CN105505943B

CN105505943B - 一种妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌

Info

Publication number: CN105505943B
Application number: CN201610063556.4A
Authority: CN
Inventors: 程书钧; 赵俊; 王明丽; 肖汀; 冯林
Original assignee: Biohit Biotechnology Hefei Co ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Current assignee: Biohit Biotechnology Hefei Co ltd; Cancer Hospital and Institute of CAMS and PUMC
Priority date: 2016-01-30
Filing date: 2016-01-30
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2036-01-30
Also published as: CN105505943A

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了一种PSG3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌。将表达重组PSG3的重组菌进行发酵和诱导，后直接收集菌体破碎后沉淀提取总蛋白；然后采用两步纯化法后得到该制剂的纯品，向纯品中加入冻干保护剂进行真空冷冻干燥后得到标准品。目前国际国内均没有重组PSG3的标准品，本发明为建立重组PSG3蛋白质量标准奠定了基础，利用本发明方法制备的PSG3经SDS‑PAGE鉴定其纯度为98%，相对分子量46kD；HPLC鉴定其纯度为99.32%。此外，本发明制得的重组PSG3的标准品为冻干制剂，2～8℃可长期保存，在低于25℃室温下可保存两年。

Description

一种妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌。

背景技术

妊娠特异性糖蛋白（Pregnancy Specific Glycoprotein, PSG）是一种胎盘多肽，自1971年德国科学家Bohn从人胎盘中分离提纯以来，各国学者对其进行了广泛的研究。发现PSG与早孕并发症、宫内胎儿生长状况及消化道肿瘤疾病关系密切，对临床上相关疾病的诊断具有指示作用。日本学者报道妊娠特异性糖蛋白1（Pregnancy SpecificGlycoprotein 1，PSG1）可在子宫颈癌、子宫体癌、卵巢癌、乳腺癌、淋巴瘤和和胃肠道恶性肿瘤患者的血中测出，进一步研究证实癌细胞浆中存在有PSG1的患者比没有PSG1患者存活时间短。近年来对妊娠特异性糖蛋白3（Pregnancy Specific Glycoprotein 3，PSG3）的研究受到广泛关注。PSG3是癌胚抗原(CEA)家族的成员，PSG3蛋白全长428个氨基酸，在胚胎发育的过程中同胚胎期免疫耐受的建立以及血管生成有关，同时该指标可应用于消化道肿瘤的诊断。

对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，这些方法本身变异性较大，因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。但实验室现有的PSG3检测试剂无标准品。而天然PSG3抗原在胎盘中含量又低、来源有限且纯化过程较为繁琐因此建立一种经济、高效的基因工程方法制备PSG3标准品蛋白就显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备PSG3标准品的重组菌及方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种制备妊娠特异性糖蛋白3标准品的方法，包括如下步骤：

（1）构建重组菌：将妊娠特异性糖蛋白3的编码基因连接入基因的表达载体中，并将构建好的基因表达载体导入宿主大肠杆菌菌体中，构建重组菌；其中，编码妊娠特异性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

（2）重组菌发酵诱导培养：将重组菌用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行发酵诱导培养，得到发酵液；

（3）蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取沉淀；经蛋白纯化即可得重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白溶液；

（4）蛋白标准品的获得：向重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组妊娠特异性糖蛋白3标准品。

本发明所述的方法，步骤（1）所述基因的表达载体为pET-30α。

本发明所述的方法，步骤（1）所述宿主大肠杆菌为E.coli JM109(DE3)。

本发明所述的方法，步骤（2）所述发酵诱导培养使用含标记物的LB培养基进行克隆培养。

本发明所述的方法，所述标记物为卡那霉素。

本发明所述的方法，步骤（3）所述蛋白纯化包括变复性纯化、阴离子交换层析纯化步骤。

利用权利要求1至6任一所述的方法制备的标准品，所述妊娠特异性糖蛋白3的氨基酸序列如SEQIDNO：3所示。

一种用于制备妊娠特异性糖蛋白3标准品的重组菌，所述重组菌是将妊娠特异性糖蛋白3的编码基因连接入基因的表达载体中，并将构建好的基因表达载体导入宿主大肠杆菌菌体中得到的，且所述重组菌的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

本发明所述的重组菌，所述基因的表达载体为pET-30α。

本发明所述的重组菌，所述宿主大肠杆菌为E.coli JM109(DE3)。

本发明的有益效果在于：

目前国际国内均没有重组PSG3的标准品，本发明提供一种重组PSG3蛋白生物学活性检测用标准品的制备方法，为建立重组PSG3蛋白质量标准奠定基础；SDS-PAGE鉴定其纯度为98%，相对分子量46kD，HPLC鉴定其纯度为99.32%；此外，本发明制得的重组PSG3的标准品为冻干制剂，2～8℃可长期保存，在低于25℃室温下可保存两年。

附图说明

图1为本发明重组PSG3的SDS-PAGE检测结果图：

其中，泳道M：蛋白Marker；泳道1：纯化后重组PSG3蛋白；

图2为本发明重组PSG3的HPLC C18反相层析C蛋白纯度检测结果图。

具体实施方式

为更好理解本发明，下面结合实施例及附图对本发明作进一步描述，以下实施例仅是对本发明进行说明而非对其加以限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

1.构建重组菌：将PSG3的编码基因连接入基因的表达载体pET-30α中，并将构建好的基因表达载体pET-30α-PSG3导入宿主大肠杆菌E.coli JM109(DE3)菌体中，构建重组菌JM109(DE3)/pET-30α-PSG3；其中，编码PSG3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，PSG3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，重组菌的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

2. PSG3蛋白溶液的制备

(2-1)将重组PSG3工程菌接种到含有卡那霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养12~24h，挑取克隆接种于3-5ml的LB培养基中，37℃恒温摇床培养至OD₆₀₀达到1.5~1.8，转速为220r/min；

(2-2将(2-1)获得的菌液1:100接种到100-200ml的LB培养基中，37℃恒温摇床培养至OD₆₀₀达到1.5~1.8，转速为220r/min，得到发酵种子液；

(2-3)将配好的LB培养基加到发酵罐中，连接pH探针、溶氧探针进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；

(2-4)将发酵种子液1:100接种于发酵罐中LB培养基上，设置温度为37℃、溶氧为30%、转速为220~270r/min、pH为7.2~7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD₆₀₀达到1.0~1.2时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达4~5h，得到发酵液；

(2-5)将发酵液4℃条件下6000 r/min离心10min，收集菌体，用适量的0.1M磷酸盐缓冲液重悬菌体，在800bar压力下高压均质破碎，重复破碎2-3次，4℃条件下12000 r/min离心10~15min，收集沉淀；重复离心一次，收集沉淀，即可得到重组PSG3蛋白粗品。

3. PSG3蛋白溶液的纯化

3.1变复性纯化

将收集的PSG3蛋白用洗涤Buffer（50mM三羟甲基氨基甲烷，2M尿素，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）洗涤两次，每次洗涤时间为2-3h，洗涤完12000r/min离心15min，收集沉淀。再将沉淀用溶解Buffer（50mM三羟甲基氨基甲烷，8M尿素，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）溶解，溶解完用透析Buffer（50mM三羟甲基氨基甲烷，4-0M尿素，100mM氯化钠，1mM乙二胺四乙酸，pH8.5）透析，尿素浓度依次为4M、3M、2M、1M、0M每个尿素浓度的透析Buffer透析8h以上，4℃操作，收集最终透析完成的上清，即为PSG3蛋白。

3.2DEAE阴离子交换层析

将经过变复性纯化后收集的蛋白置换到Binding Buffer Ⅱ（50mM三羟甲基氨基甲烷，pH8.5）中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集PSG3蛋白峰。再用Elution Buffer Ⅱ(50mM三羟甲基氨基甲烷，1M NaCl，pH8.5)洗脱，洗去杂蛋白。

4. PSG3标准品的制备

将重组PSG3纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用10mmol/L磷酸缓冲液稀释后加入终浓度为10%甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂，进行冷冻真空干燥。

5. PSG3标准品的检测

蛋白质含量测定：对上述纯化后的PSG3标准品用Lowry法检测蛋白浓度，其蛋白含量为2.0mg/ml。

SDS-PAGE进行纯度鉴定：对PSG3标准品进行SDS-PAGE鉴定纯度，其纯度为98%，相对分子量46kD（图1）。

HPLC纯度鉴定：PSG3标准品经μRPC C18 ST 4.6/100反相层析柱进行分析只得到一个主吸收峰如图2，有2个峰为杂峰。通过计算峰面积得出主峰面积占总面积的99.32%（图2）。

N-端氨基酸序列测定：

（a）SDS-PAGE电泳：将重组PSG3蛋白样品SDS-PAGE电泳，上样前先将配置好的聚丙烯酰胺凝胶装到垂直电泳仪上，用50V恒压空跑30min；

（b）转膜：将蛋白电转到PVDF（聚偏氟乙烯）膜上，电转缓冲液用CAPS缓冲液；

（c）丽春红染色：将PVDF膜放到丽春红染液中染色30min，用水洗去背景颜色；

（d）将目的条带剪下放于Eppendorf管中，-20℃保存，用Edman降解法进行N端氨基酸测序；

（e）N-末端氨基酸序列从第十五个氨基酸开始为S A P S G T G H L P G L N PL，说明纯化后的目的蛋白就是重组PSG3。

以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院；必欧瀚生物技术（合肥）有限公司

<120> 一种妊娠特异性糖蛋白3标准品、其制备方法以及用于制备的重组菌

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagtcacga ttgaagccga gccaaccaaa gtttccaagg ggaaggacgt tcttctactt 60

gtccacaatt tgccccagaa tcttgctggc tacatctggt acaaagggca aatgaaggac 120

ctctaccatt acattacatc atacgtagta gatggtcaaa taattatata tgggcctgca 180

tacagtggac gagaaacagt atattccaat gcatccctgc tgatccagaa tgtcacccgg 240

gaggacgcag gatcctacac cttacacatc gtaaagcgag gtgatgggac tagaggagaa 300

actggacatt tcaccttcac cttatacctg gagactccca agccctccat ctccagcagc 360

aacttatacc ccagggagga catggaggct gtgagcttaa cctgtgatcc tgagactccg 420

gacgcaagct acctgtggtg gatgaatggt cagagcctcc ctatgactca cagcttgcag 480

ttgtccaaaa acaaaaggac cctctttcta tttggtgtca caaagtacac tgcaggaccc 540

tatgaatgtg aaatacggaa cccagtgagt gccagccgca gtgacccagt caccctgaat 600

ctcctcccga agctgcccaa gccctacatc accatcaaca acttaaaccc cagggagaat 660

aaggatgtct tagccttcac ctgtgaacct aagagtgaga actacaccta catttggtgg 720

ctaaatggtc agagcctccc ggtcagtccc agggtaaagc gacccattga aaacaggatc 780

ctcattctac ccagtgtcac gagaaatgaa acaggaccct atcaatgtga aatacaggac 840

cgatatggtg gcatccgcag ttacccagtc accctgaatg tcctctatgg tccagacctc 900

cccagaattt acccttcatt cacctattac cattcaggag aaaacctcta cttgtcctgc 960

ttcgcggact ctaacccacc agcagaatat tcttggacaa ttaatgggaa gtttcagcta 1020

tcaggacaaa agctctttat cccccagatt actacaaagc atagcgggct ctatgcttgc 1080

tctgttcgta actcagccac tggcatggaa agctccaaat ccatgacagt caaagtctct 1140

gctccttcag gaacaggaca tcttcctggc cttaatccat ta 1182

<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

catatgcaag tcacgattga agccgagcca accaaagttt ccaaggggaa ggacgttctt 60

ctacttgtcc acaatttgcc ccagaatctt gctggctaca tctggtacaa agggcaaatg 120

aaggacctct accattacat tacatcatac gtagtagatg gtcaaataat tatatatggg 180

cctgcataca gtggacgaga aacagtatat tccaatgcat ccctgctgat ccagaatgtc 240

acccgggagg acgcaggatc ctacacctta cacatcgtaa agcgaggtga tgggactaga 300

ggagaaactg gacatttcac cttcacctta tacctggaga ctcccaagcc ctccatctcc 360

agcagcaact tataccccag ggaggacatg gaggctgtga gcttaacctg tgatcctgag 420

actccggacg caagctacct gtggtggatg aatggtcaga gcctccctat gactcacagc 480

ttgcagttgt ccaaaaacaa aaggaccctc tttctatttg gtgtcacaaa gtacactgca 540

ggaccctatg aatgtgaaat acggaaccca gtgagtgcca gccgcagtga cccagtcacc 600

ctgaatctcc tcccgaagct gcccaagccc tacatcacca tcaacaactt aaaccccagg 660

gagaataagg atgtcttagc cttcacctgt gaacctaaga gtgagaacta cacctacatt 720

tggtggctaa atggtcagag cctcccggtc agtcccaggg taaagcgacc cattgaaaac 780

aggatcctca ttctacccag tgtcacgaga aatgaaacag gaccctatca atgtgaaata 840

caggaccgat atggtggcat ccgcagttac ccagtcaccc tgaatgtcct ctatggtcca 900

gacctcccca gaatttaccc ttcattcacc tattaccatt caggagaaaa cctctacttg 960

tcctgcttcg cggactctaa cccaccagca gaatattctt ggacaattaa tgggaagttt 1020

cagctatcag gacaaaagct ctttatcccc cagattacta caaagcatag cgggctctat 1080

gcttgctctg ttcgtaactc agccactggc atggaaagct ccaaatccat gacagtcaaa 1140

gtctctgctc cttcaggaac aggacatctt cctggcctta atccattact cgag 1194

<210> 3

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Gln Val Thr Ile Glu Ala Glu Pro Thr Lys Val Ser Lys Gly Lys

1 5 10 15

Asp Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln Asn Leu Ala Gly Tyr

20 25 30

Ile Trp Tyr Lys Gly Gln Met Lys Asp Leu Tyr His Tyr Ile Thr Ser

35 40 45

Tyr Val Val Asp Gly Gln Ile Ile Ile Tyr Gly Pro Ala Tyr Ser Gly

50 55 60

Arg Glu Thr Val Tyr Ser Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Val Thr

65 70 75 80

Arg Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Thr Leu His Ile Val Lys Arg Gly Asp

85 90 95

Gly Thr Arg Gly Glu Thr Gly His Phe Thr Phe Thr Leu Tyr Leu Glu

100 105 110

Thr Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu Tyr Pro Arg Glu Asp

115 120 125

Met Glu Ala Val Ser Leu Thr Cys Asp Pro Glu Thr Pro Asp Ala Ser

130 135 140

Tyr Leu Trp Trp Met Asn Gly Gln Ser Leu Pro Met Thr His Ser Leu

145 150 155 160

Gln Leu Ser Lys Asn Lys Arg Thr Leu Phe Leu Phe Gly Val Thr Lys

165 170 175

Tyr Thr Ala Gly Pro Tyr Glu Cys Glu Ile Arg Asn Pro Val Ser Ala

180 185 190

Ser Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asn Leu Leu Pro Lys Leu Pro Lys

195 200 205

Pro Tyr Ile Thr Ile Asn Asn Leu Asn Pro Arg Glu Asn Lys Asp Val

210 215 220

Leu Ala Phe Thr Cys Glu Pro Lys Ser Glu Asn Tyr Thr Tyr Ile Trp

225 230 235 240

Trp Leu Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Val Lys Arg Pro

245 250 255

Ile Glu Asn Arg Ile Leu Ile Leu Pro Ser Val Thr Arg Asn Glu Thr

260 265 270

Gly Pro Tyr Gln Cys Glu Ile Gln Asp Arg Tyr Gly Gly Ile Arg Ser

275 280 285

Tyr Pro Val Thr Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Leu Pro Arg Ile

290 295 300

Tyr Pro Ser Phe Thr Tyr Tyr His Ser Gly Glu Asn Leu Tyr Leu Ser

305 310 315 320

Cys Phe Ala Asp Ser Asn Pro Pro Ala Glu Tyr Ser Trp Thr Ile Asn

325 330 335

Gly Lys Phe Gln Leu Ser Gly Gln Lys Leu Phe Ile Pro Gln Ile Thr

340 345 350

Thr Lys His Ser Gly Leu Tyr Ala Cys Ser Val Arg Asn Ser Ala Thr

355 360 365

Gly Met Glu Ser Ser Lys Ser Met Thr Val Lys Val Ser Ala Pro Ser

370 375 380

Gly Thr Gly His Leu Pro Gly Leu Asn Pro Leu

385 390 395

Claims

1.一种制备妊娠特异性糖蛋白3标准品的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建重组菌：将妊娠特异性糖蛋白3的编码基因连接入基因的表达载体pET-30α中，并将构建好的基因表达载体导入宿主大肠杆菌菌体中，构建重组菌；其中，编码妊娠特异性糖蛋白3的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（3）蛋白纯化：将诱导后菌体破碎，取沉淀；经蛋白纯化得重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白溶液；

（4）蛋白标准品的获得：向重组妊娠特异性糖蛋白3纯化后蛋白溶液中加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，制得重组妊娠特异性糖蛋白3标准品；

其中，步骤（2）所述重组菌发酵诱导培养具体包括以下步骤：

(2-2)将(2-1)获得的菌液1:100接种到100-200mL的LB培养基中，37℃恒温摇床培养至OD₆₀₀达到1.5~1.8，转速为220r/min，得到发酵种子液；

(2-4)将发酵种子液1:100接种于发酵罐中LB培养基上，设置温度为37℃、溶氧为30%、转速为220~270r/min、pH为7.2~7.4的条件下发酵；当发酵罐内的OD₆₀₀达到1.0~1.2时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为1mmol/L，调温度至32℃，诱导表达4~5h，得到发酵液；

步骤（3）所述蛋白纯化包括变复性纯化、阴离子交换层析纯化步骤；其中，变复性纯化包括以下步骤：

（3-1）将收集的PSG3蛋白沉淀用洗涤Buffer洗涤两次，每次洗涤时间为2-3h，洗涤完12000r/min离心15min，收集沉淀；再将沉淀用溶解Buffer溶解，溶解完用透析Buffer透析，依次用尿素浓度为4M、3M、2M、1M、0M的透析Buffer透析8h以上，4℃操作，收集最终透析完成的上清，即为PSG3蛋白；

所述洗涤Buffer为：含有50mM三羟甲基氨基甲烷、2M尿素、100mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸的pH8.5的溶液；

所述溶解Buffer为：含有50mM三羟甲基氨基甲烷、8M尿素、100mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸的pH8.5的溶液；

所述透析Buffer为：含有50mM三羟甲基氨基甲烷、0-4 M 尿素、100mM氯化钠、1mM乙二胺四乙酸的pH8.5的溶液；

阴离子交换层析纯化包括以下步骤：

（3-2）将经过变复性纯化后收集的蛋白置换到Binding Buffer Ⅱ中后，上样通过用Binding Buffer Ⅱ平衡好的DEAE阴离子交换层析柱，收集PSG3蛋白峰；再用ElutionBuffer Ⅱ洗脱，洗去杂蛋白；

所述Binding Buffer Ⅱ为：pH8.5的50mM三羟甲基氨基甲烷溶液；

所述Elution Buffer Ⅱ为：含有50mM三羟甲基氨基甲烷、1M NaCl的pH8.5的溶液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述宿主大肠杆菌为E.coliJM109(DE3)。

3.利用权利要求1或2所述的方法制备的标准品，其特征在于：所述妊娠特异性糖蛋白3的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。