CN105002203A - Pgi与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用 - Google Patents

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于海双
李小红
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Abstract

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种人胃蛋白酶原I(PGI)与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白在大肠杆菌中的可溶性分泌表达；提供了该融合蛋白的制备方法。本发明还公开了上述重组BMP-PG？I融合蛋白在制备单克隆抗体，胃蛋白酶原I试剂盒校准品中的应用。本发明利用了Ptac启动子、malE信号肽、麦芽糖结合蛋白等元件实现了PGI在大肠杆菌周至内的可溶性分泌表达，不仅大大提高了来自原核表达系统的重组人PGI蛋白的免疫原活性，并且有效的降低了重组PGI的制备成本。

Description

PGI与MBP融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种重组PG I的融合蛋白可溶性分泌表达及其制备方法和应用。
背景技术
胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和致死率一直居于我国恶性肿瘤之首，早期诊断和早期介入治疗是降低致死率的关键措施之一。近年来研究发现，血清胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)可作为胃癌和癌前病变的血清筛选指标。
胃蛋白酶原(Pepsinogen，PG)是胃蛋白酶的无酶活性的前体，在pH1-5的酸性条件下转化成有活性的胃蛋白酶。PG有7个同工酶，根据其生化免疫特性可分为PG I亚群(又称PGA)；和PG II亚群(又称为PGC)。血清PG I和PG II反映胃黏膜腺体和细胞的数量，也间接反映胃黏膜不同部位的分泌功能。
正常情况下，胃粘膜分泌的胃蛋白酶原大部分进入胃肠经胃蛋白酶或胃酸水解，在其N端水解42个氨基酸残基后产生有活性的胃蛋白酶，对蛋白质进行消化，仅有1％的PG透过胃黏膜毛细血管进入血液循环。当胃黏膜发生病理变化时，血清PG水平也会发生相应的变化。因此，PG作为胃病筛查的体外检测越来越受到关注。
目前，人胃蛋白酶原主要从人胃组织中提取，这种传统的提取方法，产品得率低，并受到材料来源有限的限制，成本高昂，很难实现产业化，所以重组表达高活性的胃蛋白酶原具有很好的市场前景。
胃蛋白酶原是分子量为42KDa的单链多肽，含有3个连续的二硫键，在原核表达系统中胞内表达很难正确折叠，蛋白以无活性的包涵体形式存在，复性后活性很低。本发明利用malE天然信号肽将PG I引导至大肠杆菌周至，实现了PG I蛋白的可溶性分泌表达，重组表达的PG I蛋白具有很好的免疫原性，本发明中的PG I蛋白的N端融合了MBP蛋白，其在提高PGI融合蛋白表达量的同时还改善了PG I蛋白不稳定容易降解的特性。
发明内容
本发明公开一种利用大肠杆菌表达系统分泌表达重组人PG I融合蛋白的方法；同时还提供了该融合蛋白的制备方法。
本发明还公开了使用上述方法获得的PG I融合蛋白在制备PG I的单克隆抗体中作为免疫原，以及在胃蛋白酶原诊断试剂中的应用。
附图说明
图1.本发明的包含PG I基因的重组质粒载体构建图；
图2.本发明的重组表达PG I融合蛋白的表达及纯化SDS-PAGE电泳图：1、诱导全菌；2、提取菌体周至蛋白；3、Ni2+螯合亲和柱纯化PG I融合蛋白；
图3.本发明制备的PG I融合蛋白作为免疫原所制备的PG I单抗的效价检测；
图4.本发明制备的融合蛋白的PG I活性检测。
具体实施方式
实施例1：PG I编码序列的扩增
使用PCR方法从质粒PET32a-PG I(本公司构建)扩增出PG I的编码序列，所用的引物PGA35的5’端添加了Xba I的酶切位点，引物PGA33的5’端添加了HindIII的酶切位点。
PGA35：5’-AACTCTAGAGGTAGCGGCTCTGGCTCGGGTTCTATTATGTATAAAGTTCCATTGATTAGAAGAAG-3’
PGA33：5’-AACAAGCTTTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGCGACTGGTGCCAAACC-3’
100μl的PCR反应体系中加入1μl的La Taq DNA聚合酶(TaKaRa)，10μM的PGA35和PGA33各4μl，2.5mM的dNTP加入8μl，10×PCR反应缓冲液加入10μl。PCR的反应条件为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟30秒，然后回到预变性，共进行25个循环，最后延伸7分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物中的目的条带，然后将目的条带切下，溶胶回收。
实施例2：MBP-PG I融合蛋白表达载体的构建
取2μg实施例1中PCR扩增得到的PG I编码序列，建立50μl的双酶切体系，具体如下：2μg的PG I编码序列，5μl的10×M酶切反应缓冲液，1.5μl Xba I和1.5μl的HindIII，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒(OMEGA BIO-TEK)纯化PG I编码序列的双酶切产物。
取600ng的pMAL-p2X(NEB公司)载体，建立50μl的双酶切体系，具体如下：600ng的pMAL-p2X载体，5μl的10×M酶切反应缓冲液，1.5μl Xba I的和1.5μl的HindIII，加双蒸水至总体积50μl，37℃水浴中反应6小时。使用凝胶回收试剂盒(OMEGA BIO-TEK)纯化pMAL-p2X载体双酶切产物。
连接反应：取4μl经过纯化的pMAL-p2X的Xba I和HindIII双酶切产物，加入6μl经过纯化的PG I的双酶切产物，1μl的T4 DNA连接酶(TaKaRa)和1μl的10×T4 DNA连接酶反应缓冲液，16℃水浴中连接过夜。
连接产物转化大肠杆菌DH5α，然后挑取克隆，送公司测序(感受态DH5α的制备方法及转化方法依照“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著)。所得重组质粒命名为pMAL-PG I。
实施例3：MBP-PG I融合蛋白的表达
将所获得的pMAL-PG I质粒转化E.coli BL21(DE3)(Novagen公司)感受态细胞。细菌的诱导表达：挑取克隆接种于100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，在37℃、250rpm条件下培养过夜，制备种子液。
取10ml种子液接种入装有1L LB-Amp培养基的3L锥形瓶，37℃培养至OD600为0.5左右，然后加入终浓度为0.5mM的1PTG，将温度降为28℃诱导8h后，12000g离心获得菌体。制备全菌电泳样品，蛋白电泳分析目的蛋白表达情况。SDS-PAGE电泳的样品制备方法、电泳电压、凝胶染色和脱色的方法见“分子克隆实验指南”第二版所述。J.萨姆布鲁克著。
实施例4：含有MBP-PG I基因的大肠杆菌的周至蛋白抽提
将细胞沉淀悬于新配置的溶菌酶(1mg/ml)、20％W/V蔗糖、30mmol/LTris、1mmol/LEDTA，pH8.0溶液中，冰浴30min，12000g离心，收集上清为周至蛋白。
实施例5：MBP-PG I融合蛋白的纯化
HiTrap Chelating HP(镍离子螯合亲和柱，GE)纯化蛋白：上样后，先用Wash Buffer(20mMTris，0.5M NaCl、80mM imidazole，pH8.0)冲洗掉杂蛋白，然后用Elution Buffer(20mM Tris，0.5M NaCl、400mM imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白。
实施例6：MBP-PG I融合蛋白免疫小鼠，制备单克隆抗体
1)免疫小鼠：制备的重组MBP-PG I融合蛋白按每只小鼠100μg蛋白量与弗氏完全佐剂等体积混匀乳化，皮下免疫；3周后，二次免疫，50μg蛋白量与弗氏不完全佐剂等体积混匀，乳化后，腹腔注射免疫；2周后，三次免疫，方法同二次免疫；7天后，采尾静脉血检测，效价大于24W。
2)单克隆抗体制备：取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，进行HAT选择性培养，利用ELISA方法筛选出阳性细胞株，进行三次单克隆化培养，得到稳定分泌抗体的单克隆细胞株，将每株单克隆抗体杂交瘤细胞株进行扩大培养后，制备腹水。
3)抗体纯化及效价检测：采集的腹水经过protein A柱纯化，获得高纯的小鼠单抗蛋白。分别包被5ug/ml MBP-PG I融合蛋白和MBP蛋白，利用ELISA检测制备的腹水抗体效价。
实施例7：MBP-PG I融合蛋白免疫原性检测
MBP-PG I融合蛋白340ng/ml为起始检测浓度，连续对半稀释，用PG I免疫比浊试剂(九强生物公司)定量不同浓度融合蛋白的PG I含量。

Claims (8)

1.一种人PG I融合蛋白的原核表达质粒的构建，其特征是将PG I的基因通过表达质粒pMAL-p2X或pMAL-p5X导入大肠杆菌表达菌株，IPTG诱导PG I融合蛋白分泌至大肠杆菌的周至内从而获得可溶性表达。
2.权利要求1所述的表达质粒，其特征是质粒包含Ptac启动子-maleE信号肽-malE基因-FactorXa酶切位点-PG I基因-8×His Tag的序列。
3.一种利用权利要求1-2所述的重组质粒表达大肠杆菌周至腔来源的MBP-PG I的融合蛋白，其特征在于PG I的NCBI Reference Sequence：NP_001073275.1，融合蛋白具有序列表中SEQ ID No 1氨基酸序列；或者是将融合蛋白的氨基酸残基在不改变融合蛋白特性的前提下，进行部分氨基酸的取代、缺失或添加所得到重组蛋白。
4.根据权利要求1-3所述的表达载体中含有maleE蛋白天然信号肽，用于MBP-PG I的分泌表达，其特征在于信号肽具有序列表中SEQ ID No 2氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4所述的重组表达的PG I融合蛋白，其N端融合BMP蛋白，用以提高融合蛋白表达量及稳定融合蛋白。
6.一种利用权利要求1-5任一项所述的表达质粒导入表达的宿主菌包括以下大肠杆菌工程菌株：DH5α、TOP10、TB1和BL21。
7.一种权利要求1-6所述重组可溶性表达PG I的融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)筛选高效表达MBP-PG I融合蛋白的菌株；
(2)将阳性菌株用LB培养基培养，IPTG诱导获得含有MBP-PG I融合蛋白的菌液；
(3)金属离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。
8.一种权利要求1-7制备得到的PG I融合蛋白在制备PG I的单克隆抗体中作为免疫原，以及在胃蛋白酶原诊断试剂中的应用。
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