CN104342423B - 高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用 - Google Patents

高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用。本发明的方法包括表达人糜蛋白酶包涵体，之后对其进行变性和复性处理、纯化，复性过程中调节特定的PH值、温度、稀释比例、添加剂成分，有效地提高了可溶性蛋白的得率，所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性，阳离子交换色谱相对于阴离子交换色谱更适合于重组人糜蛋白酶的纯化，获得高纯度、高活性的重组人糜蛋白酶。重组人糜蛋白酶与糜蛋白酶应用与大鼠烫伤模型具有同样的效果。

Description

高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物工程领域；更具体地，本发明涉及高活性重组人糜蛋白酶制备方法和应用。
背景技术
糜蛋白酶(Chymotrypsin，CT)，又称胰凝乳蛋白酶，在胰脏中以糜蛋白酶原的形态生物合成，随着胰液分泌出去。在小肠中，糜蛋白酶原受到胰蛋白酶和糜蛋白酶的作用，转变成具有活性的α-糜蛋白酶，是丝氨酸肽链内切酶。糜蛋白酶催化中心内的专一性袋穴较宽，主要作用于芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)等氨基酸形成的肽键。
糜蛋白酶的应用主要集中在医疗方面：糜蛋白酶可以分解炎症部位纤维蛋白的凝结物，促进血凝块、脓性分泌物及坏死组织的溶化分解，从而净化创面，使肉芽组织新生，促进伤口愈合。在国外，该药在眼科、皮肤科做临床局部应用己被肯定。国内临床上主要用于眼科手术，也可用于创口或局部炎症，以减少局部分泌和水肿。近年来随着临床药理学研究的不断发展，其临床应用范围也日渐广泛。
传统的糜蛋白酶制备方法是先将动物胰脏进行酸提取，提取液进行分段盐析，除去含杂蛋白的上清液，盐析得到的沉淀即为糜蛋白酶原粗品；将粗品糜蛋白酶原再次分段盐析纯化后用胰蛋白酶激活，酶的活化液用硫酸铵低温结晶后透析、冻干后既得。该生产工艺生产时间长，收率低，并且耗费大量的试剂，增加了环境净化的成本。同时由于是从牛、猪胰脏中提取，对动物的健康要求较高，并且有潜在的病毒污染风险。
无动物源性、无血浆的生物药物是目前生物药物的国际研发前沿。从1982年第一个上市的生物药物——重组人胰岛素替代其他从动物胰腺提取的胰岛素的全面成功，到2008美国FDA批准的第一个无血浆制品--重组凝血酶的上市和销售的成功，研发无动物源性的重组人糜蛋白酶替代其他从动物胰腺提取的糜蛋白酶符合这一生物药物的发展趋势，本领域有必要开发重组人糜蛋白酶制备新工艺。
发明内容
本发明的目的在于提供高活性重组人糜蛋白酶制备工艺和应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，所述方法包括：
(1)将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清；
(2)应用复性液进行复性，所述复性液包括100±10mM Tris-HCl；复性时，调节pH8.0±0.2、温度2～20℃(较佳地3～18℃；更佳地4-10℃)、复性液:变性液的体积比大于8(较佳地等于9)，经激活获得可溶的高活性人糜蛋白酶。
在一个优选例中，所述的复性液中，还添加按照体积0.1-0.8%甘油；较佳地添加按照体积0.4-0.6%甘油；和/或
所述的复性液中，还添加1-10mM GSH；更佳地添加2-6mM GSH；和/或
所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。
在另一优选例中，所述的包涵体如下表达：
(a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；
(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。
在另一优选例中，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。
在另一优选例中，所述方法还包括：对获得的人糜蛋白酶的包涵体进行洗涤。
在另一优选例中，所述的变性包括：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性0.5-6小时；所述变性液包含：4-10M尿素，0.1-100mMβ-巯基乙醇。
在另一优选例中，步骤(2)之后，还包括：DEAE-FF Sepharose阴离子交换柱或CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化；较佳地，应用CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。
在另一优选例中，所述的方法还包括：对纯化产物进行冻干。
在另一优选例中，所述的方法依次包括：将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，发酵培养该大肠杆菌→离心收集细胞→细胞破碎→离心收集包涵体→包涵体洗涤→包涵体溶解变性→复性→微滤除菌澄清→超滤浓缩→透析→离子柱纯化→浓缩→透析→除菌过滤→冻干。
在另一优选例中，所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合2010版药典对于生物制品的要求。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法获得的重组人糜蛋白酶或其冻干粉在制备治疗皮肤创伤中的用途；较佳地，所述的重组人糜蛋白酶或其冻干粉与天然人糜蛋白酶具有相同的效果。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、应用大肠杆菌重组表达人糜蛋白酶，各阶段样品的电泳结果。Line1：诱导前全菌，Line2：诱导后全菌，Line3：诱导后破菌产物离心上清，Line4：诱导后破菌产物离心沉淀。
图2、复性pH优化试验。将1mL变性液分别缓慢加入到10mL复性液(100mM Tris-HCl，pH8.0、8.5、9.0、9.5)中。25℃复性24h后激活2h，测定酶活性。
图3、复性温度优化试验。将1mL变性液分别缓慢加入到温度为4、18、25、37℃，10mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
图4、稀释倍数条件优化试验。将1mL变性液分别缓慢加入6、7、8、9mL复性液(100mMTris-HCl pH8.0)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
图5、添加剂的优化。将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HClpH8.0)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.1%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HClpH8.0、0.01%(v/v)Triton X-100)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
图6、将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.25%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.5%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.75%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、1%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、1.25%(v/v)甘油)中。复性24h后激活12h，测定酶活性。
图7、谷胱甘肽(GSH)对糜蛋白酶复性的影响。将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、1mM GSH)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、2mM GSH)、复性液(100mMTris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、3mM GSH)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、4mM GSH)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、5mM GSH)中。复性24h后激活12h
图8、激活剂浓度选择。将1mL变性液缓慢加入到三组9mL复性液(100mM Tris-HClpH8.0，0.5%甘油、2mM GSH)中。复性24h后分别向每组复性液中加入30、60、90u/mL激活剂激活12h，测定酶活性。
图9、DEAE-FF Sepharose柱纯化电泳图。泳道1-12：洗脱液1-12；泳道13：上样液；泳道14：marker。
图10、CM-FF柱纯化rhCT SDS-PAGE电泳图。泳道M：Marker；Lane1：流出1；Lane2：流出2；Lane3：流出3；Lane4：100mM NaCl溶液；Lane5：200mM NaCl溶液①；Lane6：200mM NaCl溶液②；Lane7：300mM NaCl溶液。
图11、CM-FF纯化后合并液纯化产物冻干后成品的SDS-PAGE结果。泳道1：Marker；泳道2：冻干样品。
图12、标准曲线。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，提供了一种应用生物工程重组技术生产高活性重组人糜蛋白酶的优化工艺，所述工艺包括表达人糜蛋白酶包涵体，之后对其进行变性和复性处理，复性过程中调节特定的PH值、温度、稀释比例、添加剂成分，有效地提高了可溶性蛋白的得率、纯度，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。
工艺流程
本发明中，糜蛋白酶的总体生产工艺流程如下：发酵---离心收集细胞---细胞破碎---离心收集包涵体---包涵体洗涤---包涵体溶解变性---复性--微滤除菌澄清---超滤浓缩---透析---离子柱纯化---浓缩---透析---除菌过滤---冻干。在该工艺流程中，本发明人对部分流程进行了优化。
蛋白的表达
本发明人尝试了采用多种表达系统(如酵母系统，大肠杆菌系统)来表达人糜蛋白酶，结果发现大肠杆菌系统较适于表达人糜蛋白酶，获得包涵体形式的蛋白。
研究表明包涵体形成的主要原因是蛋白质表达速度过快，以致蛋白质没有足够的时间进行正确的折叠；另外由于大肠杆菌的胞质环境是一个还原性的环境，导致蛋白质中的二硫键无法正确配对，这也是导致包涵体形成的一个重要原因[Misawa S,KumagaiI.Refolding of therapeutic proteins produced in Escherichia coli as inclusionbodies.Biopolymers.1999;51(4):297-307]。在研究之初，本发明人曾试图通过低浓度IPTG诱导或低温等方式促进蛋白的可溶表达，但是表达结果显示这些方法对提高人糜蛋白酶的可溶表达并无明显效果。也即，只能采取包涵体表达，后续进行变复性获得可溶性蛋白这一途径。
因此，作为本发明的优选方式，所述的包涵体如下表达：(a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有编码目的蛋白的DNA序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。
培养基因工程菌并使之表达目的蛋白的方法和条件是本领域人员已知的，例如可采用IPTG或者高温诱导表达。较佳地，采用IPTG诱导表达。
在基因工程菌表达了包涵体蛋白后，通常需要进行破菌(即：破碎大肠杆菌细胞)，从而释放出包涵体蛋白。破菌的方法没有特别的限制，例如超声破菌或高压均浆破菌。
破碎细胞后，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。分离沉淀通常采取离心的方法。
在获得含有包涵体的沉淀后，优选地还包括洗涤的步骤，这样可以去除与包涵体混合在一起的脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质，有利于后续变复性的进行。
作为本发明的优选方式，所述的洗涤包括步骤：先应用Triton X-100洗涤1-2次，再通过1-3次纯水洗涤。
蛋白的变性
包涵体的变性可以采用多种蛋白变性试剂，例如尿素和盐酸胍，其都可以实现将包涵体溶解的目的。对于人糜蛋白酶而言，较佳地应用尿素以及β-巯基乙醇。更佳的变性方法为：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性0.5-6小时；所述变性液包含：4-10M尿素，0.1-100mMβ-巯基乙醇。
蛋白的复性
本发明人在摸索人糜蛋白酶的包涵体的复性条件时，考虑了很多条件，最终确定pH对人糜蛋白酶的复性影响最大，具体体现为在弱碱性(pH8或9.5左右之间)条件下人糜蛋白酶的复性活性较好。同时，温度对于复性也有影响，较佳的温度是2～20℃；更佳地3～18℃；最佳地4-10℃。同时，复性液:变性液的体积比也有影响，较佳的体积比大于8，更佳地等于9。
作为本发明的优选方式，所述的复性液中，还添加按照体积0.1-0.8%甘油；较佳地添加按照体积0.4-0.6%甘油。更佳地，所述的复性液中，还添加1-10mMGSH；更佳地添加2-6mM GSH。更佳地，所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶。
对蛋白进行复性的时候，在选用上述试剂的情况下，可以通过多种途径进行复性，例如但不限于：稀释复性、透析复性、层析复性等。优选的是稀释复性。
复性实验结果表明，在上述优化条件下，获得的人糜蛋白酶的酶活性超过4.5U/ml。
蛋白的纯化
在经过蛋白复性后，还可对复性后的蛋白进行纯化。蛋白纯化可采用本领域常用于蛋白纯化的方法，例如超滤、透析、离子交换层析、分子筛层析等。
作为本发明的优选方式，应用DEAE-FF Sepharose阴离子交换柱或CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的进行纯化。
作为本发明的优选方式，还包括：对纯化产物进行冻干。
本发明的优化工艺通过优化蛋白复性时的PH值、温度、稀释比例以及添加剂，有效地提高了可溶性蛋白的得率、纯度，以及提高了人糜蛋白酶的活性。所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。
并且，本发明所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合2010版药典对于生物制品的要求。
动物试验表明，本发明所述的方法获得的重组人糜蛋白酶或其冻干粉对于治疗皮肤创伤具有良好的药效；与天然人糜蛋白酶具有相同的效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、载体构建及表达鉴定
根据人源糜蛋白酶氨基酸序列SEQ ID NO:1，人工合成基因序列(Gene CT)。GeneCT整合至表达载体pET24a(购自Invitrogen)的NdeI/EcoRI位点中，将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，获得转化子。挑取转化平板上的单克隆菌落，接种至30ml LB培养液中(含100μg/ml Kana)，置于37℃摇床过夜培养(10-12h)后，以2%接种量转入二级瓶中，继续培养。菌密度至OD6000.5-0.6时，加入终浓度为0.5mmo/L IPTG诱导4h，10000rpm离心收集菌体，弃上清，菌体超声破碎，离心后获得上清和沉淀，沉淀即为包涵体，对上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳鉴定。
人糜蛋白酶氨基酸序列(SEQ ID NO:1)：
CGVPAIHPVLSGLSRIVNGEDAVPGSWPWQVSLQDKTGFHFCGGSLISEDWVVTAAHCGVRTSDVVVAGEFDQGSDEENIQVLKIAKVFKNPKFSILTVNNDITLLKLATPARFSQTVSAVCLPSADDDFPAGTLCATTGWGKTKYNANKTPDKLQQAALPLLSNAECKKSWGRRITDVMICAGASGVSSCMGDSGGPLVCQKDGAWTLVGIVSWGSDTCSTSSPGVYARVTKLIPWVQKILAAN
表达产物的电泳结果见图1。从图1中可以看出，在29kDa处有明显表达，并且表达产物为包涵体蛋白。
实施例2、包涵体复性条件优化
细胞破碎收集的包涵体通过一次Triton X-100洗涤，再通过两次纯水洗涤后可进行变性。
包涵体变性条件为：称取25mg湿包涵体，溶解于变性液中8M尿素，10mMβ-巯基乙醇，变性2小时。
复性方法选择稀释复性。
糜蛋白酶活力测定方法：在pH7.8，25℃条件下，每分钟水解1.0μmol N-苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)定义为1个酶活力单位(U)。
2.1复性pH优化
各将1mL变性液分别缓慢加入到10mL复性液(100mM Tris-HCl，pH8.0、8.5、9.0、9.5)中。25℃复性24h后加入重组胰蛋白酶激活12h，酶活性测定结果见图2。
实验结果证明，糜蛋白酶包涵体可以复性。并且从图中可以看出pH8.0实验组复性后酶活性较高，优选复性液pH为8.0。
2.2复性温度优化
各将1mL变性液分别缓慢加入到温度为4、18、25、37℃，10mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)中。复性24h后激活12h，结果见图3。
从图3中可以看出酶活性随着温度的升高而降低，最适复性温度为4℃。
2.3稀释倍数条件优化
各将1mL变性液分别缓慢加入6(稀释7倍)、7(稀释8倍)、8(稀释9倍)、9(稀释10倍)mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)中。复性24h后激活12h，结果见图4。
从图4中可以看出，随着稀释倍数的增加，酶活性呈升高趋势，优选稀释10倍为最佳稀释倍数。
2.4添加剂的优化
各将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.1%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.01%(v/v)Triton X-100)中。复性24h后激活12h，结果见图5。
各将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.25%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.5%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、0.75%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、1%(v/v)甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0、1.25%(v/v)甘油)中。复性24h后激活12h，结果见图6。
从图5中可以看出0.1%的甘油组酶活性较高，有利于蛋白复性；从图6中可以看出0.5%的甘油最利于蛋白复性，随着甘油浓度的升高，酶活性降低。综合考虑，优选复性液中的甘油浓度为0.5%(V/V)左右。
2.5谷胱甘肽(GSH)对糜蛋白酶复性的影响
各将1mL变性液分别缓慢加入到9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%甘油)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、1mM GSH)、复性液(100mM Tris-HClpH8.0，0.5%(v/v)甘油、2mM GSH)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、3mMGSH)、复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%(v/v)甘油、4mM GSH)、复性液(100mM Tris-HClpH8.0，0.5%(v/v)甘油、5mM GSH)中。复性24h后激活12h，结果见图7。
从图7中可以看出GSH有利于糜蛋白酶的复性，当GSH浓度大于2mM时，酶活性相差不大，优选的GSH浓度为2mM。
2.6激活剂浓度选择
各将1mL变性液缓慢加入到三组9mL复性液(100mM Tris-HCl pH8.0，0.5%甘油、2mM GSH)中。复性24h后分别向每组复性液中加入30、60、90u/mL激活剂(重组胰蛋白酶)激活12h，结果见图8。
从图8中可以看出激活剂浓度的多少与复性液中最终酶活性的多少无关，激活剂浓度越大，激活速率越快。
实施例3、复性液处理
将10000mL的复性液用0.22μm滤膜过滤，滤液用10kDa的超滤膜浓缩10-100倍。
浓缩液对纯水透析(温度控制在0-10℃)3天，每12h换水一次。
实施例4、重组人糜蛋白酶的纯化
1、DEAE-FF Sepharose阴离子交换柱纯化
柱体积：约200ml；
上样液：共500ml，加入终浓度为0.01mol/L PH8.0Tris-HCl缓冲液；
洗脱液：0mM NaCl，300mM NaCl各600ml，0.01mol/L PH8.0Tris-HCl缓冲液配制，梯度洗脱。
洗脱后分管收集，每管200ml。将样品进行SDS-PAGE分析。
以上样缓冲液为空白对照，对每管洗脱液进行OD280nm的测定：由电泳鉴定图(图9)可以看出，大部分酶在前四管洗脱下来，收集合并管2-4，得到了纯化后的重组人糜蛋白酶。
DEAE-Sepharose柱纯化前后的蛋白性状比较如表1。
表1
由洗脱结果可以看出，洗脱后的蛋白较为纯净，在低盐浓度下，重组人糜蛋白酶很快洗脱下来。洗脱效果较好，得到了浓度较高、纯度较好的重组人糜蛋白酶洗脱液。
2、CM-FF阳离子交换层析
使用2×15cm层析柱，装适量的CM-FF阳离子交换树脂，通过确定的最适pH吸附条件，配制50mM NaAC-HAC缓冲液进行平衡，平衡至基线平稳，上柱，将透析后的复性液缓慢加入到层析柱中，上样结束后，用50mM NaAC-HAC缓冲液进行平衡，之后用含不同浓度NaCl的50mM NaAC-HAC缓冲液进行分步洗脱。洗脱后，测定活性，并进行电泳鉴定。
CM-FF阳离子交换层析纯化前后的蛋白性状比较如表2。
表2
由图10可以看出，200mM NaCl溶液完全可以洗脱下重组人糜蛋白酶(rhCT)，并且说明复性液中目的蛋白较纯，无其他浓度高的杂蛋白。
实施例5、冻干及冻干品活性
将CM-FF纯化后的重组人糜蛋白酶对纯化水透析，透析液用0.22μm的滤膜过滤，滤液冻干，冻干成品为白色结晶性粉末，效价为90u/mg(BTEE，换算为中国药典效价单位为2600u/mg)，成品SDS-PAGE结果见图11。
实施例6、重组人糜蛋白酶的生产工艺
因此，由实施例2-实施例5建立重组人糜蛋白酶的生产工艺如下：
发酵--离心收集细胞----细胞破碎---离心收集包涵体---包涵体洗涤---包涵体溶解变性---复性--微滤除菌澄清---超滤浓缩---透析---离子柱纯化---浓缩---透析--除菌过滤---冻干。
实施例7、冻干品质量检测
1、rhCT内毒素检测
检测依据：中国药典三部，2010版附录XII E细菌内毒素检查法。
方法：本法系利用鲎试剂来检测有革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定。采用凝胶法。
试剂盒：供应商：厦门市鲎试剂实验厂有限公司。
试剂货号：G170250凝胶法鲎试剂。
检测灵敏度为0.25EU/ml。
供试品溶液配制：取冻干品约10mg，用无热源水配制并稀释为终浓度为0.1mg/ml，按照试剂盒说明书方法进行测定，并判断结果。
检测结论：供试品中内毒素含量：小于3EU/mg。
2、rhCT大肠杆菌蛋白质残留量的检测
检测依据：中国药典三部，2010版附录IX C大肠杆菌蛋白质残留量测定法(附录62页)。
方法：本法系利用酶联免疫法来测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中菌体蛋白质残留量。
工作原理：采用双位点夹心酶联免疫吸附法(ELISA)，测定样品中大肠杆菌宿主残留蛋白(E.coli P)的水平。向预先包被大肠杆菌宿主残留蛋白(E.coli P)抗体的酶标孔中加入标准品、待测样本和HRP标记的杆菌宿主残留蛋白(E.coliP)抗体，经过温浴和洗涤，去除未结合部分，然后再加入底物A，B，产生蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅与样品中大肠杆菌宿主残留蛋白(E.coli P)的浓度成正相关。
标准品的稀释液依次稀释为：30，15，7.25，3.62，1.81，0ng/ml。
样品：rhCT冻干粉用纯化水溶解，蛋白浓度为3.75mg/ml。
在450nm波长下测量样品和标准品的吸光度值，根据标准品浓度计算出标准曲线的回归方程，算出样品浓度和占菌体蛋白含量的百分比，如表3。
表3、标准品和rhCT样品在450nm波长下的吸收值
依据表和图(图12)的标准曲线，计算出rhCT中菌体蛋白含量为2.46ng/ml。然后依据菌体蛋白残留量计算公式，算出其百分含量。最后计算出菌体蛋白占样品总含量的0.0329%，小于0.05%，符合生物制品的要求。
实施例6、应用大鼠烫伤模型对重组人糜蛋白酶的作用进行评价
动物模型
健康SD大鼠，体重350～450g。常规麻醉、脱毛后，用加热融化至150℃的石蜡液0.5ml滴至脱毛部位，在大鼠背部造成Ⅲ度烫伤。
实验分组
实验动物分为4组，每组12只。分别为模型组、生理盐水组、糜蛋白酶组、重组人糜蛋白酶组。糜蛋白冻干粉，重组人糜蛋白酶冻干粉于用药前用生理盐水溶解，均匀涂患处，每日2次，连续14天，观察各组不同时间创面愈合情况及病理组织学检查。
结果
糜蛋白酶组和重组人糜蛋白酶组大鼠各时间点烧伤创面面积均明显小于模型组(P<0.05或P<0.01)。
因此，重组人糜蛋白酶促进大鼠皮肤烫伤创面愈合作用显著，作用与糜蛋白酶无差异，可替代糜蛋白酶应用于烫伤促进创面愈合。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (11)

1.一种制备高活性人糜蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括步骤如下：
(1)将人糜蛋白酶的包涵体进行变性，分离含有经变性的人糜蛋白酶的上清；
(2)应用复性液进行复性，所述复性液包括100±10mM Tris-HCl；复性时，调节pH8.0±0.2、温度2～20℃、复性液:变性液的体积比大于8，经激活获得可溶的高活性人糜蛋白酶；所述的复性液中，还添加激活剂重组胰蛋白酶、按照体积0.1-0.8％甘油以及1-10mM GSH。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复性液中，添加2-6mM GSH。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的复性液中，添加按照体积0.4-0.6％甘油。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的包涵体如下表达：
(a)将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，培养该大肠杆菌；
(b)用IPTG诱导大肠杆菌，使之表达人糜蛋白酶的包涵体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括：破碎大肠杆菌细胞，分离获取沉淀，其中含有人糜蛋白酶的包涵体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的变性包括：将人糜蛋白酶的包涵体溶解于变性液中变性0.5-6小时；所述变性液包含4-10M尿素以及0.1-100mMβ-巯基乙醇。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)之后，还包括DEAE-FFSepharose阴离子交换柱或CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，应用CM-FF阳离子交换层析柱进行人糜蛋白酶的纯化。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：对纯化产物进行冻干。
10.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，该方法依次包括：将含有人糜蛋白酶编码基因的表达载体转化大肠杆菌，发酵培养该大肠杆菌→离心收集细胞→细胞破碎→离心收集包涵体→包涵体洗涤→包涵体溶解变性→复性→微滤除菌澄清→超滤浓缩→透析→离子柱纯化→浓缩→透析→除菌过滤→冻干。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法生产的重组人糜蛋白酶的宿主DNA、宿主蛋白含量均符合2010版药典对于生物制品的要求。
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