CN1641034B - 破伤风毒素重组抗原制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及含破伤风毒素抗原蛋白基因的重组载体，用该载体转化的宿主，利用转化体生产破伤风毒素抗原，以及该抗原蛋白在破伤风疫苗及结合疫苗蛋白载体中的应用。本发明的重组质粒载体含有破伤风毒素抗原蛋白的基因，由破伤风毒素抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)连接构建而成。本发明的转化体是由所述重组质粒载体转化大肠杆菌而得。本发明的表达系统对表达破伤风毒素抗原蛋白是高效的，表达量为15％，纯化的表达蛋白纯度可达96.5％。本发明的破伤风毒素抗原具有较好的免疫原性，其可用于制备破伤风疫苗、结合疫苗的载体蛋白。

Description

破伤风毒素重组抗原制备方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及含破伤风毒素抗原基因的重组载体，用该载体转化的宿主以及利用转化体生产破伤风毒素抗原，以及该抗原在破伤风疫苗和结合疫苗蛋白载体中的应用。

技术背景

破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)的感染引起的，在厌氧条件下细菌产生大量的毒素-破伤风神经毒素(简称破伤风毒素)，毒素侵害中枢神经系统，导致患者全身性肌肉强直性痉挛，严重者最后死于窒息及全身性衰竭。一般估计每年死于破伤风的人数约为100万，其中大约80％为新生儿。由于其症状险恶，发病率和病死率较高，破伤风得到医学界的高度重视。有效控制破伤风的方法是预防接种破伤风类毒素疫苗。目前大量使用的传统破伤风疫苗是通过甲醛处理破伤风毒素成为类毒素后制成的，破伤风梭菌可形成芽孢形式，而且毒性高，生产疫苗有一定危险性，甲醛处理生产类毒素也容易造成污染；疫苗中含有培养基和菌体杂蛋白，免疫接种后有一定副反应发生，经疫苗生产企业和国家管理部门对培养基成分进行改良，减少了可能引起过敏反应的大分子物质，从而减少接种反应，在采用精制类毒素后，过敏反应的发生率得到了进一步的控制，但类毒素接种中还是有一定的副反应发生。另外化学处理后的类毒素也容易发生毒性逆转。目前破伤风类毒素疫苗在我国是作为计划免疫接种的，适龄儿童均需接种，因此，疫苗的质量就更尤为重要。因此，传统破伤风疫苗应该得到改进。

破伤风毒素是由破伤风梭状芽孢杆菌产生并分泌至菌体外的一种蛋白质毒素，由1315个氨基酸组成，分子量为150700道尔顿。破伤风毒素在菌体内表达后是一条单一的蛋白质链，在分泌过程中被蛋白酶裂解成有二硫键连接的轻链和重链。根据毒素在体内的作用，破伤风毒素分子分为A、B、C三个部分，毒素的轻链称为A片段，重链的N末端一半称为B片段，另一半称为C片段，每个片段的分子量为5万左右。研究结果表明毒素的B片段可以在人工磷脂膜上形成离子通道(雷殿良，中华微生物学和免疫学进展，1991，11，p.310)，将毒素的活性片段导入细胞内；A片段是Zn蛋白酶(Jongeneel C.V.，et al.FEBS Letters.1989，242(2)，p.211)，可裂解神经细胞膜上的传送神经递质的蛋白质-囊泡相关膜蛋白，从而抑制神经递质的释放；C片段是破伤风毒素与神经细胞表面的神经节苷脂结合的部位(Bizzini B.，et al.J.Neurochem.1977，28，p.529)，具有逆行轴突运输进入中枢神经系统的功能，已被用于研究亚单位疫苗。然而，通过从破伤风毒素中直接提取和纯化C片段有很多不利之处：破伤风梭菌可形成芽孢形式，而且毒性高，培养、分离过程中存在一定危险性；用破伤风毒素提取和纯化C片段步骤较复杂，回收率不高。利用分子生物学技术，可使这一问题得到解决。从1986年起，伊索尔(Eisel)和法瓦泽(Fairweather)等就对破伤风毒素全序列和C片段在大肠杆菌中进行了克隆和表达(Eisel U，et al.EMBO J.1986，5，p.2495；Fairweather，N.E.，et al.J.Nucleic Acids Res.14(19)，p.7809)。哈泊尔(Halpern)等报道将破伤风毒素C片段(TTC)基因克隆进pTTQ8载体，表达量为0.5％(Halpern J.L.，et al.Infection and Immunity，1990，58，p.1004)。马克夫(Makoff)等发现破伤风基因的密码子偏爱性与大肠杆菌的偏爱性大不一样，将TTC基因中的大肠杆菌稀有密码子替换为大肠杆菌的偏爱密码子，并且改进启动子，其表达量可达11～13％(MakoffA.J.，et al.Nucleic Acids Research，1989，17(24)，p.10191)。

发明内容

为了克服已有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纯度高、副反应发生率低的破伤风抗原的制备方法，以及制备该抗原所用的重组质粒载体及转化体。

目前使用的破伤风疫苗有一定副反应，主要是由于制品纯度不高，在类毒化过程中结合了杂蛋白，增加了副反应的发生率，此外破伤风类毒素分子本身的分子量较大，抗原性也很强，致敏性亦强。本发明人经过大量的研究探索，研究出一种含有破伤风毒素抗原蛋白基因的重组质粒载体，由其转化大肠杆菌，克隆并表达破伤风毒素抗原蛋白基因，获得纯度高的破伤风毒素抗原蛋白，再由此制备破伤风疫苗，从提高制品纯度和降低类毒素分子量二个方面来到达改进传统破伤风疫苗的目的。

本发明提供一种重组质粒载体，其含有破伤风毒素抗原蛋白的基因，是由破伤风毒素抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)连接，构建成的重组表达质粒载体。所述破伤风毒素抗原蛋白的基因可以是破伤风毒素分子的C片段部分(简称TTC)的基因(简称ttc)，其构建成的重组表达质粒可表示为：pET-22b(+)/ttc。

所述的连接可以采用本领域常规或已知的方法进行，例如：所述的连接可以是将利用内切酶酶切处理含有在破伤风毒素抗原蛋白基因两侧带有限制性内切酶识别位点的克隆质粒得到的破伤风毒素抗原蛋白的基因，与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)连接，构建重组表达质粒。所述的内切酶可以是本领域通常使用的内切酶，例如BamH I、Hind III。所述克隆质粒可以是将所述破伤风毒素抗原蛋白基因与pGEM-T Easy载体连接而成的。所述的连接可以是将含所述破伤风毒素抗原蛋白基因的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接构建成。所述破伤风毒素抗原蛋白基因的PCR产物可以用含破伤风毒素抗原蛋白基因的破伤风梭状芽胞杆菌株培养裂解物作为扩增模板，通过PCR法进行扩增而得。所述破伤风毒素抗原蛋白基因可以是破伤风毒素分子的C片段部分的基因，其所述克隆质粒可以表示为pGEM-T/ttc。

本发明提供一种转化体，其由本发明提供的由破伤风毒素抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌而得。所述的转化可以按照本领域的常规或已知的方法进行。所述破伤风毒素抗原蛋白基因可以是破伤风毒素分子的C片段部分的基因。

本发明提供一种制备破伤风抗原蛋白的方法，包括用本发明提供的由破伤风毒素抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌，克隆并表达破伤风毒素抗原蛋白基因，获得破伤风毒素抗原蛋白。所述破伤风毒素抗原蛋白基因可以是破伤风毒素分子的C片段部分的基因。所述的构建重组载体、转化大肠杆菌、克隆、表达破伤风毒素抗原蛋白的方法可以按照本领域的常规或已知方法进行。

本发明提供的破伤风抗原蛋白也可以由以下方法制备：培养破伤风梭状芽胞杆菌株，例如：CMCC64008，取培养裂解物作为扩增模板。设计两端带有BamH I和Hind III酶切位点(斜体)的引物。通过PCR法进行扩增。纯化PCR产物。将纯化的含破伤风毒素抗原蛋白基因(例如破伤风毒素分子的C片段基因)的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，构建重组克隆质粒(例如pGEM-T/ttc)。该重组克隆质粒转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，经酶切或PCR鉴定得到阳性克隆。克隆质粒(如pGEM-T/ttc)上目的基因两侧带有限制性内切酶BamH I、Hind III识别位点，将其用这两种酶酶切处理得到目的基因，与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)连接，构建重组表达质粒(如pET-22b(+)/ttc)，转化大肠杆菌的感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定得到阳性克隆。表达目的基因片段，获得重组蛋白破伤风毒素抗原。

本发明可以用常规的纯化方法纯化破伤风毒素抗原；可以用分子筛、离子交换层析的方法和/或金属离子螯合亲和层析的方法及其他常规或已知的方法。

本发明提供一种破伤风疫苗，其含有按照本发明的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白与佐剂。所述佐剂是可用于制备破伤风疫苗的常规或已知的佐剂。本发明的破伤风疫苗可由按照本发明的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白和常规或已知的佐剂，按照常规或已知的方法制备。采用本法研制的疫苗纯度高、质量可控、生产过程中无毒素操作、无毒素逆转现象，分子量小，过敏性低，安全性高，是该类疫苗的新型疫苗，不仅如此，该产品还可用于结合疫苗载体蛋白，由于其明确的成分大大优于现有的类毒素载体。

本发明提供一种结合疫苗，其含有按照本发明的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白作为破伤风抗原蛋白载体。本发明的结合疫苗可由按照本发明的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白作为载体，按照常规或已知的方法制备。

本发明提供一种结合疫苗的蛋白载体，其含有按照本发明的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白。蛋白载体可增强目的蛋白的免疫原性，有效诱导目的蛋白产生保护性反应。破伤风类毒素是一种常用的蛋白载体，例如，多糖抗原属T细胞非依赖性抗原，如脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、b型嗜血流感杆菌(Hib)以及伤寒杆菌等的荚膜多糖疫苗均不能诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答，对婴幼儿免疫效果不佳。为解决这一问题，将上述各种多糖与破伤风类毒素结合，制成结合疫苗，可大大增强多糖疫苗的免疫效果。本发明提供的蛋白载体与破伤风类毒素一样，可增强目的蛋白的免疫原性，有效诱导目的蛋白产生保护性反应，而且分子量小、安全性高、纯度高、质量可控、生产过程中无毒素操作、无毒素逆转现象。

本发明提供一种破伤风疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

用由破伤风毒素抗原蛋白基因与原核表达载体pET-22b(+)构建的重组质粒载体转化大肠杆菌，克隆并表达破伤风毒素抗原蛋白，获得破伤风毒素抗原蛋白。

所述破伤风毒素抗原蛋白基因可以是破伤风毒素分子的C片段部分的基因。所得表达蛋白纯化后与常规或已知的佐剂配制成本发明的破伤风疫苗。

本发明的表达系统对表达破伤风毒素抗原蛋白是高效的。

本发明利用大肠杆菌表达外源基因，表达效率高，操作简单，成本低。外源基因在大肠杆菌中的高效表达，转录和翻译是两个关键因素。外源基因的转录效率是由启动子的强度决定的，启动子是聚合酶的识别序列，是转录的起始信号，不仅决定转录的起始位点，还决定转录的起始频率。翻译是影响外源基因表达的另一个关键因素，目的基因密码子的偏爱性与大肠杆菌的偏爱性越相似，表达水平越高。

本发明采用的是T7噬菌体表达系统，其表达效率高。这一系统有两个必需组分：第一是T7噬菌体基因1的产物-T7噬菌体RNA聚合酶，它可由感染性的λ噬菌体载体提供，也可由已插入大肠杆菌染色体的基因所产生。为此，采用的宿主菌是溶源菌BL21(DE3)，其T7噬菌体基因1受控于IPTG诱导的LacUV5启动子，未诱导时处于低水平转录状态。T7噬菌体RNA聚合酶的特点是只识别大肠杆菌染色体DNA中不存在的T7噬菌体启动子；而且是持续合成酶，可沿环状质粒连续转录数次，能转录大肠杆菌RNA聚合酶不能有效转录的基因，这样可以提高质粒上外源基因的转录效率。第二是含有T7噬菌体启动子的表达载体-pET系列载体，这些载体中，外源基因的表达受T7噬菌体RNA聚合酶调控。本发明采用的是pET-22b(+)，它的启动子是T7lac，带有氨苄青霉素抗性基因，多克隆位点，T7噬菌体转录终止子，可确保外源基因的有效克隆、转录和表达。pET-22b(+)载体的多克隆位点上游带有信号肽基因，可使外源蛋白分泌表达至细菌外周质。而且，表达产物的羧基端可携带一个串联的六个组氨酸组成的特异亲和结构-6×His Tag，此结构几乎没有免疫原性，简化了重组融合蛋白的纯化。总之，T7噬菌体表达系统是对T7RNA聚合酶水平和目的基因的转录实行多层次的调控，以使目的蛋白得到高效表达。

本发明中，将ttc目的片段基因克隆到pET-22b(+)表达载体上，转入大肠杆菌BL21(DE3)中，用IPTG诱导表达，结果是pET-22b(+)/ttc的表达量占菌体总蛋白的15％，其主要以包涵体的形式存在于菌体中。T7噬菌体表达系统是一高效表达系统，与已有技术相比，pET-22b(+)/ttc的表达量较高。目的蛋白TTC的氨基酸残基数目是451个，序列过长容易影响表达量；破伤风毒素基因的密码子偏爱性与大肠杆菌的密码子偏爱性大不一样，这可能降低核苷酸密码子翻译成氨基酸的效率，从而影响蛋白的表达量。已有技术中Halpern将TTC基因克隆进pTTQ8载体，表达量仅为0.5％，Makoff等人将TTC基因中的大肠杆菌稀有密码子替换为大肠杆菌的偏爱密码子，并改进启动子，其表达量为11-13％。本发明采用的是未替换密码子的原始基因序列，表达量为15％，说明本发明的表达系统对表达破伤风毒素抗原蛋白是高效的。

本发明制备的重组抗原蛋白可以包涵体形式存在。包涵体的形成有一定的优点，能有效防止细胞内蛋白酶对目的蛋白的水解作用，使目的蛋白大量聚集，更加稳定。经尿素、盐酸胍等变性剂处理后变为可溶状态，较易纯化，通过透析可除去变性剂。其对不溶性蛋白的分离非常有利。本发明的载体转化大肠杆菌的表达产物用离子交换层析、金属螯合亲和层析的纯化方法，获得纯度为96.5％的表达产物，纯化回收率达45％。

本发明制备的破伤风毒素抗原具有抗原活性。经免疫攻击实验测定本发明制备的破伤风抗原具有免疫活性，可以诱导动物产生抗体，经加强免疫，1μg的本发明制备破伤风抗原即能产生足够的抗体保护动物免受破伤风毒素的攻击，说明本发明制备的破伤风抗原具有较好的免疫原性，与天然的破伤风毒素抗原蛋白具有相同的功能。

本发明的重组载体和转化体既有高效表达破伤风毒素抗原蛋白、易于繁殖、安全等优点。本发明制备的重组抗原蛋白具有纯度高、免疫原性好、安全性好的优点。本发明提供的方法具有简单、高效的优点。

本发明提供的疫苗纯度高、质量可控、生产过程中无毒素操作、无毒素逆转现象，分子量小，过敏性低，安全性高，是该类疫苗的新型疫苗。

本发明制备的破伤风毒素抗原可作为结合疫苗的载体蛋白，与多糖疫苗结合后，可有效诱导保护性反应的产生，且安全性优于目前所用的破伤风类毒素载体。破伤风类毒素是一种常用的蛋白载体，例如，多糖抗原属T细胞非依赖性抗原，如脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、b型嗜血流感杆菌(Hib)以及伤寒杆菌等的荚膜多糖疫苗均不能诱导产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答，对婴幼儿免疫效果不佳。为解决这一问题，将上述各种多糖与破伤风类毒素结合，制成结合疫苗，可大大增强多糖疫苗的免疫效果。本发明提供的蛋白载体与破伤风类毒素一样，可增强目的蛋白的免疫原性，有效诱导目的蛋白产生保护性反应，而且成分明确、分子量小、安全性高、纯度高、质量可控、生产过程中无毒素操作、无毒素逆转现象。因此本发明制备的破伤风毒素抗原蛋白用于结合疫苗载体蛋白将大大优于现有的类毒素载体。

附图说明

图1是PCR产物电泳图，其中带1是标记MarkerλDNA(EcoR I/HindIII)，带2是PCR产物ttc。

图2是pGEM-T Easy载体示意图。

图3是重组克隆质粒构建示意图。

图4是pGEM-T-EASY/ttc酶切鉴定图谱，其中带M是标记MarkerλDNA(EcoR I/Hind III)，带1-10分别是10个不同的克隆(2、3、4、8、10为阳性克隆)。

图5是原核表达载体pET-22b(+)示意图。

图6是重组表达质粒pET-22b(+)/ttc构建示意图。

图7是pET-22b(+)/ttc酶切鉴定图谱，其中带M是标记MarkerλDNA(EcoR I/Hind III)，带1-10分别是10个不同的克隆(除4号以外，其余均为阳性克隆)。

图8是重组质粒在大肠杆菌中的表达和表达产物的存在形式，其中带1是蛋白分子量标准(道尔顿)，带2是含pET-22b(+)空载体的BL21(DE3)菌体对照，带3是pET-22b(+)/ttc重组质粒在BL21(DE3)菌株中的表达，带4是表达后菌体超声裂解上清，带5是表达后菌体超声裂解沉淀。

图9是重组蛋白金属螯合亲和层析图谱。

图10是重组蛋白各纯化步骤后的电泳结果，其中带1是蛋白分子量标准(道尔顿)，带2是含pET-22b(+)空载体的BL21(DE3)菌体对照，带3是pET-22b(+)/ttc重组质粒在BL21(DE3)菌株中的表达，带4是表达后菌体超声裂解上清，带5是表达后菌体超声裂解沉淀，带6是离子交换层析纯化后的重组蛋白，带7是金属螯合亲和层析纯化后的重组蛋白。

图11是重组蛋白纯化后凝胶扫描图谱。

图12是重组蛋白的免疫印迹分析结果，其中带1是蛋白质分子量标准，带2是含pET-22b(+)空载体的BL21(DE3)菌体对照，带3、4是重组蛋白。

图13是用平行线分析法算出效价。

具体实施方式

下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是要对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明内容的技术特征所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

实施例1、破伤风毒素抗原蛋白基因的扩增

(1)扩增模板的制备

选取破伤风梭状芽胞杆菌的产毒株CMCC64008作为扩增菌株。将细菌接种于苞肉培养基，35℃厌氧培养2至3天后，4000rpm离心20分钟，弃上清，菌体沉淀用蒸馏水悬浮，于液氮和室温反复冻融3次，沸水煮5-10分钟，10000rpm离心30分钟，取细菌裂解液上清作为扩增模板。

(2)引物设计

根据GenBank中破伤风毒素基因序列，设计基因两端带有BamH I和Hind III酶切位点(用斜体表示)的引物，见下表1。

表1：引物序列

(3)PCR扩增

反应体系：10μl 10x PCR Buffer(不含Mg2+)，dNTP 0.2mM，Mg2+离子2mM，引物各0.4μM，模板5μl，Taq DNA聚合酶(Promega公司产品)0.5μl，反应体系50μl。反应程序：94℃预变性5min后，开始循环，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环，最后72℃延伸10min，得PCR产物。扩增片段长度是1370bp，扩增浓度和特异性好，结果见图1。

实施例2、PCR产物的克隆和测序

(1)PCR产物的纯化(玻璃奶纯化)

将前述步骤所得PCR产物经1％琼脂糖(Sigma公司产品)凝胶电泳分离后，长波紫外灯照射下切取目的条带，置1.5ml Eppendorf管中。加入3倍体积的溶胶液(100μl体积胶加入300μl溶胶液)，65℃ 5min，其间轻摇Eppendorf管几次，使胶完全溶化。加入10μl玻璃奶(博大公司产品)(玻璃奶使用前充分混匀)，颠倒混匀，冰浴放置10min，每2-3min混匀一次。12000rpm离心30秒，吸弃上清。加入250μl漂洗液，用加样器吹打漂洗液，轻柔的将玻璃奶悬浮混匀，12000rpm离心30秒，吸弃上清。重复前述漂洗步骤。吸取完漂洗液后再离心10秒，用Tip头将最后一点漂洗液吸干净。然后，放置37℃烘箱干燥直至沉淀成白色，约15-20min。加适量洗脱液，混匀，60℃水浴5min，12000rpm离心1min，即得纯化的ttc PCR产物。

(2)PCR产物的克隆

1)PCR产物和克隆载体的连接

将前述步骤所得纯化的ttc PCR产物与如图2所示的pGEM-T Easy载体连接(pGEM-T Easy Vector System为Promega公司产品)，其构建示意图见图3。反应体系：5μl 2x连接缓冲液，1μl pGEM-T Easy载体，3μl PCR纯化产物，1μl T4DNA连接酶(Promega公司产品)。4℃过夜。同时设立不加PCR产物的阴性对照。得重组克隆质粒pGEM-T/ttc。

2)大肠杆菌感受态细胞的制备

从37℃培养16-20小时的大肠杆菌TG1，BL21(DE3)(中国药品生物制品检定所提供)新鲜平板中挑取一个单菌落，接种到含100ml LB培养基的1L烧瓶中。于37℃下剧烈振荡培养至菌液呈“云雾状”。将细菌转移到无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰上放置10min。于4℃下，8000rpm离心5min，弃上清。以10ml用冰预冷的0.1M CaCl2悬浮每份沉淀，冰浴30min。于4℃下，8000rpm离心5min，弃上清，用2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬每份沉淀，放置冰上，以200μl/管分装于1.5ml Eppendorf离心管中，即得大肠杆菌感受态细胞，于-70℃保存备用。

3)重组克隆质粒转化大肠杆菌感受态细胞

从冰箱中取出步骤2)所得大肠杆菌感受态细胞，置冰上，待溶化后加入5μl步骤1)所得的连接产物重组克隆质粒pGEM-T/ttc，轻轻混匀，冰浴30min。42℃水浴60秒后迅速转至冰浴6-7min。加入1ml LB培养基，37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min，弃上清1100μl，悬浮沉淀，将菌液均匀涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养皿上，37℃倒置培养过夜。以相同步骤设立阴性对照。

4)阳性克隆的筛选和鉴定

通过与阴性对照的平皿相比，从培养过夜的平皿上挑取湿润、光滑、边缘整齐的单个菌落，接种到5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，用常规分子克隆碱抽提法小量提取质粒，经酶切或PCR确定阳性克隆。琼脂糖凝胶电泳结果见图4。

(3)核苷酸序列测定和分析

用测序仪ABI PRISM 377-96(ABI产品)对阳性克隆进行测序，将测序结果M478 ttc与GenBank中序列号为AF154828、X04436、X06214的破伤风基因序列用MegAlign软件进行比较分析，发现克隆获得的破伤风毒素C片段基因，长度为1370bp，基因变异性较小，序列测定和分析表明与国内克隆株AF154828相同。与X04436、X06214有11处不同。序列分析结果见表2。

表1-2：序列比较

实施例3、重组表达质粒的构建

实施例2所得重组克隆质粒pGEM-T/ttc上目的基因两侧带有限制性内切酶BamH I、Hind III识别位点，将其用这两种酶酶切处理得到目的基因，与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)(见图5)连接，其构建示意图见图6，转化大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞，提取质粒，经酶切鉴定得到阳性克隆。琼脂糖电泳鉴定，有1.3Kb的片段，与ttc大小相同，见图7。所表达质粒为pET-22b(+)/ttc，读码框架分析见表3。

表3：pET-22b(+)/ttc读码框架分析

实施例4、目的基因片段的表达

(1)重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中的诱导表达

取实施例3所得阳性克隆的液体培养菌液50μl，接种于5ml含氨苄青霉素(100μg/ml)(Sigma公司产品，简称Amp)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1∶50转接于含Amp(100μg/ml)的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡(200rpm)培养至550nm OD值达0.4-0.6。加入异丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropylthio-β-D-galactoside，简称为IPTG，大连宝生物公司产品)至终浓度1mM，37℃诱导表达4-6小时。于4℃下，5000rpm离心5min，收集菌体。

将所得菌体沉淀悬于1x SDS加样缓冲液(50mM Tris-Cl pH6.8(Sigma公司产品)，100mM DTT(Sigma公司产品)，2％SDS(Sigma公司产品)，0.1％溴酚兰，10％甘油)中，按以下方法进行SDS-PAGE电泳分析。

(2)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

配制12％分离胶和5％浓缩胶，灌制凝胶，另配制电泳缓冲液(25mMTris-Cl，250mM甘氨酸，0.1％SDS)。将前面步骤所得菌体沉淀悬于SDS-PAGE加样缓冲液，煮沸5min，12000rpm离心1min后上样，上样体积为20μl/孔。电泳时，样品位于浓缩胶时电压设为80V，样品进入分离胶后电压设为120V，待溴酚兰到达分离胶底部时停止电泳。将凝胶浸泡于考马斯亮蓝R-250染液中染色2-3小时后，用含20％乙醇和10％冰醋酸的脱色液脱色直至背景无色后观察。结果见图8。目的蛋白pET-22b(+)/ttc的表达量占菌体总蛋白的15％。

(3)重组蛋白表达水平及表达形式鉴定

第(1)步所得菌体沉淀按上述步骤进行染色、脱色后，在凝胶成像系统上进行扫描，用ImageMaster TotalLab软件(瑞士Amersham pharmaciabiotech ImageMaster VDS)分析测定蛋白表达水平。

按第(1)步骤诱导表达重组蛋白100ml后，4℃，5000rpm离心5min收集菌体，用pH7.4的TE(25mM Tris，1mM EDTA)重悬、洗涤菌体3次，最后溶于5mlTE+0.5％Triton X-100(？)中，冰浴中超声(30％Amp，9secON，1sec OFF，10min)破碎菌体。4℃，12000rpm，离心30min，分别对沉淀和上清取样进行SDS-PAGE电泳分析。结果见图8，重组蛋白大部分存在于沉淀中，上清中较少，说明重组蛋白主要以包涵体的形式存在于菌体中。

实施例5、重组蛋白-破伤风毒素抗原的纯化

(1)包涵体的初步提纯和裂解

按照实施例4第(1)步方法诱导表达重组蛋白，经IPTG诱导4-6小时，4℃，5000rpm离心15min收集菌体。取5g菌体用TE溶液洗涤3次，以20ml的TE+0.5％Triton X-100溶液重新悬浮，冰浴超声破碎菌体，4℃，12000rpm，离心30min，弃上清，沉淀用TE+0.5％Triton X-100溶液洗涤3次，最后将沉淀悬于20ml裂解缓冲液(pH7.8，8M尿素，25mM Tris，1mMEDTA)中，室温放置2小时，4℃，12000rpm，离心30min，取上清进行下一步纯化。

(2)融合蛋白的分离纯化

(2-1)离子交换层析法

将前述第(1)步所得上清蛋白置透析袋中，用A液(pH8.5，8M尿素，25mM Tris，1mM EDTA)透析过夜。

取100ml Phamacia公司的DEAE Sepharose Fast Flow介质装柱，用5倍柱床体积的双蒸水洗涤介质，洗去乙醇。用5倍柱床体积的A液(pH8.5，8M尿素，25mM Tris，1mM EDTA)平衡介质至紫外监测器的数值达到基线水平，流速为5ml/min。

将透析好的样品用0.45μm孔径滤膜过滤除去粗悬浮物，往前一步骤所得柱子A2口进样，流速为1ml/min。用2倍柱床体积的A液洗柱，除去未吸附于介质上的物质，流速为5ml/min。分步梯度洗脱：用7％B液(pH8.5，8M尿素，25mM Tris，1mM EDTA，1M NaCl)+93％A液洗柱，用20％B液+80％A液洗柱，用100％B液洗柱。每个浓度的洗脱液各洗3倍柱床体积，流速为5ml/min。紫外监测(波长为280nm，260nm)自动收集出峰时的流出液。收集流出液，即得经纯化重组蛋白溶液A。分别取少量各步流出液进行SDS-PAGE分析。纯化的重组蛋白的纯度为68.6％。

(2-2)金属螯合亲和层析法

将前一步骤收集到的离子交换柱流出液，在上样缓冲液(20mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，25mM咪唑，pH7.8)中透析。

取5ml Phamacia公司的Chelating SepharoseTM Fast Flow介质装柱。洗涤：用5倍柱床体积的双蒸水洗涤介质，洗去乙醇，流速为1ml/min。用1倍柱体积0.1M NiSO4洗柱，使Ni2+与介质结合。用5倍柱床体积的双蒸水洗涤介质，洗去多余的未与介质结合的金属离子，流速为1ml/min。用5倍柱床体积的上样缓冲液平衡介质，流速为1ml/min。

透析后的样品，经0.45μm孔径滤膜过滤除去粗悬浮物后上样，流速为0.5ml/min，收集流出液。用7倍柱床体积的上样缓冲液平衡介质，洗去未吸附的样品和杂蛋白，流速为1ml/min，收集流出液。用5倍柱床体积的洗脱缓冲液(20mM PB，0.5M NaCl，8M尿素，300mM咪唑，pH7.8)洗柱，流速为1ml/min。自动收集流出液。收集流出液，即得纯化的重组蛋白溶液。分别取少量各步流出液进行SDS-PAGE分析。结果表明通过亲和层析，重组蛋白的纯度达到96.5％，达到纯化要求。见图9、10、11。

(3)重组蛋白经纯化后回收率的测定

对100ml含本发明重组质粒的菌液进行诱导表达，离心破碎处理后以及蛋白纯化后，分别测定吸光度。测出总蛋白含量是126.9mg，纯化后的本发明的破伤风毒素抗原蛋白含量是8.87mg，计算得到该蛋白的纯化回收率是45％。

计算蛋白含量，公式为：蛋白量(mg/ml)＝1.45×OD280 0.74×OD260。

计算回收率，公式为：(纯化后蛋白量×纯度)/(总蛋白含量×目的蛋白表达量)。

(4)蛋白质复性

将第(2-2)步所得纯化的本发明的破伤风毒素抗原蛋白溶液进行梯度透析除去尿素，使其缓慢复性：将蛋白变性液分别对含4M、2M、1M、0.5M、0.1M尿素的生理盐水透析液在4℃的条件下透析6小时，其间换液2次。此过程中若出现蛋白沉淀，则停止透析，蛋白溶液离心后将沉淀再用尿素溶解、透析。透析复性共72小时。即得本发明制备的破伤风毒素抗原。

(5)纯化产物蛋白浓度的测定

按照Lowry法用标准蛋白质溶液绘制标准曲线。测得第(2)步骤所得纯化蛋白在波长为650nm处的吸光度值，由标准工作曲线计算待测样品的蛋白浓度为52.608μg/ml，原液浓度为526.08μg/ml。

实施例6、重组蛋白活性检测-Western Blot检测

a)将实施例5第(4)步所得本发明的破伤风毒素抗原蛋白进行SDS-PAGE电泳。

b)电转移：将相同大小的凝胶、6张滤纸及1张硝酸纤维素滤膜在转移缓冲液(5.82g Tris，2.93g Glycine，0.375g SDS，200ml甲醇，定容至1000ml)中浸泡15-20min，按照Bio-Rad半干胶电转移使用说明将上一步骤所得蛋白转至硝酸纤维素膜上，15V，45-60min完成电转。

c)将滤膜放入塑料袋中，加入封闭液(pH7.4，0.01M PBS，0.05％Tween-20，10％脱脂奶粉)，置摇床平台，室温封闭2小时。

d)弃去封闭液，加用封闭液稀释的马抗破伤风毒素血清(中国药品生物制品检定所制)(1∶100)，置摇床平台，室温温育2小时或过夜。

e)100mlPBST(0.01M PBS，pH7.4，0.05％Tween-20)洗膜5次，每次15min。

f)加入用封闭液以1∶1000稀释的辣根过氧化物酶标记的市售兔抗马IgG抗体，室温温育2小时。

g)100mlPBST洗膜5次，每次15min。

h)加底物反应液(9ml 0.01M Tris-Cl溶解6mg二氨基联苯胺)显色，10min内用蒸馏水冲洗终止显色。

i)用滤纸吸干膜上残余液体，拍摄照片。结果可见图12，重组蛋白与马抗破伤风抗体有特异性印迹反应，在55Kd处有显色条带，空载体对照无明显显色带，说明本发明载体表达的蛋白具有一定的抗原活性。

实施例7、制备破伤风疫苗

取实施例5第(4)步所得本发明的破伤风毒素抗原稀释至所需浓度(400μg/ml)，与2mg/ml的Al(OH)3等体积混合，冰浴下磁力搅拌过夜。制备铝吸附的破伤风疫苗。

实施例8、纯化重组蛋白的免疫活性分析

(1)免疫攻击实验

按照《中国生物制品规程2000年版》操作。取实施例5第(4)步所得本发明的破伤风毒素抗原稀释至所需浓度(400μg/ml)，与2mg/ml的Al(OH)3等体积混合，冰浴下磁力搅拌过夜。取1支冻干吸附破伤风毒素(国家标准品，效价588IU/安瓿，类毒素含量85Lf/安瓿，纯度1010Lf/mgPN)，用10ml生理盐水定容，单位为58.8IU/ml。用生理氯化钠溶液将吸附破伤风类毒素以2倍稀释法稀释成3-5个稀释度；将吸附好的待检样品以10倍稀释法稀释为200、20、2μg/ml。每一稀释度的样品免疫体重14-16g的NIH小鼠10只(雌雄各半)，每只小鼠皮下注射0.5ml。另外10只小鼠不注射作为对照。免疫4周，每只免疫小鼠攻击破伤风毒素50LD50，皮下注射0.5ml。对照组健康小鼠注射1LD50破伤风毒素，每只皮下注射0.5ml，攻击后观察5日，每日记录结果。用平行线分析法进行结果计算。实验结果见下表及图13。用平行线分析法算出样品效价为18.706IU/mg，ED50为20μg。

表4：免疫攻击实验

注：标准品单位：58.8IU/ml

表5：破伤风毒素标准品与本发明抗原的直线性、平行性及效价

与前述步骤同时进行多次免疫实验，将吸附好的待检样品以10倍稀释法稀释为200μg/ml、20μg/ml、2μg/ml。每一稀释度的样品免疫体重14-16g的NIH小鼠10只(雌雄各半)，每只小鼠皮下注射0.5ml，每周1次，共免疫4周，其余步骤同前述步骤。结果三个剂量的所有动物均未死亡，说明表达产物TTC能使动物产生中和抗体，经加强免疫，1μg的本发明制备出的破伤风毒素抗原能产生足够的抗体保护动物免受破伤风毒素的攻击。

(2)免疫动物的血清中破伤风抗体的测定：间接血凝实验

对前述第(1)部分中免疫小鼠和对照组健康小鼠在攻毒之前进行眼内眦采血，分离出血清，混和。打开破伤风诊断血球(中国药品生物制品检定所制)和对照血球安瓿各加入5ml 1％兔血清生理盐水，摇匀后即可使用。于微量血凝板中，每孔加入1％兔血清生理盐水25μl，第一孔加入待检血清25μl，作倍比稀释至所需稀释度，再向每孔中加入诊断血球悬液25μl，振荡1-2min，放室温或37℃约1小时观察结果。每份待检血清按上述方法作4-6个稀释度加入对照血球以观察待检血清是否有自然凝集作用。每次试验，同时作1份标准抗毒素，用于计算效价。试验需设对照：1％兔血清生理盐水+诊断血球；1％兔血清生理盐水+对照血球。计算出待测血清抗体单位。待检血清抗体单位(HAU/ml)＝标准抗毒素终点稀释度所含单位×待检血清终点稀释度倍数。结果见下表。

表6：血清抗体测定情况

注：标准抗毒素抗体单位是1IU/ml，终点稀释度倍数是512。

当用本发明的破伤风毒素抗原免疫的小鼠的血清抗体滴度＞1∶4(0.01HAU/ml)时，小鼠在毒素攻击后一般可免于死亡，当血清抗体滴度＞1∶128(0.5HAU/ml)时，小鼠经攻毒后一般不表现出任何中毒症状，当血清抗体滴度处于二者之间时，小鼠一般表现有破伤风中毒症状，但大部分可以存活。上表血清抗体的测定结果与毒素攻击后结果一致。

Claims (8)

1.一种重组质粒载体，由破伤风毒素抗原蛋白的基因与表达载体pET-22b(+)连接构建成，其特征在于破伤风毒素抗原蛋白的基因是来自保藏号为CMCC 64008的破伤风梭状芽胞杆菌株的破伤风毒素C片段基因。

2.一种转化体，其由如权利要求1所述的重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE)而得。

3.一种制备破伤风抗原蛋白的方法，包括用如权利要求1所述的重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE)，克隆并表达，获得破伤风毒素抗原蛋白。

4.一种制备破伤风抗原蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)培养保藏号为CMCC 64008的破伤风梭状芽胞杆菌株，取培养裂解物作为扩增模板；设计两端带有BamH I和Hind III酶切位点的引物；通过PCR法进行扩增；纯化PCR产物；

(2)将第(1)步所得纯化的PCR产物与pGEM-T Easy载体连接，构建重组克隆质粒；所述克隆质粒转化大肠杆菌BL21(DE)感受态细胞，得到阳性克隆；

(3)将内切酶BamH I、Hind III酶切处理在目的基因两侧带有限制性内切酶BamH I、Hind III识别位点的所述克隆质粒得到目的基因，与经相同酶切处理的表达载体pET-22b(+)连接，构建重组表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE)的感受态细胞，得到阳性克隆；表达、获得重组蛋白破伤风毒素抗原。

5.一种破伤风疫苗，其含有按照权利要求3的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白。

6.一种结合疫苗，其含有按照权利要求3的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白作为破伤风抗原蛋白载体。

7.一种结合疫苗的蛋白载体，其含有按照权利要求3的方法制备的破伤风毒素抗原蛋白。

8.一种破伤风疫苗的制备方法，其包括以下步骤：

用如权利要求1所述的重组质粒载体转化大肠杆菌BL21(DE)，克隆并表达破伤风毒素抗原蛋白，获得破伤风毒素抗原蛋白。

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