被称为破伤风毒素(Tetanus toxin，TT)，而诺维梭菌主要能够产生α，β，γ，和δ共4种外毒素。根据上述毒素的产生情况，可将诺维梭菌分为A，B和C三种类型。其中，A和B型是引起牛羊发病的主要类型，而C型没有毒力(Eeckhaut V,Boyen F,Pasmans F,et al.Clostridium novyi type B as a causative agent of bovine meat spoilage[J].Anaerobe,2012,18(3):286-288.)。已有研究表明，诺维梭菌引起的牛和羊的坏死性肝炎(又称为黑疫)主要是与诺维梭菌产生的α毒素(Tncα)有关(Aquino P L,Fonseca F S,Mozzer O D,et al.Optimization of the Production of Inactivated Clostridiumnovyi Type B Vaccine Using Computational Intelligence Techniques[J].AppliedBiochemistry&Biotechnology,2016,179(5):895-909.)。由于破伤风梭菌病和诺维梭菌病发病急，往往来不及救治就死亡，导致死亡率较高。为此，疫苗免疫是预防以上两种疾病的有效手段，而商品化的梭菌疫苗主要是灭活疫苗。该类疫苗在预防动物破伤风梭菌病和诺维梭菌病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在外毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，诺维梭菌毒素产量较低，且耗时过长，在发酵中的影响因素过多。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的重组破伤风毒素和重组诺维梭菌毒素，是未来的发展方向。

目前，市场用量较大商品化梭菌灭活苗主要是羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，破伤风梭菌病主要是由破伤风毒素(TT)引起，羊黑疫(诺维梭菌病)主要与诺维梭菌分泌的α毒素(Tncα)有关(Aquino P L,FonsecaF S,Mozzer O D,et al.Optimization of the Production of InactivatedClostridium novyi Type B Vaccine Using Computational Intelligence Techniques[J].Applied Biochemistry&Biotechnology,2016,179(5):895-909.)。破伤风毒素(TT)，全长1 315个氨基酸，相对分子质量约150kDa，由A、B和C共3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)相对分子质量50kDa，是毒素与细胞的结合区域。已有的研究发现，该区域在原核表达系统中不仅可溶表达的比例较高，且具有较好的免疫原性(Wells J M,Wilson P W,Norton P M,et al.Lactococcus lactis:high-levelexpression of tetanus toxin fragment C and protection against lethalchallenge[J].Molecular Microbiology,2010,8(6):1155-1162.)。

诺维梭菌α毒素(Tncα)是A型和B型诺维梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性。Tncα由单链构成，蛋白分子量大约为250kDa，分为N末端和C末端。其中，N末端是该毒素的酶活性区域，而C末端是毒素与细胞受体的结合区，具有一定的抗原保护性(HofmannF,Herrmann A,Habermann E,et al.Sequencing and analysis of the gene encodingthe alpha-toxin of Clostridium novyi proves its homology to toxins A and B ofClostridium difficile[J].Mol Gen Genet,1995,247(6):670-679.)。Schranner等人在Tncα的N端发现了数条抗原性良好且无毒力的抗原表位(Schranner I,Erhard M H,Kaltner H,et al.Isolation of immunogenic and lethal peptides of alpha-toxinfrom Clostridium novyi type B[J].Toxicon Official Journal of theInternational Society on Toxinology,1992,30(5-6):653.)，以上研究结果为无毒性重组诺维梭菌α毒素的研制提供了重要的理论基础。

本发明制备的一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，系采用宿主细胞表达经过密码子优化、含有破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)和诺维梭菌α毒素的N端3个无毒性抗原表位(第3位～第17位、第965位～第979位和第983位～第997位氨基酸)以及C末端(第1800位～第2178位氨基酸)重组融合基因而获得的。该重组融合蛋白以TTc为助溶签来实现Tncα的N端无毒性抗原表位和C末端融合蛋白的可溶性表达，一方面能够提高融合蛋白的抗原性，实现一种融合蛋白预防两种疾病的效果；另一方面，避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本。为此，该重组融合蛋白可作为我国现行破伤风梭菌和诺维梭菌的传统灭活疫苗升级换代的理想候选抗原。

发明内容

本发明目的在于利用构建的表达破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)和诺维梭菌α毒素的N端3个无毒性抗原表位(第3～第17位、第965～第979位和第983～第997位氨基酸)以及C末端(第1800～第2178位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒性的重组融合蛋白(rTTc-Tcnα_nc)，用于同时预防由破伤风梭菌以及诺维梭菌感染引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型诺维梭菌α毒素相比，只含有无毒性的C端以及N端的无毒性抗原表位，优选的为以下3个抗原表位，分别为第3～第17位、第965～第979位和第983～第997位氨基酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；

所述rTTc-Tcnα_nc是由重组表达rTTc-Tcnα_nc的大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17163。

2.本发明所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在所述rTTc-Tcnα_nc是用生产菌株大肠埃希氏菌BL/TN株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得。

3.本发明所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc在所述宿主细胞的细胞质中表达。

4.本发明所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于编码所述rTTc-Tcnα_nc的基因序列经过了密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达和可溶性表达。

5.本发明所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc的C端含有便于蛋白纯化的标签，优选为6个组氨酸(6*His)标签。

6.本发明所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc为无毒蛋白，大大降低了蛋白生产过程中的生物安全风险。

7.本发明所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc添加佐剂混合后制成亚单位疫苗，用来同时预防破伤风梭菌和诺维梭菌感染所致疾病。8.本发明所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于用于表达rTTc-Tcnα_nc的“宿主细胞”，所述“宿主细胞”涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；

所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。

本发明有益效果

本发明将破伤风毒素的无毒区域C片段(TTc)以及诺维梭菌α毒素(Tncα)N端的3个无毒性抗原表位(第3～第17位、第965～第979位和第983～第997位氨基酸)以及C末端(第1800～第2178位氨基酸)进行融合表达，获得了对于动物体无毒的重组融合蛋白(rTTc-Tcnα_nc)。本发明进一步公开了含有所述rTTc-Tcnα_nc编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明的rTTc-Tcnα_nc在小鼠体内完全无毒，且在家兔模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的rTTc-Tcnα_nc或其编码基因能够应用于制备同时预防破伤风梭菌和诺维梭菌病的毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。采用本发明提出的一种无毒性破伤风梭菌毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白可作为破伤风梭菌和诺维梭菌的亚单位疫苗的理想抗原，这与我国目前商品化的破伤风梭菌和诺维梭菌毒素灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。同时，该融合蛋白的生产方法稳定性好、耗时短，而且利用该融合蛋白所制备的亚单位疫苗一免后的血清中和效价对破伤风梭菌以及诺维梭菌均可达到目前商品化疫苗标准。此外，凭借融合蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发。

鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。此外，现行梭菌多联苗需要每种(型)梭菌单独发酵，时间和培养基成本过高。因此，本申请生产的无毒性破伤风梭菌和诺维梭菌毒素重组融合蛋白，是我国现行破伤风梭菌和诺维梭菌灭活疫苗升级换代的理想候选抗原。

综上可见：(1)本发明首次将破伤风毒素与诺维梭菌α毒素融合表达，并实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，从而一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本，另一方面也达到了一种融合蛋白同时预防破伤风梭菌和诺维梭菌感染引起的疾病。(2)同时选择破伤风毒素的无毒区域C片段(TTc)和诺维梭菌α毒素N端的3个无毒性抗原表位和C末端，获得了无毒性的重组融合蛋白。(3)对编码该rTTc-Tcnα_nc的基因序列进行了密码子优化，实现了在大肠杆菌中的高效表达和可溶性表达。(4)采用基因工程方法制备的rTTc-Tcnα_nc可作为亚单位疫苗替代传统的培养致病性破伤风梭菌以及诺维梭菌制备毒素再灭活脱毒的办法，大大降低了生产过程中的生物安全风险。

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：表达破伤风毒素C片段和诺维梭菌α毒素(Tncα)N端的3个无毒性抗原表位(第3位～第17位、第965位～第979位和第983位～第997位氨基酸)以及C末端(第1800位～第2178位氨基酸)的重组融合蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞株，被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，该菌株已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCC No.17163。

附图说明

图1：rTTc-Tcnα_nc表达的SDS-PAGE鉴定

M₁:Protein marker；1:BSA(1μg)；2:BSA(2μg)；3:空载体细胞裂解物；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物；5:37℃、4h诱导的细胞裂解物；6:空载体细胞裂解物上清；7:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；8:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；9:空载体细胞裂解物沉淀；10:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；11:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；

图2：rTTc-Tcnα_nc表达的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果

M2:Western blot marker；1:空载体细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解物；3:37℃、4h诱导的细胞裂解液；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；7:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀；

图3：rTTc-Tcnα_nc的纯化M1:Protein marker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解液；2:15℃、16h诱导的细胞裂解液上清；3:流穿液；4:20mM咪唑洗脱液；5:50mM咪唑洗脱液；6:500mM咪唑洗脱液；7：洗脱后的Ni柱；

本发明具体实施方式

1.本发明所述破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白(rTTc-Tcnα_nc)，其中：

(1)术语“TTc”意指破伤风毒素C片段，“Tcnα_nc”意指含有诺维梭菌α毒素(Tcnα)的N端3个无毒性抗原表位(第3位～第17位、第965位～第979位和第983位～第997位氨基酸)以及C末端的重组蛋白。“TTc”和“Tcnα_nc”还涵盖一个或多个修饰(包括化学修饰和基因修饰)的破伤风毒素C片段和诺维梭菌α毒素(Tcnα)的N端无毒性抗原表位和C末端。术语“基因修饰”意指缺失、置换或添加一个或多个氨基酸碱基。

本发明的方法可以用来产生任何破伤风毒素(TT)和诺维梭菌α毒素(Tcnα)的同源物或其衍生物，包括例如破伤风毒素(TT)氨基酸序列SEQ ID No.1(GenBank编号：WP_115606337)和诺维梭菌α毒素(Tcnα)氨基酸序列SEQ ID No.2(GenBank编号：CAA88565.1)的多肽及其衍生物。术语“衍生物”包含氨基酸突变如添加、置换、缺失或截短一个或多个氨基酸残基。

rTTc-Tcnα_nc可以包含多肽序列，所述多肽序列是与上文提到的破伤风毒素(TT)和诺维梭菌α毒素(Tcnα)序列之一具有至少50％序列同一性的同源物或衍生物。

rTTc-Tcnα_nc可以包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中任一者的衍生物或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列之一的衍生物。其中所述衍生物具有一个或多个点突变和/或一个或多个额外的氨基酸残基。在另一个方面，所述重组融合蛋白可以包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2的序列或与本文中确定的登录号相对应的多肽序列列之一具有至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性。

(2)术语“序列同一性”指确定参考氨基酸序列和查询序列之间的同一性，其中将序列如此比对，从而获得最高级级别的匹配，并且所述序列同一性可以使用计算机程序(例如BLASTP、BLASTN、FASTA)中代码化的公开技术或方法计算。同一性百分数值可以在完整氨基酸序列范围内或氨基酸序列的某个区域内计算。

(3)rTTc-Tcnα_nc可以在N末端或C末端或在内部位置含有额外的氨基酸残基。额外的氨基酸残基可以旁侧分布有一个或多个蛋白酶切割位点，可以作为可检测标签发挥作用和或允许与固相支持物结合，例子是His标签。

(4)编码所述rTTc-Tcnα_nc的核酸分子可以根据本专利任选地包含调节元件。如本文所用的术语“调节元件”指基因表达的调节元件，包括转录和翻译，并且包括元件如TATA框、启动子、增强子、核糖体结合位点等。所述调节元件可以包含一个或多个同源调节元件和/或异源调节元件。“同源调节元件”是涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。“异源调节元件”是不涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。此外，也可以使用诱导型表达的调节元件，如诱导型启动子。

(5)编码所述rTTc-Tcnα_nc的核酸分子可以设计成有利于在宿主细胞、特别是细菌宿主细胞、优选的是大肠杆菌细胞中高水平表达，如根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化等。另一方面，本发明可任意使用包含编码所述rTTc-Tcnα_nc的核酸分子的表达载体，载体可以适于在体外和/或在体内表达所述重组融合蛋白。所述载体可以是用于瞬时和/或稳定基因表达的载体，可以另外包含调节元件和/或选择标记，可以是病毒来源的、噬菌体来源或细菌来源的。例如，所述表达载体可以是pET30a载体。

(6)编码所述rTTc-Tcnα_nc的核酸分子或表达载体可以通过宿主细胞表达。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖适合翻译所述核酸分子或所述载体的原核细胞和/或真核细胞。所述宿主细胞不仅包括不表达破伤风毒素和/或诺维梭菌α毒素或其同源物的宿主细胞，也涵盖表达两种毒素或同源物的宿主细胞，如野生型。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本发明用所述表达TTc和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白的埃希氏大肠菌BL21(DE3)，被命名为BL/TN株。

2.大肠埃希氏菌BL/TN株的构建、表达及鉴定

(1)基因合成

根据破伤风毒素(TT)和诺维梭菌α毒素(Tncα)的天然编码基因序列，经密码子优化后，将只含有破伤风毒素的无毒区域C片段编码基因(序列1)以及含有Tncα的N端无毒性抗原表位(第3～第17位、第965～第979位、第983位～第997位氨基酸)以及C末端(第1800位～第2178位氨基酸)的编码基因(序列2)进行串联。同时，在串联基因的3’端添加纯化所用氨基酸标签编码序列。用化学合成的方法，合成该段基因序列(序列3)。

(2)重组融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的基因为模板，采用设计的引物对进行PCR扩增到的目的DNA条带，经回收后，与原核表达载体同时采用双酶切消化后进行连接，得到插目的基因的原核表达载体。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR和序列测定来确定阳性菌株，之后提取质粒备用。

(3)表达重组融合蛋白的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，获得阳性菌株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

(4)重组融合蛋白的表达与鉴定

将大肠埃希氏菌(E.coli)BL/TN株接种于4mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃振荡培养，当OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体30min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，同时，采用抗His抗体，对其进行Western blot鉴定，最终确定表达的最优化条件。

3.重组融合蛋白的纯化

将大肠埃希氏菌BL/TN株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，根据上述确定的最优表达条件，进行诱导表达并收集菌体进行纯化。

4.融合蛋白的应用

对纯化的蛋白进行蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量(PierceTM BCA ProteinAssay Kit，TG268883)，应不低于0.5mg/ml。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于85％。将双相油佐剂(如206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终制成浓度为50μg/mL和100μg/mL的疫苗。同时，用同样剂量的PBS与佐剂混匀，作为对照疫苗。

对分装后的亚单位疫苗按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行以下检验：

(1)性状

外观应为乳白色乳剂。

剂型应为呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。

黏度按《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2015年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行测定，应符合规定。

(2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射50μg/mL的疫苗4.0mL，观察10日，应全部健活。

(4)效力检验

按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部)附录中羊梭菌多联苗的标准进行，具体如下：

(1)血清中和法

选取对诺维梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔4只、1～3岁体重相近的绵羊8只，各颈部皮下或肌肉注射疫苗适宜剂量的疫苗。其中，家兔的免疫剂量为100μg/只，4只绵羊的免疫剂量为100μg/只，另外4只绵羊的免疫剂量为200μg/只。接种后21日，采血，分离血清。取每只动物血清0.4mL分别与0.8mL破伤风梭菌培养物上清(含8个及以上小鼠MLD)和0.8mL诺维梭菌培养物上清(含20个及以上小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min后，对16～18g的小鼠进行注射，每种样品注射2只，0.3mL/只。其中，破伤风梭菌组分采用腹部皮下注射方式，诺维梭菌组分采用静脉注射方式。同时各用同批小鼠2只，分别用相同的注射方式注射1MLD相应的梭菌培养物上清作对照。其中，破伤风梭菌组分观察5d，诺维梭菌组分观察3d，判定结果。

对照鼠全部死亡，血清对破伤风毒素的中和效价达到2及以上(0.1mL免疫动物血清中和2及以上MLD毒素)，对诺维梭菌毒素的中和效价均达到5及以上(0.1mL免疫动物血清中和5及以上MLD毒素)，即判为合格。

(2)免疫攻毒法

选取对诺维梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔12只，随机分为对照组(4只)和免疫组(8只)。其中，免疫组的8只家兔只各颈部皮下或肌肉注射疫苗，剂量为100μg/只。对照组的4只各颈部皮下或肌肉注射相同剂量的对照疫苗。一免后14～21d进行攻毒实验，具体的攻毒实验方案如下：用10MLD的破伤风毒素分别经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，观察10天；用50MLD的诺维梭菌毒素分别经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，观察3～5d。对照组动物应该全部死亡，免疫组动物至少保护3只。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制，通过破伤风毒素C末端作为助溶标签来提高目的蛋白的表达量和(或)可溶性、通过Tncα的N端其它无毒性抗原表位和(或)C末端获得无毒性重组蛋白也在本专利的保护范围内。

实施例1

——大肠埃希氏菌BL/TN株的构建、表达及鉴定

1.基因合成

本申请根据破伤风毒素(TT)和诺维梭菌α毒素(Tncα)的编码基因序列，经密码子优化后，用柔性氨基酸将只含有破伤风毒素的无毒区域C片段(TTc)(序列1)以及Tncα的N端无毒性抗原表位(第3位～第17位、第965位～第979位和第983位～第997位氨基酸)以及C末端(第1800位～第2178位氨基酸)的编码基因(序列2)进行串联。同时，在串联基因的3’端添加纯化所用6×His氨基酸标签编码序列。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GTTc-Tcnα_nc(序列3)，氨基酸序列如序列4。

2.融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的GTTc-Tcnα_nc为模板，采用引物对1F/1R(序列5/序列6)进行PCR扩增。

其中上游引物1F序列为：

5’-ggcatatgaa gaacctggac tg-3’22(序列5)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；

下游引物1R序列为：

5’-ggaagctttt agtggtgatg at-3’22(序列6)，其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基。

PCR体系为：

Buffer(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，

HS聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充dd H₂O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入GTTc-Tncα的阳性克隆pET30a-GTTc-Tncα。

3.表达GTTc-Tcnα_nc的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

序列1(破伤风毒素氨基酸序列)

序列2(诺维梭菌α毒素序列)

序列3(编码破伤风毒素与诺维梭菌α毒素重组融合蛋白的核苷酸序列)

序列4(破伤风毒素与诺维梭菌α毒素重组融合蛋白的氨基酸序列)

实施例2

——rTTc-Tcnα_nc的表达和鉴定

1.rTTc-Tcnα_nc的表达

将大肠埃希氏菌(E.coli)BL/TN株接种于4mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃振荡培养，当OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体15min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，在15℃的条件下，rTTc-Tcnα_nc大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达，约占目的蛋白总表达量的30％。为此，我们选择15℃，诱导表达16h作为rTTc-Tcnα_nc的最适诱导表达条件。

2.rTTc-Tcnα_nc的鉴定

采用上述步骤中诱导条件下的rTTc-Tcnα_nc，采用抗His抗体，对其进行Westernblot鉴定，结果见图2。从图2可知，15℃、16h诱导的细胞裂解上清中，rTTc-Tcnα_nc表达量最高。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的重组融合毒素，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，进一步确定rTTc-Tcnα_nc的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

实施例3

——rTTc-Tcnα_nc的纯化

将大肠埃希氏菌BL/TN株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液诱导培养16h。菌液培养完成后，以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.2 0.02mol/L Tris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，收集上清液。按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的rTTc-Tcnα_nc进行纯化。如图3所示，收集纯度较高的5～6泳道的洗脱液，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的目的蛋白rTTc-Tcnα_nc。

实施例4

——rTTc-Tcnα_nc对小鼠的毒力试验

通过测定rTTc-Tcnα_nc对小鼠的毒力，以验证rTTc-Tcnα_nc在体内的实际减毒效果。将纯化的rTTc-Tcnα_nc，以及诺维梭菌培养上清，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g的ICR小鼠，每剂量注射5只，0.2mL/只。结果当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而B型诺维梭菌培养上清在接种0.02μL时即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rTTc-Tcnα_nc在小鼠体内是无毒的，被确定为无毒重组融合蛋白。

实施例5

——以rTTc-Tcnα_nc为抗原的破伤风梭菌和B型诺维梭菌的亚单位疫苗的制备。

1.菌种：制苗用菌种为重组表达rTTc-Tcnα_nc的大肠埃希氏菌BL/TN株。

(1)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。

(2)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。

(3)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃，当培养物OD₆₀₀值为0.6～0.8时，温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养16h。

(4)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。

(5)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(6)蛋白含量检测：用BCA法检检测试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit，TG268883)测蛋白含量。

(7)疫苗配制：将双相油佐剂(206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化rTTc-Tcnα_nc适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终配制成50μg/mL和100μg/mL的疫苗。同时，以相同体积的PBS和佐剂配制成对照疫苗。

实施例6

——以rTTc-Tcnα_nc为抗原的破伤风梭菌和B型诺维梭菌的亚单位疫苗的检验

1.性状

外观乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，不破乳，并且管底析出的水相为0.2mL。

黏度按《中国兽药典》附录进行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)测定，符合规定。

2.无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3.安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射50μg/mL的疫苗4.0mL，观察10日后，全部健活。

4.效力检验

按《中国兽药典》附录进行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部进行检验

(1)血清中和法

选取对诺维梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔4只、1～3岁体重相近的绵羊8只，肌肉注射疫苗适宜剂量的疫苗。其中，家兔的免疫剂量为100μg/只，4只绵羊的免疫剂量为100μg/只，另外4只绵羊的免疫剂量为200μg/只。接种后21日，采血，分离血清。取每只动物血清0.4mL分别与0.8mL破伤风梭菌培养物上清(含8个及以上小鼠MLD)和0.8mL诺维梭菌培养物上清(含20个及以上小鼠MLD)，混合后置37℃作用40min后，对16～18g的小鼠进行注射，每种混合样品注射2只，0.3mL/只。其中，破伤风梭菌组分采用腹部皮下注射方式，诺维梭菌组分采用静脉注射方式。同时各用同批小鼠2只，分别用相同的注射方式注射1MLD相应的梭菌培养物上清作对照。其中，破伤风梭菌组分观察5d，诺维梭菌组分观察3d，判定结果。

血清的毒素中和实验结果显示，一次免疫后，每只家兔血清对破伤风梭菌毒素和诺维梭菌毒素的中和效价分别可达到5120及以上和8～12(即0.1mL家兔血清可中和5120及以上个MLD的破伤风梭菌毒素和8～12个MLD的诺维梭菌毒素)；高剂量免疫组(免疫剂量为200μg/只)羊血清对破伤风梭菌和诺维梭菌毒素的中和效价分别可达到1600及以上和5～7(即0.1mL家兔血清可中和1600及以上个MLD的破伤风梭菌毒素和5～7个MLD的诺维梭菌毒素)；低剂量免疫组(免疫剂量为100μg/只)绵羊血清对破伤风梭菌和诺维梭菌毒素的中和效价分别可达到800及以上个和3～5(即0.1mL家兔血清可中和800及以上个MLD的破伤风梭菌毒素和3～5个MLD的诺维梭菌毒素)。

(2)免疫攻毒法

选取对诺维梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔12只，随机分为对照组(4只)和免疫组(8只)。其中，免疫组的8只家兔各肌肉注射50μg/mL的疫苗2.0mL。对照组的4只家兔各肌肉注射相同体积的对照疫苗。一免后14d进行攻毒实验。实验结果显示，用10MLD的破伤风梭菌培养物上清分别经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，对照组家兔在72h内2/2死亡，免疫组动物在10d后4/4存活；用50MLD的诺维梭菌培养物上清分别经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔后，对照组家兔在48h内2/2死亡，免疫组家兔在5d后4/4存活。

《中国兽药典》中关于羊梭菌多联干粉灭活苗规定，家兔血清中抗体效价对破伤风梭菌毒素达到2，诺维梭菌毒素达到5，即可判为疫苗中破伤风梭菌、诺维梭菌毒素组分为合格。兔和绵羊血清的毒素中和实验结果显示，一次免疫后，4/4的家兔(免疫剂量为100μg/只)、4/4绵羊(免疫剂量为200μg/只)的血清对破伤风梭菌毒素和诺维梭菌毒素的中和效价均可达到《中国兽药典》的标准要求。此外，rTTc-Tcnα_nc的家兔免疫攻毒保护效果也达到现行《中国兽药典》的标准。

鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。此外，现行梭菌多联苗需要每种(型)梭菌单独发酵，时间和培养基成本过高。因此，本申请生产的无毒性破伤风梭菌和诺维梭菌毒素重组融合蛋白，是我国现行破伤风梭菌和诺维梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选抗原。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1315

<212> PRT

<213> 破伤风毒素(Clostridium tetanus)

<400> 1

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser

50 55 60

Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn

85 90 95

Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile

100 105 110

Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Pro

130 135 140

Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe

145 150 155 160

Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu

165 170 175

Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser

180 185 190

Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Ile Pro Thr Phe Asp Asn

195 200 205

Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe

210 215 220

Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys

245 250 255

Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn

290 295 300

Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn

340 345 350

Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn

355 360 365

Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys

370 375 380

Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe

385 390 395 400

Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met

405 410 415

Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val

420 425 430

Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile

435 440 445

Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly

450 455 460

Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Ile Phe Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr

485 490 495

Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile

500 505 510

Ile Leu Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg

515 520 525

Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser

530 535 540

Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile

545 550 555 560

Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile

565 570 575

Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile

580 585 590

Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln

595 600 605

Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr

610 615 620

Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser

625 630 635 640

Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly

645 650 655

Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu

660 665 670

Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu

675 680 685

Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile

690 695 700

Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys

705 710 715 720

Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys

725 730 735

Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile

740 745 750

Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys

755 760 765

Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu

770 775 780

Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser

785 790 795 800

Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln

805 810 815

Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile

820 825 830

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu

835 840 845

Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser

850 855 860

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

865 870 875 880

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

885 890 895

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

900 905 910

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

915 920 925

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

930 935 940

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

945 950 955 960

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

965 970 975

Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

980 985 990

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

995 1000 1005

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys Phe Asn

1010 1015 1020

Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg

1025 1030 1035 1040

Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala

1045 1050 1055

Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu

1060 1065 1070

Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys

1075 1080 1085

Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu

1090 1095 1100

Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn

1105 1110 1115 1120

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Tyr Ser

1125 1130 1135

Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr

1140 1145 1150

Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg

1155 1160 1165

Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn

1170 1175 1180

Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val

1185 1190 1195 1200

Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn

1205 1210 1215

Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro

1220 1225 1230

Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

1235 1240 1245

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp Ala Ser

1250 1255 1260

Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn

1265 1270 1275 1280

Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp

1285 1290 1295

Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp

1300 1305 1310

Thr Asn Asp

1315

<210> 2

<211> 2178

<212> PRT

<213> 诺维梭菌α毒素(Clostridium novyαtoxin)

<400> 2

Met Leu Ile Thr Arg Glu Gln Leu Met Lys Ile Ala Ser Ile Pro Leu

1 5 10 15

Lys Arg Lys Glu Pro Glu Tyr Asn Leu Ile Leu Asp Ala Leu Glu Asn

20 25 30

Phe Asn Arg Asp Ile Glu Gly Thr Ser Val Lys Glu Ile Tyr Ser Lys

35 40 45

Leu Ser Lys Leu Asn Glu Leu Val Asp Asn Tyr Gln Thr Lys Tyr Pro

50 55 60

Ser Ser Gly Arg Asn Leu Ala Leu Glu Asn Phe Arg Asp Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Ser Glu Leu Arg Glu Leu Ile Lys Asn Ser Arg Thr Ser Thr Ile Ala

85 90 95

Ser Lys Asn Leu Ser Phe Ile Trp Ile Gly Gly Pro Ile Ser Asp Gln

100 105 110

Ser Leu Glu Tyr Tyr Asn Met Trp Lys Met Phe Asn Lys Asp Tyr Asn

115 120 125

Ile Arg Leu Phe Tyr Asp Lys Asn Ser Leu Leu Val Asn Thr Leu Lys

130 135 140

Thr Ala Ile Ile Gln Glu Ser Ser Lys Val Ile Ile Glu Gln Asn Gln

145 150 155 160

Ser Asn Ile Leu Asp Gly Thr Tyr Gly His Asn Lys Phe Tyr Ser Asp

165 170 175

Arg Met Lys Leu Ile Tyr Arg Tyr Lys Arg Glu Leu Lys Met Leu Tyr

180 185 190

Glu Asn Met Lys Gln Asn Asn Ser Val Asp Asp Ile Ile Ile Asn Phe

195 200 205

Leu Ser Asn Tyr Phe Lys Tyr Asp Ile Gly Lys Leu Asn Asn Gln Lys

210 215 220

Glu Asn Asn Asn Asn Lys Met Ile Ala Ile Gly Ala Thr Asp Ile Asn

225 230 235 240

Thr Glu Asn Ile Leu Thr Asn Lys Leu Lys Ser Tyr Tyr Tyr Gln Glu

245 250 255

Leu Ile Gln Thr Asn Asn Leu Ala Ala Ala Ser Asp Ile Leu Arg Ile

260 265 270

Ala Ile Leu Lys Lys Tyr Gly Gly Val Tyr Cys Asp Leu Asp Phe Leu

275 280 285

Pro Gly Val Asn Leu Ser Leu Phe Asn Asp Ile Ser Lys Pro Asn Gly

290 295 300

Met Asp Ser Asn Tyr Trp Glu Ala Ala Ile Phe Glu Ala Ile Ala Asn

305 310 315 320

Glu Lys Lys Leu Met Asn Asn Tyr Pro Tyr Lys Tyr Met Glu Gln Val

325 330 335

Pro Ser Glu Ile Lys Glu Arg Ile Leu Ser Phe Val Arg Asn His Asp

340 345 350

Ile Asn Asp Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asp Ile Lys Ile Ser Gln Leu

355 360 365

Glu Ile Leu Leu Ser Arg Leu Lys Ala Ala Thr Gly Lys Lys Thr Phe

370 375 380

Ser Asn Ala Phe Ile Ile Ser Asn Asn Asp Ser Leu Thr Leu Asn Asn

385 390 395 400

Leu Ile Ser Gln Leu Glu Asn Arg Tyr Glu Ile Leu Asn Ser Ile Ile

405 410 415

Gln Glu Lys Phe Lys Ile Cys Glu Thr Tyr Asp Ser Tyr Ile Asn Ser

420 425 430

Val Ser Glu Leu Val Leu Glu Thr Thr Pro Lys Asn Leu Ser Met Asp

435 440 445

Gly Ser Ser Phe Tyr Gln Gln Ile Ile Gly Tyr Leu Ser Ser Gly Phe

450 455 460

Lys Pro Glu Val Asn Ser Thr Val Phe Phe Ser Gly Pro Asn Ile Tyr

465 470 475 480

Ser Ser Ala Thr Cys Asp Thr Tyr His Phe Ile Lys Asn Thr Phe Asp

485 490 495

Met Leu Ser Ser Gln Asn Gln Glu Ile Phe Glu Ala Ser Asn Asn Leu

500 505 510

Tyr Phe Ser Lys Thr His Asp Glu Phe Lys Ser Ser Trp Leu Leu Arg

515 520 525

Ser Asn Ile Ala Glu Lys Glu Phe Gln Lys Leu Ile Lys Thr Tyr Ile

530 535 540

Gly Arg Thr Leu Asn Tyr Glu Asp Gly Leu Asn Phe Asn Lys Trp Lys

545 550 555 560

Arg Val Thr Thr Ser Glu Leu Leu Lys Val Ile Glu Glu Val Asn Ser

565 570 575

Thr Lys Ile Tyr Glu Asn Tyr Asp Leu Asn Met Ile Leu Gln Ile Gln

580 585 590

Gly Asp Asp Ile Ser Tyr Glu Ser Ala Val Asn Val Phe Gly Lys Asn

595 600 605

Pro Asn Lys Ser Ile Leu Ile Gln Gly Val Asp Asp Phe Ala Asn Val

610 615 620

Phe Tyr Phe Glu Asn Gly Ile Val Gln Ser Asp Asn Ile Asn Asn Ile

625 630 635 640

Leu Ser Arg Phe Asn Asp Ile Lys Lys Ile Lys Leu Thr Leu Ile Gly

645 650 655

His Gly Glu Asn Val Phe Asn Pro Lys Leu Phe Gly Gly Lys Thr Val

660 665 670

Asn Asp Leu Tyr Thr Asn Ile Ile Lys Pro Lys Leu Gln His Leu Leu

675 680 685

Glu Arg Glu Gly Val Ile Leu Lys Asn Lys Tyr Leu Lys Ile Asn Ile

690 695 700

Leu Gly Cys Tyr Met Phe Thr Pro Lys Val Asp Ile Asn Ser Thr Phe

705 710 715 720

Val Gly Lys Leu Phe Asn Lys Ile Ser Arg Asp Leu Gln Pro Lys Gly

725 730 735

Phe Ser Lys Asn Gln Leu Glu Ile Ser Ala Asn Lys Tyr Ala Ile Arg

740 745 750

Ile Asn Arg Glu Gly Lys Arg Glu Val Leu Asp Tyr Phe Gly Lys Trp

755 760 765

Val Ser Asn Thr Asp Leu Ile Ala Glu Gln Ile Ser Asn Lys Tyr Val

770 775 780

Val Tyr Trp Asn Glu Val Glu Asn Thr Leu Ser Ala Arg Val Glu Gln

785 790 795 800

Leu Asn Lys Val Ala Glu Phe Ala Lys Asp Ile Asn Ser Ile Ile Gln

805 810 815

Thr Thr Asn Asn Gln Glu Leu Lys Gln Ser Leu Val Asn Thr Tyr Ala

820 825 830

Asp Leu Ile Thr Thr Leu Tyr Ser Glu Leu Leu Lys Glu Asp Ile Pro

835 840 845

Phe Glu Leu Asp Asn Ile Gln Ile Lys Glu Arg Ile Ile Leu Asn Glu

850 855 860

Ile Ser Arg Leu His Asp Phe Ser Asn Ile Ile Leu Asp Phe Tyr Gln

865 870 875 880

Lys Asn Asn Ile Ser Asn Asn Met Ile Ile Leu Phe Asp Ser Ile Ile

885 890 895

Lys Glu Lys Asp Tyr Tyr Asn Val Lys Leu Ala Asn Lys Ile Thr Gly

900 905 910

Glu Thr Ser Val Ile Lys Thr Tyr Ser Asp Ser Leu Trp Asn Phe Thr

915 920 925

Asn Lys Tyr Lys Lys Ile Val Asp Asp Ile Lys Gly Ile Ile Val Lys

930 935 940

Asp Ile Asn Gly Glu Phe Ile Lys Lys Ala Asp Phe Glu Ile Glu Gln

945 950 955 960

Asn Pro Ser Leu Leu Asn Ser Ala Met Leu Met Gln Leu Leu Ile Asp

965 970 975

Tyr Lys Pro Tyr Thr Glu Ile Leu Thr Asn Met Asn Thr Ser Leu Lys

980 985 990

Val Gln Ala Tyr Ala Gln Ile Phe Gln Leu Ser Ile Gly Ala Ile Gln

995 1000 1005

Glu Ala Thr Glu Ile Val Thr Ile Ile Ser Asp Ala Leu Asn Ala Asn

1010 1015 1020

Phe Asn Ile Leu Ser Lys Leu Lys Val Gly Ser Ser Val Ala Ser Val

1025 1030 1035 1040

Ile Ile Asp Gly Ile Asn Leu Ile Ala Ala Leu Thr Glu Leu Lys Asn

1045 1050 1055

Val Lys Thr Asn Phe Glu Arg Lys Leu Ile Glu Ala Lys Val Gly Met

1060 1065 1070

Tyr Ser Ile Gly Phe Ile Leu Glu Ser Ser Ser Leu Ile Ser Gly Leu

1075 1080 1085

Leu Gly Ala Thr Ala Val Ser Glu Ile Leu Gly Val Ile Ser Val Pro

1090 1095 1100

Val Ala Gly Ile Leu Val Gly Leu Pro Ser Leu Val Asn Asn Ile Leu

1105 1110 1115 1120

Val Leu Gly Glu Lys Tyr Asn Gln Ile Leu Asp Tyr Phe Ser Lys Phe

1125 1130 1135

Tyr Pro Ile Val Gly Lys Asn Pro Phe Ser Ile Gln Asp Asn Ile Ile

1140 1145 1150

Ile Pro Tyr Asp Asp Ile Ala Ile Thr Glu Leu Asn Phe Lys Tyr Asn

1155 1160 1165

Lys Phe Lys Tyr Gly Tyr Ala Lys Ile Ser Gly Leu Lys Val Gly Leu

1170 1175 1180

Val Thr His Ile Gly Glu Asn Ile Asp His Tyr Phe Ser Ala Pro Ser

1185 1190 1195 1200

Leu Asp His Tyr Ile Glu Leu Ser Ile Tyr Pro Ala Leu Lys Leu Asn

1205 1210 1215

Asp Thr Asn Leu Pro Lys Gly Asn Val Val Leu Leu Pro Ser Gly Leu

1220 1225 1230

Asn Lys Val Tyr Lys Pro Glu Ile Ser Ala Ile Ala Gly Ala Asn Ser

1235 1240 1245

Gln Glu Gly Asn Gly Val Glu Val Leu Asn Leu Ile Arg Asn Tyr Tyr

1250 1255 1260

Val Asp Ser Asn Gly Asn Thr Lys Phe Pro Trp Lys Tyr Glu Ala Pro

1265 1270 1275 1280

Phe Glu Tyr Ser Phe Ser Tyr Met Arg Val Glu Tyr Phe Asp Thr Lys

1285 1290 1295

Val Asn Val Ile Leu Asp Asn Glu Asn Lys Thr Leu Ile Ile Pro Val

1300 1305 1310

Leu Thr Ile Asp Glu Met Arg Asn Lys Ile Ser Tyr Glu Ile Leu Gly

1315 1320 1325

Asp Gly Gly Gln Tyr Asn Val Ile Leu Pro Val Asn Gln Thr Asn Ile

1330 1335 1340

Asn Ile Val Ser Asn Lys Asn Asp Ile Trp Asn Phe Asp Val Ser Tyr

1345 1350 1355 1360

Ile Val Lys Glu Ser Lys Ile Glu Asp Asn Lys Phe Val Leu Asp Gly

1365 1370 1375

Phe Ile Asn Asn Ile Phe Ser Thr Leu Lys Val Ser Asn Asp Gly Phe

1380 1385 1390

Lys Ile Gly Lys Gln Phe Ile Ser Ile Lys Asn Thr Pro Arg Ala Ile

1395 1400 1405

Asn Leu Ser Phe Lys Ile Asn Asn Asn Ile Val Ile Val Ser Ile Tyr

1410 1415 1420

Leu Asn His Glu Lys Ser Asn Ser Ile Thr Ile Ile Ser Ser Asp Leu

1425 1430 1435 1440

Asn Asp Ile Lys Asn Asn Phe Asp Asn Leu Leu Asp Asn Ile Asn Tyr

1445 1450 1455

Ile Gly Leu Gly Ser Ile Ser Asp Asn Thr Ile Asn Cys Ile Val Arg

1460 1465 1470

Asn Asp Glu Val Tyr Met Glu Gly Lys Ile Phe Leu Asn Glu Lys Lys

1475 1480 1485

Leu Val Phe Ile Gln Asn Glu Leu Glu Leu His Leu Tyr Asp Ser Val

1490 1495 1500

Asn Lys Asp Ser Gln Tyr Leu Ile Asn Asn Pro Ile Asn Asn Val Val

1505 1510 1515 1520

Lys Tyr Lys Asp Gly Tyr Ile Val Glu Gly Thr Phe Leu Ile Asn Ser

1525 1530 1535

Thr Glu Asn Lys Tyr Ser Leu Tyr Ile Glu Asn Asn Lys Ile Met Leu

1540 1545 1550

Lys Gly Leu Tyr Leu Glu Ser Ser Val Phe Lys Thr Ile Gln Asp Lys

1555 1560 1565

Ile Tyr Ser Lys Glu Lys Val Asn Asp Tyr Ile Leu Ser Leu Ile Lys

1570 1575 1580

Lys Phe Phe Thr Val Asn Ile Gln Leu Cys Pro Phe Met Ile Val Ser

1585 1590 1595 1600

Gly Val Asp Glu Asn Asn Arg Tyr Leu Glu Tyr Met Leu Ser Thr Asn

1605 1610 1615

Asn Lys Trp Ile Ile Asn Gly Gly Tyr Trp Glu Asn Asp Phe Asn Asn

1620 1625 1630

Tyr Lys Ile Val Asp Phe Glu Lys Cys Asn Val Ile Val Ser Gly Ser

1635 1640 1645

Asn Lys Leu Asn Ser Glu Gly Asp Leu Ala Asp Thr Ile Asp Val Leu

1650 1655 1660

Asp Lys Asp Leu Glu Asn Leu Tyr Ile Asp Ser Val Ile Ile Ile Pro

1665 1670 1675 1680

Lys Val Tyr Thr Lys Lys Ile Ile Ile His Pro Ile Pro Asn Asn Pro

1685 1690 1695

Gln Ile Asn Ile Ile Asn Thr Gln Ser Ile His Asp Lys Cys His Leu

1700 1705 1710

Ile Ile Asp Ser Val Leu Thr Asn Asn Tyr His Trp Glu Ser Asp Gly

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Asp Asp Leu Ile Ile Thr Asn Gly Leu Asp Ile Asn Ile Arg Ile Leu

1730 1735 1740

Gln Gly Leu Ser Phe Gly Phe Lys Tyr Lys Asn Ile Tyr Leu Lys Phe

1745 1750 1755 1760

Ser Asn Tyr Asp Glu Leu Ser Leu Asn Asp Phe Leu Leu Gln Asn Tyr

1765 1770 1775

Asn Val Lys Gly Leu Tyr Tyr Ile Asn Gly Glu Leu His Tyr Lys Asn

1780 1785 1790

Ile Pro Gly Asp Thr Phe Glu Tyr Gly Trp Ile Asn Ile Asp Ser Arg

1795 1800 1805

Trp Tyr Phe Phe Asp Ser Ile Asn Leu Ile Ala Lys Lys Gly Tyr Gln

1810 1815 1820

Glu Ile Glu Gly Glu Arg Tyr Tyr Phe Asn Pro Asn Thr Gly Val Gln

1825 1830 1835 1840

Glu Ser Gly Val Phe Leu Thr Pro Asn Gly Leu Glu Tyr Phe Thr Asn

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Lys His Ala Ser Ser Lys Arg Trp Gly Arg Ala Ile Asn Tyr Thr Gly

1860 1865 1870

Trp Leu Thr Leu Asp Gly Asn Lys Tyr Tyr Phe Gln Ser Asn Ser Lys

1875 1880 1885

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1905 1910 1915 1920

Tyr Tyr Phe Asp Gly Asn Thr Gly Glu Ala Ile Ile Gly Trp Phe Asn

1925 1930 1935

Asn Asn Lys Glu Arg Tyr Tyr Phe Asp Ser Glu Gly Arg Leu Leu Thr

1940 1945 1950

Gly Tyr Gln Val Ile Gly Asp Lys Ser Tyr Tyr Phe Ser Asp Asn Ile

1955 1960 1965

Asn Gly Asn Trp Glu Glu Gly Ser Gly Val Leu Lys Ser Gly Ile Phe

1970 1975 1980

Lys Thr Pro Ser Gly Phe Lys Leu Phe Ser Ser Glu Gly Asp Lys Ser

1985 1990 1995 2000

Ala Ile Asn Tyr Lys Gly Trp Leu Asp Leu Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr

2005 2010 2015

Phe Asn Ser Asp Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Tyr Asn Ile Lys Gly

2020 2025 2030

Ile Gln Tyr Tyr Phe Asn Pro Lys Thr Ala Val Leu Thr Asn Gly Trp

2035 2040 2045

Tyr Thr Leu Asp Asn Asn Asn Tyr Tyr Val Ser Asn Gly His Asn Val

2050 2055 2060

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Thr Gly Ile Gln Lys Ala Gly Val Phe Pro Thr Pro Asn Gly Leu Arg

2085 2090 2095

Tyr Phe Thr Met Lys Pro Ile Asp Gly Gln Arg Trp Gly Gln Cys Ile

2100 2105 2110

Asp Tyr Thr Gly Trp Leu His Leu Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Phe Gly

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Tyr Tyr Asn Ser Ala Val Thr Gly Trp Arg Val Leu Gly Gly Lys Arg

2130 2135 2140

Tyr Phe Phe Asn Ile Lys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Leu Leu Thr

2145 2150 2155 2160

Leu Ser Gly Lys Arg Tyr Tyr Phe Asn Glu Lys Gly Glu Gln Leu Thr

2165 2170 2175

Leu Val

<210> 3

<211> 2709

<212> DNA

<213> 破伤风毒素与诺维梭菌α毒素重组融合蛋白(rTTc-Tcnαnc)

<400> 3

catatgaaga acctggactg ttgggttgat aatgaagagg atattgatgt cattctgaag 60

aaatctacga tcctgaacct ggacattaac aacgacatca tttctgacat tagtggtttc 120

aatagtagtg ttatcactta cccagacgcg caactggtgc caggtatcaa cggtaaagcg 180

atccatctgg tgaataacga atctagcgaa gtgattgttc ataaggcgat ggacattgag 240

tacaatgata tgttcaacaa tttcactgtg tctttttggc tgcgcgttcc gaaagtaagc 300

gccagccacc tggagcagta tgatactaac gaatactcta tcatcagttc tatgaagaaa 360

tacagtctga gcattggcag cggctggagt gtgtctctga agggtaacaa cctgatctgg 420

acgctgaaag actctgccgg tgaggtccgt cagattacgt ttcgcgacct gagcgacaag 480

tttaacgcat acctggctaa caaatgggtc ttcattacca ttacgaacga tcgtctgagt 540

agcgcaaacc tgtatatcaa cggtgtgctg atgggtagtg cagagatcac tggcctgggt 600

gctatccgtg aagacaataa catcaccctg aaactggatc gttgcaacaa taacaaccaa 660

tatgtgagta tcgacaagtt tcgtatcttc tgtaaagccc tgaaccctaa ggagattgag 720

aagctgtata ccagttacct gagtatcacc ttcctgcgtg acttctgggg caatccgctg 780

cgttatgaca ctgagtacta tctgattcca gtagcgtaca gctctaaaga tgtgcagctg 840

aagaatatca ctgattacat gtacctgacg aatgccccaa gttacactaa cgggaaactg 900

aatatctact atcgtcgcct gtacagcggt ctgaaattca tcatcaaacg ttacacgccg 960

aacaacgaga ttgattcttt tgtgcgtagc ggtgacttca tcaaactgta cgtttcttac 1020

aataacaatg aacacattgt gggttacccg aaagatggta acgcattcaa caatctggac 1080

cgcattctgc gtgtcgggta caatgcacca gggattccac tgtacaagaa aatggaagcc 1140

gtaaagctgc gtgatctgaa gacctacagc gtccaactga aactgtacga tgataaggac 1200

gcgagcctgg gtctggttgg tactcataac ggtcagatcg gcaatgaccc aaatcgtgac 1260

atcctgattg ccagtaactg gtactttaac catctgaagg acaagaccct gacctgtgat 1320

tggtatttcg tcccgactga tgaagggtgg accaatgacg gtggtggcgg ttccataaca 1380

agagaacaat taatgaaaat tgcaagtata ccattaaaag gtggcggttc tttaaattca 1440

gctatgttaa tgcaattatt aatagattat aagcctggtg gcggttctat tttgactaat 1500

atgaatacta gtttaaaagt acaagcatat gcaggtggcg gttcttacgg ctggattaac 1560

attgattctc gttggtactt cttcgactct atcaacctga tcgcgaagaa aggttatcag 1620

gaaatcgaag gcgagcgtta ctacttcaac ccgaatactg gtgtacaaga aagcggtgta 1680

ttcctgactc cgaacggcct ggaatacttc accaacaaac acgcatcttc taaacgctgg 1740

ggtcgcgcga tcaactacac tggttggctg accctggatg gcaacaagta ttacttccag 1800

tctaactcca aagccgttac tggtctgcag aagatcagcg ataagtatta ctatttcaac 1860

gataacggcc agatgcagat taagtggcag atcattaaca acaacaaata ctacttcgat 1920

ggcaacactg gtgaagcaat cattggttgg ttcaacaata acaaagaacg ttactacttt 1980

gactctgaag gccgtctgct gactggctat caggttatcg gcgacaaatc ttactatttc 2040

tccgataaca ttaacggcaa ctgggaggag ggttccggtg tactgaagtc cggcatcttt 2100

aagactccat ctggtttcaa actgttctct tctgagggcg acaaatctgc aatcaactat 2160

aagggttggc tggatctgaa cggtaacaag tactatttca acagcgactc catcgcggta 2220

actggctctt acaacatcaa aggcattcag tactatttca atccaaagac cgcagtactg 2280

actaacggct ggtacaccct ggacaataac aactactacg taagcaatgg tcataacgtg 2340

ctgggctacc aggacatcga cggcaaaggt tactatttcg acccgtctac tggtatccag 2400

aaagcaggtg tatttccaac tccgaacggt ctgcgctact ttactatgaa accgatcgac 2460

ggccagcgct ggggccagtg tattgattac accggctggc tgcacctgaa cggcaacaag 2520

tactatttcg gttactacaa cagcgcagtg actggttggc gtgtactggg tggtaaacgc 2580

tacttcttca acatcaagac tggtgcggct accactggtc tgctgaccct gagcggcaaa 2640

cgttactact ttaacgagaa aggcgaacag ctgaccctgg ttcaccacca tcaccatcac 2700

taaaagctt 2709

<210> 4

<211> 900

<212> PRT

<213> 破伤风毒素与诺维梭菌α毒素重组融合蛋白(rTTc-Tcnαnc)

<400> 4

His Met Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp

1 5 10 15

Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp

20 25 30

Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro

35 40 45

Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val

50 55 60

Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu

65 70 75 80

Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

85 90 95

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr

100 105 110

Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly

115 120 125

Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp

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Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys

145 150 155 160

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Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly

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Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile

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Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile

210 215 220

Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu

225 230 235 240

Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp

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Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu

325 330 335

Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp

340 345 350

Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn

355 360 365

Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg

370 375 380

Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp

385 390 395 400

Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp

405 410 415

Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu

420 425 430

Lys Asp Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu

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Gly Trp Thr Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Arg Glu Gln Leu

450 455 460

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Leu Gln Lys Ile Ser Asp Lys Tyr Tyr Tyr Phe Asn Asp Asn Gly Gln

610 615 620

Met Gln Ile Lys Trp Gln Ile Ile Asn Asn Asn Lys Tyr Tyr Phe Asp

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Glu Glu Gly Ser Gly Val Leu Lys Ser Gly Ile Phe Lys Thr Pro Ser

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Gly Phe Lys Leu Phe Ser Ser Glu Gly Asp Lys Ser Ala Ile Asn Tyr

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Lys Gly Trp Leu Asp Leu Asn Gly Asn Lys Tyr Tyr Phe Asn Ser Asp

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Ser Ile Ala Val Thr Gly Ser Tyr Asn Ile Lys Gly Ile Gln Tyr Tyr

740 745 750

Phe Asn Pro Lys Thr Ala Val Leu Thr Asn Gly Trp Tyr Thr Leu Asp

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Asn Asn Asn Tyr Tyr Val Ser Asn Gly His Asn Val Leu Gly Tyr Gln

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Asp Ile Asp Gly Lys Gly Tyr Tyr Phe Asp Pro Ser Thr Gly Ile Gln

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Lys Ala Gly Val Phe Pro Thr Pro Asn Gly Leu Arg Tyr Phe Thr Met

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Ile Lys Thr Gly Ala Ala Thr Thr Gly Leu Leu Thr Leu Ser Gly Lys

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Arg Tyr Tyr Phe Asn Glu Lys Gly Glu Gln Leu Thr Leu Val His His

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His His His His

900

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(1F)

<400> 5

ggcatatgaa gaacctggac tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(1R)

<400> 6

ccgcaagctt ttagtggtga tg 22

Claims

1.一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白，其特征在于所述无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白rTTc-Tcnα_nc的氨基酸序列如序列4的第2位～第900位所示，其是由重组表达rTTc-Tcnα_nc的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）的BL21（DE3）细胞作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TN株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No. 17163。

2.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白的制备方法，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc是用生产菌株大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL/TN株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得，所述大肠埃希氏菌BL/TN株的保藏号为CGMCC No. 17163。

3.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和诺维梭菌α毒素重组融合蛋白在疫苗制备中的应用，其特征在于所述rTTc-Tcnα_nc是用来添加佐剂混合制成同时预防破伤风梭菌病和诺维梭菌病的亚单位疫苗。