CN109942718B

CN109942718B - 一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白

Info

Publication number: CN109942718B
Application number: CN201910352909.6A
Authority: CN
Inventors: 杜吉革; 刘莹; 王磊; 陈小云; 李旭妮; 李启红; 朱真; 薛麒; 张莹辉; 姚文生; 印春生
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2019-04-29
Filing date: 2019-04-29
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-04-29
Also published as: CN109942718A

Abstract

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。本发明系采用经过密码子优化、破伤风梭菌毒素C片段与含有多个氨基酸突变的产气荚膜梭菌β毒素突变体的重组融合蛋白，即最大限度地保留两种毒素蛋白的免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。该重组融合蛋白可用来制备破伤风梭菌、B型产气荚膜梭菌和C型产气荚膜梭菌的单位疫苗，与我国目前商品化的梭菌类天然毒素灭活疫苗相比，具有制备工艺简单、免疫剂量低、疫苗效力优良等优点，并大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险，是上述三种梭菌毒素疫苗升级换代的理想候选疫苗抗原；而且在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗。

Description

一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白

技术领域

本发明涉及一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。属于生物制品领域。

背景技术

破伤风梭菌和产气荚膜梭菌是能够引起人和多种动物发病的厌氧菌，对人类的健康和畜禽养殖业危害极大，而这两种类型的梭菌的致病因素均是菌体分泌的外毒素。破伤风梭菌只含有一种外毒素，被称为破伤风毒素(Tetanus toxin，TT)，而产气荚膜梭菌的外毒素至少有20种，但以α(CPA)、β(CPB)、ε(ETX)和ι(CPI)这4种外毒素最为主要，并可据此将该菌分为A，B，C，D，E 5个毒素型(Revitt-Mills,S；Rood,J；Adams,V.Clostridiumperfringens extracellular toxins and enzymes:20andcounting.Microbiol.Aust.2015,36,114–117.)。由于破伤风梭菌病和产气荚膜梭菌病均具有发病突然，死亡迅速等特点，因此，疫苗免疫是防控上述两类疾病的主要手段。目前，使用的商品化梭菌疫苗主要是灭活疫苗，如羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活苗以及羊梭菌病多联干粉苗。其中，破伤风主要是由破伤风毒素(TT)引起，而猝疽和羔羊痢疾主要与B和C型产气荚膜梭菌分泌的β毒素(CPB)有关。该类灭活疫苗在预防动物破伤风梭菌和产气荚膜梭菌所致疾病方面虽然取得了一定的效果，但这些疫苗在使用过程中仍然暴露了一些缺陷，例如疫苗免疫易引起动物局部炎症及毒性反应；其在制备过程中涉及外毒素的灭活，存在毒素外泄或灭活不彻底等生物安全隐患；此外，培养上清中的各种微小毒素以及细菌的代谢产物往往成为免疫动物的致敏原，接种动物易产生不良反应，导致免疫效果下降甚至免疫失败。因此，开发安全性好、有效抗原含量高、免疫原性强的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌毒素基因工程疫苗，是未来的发展方向。

破伤风毒素(TT)，全长1 315个氨基酸，相对分子质量约150kDa，由A、B和C共3个片段组成。其中，破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)是重链的C末端，相对分子质量约为50kDa，是毒素与细胞受体的结合区域。已有研究发现，该片段在原核表达系统中可溶表达的比例较高，且具有较好的免疫原性(Wells J M,Wilson P W,Norton P M,etal.Lactococcus lactis:high-level expression of tetanus toxin fragment C andprotection against lethal challenge[J].Molecular Microbiology,2010,8(6):1155-1162.)。

β毒素(CPB)是B型和C型产气荚膜梭菌的主要致病因子，具有细胞毒性和致死性，能导致人和动物的坏死性肠炎。其中，CPB在B型和C型产气荚膜梭菌中高度保守，氨基酸同源性在99％以上。虽然外源重组CPB分子具有一定的免疫保护作用，但需要考虑到蛋白的毒性。已有的研究表明，以可溶性形式表达的重组CPB具有较强的毒力，而以包涵体形式表达的重组CPB的毒力基本上可以忽略(Ferreira MR,Moreira GM,Cunha CE,etal.Recombinant Alpha,Beta,and Epsilon Toxins of Clostridium perfringens:Production Strategies and Applications as Veterinary Vaccines.Toxins(Basel).2016；8(11):340.Published 2016Nov 21.doi:10.3390/toxins8110340)。然而，由于包涵体中的表达产物不具有生物学活性，因而需要进行变性与复性处理，而蛋白的变性与复性是一个极其复杂的过程，不同蛋白的复性条件各异，复性率往往很难提高，这是限制其应用的主要制约因素。因此，以TTc为助溶签来实现CPB的可溶性表达，一方面能够提高CPB的抗原性，从而实现一种融合蛋白预防多种疾病的效果；另一方面，避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本。

本发明制备的一种无毒性破伤风梭菌毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，系采用宿主细胞表达经过密码子优化、含有破伤风毒素C片段(Tetanus toxin Cfragment，TTc)和多个氨基酸突变的β毒素的重组融合基因而获得的，即最大限度地保留天然β毒素的完整性和空间构象，从而保持其免疫原性，又避免了单个氨基酸突变带来的生物安全隐患。同时，该重组融合蛋白还具有一种融合蛋白同时预防由破伤风梭菌以及B型和C型两种产气荚膜梭菌感染所致疾病，且制备工艺简单、免疫剂量低、免疫效力好，是我国现行破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌灭活疫苗升级换代的理想抗原。

发明内容

本发明目的在于利用构建的表达破伤风毒素C片段(Tetanus toxin C fragment，TTc)和产气荚膜梭菌β毒素(CPB)突变体重组融合蛋白的大肠杆菌制备出无毒重组融合蛋白，用于同时预防由破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。

本发明技术方案

1.一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述表达的破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白(rTTc-CPB_m4)与成熟的野生型破伤风毒素相比，只含有无毒的C片段；与成熟的野生型产气荚膜梭菌β毒素相比，包含多个氨基酸的突变，优选的为以下4个氨基酸突变：第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸；在融合蛋白的C端含有便于蛋白纯化的标签；

所述重组融合蛋白是由重组表达rTTc-CPB_m4的大肠杆菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17162。

2.本发明所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-CPB_m4是用生产菌株大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BL/TB株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得rTTc-CPB_m4。

3.如权利要求2至4中任一项所述方法，其特征在于所述rTTc-CPB_m4在所述宿主细胞的细胞质中表达。

4.如权利要求1本发明所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于编码所述rTTc-CPB_m4的基因序列经过了密码子优化，更易于在大肠杆菌中实现高效表达和可溶性表达。

5.本发明所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述rTTc-CPB_m4为无毒蛋白，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。

6.本发明所述无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于其应用：用所述表达的rTTc-CPB_m4加佐剂混合制成亚单位疫苗，用来同时预防破伤风梭菌、B型和C型产气荚膜梭菌感染所致疾病。

7.本发明所述无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于用于表达rTTc-CPB_m4的“宿主细胞”，所述“宿主细胞”涵盖原核细胞和或真核细胞，可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞；

所述宿主细胞优选地是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。

本发明的有益效果

本发明涉及一种无毒性破伤风梭菌和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白。本发明将产气荚膜梭菌成熟CPB的进行了4个氨基酸位点的突变(第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸)之后与TTc进行融合表达，获得了对于动物体无毒的重组融合蛋白(rTTc-CPB_m4)。本发明进一步公开了含有编码所述rTTc-CPB_m4基因的表达载体和宿主细胞。本发明的rTTc-CPB_m4在小鼠体内完全无毒，且在家兔和绵羊模型中呈现良好的免疫原性和免疫保护性。本发明的重组融合蛋白或其编码基因能够应用于制备同时预防破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌病的毒素亚单位疫苗或多价梭菌毒素亚单位疫苗。采用本发明提出的一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白可作为破伤风梭菌和产气荚膜梭菌的亚单位疫苗的理想抗原，这与我国目前商品化的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌毒素灭活疫苗相比，大大降低了疫苗生产过程中的生物安全风险。同时，此类疫苗生产方法稳定性好、耗时短，而且所制备的亚单位疫苗一免后的血清中和效价对破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌均可达到目前商品化疫苗标准。此外，凭借疫苗半成品蛋白浓度高的优势，在与其它抗原共同制备联苗时，无需增大联苗的使用剂量，即可制备联苗，极大方便了联苗的开发，即本发明：

1.首次将破伤风毒素与产气荚膜梭菌CPB融合表达，并实现了在大肠杆菌中的可溶性表达，从而一方面避免了包涵体变性复性的繁琐工艺对抗原蛋白免疫原性的影响，减少了目的蛋白的制备时间和生产成本，另一方面也达到了一种融合蛋白同时预防破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌感染引起的疾病。2.同时选择破伤风毒素的无毒区域C片段(TTc)和CPB的多个氨基酸的突变，获得了无毒性的重组融合蛋白。3.对编码该重组融合蛋白的基因序列进行了密码子优化，实现了在大肠杆菌中的高水平表达。4.采用基因工程方法制备的重组融合蛋白作为亚单位疫苗替代传统的培养致病性破伤风梭菌以及B型和C型产气荚膜梭菌制备毒素再灭活脱毒的办法，大大降低了生产过程中的生物安全风险。

附图说明

图1：rTTc-CPB_m4表达的SDS-PAGE鉴定

M₁:Protein marker；1:BSA(1μg)；2:BSA(2μg)；3:空载体细胞裂解物；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物；5:37℃、4h诱导的细胞裂解物；6:空载体细胞裂解物上清；7:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；8:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；9:空载体细胞裂解物沉淀；10:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；11:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。

图2：rTTc-CPB_m4表达的Western blot(采用抗His抗体)鉴定结果M2:Western blotmarker；1:空载体细胞裂解物；2:15℃、16h诱导的细胞裂解物；3:37℃、4h诱导的细胞裂解物；4:15℃、16h诱导的细胞裂解物上清；5:37℃、4h诱导的细胞裂解上清；6:15℃、16h诱导的细胞裂解物沉淀；7:37℃、4h诱导的细胞裂解沉淀。

图3：rTTc-CPB_m4的纯化M1:Protein marker；1:15℃、16h诱导的细胞裂解上清；2:流穿液；3:20mM咪唑洗脱液；4:50mM咪唑洗脱液；5:300mM咪唑洗脱液；6：洗脱后的Ni柱；7：15℃、16h诱导的细胞裂解沉淀；

本发明涉及生物材料资源信息

本发明涉及的微生物为：表达破伤风毒素C片段以及4个氨基酸突变的CPB(分别为第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸)的重组融合蛋白的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)的BL21(DE3)细胞株，被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株。

本发明具体实施方式

1.本发明涉及一种破伤风梭毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白(rTTc-CPB_m4)，其中：

(1)术语“TTc”意指破伤风毒素C片段，“CPB_m4”意指含有4个氨基酸突变的产气荚膜梭菌β毒素的无毒突变体。“TTc”和“CPB_m4”还涵盖一个或多个修饰(包括化学修饰和基因修饰)的破伤风梭毒素C片段和产气荚膜梭菌β毒素突变体。术语“基因修饰”意指缺失、置换或添加一个或多个氨基酸碱基。

本发明的方法可以用来产生任何破伤风毒素C片段和产气荚膜梭菌β毒素的同源物或其衍生物，包括例如破伤风毒素氨基酸序列SEQ ID No.1(GenBank编号：WP_115606337)和产气荚膜梭菌CPB氨基酸序列SEQ ID No.2(GenBank编号：WP_004456321)的多肽及其衍生物。术语“衍生物”包含氨基酸突变如添加、置换、缺失或截短一个或多个氨基酸残基。

rTTc-CPB_m4可以包含多肽序列，所述多肽序列是与上文提到的TTc和CPB序列之一具有至少50％序列同一性的同源物或衍生物。

rTTc-CPB_m4可以包含SEQ ID No.1和SEQ ID No.2中任一者的衍生物。其中所述衍生物具有一个或多个点突变和/或一个或多个额外的氨基酸残基。在另一个方面，所述重组融合蛋白可以包含多肽序列，所述多肽序列与SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的序列具有至少30％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更大序列同一性。

(2)术语“序列同一性”指确定参考氨基酸序列和查询序列之间的同一性，其中将序列如此比对，从而获得最高级级别的匹配，并且所述序列同一性可以使用计算机程序(例如BLASTP、BLASTN、FASTA)中代码化的公开技术或方法计算。同一性百分数值可以在完整氨基酸序列范围内或氨基酸序列的某个区域内计算。

(3)rTTc-CPB_m4可以在N末端或C末端或在内部位置含有额外的氨基酸残基。额外的氨基酸残基可以旁侧分布有一个或多个蛋白酶切割位点。额外的氨基酸序列可以作为可检测标签发挥作用和或允许与固相支持物结合，例子是His标签。

(4)编码所述rTTc-CPB_m4的核酸分子可以根据本专利任选地包含调节元件。如本文所用的术语“调节元件”指基因表达的调节元件，包括转录和翻译，并且包括元件如TATA框、启动子、增强子、核糖体结合位点等。所述调节元件可以包含一个或多个同源调节元件和/或异源调节元件。“同源调节元件”是涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。“异源调节元件”是不涉及在所述野生型细胞中核酸分子或多肽的基因表达的调节元件。此外，也可以使用诱导型表达的调节元件，如诱导型启动子。

编码所述rTTc-CPB_m4的核酸分子可以设计成有利于在宿主细胞、特别是细菌宿主细胞、优选的是大肠杆菌细胞中高水平表达，如根据大肠杆菌表达系统进行密码子优化等。另一方面，本发明可任意使用包含编码所述rTTc-CPB_m4的核酸分子的表达载体，载体可以适于在体外和/或在体内表达所述重组融合蛋白。所述载体可以是用于瞬时和/或稳定基因表达的载体，可以另外包含调节元件和/或选择标记，可以是病毒来源的、噬菌体来源或细菌来源的。例如，所述表达载体可以是pET30a载体。

编码所述rTTc-CPB_m4的核酸分子或表达载体可以通过宿主细胞表达。如本文所用，术语“宿主细胞”涵盖适合翻译所述核酸分子或所述载体的原核细胞和/或真核细胞。所述宿主细胞不仅包括不表达破伤风毒素和/或产气荚膜梭菌CPB或其同源物的宿主细胞，也涵盖表达两种毒素或同源物的宿主细胞，如野生型。如本文所用，术语“宿主细胞”可以是产抱子梭菌、产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌、蜡样芽胞杆菌、苏云金芽抱杆菌、曹状芽抱杆菌、嗜热溶蛋白芽胞杆菌、炭疽芽抱杆菌、巨大芽抱杆菌、枯草芽抱杆菌、大肠杆菌或酵母细胞。优选地，宿主细胞是大肠杆菌宿主细胞，特别是大肠杆菌BL21(DE3)或Rosetta(DE3)。本发明用所述表达TTc和CPB突变体重组融合蛋白的埃希氏大肠菌BL21(DE3)，被命名为BL/TB株。

2.大肠埃希氏菌BL/TB株的构建、表达及鉴定

(1)基因合成

根据破伤风毒素(TT)(序列1)和C型产气荚膜梭菌CPB(序列2)的天然编码基因序列，经密码子优化后，将只含有破伤风毒素的无毒区域C片段编码基因和含有多个氨基酸突变的CPB编码基因进行串联。同时，在串联基因的3’端添加纯化所用氨基酸标签编码序列。用化学合成的方法合成该段基因片段(序列3)。

(2)重组融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的基因为模板，采用设计的引物对进行PCR扩增到的目的DNA条带，经回收后，与原核表达载体同时采用双酶切消化后，进行连接，得到插入目的基因的原核表达载体。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，提取质粒备用。

(3)表达重组融合蛋白的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，获得阳性菌株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

(4)重组融合蛋白的表达与鉴定

将大肠埃希氏菌(E.coli)BL/TB株接种于4mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃振荡培养，当OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体15min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，同时，采用抗His抗体，对其进行Western blot鉴定，最终确定表达的最优化条件。

3.重组融合蛋白的纯化

将大肠埃希氏菌BL/TB株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，根据上述确定的最优表达条件，进行诱导表达并收集菌体进行纯化。

4.重组融合蛋白的应用

对纯化的蛋白进行蛋白含量检测：用BCA法检测蛋白含量(PierceTM BCA ProteinAssay Kit，TG268883)，应不低于0.5mg/ml。经SDS-PAGE检测并对条带进行灰度扫描，蛋白纯度应不低于85％。将双相油佐剂(如206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终制成浓度为50μg/mL和100μg/mL的亚单位疫苗。同时，用同样剂量的PBS与佐剂混匀，作为对照疫苗。对分装后的亚单位疫苗按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)附录进行以下检验：

(1)性状

外观应为乳白色乳剂。

剂型应呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，应不破乳，并且管底析出的水相应不多于0.5mL。

黏度按《中国兽药典》(中国兽药典委员会编，中华人民共和国兽药典，2015年版三部，中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)附录进行测定，应符合规定。

(2)无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，应无菌生长。

(3)安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射50μg/mL的疫苗4.0mL，观察10日。应全部健活。

(4)效力检验

按《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部)附录中羊梭菌多联苗的标准进行，具体如下：

(1)血清中和法：

选取对B和C型产气荚膜梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔和1～3岁体重相近的绵羊各4只，各颈部皮下或肌肉注射适宜剂量的疫苗。一免后14～21d，采血分离血清。分别取每只实验动物血清0.4mL分别与0.8mL破伤风梭菌培养物上清(含8个及以上小鼠MLD)、0.8mL B型产气荚膜梭菌培养物上清(含4个及以上小鼠MLD)以及0.8mL C型(含4个及以上小鼠MLD)产气荚膜梭菌的培养物上清混合，置37℃作用40min后，对16～18g的小鼠进行注射，每种混合样品注射2只，0.3mL/只。其中，破伤风梭菌组分采用腹部皮下注射方式，B型和C型产气荚膜梭菌组分采用静脉注射方式。同时各用同批小鼠2只，分别用相同的注射方式注射1MLD相应的梭菌培养物上清作对照。其中，破伤风梭菌组分观察5d，其余两种梭菌组分观察1d，判定结果。

对照鼠全部死亡，免疫组血清对破伤风梭菌毒素的中和效价达到2及以上(0.1mL免疫动物血清中和2及以上MLD的毒素)，对B和C型产气荚膜梭菌毒素的中和效价均达到1及以上(0.1mL免疫动物血清中和1及以上MLD毒素)，即判为合格。

(2)免疫攻毒法：

选取对B和C型产气荚膜梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔18只，随机分为对照组(6只)和免疫组(12只)。其中，免疫组的12只家兔各颈部皮下或肌肉注射50μg/mL的疫苗2.0mL，对照组的6只各颈部皮下或肌肉注射相同剂量的对照疫苗。一免后14～21d进行攻毒实验。具体的攻毒实验方案如下：分别用1MLD的B型产气荚膜梭菌毒素和1MLD的C型产气荚膜梭菌毒素经耳经脉各注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，观察3～5天；用10MLD的破伤风毒素经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，观察10天。对照组动物应该全部死亡，免疫组动物至少保护3只。

实施例

以下实施例为更好说明本发明的技术方案，但不对本发明技术方案构成限制，通过破伤风毒素C末端作为助溶标签来提高目的蛋白的表达量和(或)可溶性、通过其它氨基酸位点突获得的β毒素突变体以及添加其它标签实现β毒素突变体在大肠杆菌中高表达和可溶性表达的也在本专利的保护范围内。

实施例1

——大肠埃希氏菌BL/TB株的构建、表达及鉴定

1.基因合成

本申请根据破伤风毒素(TT)(序列1)和C型产气荚膜梭菌CPB(序列2)的编码基因序列，经密码子优化后，用柔性氨基酸将只含有破伤风毒素的无毒区域C片段(TTc)和含4个氨基酸突变(第212位精氨酸突变为谷氨酸，第268位的亮氨酸突变为甘氨酸，266位的酪氨酸和275位的色氨酸突变为丙氨酸)的CPB编码基因进行串联。同时，在串联基因的3’端添加纯化所用6×His标签的编码序列。用化学合成的方法，合成了该段基因序列GTTc-CPB_m4(序列3)。具体的核酸序列如SEQ ID No.3所示，氨基酸序列见SEQ ID No.4所示。

2.重组融合蛋白表达载体的构建

以人工合成的GTTc-CPB_m4为模板，采用引物对1F/1R(序列5/序列6)进行PCR扩增。

其中上游引物1F序列为：

5’-ggcatatgaa gaacctggac tg-3’22(序列5)，其5’端引入限制性内切酶NdeⅠ位点及保护性碱基；

下游引物1R序列为：

5’-ggaagctttt agtggtgatg at-3’22(序列6)，其5’端引入限制性内切酶HindIII位点及保护性碱基。

PCR体系为：

Buffer(Mg2+plus)10μL，dNTPs 4μL，上、下游引物各1μL，

HS聚合酶1μL，DNA模板2μL，补充dd H₂O至50μL体系。PCR反应条件为：98℃预变性1min；98℃变性10s，56℃退火30s，72℃延伸2min，共33个循环；最后72℃环延伸10min。

扩增得到的目的DNA条带，经回收后，采用NdeⅠ/Hind III双酶切消化，与经过相同酶切消化的pET30a载体连接，得到插入GTTc-CPB_m4的阳性克隆pET30a-GTTc-CPB_m4。

3.表达rTTc-CPB_m4的基因工程菌株的构建

将提取得到的质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆至含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，经PCR鉴定，含有目的DNA片段后，命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并加入等体积的50％甘油LB，-70℃冻存。

序列1(破伤风毒素氨基酸序列)

序列2(产气荚膜梭菌β毒素氨基酸序列)

序列3(编码破伤风毒素与产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白的核苷酸序列)

序列4(破伤风毒素与产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白的氨基酸序列)

实施例2

——rTTc-CPB_m4的表达和鉴定

1.rTTc-CPB_m4表达的SDS-PAGE鉴定

将大肠埃希氏菌(E.coli)BL/TB株接种于4mL含有卡那霉素的LB液体培养基中，分别置于37℃振荡培养，当OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液分别置于37℃和15℃诱导培养4h和16h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体温重加10mL裂解液[0.02mol/L Tris缓冲液(pH值7.2)，0.3mol/L NaCl]的比例重悬菌体，在冰水浴中超声破碎菌体15min，破碎条件为：工作9s，间歇9s，超声功率为400W。将破碎后的菌液于4℃，以12000r/min离心10min，收集上清。取30μL上清加入10μL的4×SDS-PAGE上样缓冲液，70℃作用10min，进行12％SDS-PAGE电泳，结果见图1。从图1可以看出，在15℃的诱导温度下，rTTc-CPB_m4大量存在于菌体裂解液的上清中，呈可溶性表达。为此，我们将rTTc-CPB_m4的最适诱导表达条件定为15℃，诱导表达16h。

2.rTTc-CPB_m4表达的Western blot鉴定

采用上述步骤中诱导条件下的rTTc-CPB_m4，采用抗His抗体，对其进行Westernblot鉴定，结果见图2。从图2可知，15℃、16h诱导的细胞裂解上清中，rTTc-CPB_m4表达量最高，约占目的蛋白总表达量的17％。由于细胞裂解上清中呈可溶性表达的rTTc-CPB_m4，空间结构与野生型毒素最为接近。综合SDS-PAGE和Western blot鉴定结果，我们进一步确定rTTc-CPB_m4的最适诱导表达条件为15℃，诱导表达16h。

实施例3

——rTTc-CPB_m4的纯化

将大肠埃希氏菌BL/TB株接种于1L含有卡那霉素的LB液体培养基中发酵培养，37℃振荡培养OD₆₀₀为0.6～0.8时，将温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG溶液诱导培养16h。菌液培养完成后，以5000r/min离心5min收集菌体，按每克菌体湿重加10ml裂解液(pH值7.2 0.02mol/L Tris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，4℃条件下用低温高压均质机以800bar的压力破碎菌体3次。裂解液经4℃10000r/min离心30min，收集上清液。按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的rTTc-CPB_m4进行纯化。如图3所示，收集纯度较高的4～6泳道的洗脱液，经0.22μm孔径滤膜过滤，即为初步纯化的rTTc-CPB_m4。

实施例4

——rTTc-CPB_m4对小鼠的毒力试验

通过测定rTTc-CPB_m4对小鼠的毒力，以验证该rTTc-CPB_m4在体内的实际减毒效果。将纯化的rTTc-CPB_m4、B和C型产气荚膜梭菌培养上清，分别以不同的剂量，经尾静脉接种16～18g的ICR小鼠，每剂量注射5只，0.2mL/只。将纯化的rTTc-CPB_m4和破伤风梭菌培养上清分别以不同的剂量经腹部皮下注射16～18g的ICR小鼠，每剂量注射5只，0.2mL/只。结果显示，当接种剂量为0.1mg时，所有小鼠均健活且无不良反应，而B、C型产气荚膜梭菌和破伤风梭菌培养物上清分别在接种0.001mL、0.001mL和0.02μL即可导致小鼠5/5死亡。该结果表明，rTTc-CPB_m4在小鼠体内是无毒的，被确定为无毒重组融合蛋白。

表1 rTTc-CPB_m4对小鼠的毒力

实施例5

——以rTTc-CPB_m4为抗原的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌的亚单位疫苗的制备。

1.菌种：制苗用菌种为重组表达rTTc-CPB_m4的大肠埃希氏菌BL/TB株。

(1)一级种子繁殖及鉴定：将冻干菌种用少量LB液体培养基融解，划线接种于含卡那霉素的LB固体平板，置37℃培养12～16小时，选取符合标准的单个菌落，接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃培养8～12小时，与50％甘油等比例混合后分装，经纯粹检验合格后，作为制苗用一级种子。

(2)二级种子繁殖及鉴定：取一级种子，按1％的量接种含卡那霉素的LB液体培养基，置37℃振荡培养8～12小时，即为二级种子。

(3)制苗用抗原制备：取合格的二级种子，按培养基总量的2％接种含卡那霉素的LB液体培养基，培养温度37℃，当培养物OD₆₀₀值为0.6～0.8时，温度降至15℃，加入终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养16h。

(4)破菌：离心收集菌体，按每克菌体湿重加10mL裂解液(pH值7.2 0.02mol/LTris缓冲液，0.3mol/L NaCl)的比例重悬菌体，用高压均质机以800bar的压力破碎菌体，离心收集上清。

(5)纯化：按照Ni-IDA亲和层析介质试剂盒的使用说明书对菌体裂解上清中呈可溶性表达的目的蛋白进行纯化，经0.22μm孔径滤膜过滤，-80℃保存备。

(6)蛋白含量检测：用BCA法检检测试剂盒(PierceTM BCA Protein Assay Kit，TG268883)测蛋白含量。

(7)疫苗配制：将双相油佐剂(206佐剂)导入油相罐内，以至少121℃高压灭菌30分钟，冷却至室温备用。根据蛋白含量测定结果，用PBS(pH值7.2 0.01mol/L)将检验合格的纯化蛋白适当稀释后混匀。将水相加入乳化罐内，以80～100r/min搅拌，同时按1:1(V/V)的比例，缓慢加入油相，加完后搅拌20～30min。乳化后取样进行检验，合格后分装，最终配制成50μg/mL和100μg/mL的疫苗。同时，用同样剂量的PBS与佐剂混匀，作为对照疫苗。

实施例6

——以rTTc-CPB_m4为抗原的破伤风梭菌和产气荚膜梭菌的亚单位疫苗的检验

1.性状

外观为乳白色乳剂。

剂型呈水包油包水型(W/O/W)。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散。

稳定性吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min，不破乳，并且管底析出的水相为0.2mL。

黏度按《中国兽药典》附录进行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部，中国农业出版社，2016，以下称《中国兽药典》)测定，符合规定。

2.无菌检验按《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

3.安全检验用体重1.5～2.0kg健康家兔4只，各肌肉或皮下注射50μg/mL的疫苗4.0mL，观察10日后全部健活。

4.效力检验

按《中国兽药典》附录进行《中国兽药典》(中国兽药典委员会，中华人民共和国兽药典，二〇一五年版三部进行检验

(1)血清中和法

选取对B和C型产气荚膜梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔和1～3岁体重相近的绵羊各4只，各肌肉注射疫苗适宜剂量的疫苗。其中，家兔的免疫剂量为100μg/只，绵羊的免疫剂量为200μg/只。一免21d后，采血分离血清。取每只实验动物血清0.4mL分别与0.8mL破伤风毒梭菌培养物上清(含8个及以上小鼠MLD)、0.8mL B型产气荚膜梭菌培养物上清(含4个及以上小鼠MLD)和0.8mL C型(含4个及以上小鼠MLD)产气荚膜梭菌的培养物上清混合，置37℃作用40min后，对16～18g的小鼠进行注射，每种混合样品注射2只，0.3mL/只。其中，破伤风梭菌组分采用腹部皮下注射方式，B型和C型产气荚膜梭菌组分采用静脉注射方式。同时各用同批小鼠2只，分别用相同的注射方式注射1MLD相应的梭菌培养物上清作对照。其中，破伤风梭菌组分观察5d，其余两种梭菌组分观察1d，判定结果。

结果显示一次免疫后，每只家兔对破伤风梭菌、B和C型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价分别可达到5120、1～2和1(即0.1mL家兔血清可中和5120、1～2、1个MLD的相应梭菌毒素)；每只绵羊对破伤风梭菌、B和C型产气荚膜梭菌毒素的血清中和效价分别可达到1600、1和1(即0.1mL家兔血清可中和1600、1、1个MLD的相应梭菌毒素)。

(2)攻毒保护法

选取对B和C型产气荚膜梭菌毒素以及破伤风毒素血清中和效价为0的实验动物，具体如下：体重1.5～2.0kg健康家兔18只，随机分为对照组(6只)和免疫组(12只)。其中，免疫组的12只家兔各肌肉注射疫苗，免疫剂量为100μg/只，对照组6只家兔各肌肉注射相同剂量的对照疫苗。一免后14d进行攻毒实验。具体的攻毒实验方案如下：用1MLD的B型产气荚膜梭菌毒素和1MLD的C型产气荚膜梭菌毒素分别经耳经脉各注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔。24h内，两种毒素攻毒的对照组家兔均2/2死亡，两种毒素攻毒的免疫组家兔在5d后均4/4存活；用10MLD的破伤风毒素分别经皮下注射4只免疫组家兔和2只对照组家兔，对照组家兔在72h内2/2死亡，免疫组家兔在10d后4/4存活。

《中国兽药典》中关于羊梭菌多联干粉灭活苗规定，家兔或绵羊血清对破伤风梭菌毒素的中和效价达到2，对B型和C型产气荚膜梭菌毒素分别达到1，即可判为疫苗中破伤风梭菌、B型和C型产气荚膜梭菌毒素组分为合格。因此，本发明生产的疫苗，在抗原含量低至100～200μg/只的情况下，免疫后家兔和绵羊血清对破伤风梭菌、B型和C型产气荚膜梭菌毒素的中和效价以及家兔的免疫攻毒保护效果均达到现行《中国兽药典》的标准。

鉴于我国现有商品化梭菌毒素疫苗须采用甲醛灭活脱毒，存在生物安全隐患，也影响了疫苗在田间使用的安全性；同时现行商品化疫苗在生产过程中，还存在产毒不稳定，导致疫苗效力不稳定的问题。此外，现行梭菌多联苗需要每种(型)梭菌单独发酵，时间和培养基成本过高。因此，本申请生产的无毒性破伤风梭菌和产气荚膜梭菌重组融合蛋白，是我国现行破伤风梭菌、B型和C型产气荚膜梭菌毒素基因工程亚单位疫苗升级换代的理想候选抗原。

序列表

<110> 中国兽医药品监察所

<120> 一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1315

<212> PRT

<213> 破伤风毒素(Tetanus toxin)

<400> 1

Met Pro Ile Thr Ile Asn Asn Phe Arg Tyr Ser Asp Pro Val Asn Asn

1 5 10 15

Asp Thr Ile Ile Met Met Glu Pro Pro Tyr Cys Lys Gly Leu Asp Ile

20 25 30

Tyr Tyr Lys Ala Phe Lys Ile Thr Asp Arg Ile Trp Ile Val Pro Glu

35 40 45

Arg Tyr Glu Phe Gly Thr Lys Pro Glu Asp Phe Asn Pro Pro Ser Ser

50 55 60

Leu Ile Glu Gly Ala Ser Glu Tyr Tyr Asp Pro Asn Tyr Leu Arg Thr

65 70 75 80

Asp Ser Asp Lys Asp Arg Phe Leu Gln Thr Met Val Lys Leu Phe Asn

85 90 95

Arg Ile Lys Asn Asn Val Ala Gly Glu Ala Leu Leu Asp Lys Ile Ile

100 105 110

Asn Ala Ile Pro Tyr Leu Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Phe

115 120 125

Asp Thr Asn Ser Asn Ser Val Ser Phe Asn Leu Ser Glu Gln Asp Pro

130 135 140

Ser Gly Ala Thr Thr Lys Ser Ala Met Leu Thr Asn Leu Ile Ile Phe

145 150 155 160

Gly Pro Gly Pro Val Leu Asn Lys Asn Glu Val Arg Gly Ile Val Leu

165 170 175

Arg Val Asp Asn Lys Asn Tyr Phe Pro Cys Arg Asp Gly Phe Gly Ser

180 185 190

Ile Met Gln Met Ala Phe Cys Pro Glu Tyr Ile Pro Thr Phe Asp Asn

195 200 205

Val Ile Glu Asn Ile Thr Ser Leu Thr Ile Gly Lys Ser Lys Tyr Phe

210 215 220

Gln Asp Pro Ala Leu Leu Leu Met His Glu Leu Ile His Val Leu His

225 230 235 240

Gly Leu Tyr Gly Met Gln Val Ser Ser His Glu Ile Ile Pro Ser Lys

245 250 255

Gln Glu Ile Tyr Met Gln His Thr Tyr Pro Ile Ser Ala Glu Glu Leu

260 265 270

Phe Thr Phe Gly Gly Gln Asp Ala Asn Leu Ile Ser Ile Asp Ile Lys

275 280 285

Asn Asp Leu Tyr Glu Lys Thr Leu Asn Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Asn

290 295 300

Lys Leu Ser Gln Val Thr Ser Cys Asn Asp Pro Asn Ile Asp Ile Asp

305 310 315 320

Ser Tyr Lys Gln Ile Tyr Gln Gln Lys Tyr Gln Phe Asp Lys Asp Ser

325 330 335

Asn Gly Gln Tyr Ile Val Asn Glu Asp Lys Phe Gln Ile Leu Tyr Asn

340 345 350

Ser Ile Met Tyr Gly Phe Thr Glu Ile Glu Leu Gly Lys Lys Phe Asn

355 360 365

Ile Lys Thr Arg Leu Ser Tyr Phe Ser Met Asn His Asp Pro Val Lys

370 375 380

Ile Pro Asn Leu Leu Asp Asp Thr Ile Tyr Asn Asp Thr Glu Gly Phe

385 390 395 400

Asn Ile Glu Ser Lys Asp Leu Lys Ser Glu Tyr Lys Gly Gln Asn Met

405 410 415

Arg Val Asn Thr Asn Ala Phe Arg Asn Val Asp Gly Ser Gly Leu Val

420 425 430

Ser Lys Leu Ile Gly Leu Cys Lys Lys Ile Ile Pro Pro Thr Asn Ile

435 440 445

Arg Glu Asn Leu Tyr Asn Arg Thr Ala Ser Leu Thr Asp Leu Gly Gly

450 455 460

Glu Leu Cys Ile Lys Ile Lys Asn Glu Asp Leu Ile Phe Ile Ala Glu

465 470 475 480

Lys Asn Ser Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gln Asp Glu Ile Val Ser Tyr

485 490 495

Asn Thr Lys Asn Lys Pro Leu Asn Phe Asn Tyr Ser Leu Asp Lys Ile

500 505 510

Ile Leu Asp Tyr Asn Leu Gln Ser Lys Ile Thr Leu Pro Asn Asp Arg

515 520 525

Thr Thr Pro Val Thr Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Pro Glu Tyr Lys Ser

530 535 540

Asn Ala Ala Ser Thr Ile Glu Ile His Asn Ile Asp Asp Asn Thr Ile

545 550 555 560

Tyr Gln Tyr Leu Tyr Ala Gln Lys Ser Pro Thr Thr Leu Gln Arg Ile

565 570 575

Thr Met Thr Asn Ser Val Asp Asp Ala Leu Ile Asn Ser Thr Lys Ile

580 585 590

Tyr Ser Tyr Phe Pro Ser Val Ile Ser Lys Val Asn Gln Gly Ala Gln

595 600 605

Gly Ile Leu Phe Leu Gln Trp Val Arg Asp Ile Ile Asp Asp Phe Thr

610 615 620

Asn Glu Ser Ser Gln Lys Thr Thr Ile Asp Lys Ile Ser Asp Val Ser

625 630 635 640

Thr Ile Val Pro Tyr Ile Gly Pro Ala Leu Asn Ile Val Lys Gln Gly

645 650 655

Tyr Glu Gly Asn Phe Ile Gly Ala Leu Glu Thr Thr Gly Val Val Leu

660 665 670

Leu Leu Glu Tyr Ile Pro Glu Ile Thr Leu Pro Val Ile Ala Ala Leu

675 680 685

Ser Ile Ala Glu Ser Ser Thr Gln Lys Glu Lys Ile Ile Lys Thr Ile

690 695 700

Asp Asn Phe Leu Glu Lys Arg Tyr Glu Lys Trp Ile Glu Val Tyr Lys

705 710 715 720

Leu Val Lys Ala Lys Trp Leu Gly Thr Val Asn Thr Gln Phe Gln Lys

725 730 735

Arg Ser Tyr Gln Met Tyr Arg Ser Leu Glu Tyr Gln Val Asp Ala Ile

740 745 750

Lys Lys Ile Ile Asp Tyr Glu Tyr Lys Ile Tyr Ser Gly Pro Asp Lys

755 760 765

Glu Gln Ile Ala Asp Glu Ile Asn Asn Leu Lys Asn Lys Leu Glu Glu

770 775 780

Lys Ala Asn Lys Ala Met Ile Asn Ile Asn Ile Phe Met Arg Glu Ser

785 790 795 800

Ser Arg Ser Phe Leu Val Asn Gln Met Ile Asn Glu Ala Lys Lys Gln

805 810 815

Leu Leu Glu Phe Asp Thr Gln Ser Lys Asn Ile Leu Met Gln Tyr Ile

820 825 830

Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Lys Lys Leu Glu

835 840 845

Ser Lys Ile Asn Lys Val Phe Ser Thr Pro Ile Pro Phe Ser Tyr Ser

850 855 860

Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp Val Ile

865 870 875 880

Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp Ile Ile

885 890 895

Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro Asp Ala

900 905 910

Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val Asn Asn

915 920 925

Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu Tyr Asn

930 935 940

Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val Pro Lys

945 950 955 960

Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr Ser Ile

965 970 975

Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly Trp Ser

980 985 990

Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp Ser Ala

995 1000 1005

Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys Phe Asn

1010 1015 1020

Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn Asp Arg

1025 1030 1035 1040

Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly Ser Ala

1045 1050 1055

Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile Thr Leu

1060 1065 1070

Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile Asp Lys

1075 1080 1085

Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu Lys Leu

1090 1095 1100

Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp Gly Asn

1105 1110 1115 1120

Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala Tyr Ser

1125 1130 1135

Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr Leu Thr

1140 1145 1150

Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr Arg Arg

1155 1160 1165

Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro Asn Asn

1170 1175 1180

Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu Tyr Val

1185 1190 1195 1200

Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp Gly Asn

1205 1210 1215

Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn Ala Pro

1220 1225 1230

Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg Asp Leu

1235 1240 1245

Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp Ala Ser

1250 1255 1260

Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp Pro Asn

1265 1270 1275 1280

Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu Lys Asp

1285 1290 1295

Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu Gly Trp

1300 1305 1310

Thr Asn Asp

1315

<210> 2

<211> 336

<212> PRT

<213> 产气荚膜梭菌β毒素(Clostridium perfringens β toxins)

<400> 2

Met Lys Lys Lys Phe Ile Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Leu Leu Asn

1 5 10 15

Gly Cys Leu Leu Ser Pro Thr Leu Val Tyr Ala Asn Asp Ile Gly Lys

20 25 30

Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Ile Ile

35 40 45

Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Ser Val Asp Ser Ser

50 55 60

Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp Ala Arg Phe Ile

65 70 75 80

Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu Ile Asn Leu Thr Gly

85 90 95

Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Lys Tyr Asn Leu His

100 105 110

Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro Val Arg Tyr Ser Ile

115 120 125

Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val Lys Ile Val Asp Ser

130 135 140

Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val Ser Asn Thr Met Gly

145 150 155 160

Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu Asn Lys Pro Lys Ala

165 170 175

Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Ile Glu Tyr Val Gln

180 185 190

Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser Thr Ser Lys Ala Ser

195 200 205

Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly Asn Tyr Asn Leu Lys

210 215 220

Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met Tyr Gly Arg Tyr

225 230 235 240

Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser

245 250 255

Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met Ser Val Val Leu Thr

260 265 270

Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys Val Lys Met Glu Arg

275 280 285

Glu Arg Asn Cys Tyr Tyr Leu Asn Trp Asn Gly Ala Asn Trp Val Gly

290 295 300

Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro Asn Val Asp Ser His

305 310 315 320

Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His Lys Val Thr Ala Ile

325 330 335

<210> 3

<211> 2343

<212> DNA

<213> 编码破伤风毒素与产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白rTTc-CPBm4(rTTc-CPBm4)

<400> 3

catatgaaga acctggactg ttgggttgat aatgaagagg atattgatgt cattctgaag 60

aaatctacga tcctgaacct ggacattaac aacgacatca tttctgacat tagtggtttc 120

aatagtagtg ttatcactta cccagacgcg caactggtgc caggtatcaa cggtaaagcg 180

atccatctgg tgaataacga atctagcgaa gtgattgttc ataaggcgat ggacattgag 240

tacaatgata tgttcaacaa tttcactgtg tctttttggc tgcgcgttcc gaaagtaagc 300

gccagccacc tggagcagta tgatactaac gaatactcta tcatcagttc tatgaagaaa 360

tacagtctga gcattggcag cggctggagt gtgtctctga agggtaacaa cctgatctgg 420

acgctgaaag actctgccgg tgaggtccgt cagattacgt ttcgcgacct gagcgacaag 480

tttaacgcat acctggctaa caaatgggtc ttcattacca ttacgaacga tcgtctgagt 540

agcgcaaacc tgtatatcaa cggtgtgctg atgggtagtg cagagatcac tggcctgggt 600

gctatccgtg aagacaataa catcaccctg aaactggatc gttgcaacaa taacaaccaa 660

tatgtgagta tcgacaagtt tcgtatcttc tgtaaagccc tgaaccctaa ggagattgag 720

aagctgtata ccagttacct gagtatcacc ttcctgcgtg acttctgggg caatccgctg 780

cgttatgaca ctgagtacta tctgattcca gtagcgtaca gctctaaaga tgtgcagctg 840

aagaatatca ctgattacat gtacctgacg aatgccccaa gttacactaa cgggaaactg 900

aatatctact atcgtcgcct gtacagcggt ctgaaattca tcatcaaacg ttacacgccg 960

aacaacgaga ttgattcttt tgtgcgtagc ggtgacttca tcaaactgta cgtttcttac 1020

aataacaatg aacacattgt gggttacccg aaagatggta acgcattcaa caatctggac 1080

cgcattctgc gtgtcgggta caatgcacca gggattccac tgtacaagaa aatggaagcc 1140

gtaaagctgc gtgatctgaa gacctacagc gtccaactga aactgtacga tgataaggac 1200

gcgagcctgg gtctggttgg tactcataac ggtcagatcg gcaatgaccc aaatcgtgac 1260

atcctgattg ccagtaactg gtactttaac catctgaagg acaagaccct gacctgtgat 1320

tggtatttcg tcccgactga tgaagggtgg accaatgacg gtggtggcgg ttccggcggt 1380

ggtggcagca acgatattgg caaaaccacg acgattaccc gcaacaaaac gagcgatggc 1440

tacacgatta ttacgcagaa cgacaaacag attatttcct atcagtcagt ggatagctct 1500

agtaaaaacg aagacggctt taccgcgtct attgatgccc gtttcatcga tgacaaatat 1560

tcctcagaaa tgaccacgct gatcaacctg accggtttta tgtcgagcaa gaaagaagat 1620

gttatcaaaa aatacaatct gcatgatgtc accaacagta cggcaatcaa tttcccggtc 1680

cgctactcca tttcaatcct gaacgaatcg atcaacgaaa acgtcaaaat cgtggatagc 1740

atcccgaaaa acaccatctc ccaaaaaacc gtgtcaaata cgatgggcta caaaattggc 1800

ggtagcattg aaatcgaaga aaacaaaccg aaagcatcta tcgaaagtga atatgctgaa 1860

tctagtacca tcgaatacgt tcagccggac ttttctacca ttcaaacgga tcactcgacg 1920

agcaaagcca gttgggacac caaattcacg gaaaccacgc gtggcaacta taatctgaaa 1980

agcaacaatc cggtgtacgg caacgaaatg tttatgtatg gtgaatacac caacgttccg 2040

gcgacggaaa atattatccc ggattatcag atgtccaaac tgattaccgg cggtctgaac 2100

ccgaatatgt cagtggttct gaccgccccg aatggtacgg aagaatcgat tatcaaagtc 2160

aaaatggaac gtgaacgcaa ctgcgcgtac ggcaactgga atggtgccaa cgcggtgggt 2220

caagtgtatt ctcgtctggc tttcgatact ccaaacgttg actctcacat cttcaccttc 2280

aagatcaact ggctgactca taaagttacc gcaatccatc accatcatca ccactaaaag 2340

ctt 2343

<210> 4

<211> 778

<212> PRT

<400> 4

His Met Lys Asn Leu Asp Cys Trp Val Asp Asn Glu Glu Asp Ile Asp

1 5 10 15

Val Ile Leu Lys Lys Ser Thr Ile Leu Asn Leu Asp Ile Asn Asn Asp

20 25 30

Ile Ile Ser Asp Ile Ser Gly Phe Asn Ser Ser Val Ile Thr Tyr Pro

35 40 45

Asp Ala Gln Leu Val Pro Gly Ile Asn Gly Lys Ala Ile His Leu Val

50 55 60

Asn Asn Glu Ser Ser Glu Val Ile Val His Lys Ala Met Asp Ile Glu

65 70 75 80

Tyr Asn Asp Met Phe Asn Asn Phe Thr Val Ser Phe Trp Leu Arg Val

85 90 95

Pro Lys Val Ser Ala Ser His Leu Glu Gln Tyr Asp Thr Asn Glu Tyr

100 105 110

Ser Ile Ile Ser Ser Met Lys Lys Tyr Ser Leu Ser Ile Gly Ser Gly

115 120 125

Trp Ser Val Ser Leu Lys Gly Asn Asn Leu Ile Trp Thr Leu Lys Asp

130 135 140

Ser Ala Gly Glu Val Arg Gln Ile Thr Phe Arg Asp Leu Ser Asp Lys

145 150 155 160

Phe Asn Ala Tyr Leu Ala Asn Lys Trp Val Phe Ile Thr Ile Thr Asn

165 170 175

Asp Arg Leu Ser Ser Ala Asn Leu Tyr Ile Asn Gly Val Leu Met Gly

180 185 190

Ser Ala Glu Ile Thr Gly Leu Gly Ala Ile Arg Glu Asp Asn Asn Ile

195 200 205

Thr Leu Lys Leu Asp Arg Cys Asn Asn Asn Asn Gln Tyr Val Ser Ile

210 215 220

Asp Lys Phe Arg Ile Phe Cys Lys Ala Leu Asn Pro Lys Glu Ile Glu

225 230 235 240

Lys Leu Tyr Thr Ser Tyr Leu Ser Ile Thr Phe Leu Arg Asp Phe Trp

245 250 255

Gly Asn Pro Leu Arg Tyr Asp Thr Glu Tyr Tyr Leu Ile Pro Val Ala

260 265 270

Tyr Ser Ser Lys Asp Val Gln Leu Lys Asn Ile Thr Asp Tyr Met Tyr

275 280 285

Leu Thr Asn Ala Pro Ser Tyr Thr Asn Gly Lys Leu Asn Ile Tyr Tyr

290 295 300

Arg Arg Leu Tyr Ser Gly Leu Lys Phe Ile Ile Lys Arg Tyr Thr Pro

305 310 315 320

Asn Asn Glu Ile Asp Ser Phe Val Arg Ser Gly Asp Phe Ile Lys Leu

325 330 335

Tyr Val Ser Tyr Asn Asn Asn Glu His Ile Val Gly Tyr Pro Lys Asp

340 345 350

Gly Asn Ala Phe Asn Asn Leu Asp Arg Ile Leu Arg Val Gly Tyr Asn

355 360 365

Ala Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Lys Lys Met Glu Ala Val Lys Leu Arg

370 375 380

Asp Leu Lys Thr Tyr Ser Val Gln Leu Lys Leu Tyr Asp Asp Lys Asp

385 390 395 400

Ala Ser Leu Gly Leu Val Gly Thr His Asn Gly Gln Ile Gly Asn Asp

405 410 415

Pro Asn Arg Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asn Trp Tyr Phe Asn His Leu

420 425 430

Lys Asp Lys Thr Leu Thr Cys Asp Trp Tyr Phe Val Pro Thr Asp Glu

435 440 445

Gly Trp Thr Asn Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn

450 455 460

Asp Ile Gly Lys Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly

465 470 475 480

Tyr Thr Ile Ile Thr Gln Asn Asp Lys Gln Ile Ile Ser Tyr Gln Ser

485 490 495

Val Asp Ser Ser Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp

500 505 510

Ala Arg Phe Ile Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu Ile

515 520 525

Asn Leu Thr Gly Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Lys

530 535 540

Tyr Asn Leu His Asp Val Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro Val

545 550 555 560

Arg Tyr Ser Ile Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val Lys

565 570 575

Ile Val Asp Ser Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val Ser

580 585 590

Asn Thr Met Gly Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu Asn

595 600 605

Lys Pro Lys Ala Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Ile

610 615 620

Glu Tyr Val Gln Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser Thr

625 630 635 640

Ser Lys Ala Ser Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly Asn

645 650 655

Tyr Asn Leu Lys Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met

660 665 670

Tyr Gly Glu Tyr Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp

675 680 685

Tyr Gln Met Ser Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met Ser

690 695 700

Val Val Leu Thr Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys Val

705 710 715 720

Lys Met Glu Arg Glu Arg Asn Cys Ala Tyr Gly Asn Trp Asn Gly Ala

725 730 735

Asn Ala Val Gly Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro Asn

740 745 750

Val Asp Ser His Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His Lys

755 760 765

Val Thr Ala Ile His His His His His His

770 775

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(1F)

<400> 5

ggcatatgaa gaacctggac tg 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成(1R)

<400> 6

ccgcaagctt ttagtggtga tg 22

Claims

1.一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白，其特征在于所述重组融合蛋白rTTc-CPB_m4的氨基酸序列如SEQ ID No .4的第2位～第778位所示，其是由重组表达rTTc-CPB_m4的宿主细胞大肠杆菌（Escherichia coli）的BL21(DE3)细胞株作为生产菌株制备的，该菌株被命名为大肠埃希氏菌BL/TB株，并已于2019年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.17162。

2.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白的制备，其特征在于所述rTTc-CPB_m4是用生产菌株大肠埃希氏菌BL/TB株经发酵培养、诱导表达、菌体破碎、可溶性抗原蛋白分离纯化后获得，所述大肠埃希氏菌BL/TB株的保藏号为CGMCCNo.17162。

3.如权利要求1所述一种无毒性破伤风毒素和产气荚膜梭菌β毒素重组融合蛋白在疫苗制备中的应用，其特征在于所述rTTc-CPB_m4是用来添加佐剂混合制成同时预防破伤风梭菌病、B型产气荚膜梭菌病和C型产气荚膜梭菌病的疫苗。