CN109055334B - 一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高效表达糖苷内切酶Endo S及其突变体的方法，属于发酵工程技术领域。本发明的方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基对可产糖苷内切酶Endo S及其突变体的菌株进行发酵；本发明的方法可成功将糖苷内切酶Endo S的产量提高至225mg/L。

Description

一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法
技术领域
本发明涉及一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
Endo S(EC 3.2.1.96)是一种来源于化脓链球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶，属于糖苷水解酶GH18家族，其主要的生物学功能是特异性水解免疫球蛋白G(IgG)可结晶区(Fc片段)N糖链，作用位点为N糖链核心五糖中两个N-乙酰葡萄糖胺之间的苷键。
由于IgG抗体糖基化修饰影响抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)及补体依赖的细胞毒性作用等一系列免疫反应，Endo S逐步被开发应用于自身免疫疾病治疗和抗体糖基修饰功能化改造。
随着Endo S应用的增多，市场上对其需求量也越来越大，但是，目前，关于提高Endo S产量方面的研究依旧十分少，已有的研究所展示出的成果也不尽如人意，这一定程度上限制了Endo S的应用。
例如，2001年，Mattias Collin等先第一次利用pET30a载体克隆了完整的Endo S基因，并在BL21(DE3)pLys中成功表达，随后又利用载体pGEX表达了与谷胱甘肽转移酶(GST)标签融合表达的Endo S，纯化后并把GST标签切除得到Endo S纯蛋白，但是，其产量微乎其微；2012年，Wei Huang等报道，在25℃下，使用添加了0.1mM IPTG的LB培养基发酵培养Mattias Collin课题组的BL21(DE3)-pGEX-GST-Endo S重组菌，16h后蛋白产量为40mg/L，此产量仍旧不能满足工业生产的需求；Goodfellow等以pGEX-4T-1为载体，BL21(DE3)为宿主表达了密码子优化后的GST-Endo S，但是，其产量仅为10mg/L发酵液；2013年，Trastoy等人在C端融合霍乱弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶结构域(his6-CPD)的载体pCPD上表达Endo S，宿主同样为BL21(DE3)，通过镍柱纯化，肌醇六磷酸处理最后得到Endo S蛋白，其产量也微乎其微。
因此，我们急需找到一种可提高Endo S产量的方法以满足市场需求。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法。此方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基对可产糖苷内切酶Endo S或其突变体的菌株进行发酵；此方法可成功将糖苷内切酶Endo S的产量提高至225mg/L。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，所述方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基进行发酵；所述发酵所使用的生产菌株为可产糖苷内切酶Endo S或其突变体的菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含10.0g/L的酵母粉4.0g/L的甘油、25.4g/L的牛肉浸膏、5.0g/L的NaCl。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为5～9。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为8.0。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度16～37℃、时间4～48h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度20℃、时间24h。
在本发明的一种实施方式中，所述生产菌株为可表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的大肠杆菌重组菌；所述大肠杆菌以糖苷内切酶Endo S或其突变体为目的基因，以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌BL21为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述糖苷内切酶Endo S来源于化脓链球菌。
在本发明的一种实施方式中，所述糖苷内切酶Endo S的氨基酸序列为SEQ IDNO.1。
在本发明的一种实施方式中，所述糖苷内切酶Endo S突变体的氨基酸序列为SEQID NO.2或SEQ ID NO.3。
本发明提供了上述一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法在制备糖苷内切酶Endo S或其突变体、制备自身免疫疾病药物、修饰和功能化改造抗体糖基方面的应用。
有益效果：
本发明的方法使用了成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基对可产糖苷内切酶Endo S或其突变体的菌株进行发酵，成功将糖苷内切酶Endo S的产量提高至225mg/L。
附图说明
图1：Endo S催化SGP水解过程的示意图；
图2：Endo S催化SGP水解的高效液相色谱图，其中，A为反应前，B为反应1h后；
图3：培养基对菌株生长及Endo S产量的影响；
图4：氮源对菌株生长及Endo S产量的影响；
图5：碳源对菌株生长及Endo S产量的影响；
图6：无机盐对菌株生长及Endo S产量的影响；
图7：诱导温度和时间对菌株生长的影响；
图8：诱导温度和时间对Endo S产量的影响；
图9：pH对菌株生长及Endo S产量的影响；
图10：优化前和优化后Endo S、EndoS D233Q和EndoS D233A酶表达量。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的培养基如下：
LB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨10.0，NaCl 10.0。
TB培养基：蛋白胨12.0g，酵母提取物24.0g，甘油4.0ml，900mL去离子水溶解后高压灭菌。冷却至60℃后，加入100ml灭菌的1.7mol/L KH2PO4、7.2mol/L K2HPO4溶液混匀。
SB培养基(g/L)：酵母粉20.0，蛋白胨30.0，MOPS 10.0，pH 7.0。
SOB培养基(g/L)：酵母粉5.0，蛋白胨20.0，NaCl 0.5，KCl 0.2。
2×YT培养基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨16.0，NaCl 5.0，pH 7.0。
下述实施例中涉及的检测方法如下：
Endo S酶活验证：
唾液酸糖肽SGP是一种来源于鸡蛋黄的N糖肽，是Endo S天然小分子底物，以SGP为底物验证Endo S的糖苷内切酶活性，反应示意图如图1所示；
反应条件：37℃，1h；
反应体系：2mg/mL的SGP、0.11mg/mL的Endo S、50mM，pH 6.3的PBS Buffer；
用HPLC检测反应进程。
Endo S产量检测：
1、纯化
将发酵液离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬，研磨仪破壁处理10min，离心收集上清，即为粗酶液；粗酶液中的Endo S用His Tag标签蛋白螯合磁珠(海狸纳米科技有限公司)进行纯化，具体操作步骤参看磁珠使用说明。
2、测定
使用碧云天生物技术研究所研发的Bradford蛋白浓度测定试剂盒进行检测，具体操作步骤参看试剂盒使用说明。
下述实施例中涉及的基因如下：
所述编码糖苷内切酶Endo S及其突变体的基因记载于文献《Huang W,etal.Journal of the American Chemical Society,2012,134(29):12308-12318.》中。
实施例1：重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S、E.coli BL21(DE3)/pET28a-EndoS D233A以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-EndoS D233Q的构建
重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S：
1、构建重组质粒pET28a-Endo S
以中科院上海药物研究所合成的pET30a-Endo S为模板，通过引物Endo S-F、EndoS-R，PCR扩增得到Endo S基因；
以实验室保藏的pET-28a质粒为模板，通过引物28a-F、28a-R，PCR扩增得到pET-28a载体；
核苷酸序列为SEQ ID NO.4的Endo S-F：
AGATATACCATGGGCGAAGAGAAGACAGTTCAGGTTCAG；
核苷酸序列为SEQ ID NO.5的Endo S-R：
GATCCTCAGTGGTGGTGATGATGATGTTTCTTCAGCAGCTGGCG；
核苷酸序列为SEQ ID NO.6:的28a-F：
GAAACATCATCATCACCACCACTGAGGTCCGAATTCGAGCTC；
核苷酸序列为SEQ ID NO.7的28a-R：
AACTGTCTTCTCTTCGCCCATGGTATATCTCCTTCT；
由于EndoS扩增引物和pET-28a扩增引物包含反向互补序列，因此扩增得到的EndoS基因和pET-28a载体存在同源互补片段，通过T4DNA聚合酶酶切处理Endo S基因和pET-28a载体形成粘性末端，连接后得到重组质粒pET28a-Endo S。
2、构建重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S
将重组质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态，测序正确后保藏菌株。
重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-EndoS D233A以及E.coli BL21(DE3)/pET28a-EndoS D233Q的构建同上。
实施例2：培养基对菌株生长及Endo S产量的影响
将实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入LB、TB、SB、SOB和2×YT培养基进行培养，探究培养基对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于30℃诱导，培养12h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图3，在蛋白表达方面，5个培养基中2×YT培养基最有利于酶表达，可将酶表达量提高至58.5mg/L(图3-10中所有酶量纵坐标数值为实际值的1/30)，TB培养基和LB培养基次之，酶表达量分别为53.4mg/L和38.1mg/L，SOB培养基和SB培养基最差，酶表达量分别为16.2mg/L和35.4mg/L；在细胞生长方面，TB对菌的生长最好，可将菌体浓度提高至9.32，SB和2×YT次之，菌体浓度分别为8.31和7.14，LB和SOB最差，菌体浓度分别为2.96和4.30。
由于本发明是主要对酶表达量进行优化，从酶含量和菌体生长综合方面考虑，选择2×YT培养基作为基础培养基。
实施例3：氮源对菌株生长及Endo S产量的影响；
选用2×YT培养基，将氮源16g/L的蛋白胨分别替换成相同含氮量的工业级胰蛋白、工业级牛肉浸膏、酪蛋白、柠檬酸三铵、氯化铵、硫酸铵、鱼粉蛋白胨、牛肉浸膏、大豆蛋白胨以及尿素，将实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入上述培养基进行培养，探究氮源对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于30℃诱导，培养12h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图4，不同氮源对菌体酶表达量的作用差别很大，对菌体的生长相差不大，有机氮源比无机氮源更利于菌体酶的表达，其中，添加了牛肉浸膏的培养基最有利于酶的表达，可将酶表达量提高至74.7mg/L；添加了氯化铵的培养基最不利于酶的表达，酶表达量仅为7.5mg/L。
为了能够满足以后菌体酶表达量的需求，决定采用牛肉浸膏作为氮源。
实施例4：碳源对菌株生长及Endo S产量的影响；
选用氮源为25.4g/L的牛肉浸膏的2×YT培养基，添加相同含氮量的碳源，如麦芽糖、糊精、可溶性淀粉、乳糖、半乳糖、蔗糖、果糖、葡萄糖以及甘油，将实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入上述培养基进行培养，探究碳源对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于30℃诱导，培养12h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图5，是否添加碳源对菌体酶表达量和菌体生长是有影响的，尤其是以甘油作为碳源对酶表达量影响最大，可将酶表达量提高至171.3mg/L；果糖次之，酶表达量分别为156.6mg/L；葡萄糖的效果最不明显，酶表达量为32.7mg/L。
同样以甘油作为碳源对菌体生长有利，综合考虑选择以甘油作为碳源添加到优化培养基中。
实施例5：无机盐对菌株生长及Endo S产量的影响；
选用氮源为25.4g/L的牛肉浸膏、碳源为4g/L的甘油的2×YT培养基，在培养基中分别添加1mM的CaCl2、CuSO4、FeSO4、CoCl2、MnSO4、LiCl、ZnCl2、MgCl2、NiSO4，将实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入上述培养基进行培养，探究对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于30℃诱导，培养12h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图6，添加Co2+的培养基对菌体生长和酶表达量有很强的抑制作用，几乎抑制了菌的生长，使得菌体浓度降低至0.99；其余金属离子对菌体酶量表达没有非常大的影响，跟对照组相比，这些加了金属离子的培养基对菌体的生长和酶表达量变化不大，其中，对照组菌体浓度为8.22，添加Fe2+的培养基菌体浓度为8.16；对照组酶表达量为165.3mg/L，添加Mg2+的培养基酶表达量为136.2mg/L。可以说明菌体的生长和酶表达量不依靠金属离子，并且考虑到实验成本问题，所以决定不添加金属离子到培养基中。
实施例6：诱导温度和时间对菌株生长及Endo S产量的影响；
选用氮源为25.4g/L的牛肉浸膏、碳源为4g/L的甘油的2×YT培养基，将记实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入上述培养基于16℃、20℃、26℃、30℃、37℃，培养4h、8h、12h、24h、48h，探究温度时间对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG分别于16℃、20℃、26℃、30℃、37℃诱导，培养4h、8h、12h、24h、48h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图7，16℃下大肠杆菌生长相对于其他几个温度显得十分缓慢，但生长48h最终菌体浓度较高为7.48；虽然30℃和37℃下菌体可以在前期表现出生长优势，但后期生长逐渐放缓，最高菌体浓度分别为7.01和7.24；总的来说，20℃和26℃下菌体的生长情况最好，最高菌体浓度分别为9.20和7.81，说明温度过低或者过高都不利于大肠杆菌的生长。
如图8，从酶的表达水平来看，适当延长发酵时间有利于酶量的积累，但是发酵时间过长反而对酶的积累有负作用，比如各个实验组48h所积累酶量分别为74.7mg/L、180.9mg/L、144.6mg/L、166.5mg/L、17.4mg/L，均低于24h所积累的酶量70.8mg/L、137.4mg/L、81mg/L、98.4mg/L、14.1mg/L，因此，在比较温度对酶表达量的影响时，主要考虑的时间范围为8-24h，结果表明20℃下酶表达量最好，并且显著高于其他实验组，同时在该温度下发酵24h可以获得最高的酶量积累。
筛选出的最适发酵温度和时间分别为20℃和24h
实施例7：pH对菌株生长及Endo S产量的影响；
选用氮源为25.4g/L的牛肉浸膏、碳源为4g/L的甘油的2×YT培养基，将上述培养基的pH分别调节为5、6、7、8、9，将实施例1构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-Endo S接种入上述培养基进行培养，探究pH对菌株生长及Endo S产量的影响。
具体步骤如下：
将上述培养基的pH分别调节为5、6、7、8、9，按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于20℃诱导，培养24h后取样并测定生物量和Endo S酶量。
检测结果如下：
如图9，在5-9的pH区间内，菌体的生长情况变化不大，但酶的表达量却明显不同，在pH 8.0的培养基中，酶的表达量最高，为198.6mg/L，而当pH低于7.0或者高于8.0时，菌体酶表达量明显受到抑制，pH为5时，酶表达量为72.3mg/L，pH为6时，酶表达量为104.7mg/L，pH为9时，酶表达量为114.6mg/L，说明过酸和过碱的情况下都不利于酶的表达积累。
综合上述结果，培养基的pH应该控制在8.0。
实施例8：摇瓶培养验证优化结果；
优化前的培养基及条件：TB培养基(蛋白胨12.0g/L，酵母粉24.0g/L，甘油4.0g/L，KH2PO4 23.1g/L，K2HPO4 125.4g/L)，发酵温度30℃，发酵时间12h。
优化后培养基及条件：酵母粉10g/L，牛肉浸膏25.4g/L，NaCl 5g/L，甘油4g/L，pH：8.0，发酵温度20℃，发酵时间24h。
具体步骤如下：
分别以优化前和优化后的培养基和条件分别对EndoS，EndoS D233A和EndoSD233Q进行摇瓶发酵表达，按4％接种量将种子液分别接入上述培养基中，37℃、250rpm培养至OD600≈0.6时，加入终浓度250μM的IPTG于20℃诱导，培养24h后取样并测定生物量和EndoS酶量。
检测结果如下：
如图10，优化后EndoS(图中WT指的是野生型，区别于突变体D233A，D233Q)蛋白表达量为225mg/L，是优化前的14倍，优化后EndoS D233Q蛋白表达量是优化前的约14倍，优化后EndoS D233A蛋白表达量也是优化前的14倍。
表明优化后的培养基和发酵条件可以明显促进EndoS的表达积累，并且对EndoSD233A和EndoS D233Q的表达同样适用。获得的EndoS D233A和EndoS D233Q酶的蛋白量要略高于EndoS。
实施例9：Endo S酶活验证。
酶具有催化活性才有实际应用价值，因此本发明验证了以优化后培养基及条件获得的Endo S的糖苷内切酶活性。
具体步骤如下：
以SGP为底物验证Endo S的糖苷内切酶活性，反应示意图如图1所示；
反应条件：37℃，1h；
反应体系：2mg/mL的SGP、0.11mg/mL的Endo S、50mM，pH 6.3的PBS Buffer；
用HPLC检测反应进程。
检测结果如下：
如图2B，反应1h后保留时间在15.5min的底物SGP峰1明显下降，同时在保留时间17.2min出现一个新峰2(SGP水解后的糖肽)，说明表达的Endo S具有糖苷内切酶活性。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 966
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Glu Glu Lys Thr Val Gln Val Gln Lys Gly Leu Pro Ser Ile Asp
1 5 10 15
Ser Leu His Tyr Leu Ser Glu Asn Ser Lys Lys Glu Phe Lys Glu Glu
20 25 30
Leu Ser Lys Ala Gly Gln Glu Ser Gln Lys Val Lys Glu Ile Leu Ala
35 40 45
Lys Ala Gln Gln Ala Asp Lys Gln Ala Gln Glu Leu Ala Lys Met Lys
50 55 60
Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly
65 70 75 80
Gly Tyr Phe Arg Thr Trp His Asp Lys Thr Ser Asp Pro Thr Glu Lys
85 90 95
Asp Lys Val Asn Ser Met Gly Glu Leu Pro Lys Glu Val Asp Leu Ala
100 105 110
Phe Ile Phe His Asp Trp Thr Lys Asp Tyr Ser Leu Phe Trp Lys Glu
115 120 125
Leu Ala Thr Lys His Val Pro Lys Leu Asn Lys Gln Gly Thr Arg Val
130 135 140
Ile Arg Thr Ile Pro Trp Arg Phe Leu Ala Gly Gly Asp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ile Ala Glu Asp Thr Ser Lys Tyr Pro Asn Thr Pro Glu Gly Asn Lys
165 170 175
Ala Leu Ala Lys Ala Ile Val Asp Glu Tyr Val Tyr Lys Tyr Asn Leu
180 185 190
Asp Gly Leu Asp Val Asp Val Glu His Asp Ser Ile Pro Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Glu Asp Thr Ala Gly Val Glu Arg Ser Ile Gln Val Phe Glu
210 215 220
Glu Ile Gly Lys Leu Ile Gly Pro Lys Gly Val Asp Lys Ser Arg Leu
225 230 235 240
Phe Ile Met Asp Ser Thr Tyr Met Ala Asp Lys Asn Pro Leu Ile Glu
245 250 255
Arg Gly Ala Pro Tyr Ile Asn Leu Leu Leu Val Gln Val Tyr Gly Ser
260 265 270
Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys
275 280 285
Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu
290 295 300
Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly
305 310 315 320
Asn Leu Trp Tyr Asp Ile Asn Ser Arg Lys Asp Glu Asp Lys Ala Asn
325 330 335
Gly Ile Asn Thr Asp Ile Thr Gly Thr Arg Ala Glu Arg Tyr Ala Arg
340 345 350
Trp Gln Pro Lys Thr Gly Gly Val Lys Gly Gly Ile Phe Ser Tyr Ala
355 360 365
Ile Asp Arg Asp Gly Val Ala His Gln Pro Lys Lys Tyr Ala Lys Gln
370 375 380
Lys Glu Phe Lys Asp Ala Thr Asp Asn Ile Phe His Ser Asp Tyr Ser
385 390 395 400
Val Ser Lys Ala Leu Lys Thr Val Met Leu Lys Asp Lys Ser Tyr Asp
405 410 415
Leu Ile Asp Glu Lys Asp Phe Pro Asp Lys Ala Leu Arg Glu Ala Val
420 425 430
Met Ala Gln Val Gly Thr Arg Lys Gly Asp Leu Glu Arg Phe Asn Gly
435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520 525
Gly Leu Lys Glu Leu Asp Leu Ser Gly Phe Asp Arg Glu Thr Leu Ala
530 535 540
Gly Leu Asp Ala Ala Thr Leu Thr Ser Leu Glu Lys Val Asp Ile Ser
545 550 555 560
Gly Asn Lys Leu Asp Leu Ala Pro Gly Thr Glu Asn Arg Gln Ile Phe
565 570 575
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580 585 590
Thr Val Lys Phe Asp Lys Gln Lys Pro Thr Gly His Tyr Pro Asp Thr
595 600 605
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610 615 620
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660 665 670
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850 855 860
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865 870 875 880
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885 890 895
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900 905 910
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915 920 925
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930 935 940
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His His His His His His
965
<210> 2
<211> 966
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
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225 230 235 240
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725 730 735
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740 745 750
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755 760 765
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770 775 780
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785 790 795 800
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885 890 895
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His His His His His His
965
<210> 3
<211> 966
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
Ile Pro Glu Lys Ile Pro Met Lys Pro Leu His Gly Pro Leu Tyr Gly
65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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245 250 255
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260 265 270
Gln Gly Glu Lys Gly Gly Trp Glu Pro Val Ser Asn Arg Pro Glu Lys
275 280 285
Thr Met Glu Glu Arg Trp Gln Gly Tyr Ser Lys Tyr Ile Arg Pro Glu
290 295 300
Gln Tyr Met Ile Gly Phe Ser Phe Tyr Glu Glu Asn Ala Gln Glu Gly
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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435 440 445
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
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<210> 7
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aactgtcttc tcttcgccca tggtatatct ccttct 36

Claims (5)

1.一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，其特征在于，所述方法为使用成分为8~15g/L的酵母粉、2~10g/L的甘油、20~30g/L的牛肉浸膏、2~10g/L的NaCl的发酵培养基进行发酵，所述发酵培养基的pH为5~9，所述发酵的条件为温度16~37℃、时间4~48h；所述生产菌株为表达糖苷内切酶Endo S及其突变体的大肠杆菌重组菌；所述大肠杆菌以糖苷内切酶Endo S及其突变体为目的基因，以pET-28a为表达载体，以大肠杆菌BL21为表达宿主；所述糖苷内切酶Endo S的氨基酸序列为SEQ ID NO.1；所述糖苷内切酶Endo S突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3。
2.如权利要求1所述的一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，其特征在于，所述发酵培养基的成分为10.0g/L的酵母粉、4.0g/L的甘油、25.4g/L的牛肉浸膏、5.0g/L的NaCl。
3.如权利要求2所述的一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，其特征在于，所述发酵培养基的pH为8.0。
4.如权利要求1-3任一项所述的一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，其特征在于，所述发酵的条件为温度20℃、时间24h。
5.权利要求1-4任一项所述的一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法在制备所述糖苷内切酶Endo S或其突变体方面的应用。
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