TW201842187A - 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本申請案是有關於一種包括果糖-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。

Description

製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法
本申請案是有關於一種包括果糖-4-差向異構酶的用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法。
塔格糖是少量存在於牛奶、乳酪、可可等食品、以及如蘋果與柑橘般具有甜味的天然水果的天然甜味料，塔格糖的物理性質亦與砂糖相似。塔格糖的卡路里為1.5 kcal/g（即砂糖的卡路里的1/3），血糖指數（Glycemic index，GI）為3（即砂糖的血糖指數的5%），然而，其具有與砂糖類似的甜味，並且具有各種健康功能性，故而可用作可同時滿足健康與口感的替代甜味料而應用至多種製品。
先前公知的塔格糖的製備方法有以半乳糖為主原料的化學（觸媒反應）方法與生物學（異構酶反應）方法（參照PCT WO 2006/058092、韓國註冊專利第10-0964091號及韓國註冊專利第10-1368731號）。然而，於上述先前的製備方法中，作為半乳糖的基礎原料的乳糖因國際市場中的生乳（raw milk）及乳糖的生產量、供需量等而價格存在不穩定性，導致塔格糖生產原料的穩定供需存在極限。因此，需要一種能夠以普遍的糖（砂糖、葡萄糖、果糖等）為原料來製備塔格糖的新的方法而對此進行了研究，上述文獻中揭示有分別自葡萄糖、半乳糖及果糖生產半乳糖、阿洛酮糖及塔格糖的方法（韓國註冊專利第10-744479號、韓國註冊專利第10-1057873號及韓國註冊專利第10-1550796號）。
另一方面，已知塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，酶學委員會（Enzyme Commission，EC）2.7.1.144）如下述[反應式1]般以三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP）與D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）與D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate），但並無針對上述塔格糖-6-磷酸激酶是否具有將果糖（D-fructose）轉化成塔格糖的活性的報告。
[反應式1] ATP＋D-塔格糖6-磷酸＜＝＞ADP＋D-塔格糖1,6-二磷酸
於此種背景下，本發明者等人為了開發一種具有將果糖轉化成塔格糖的活性的酶而進行銳意研究，結果確認到塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144）具有將果糖轉化成塔格糖的活性，藉此完成本申請案。
[發明欲解決的課題]
本申請案的一目的在於提供一種有效製備塔格糖的組成物，上述組成物包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物。
本申請案的另一目的在於提供一種塔格糖的製備方法，其包括使本申請案的果糖-4-差向異構酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物與果糖接觸而將果糖轉化成塔格糖的步驟。
以下，本申請案的其他目的及優點藉由隨附的發明申請專利範圍、圖式及下述詳細說明而變得更加明確。本說明書中未記載的內容可由在本申請案的技術領域或相似領域內具有常識者充分地認知、推導，因此省略其說明。
[解決課題的手段]
以下，具體地對本申請案的內容進行說明。另一方面，本申請案中揭示的一實施方式的說明及實施形態中的共通事項亦可應用於其他實施方式的說明及實施形態。另外，本申請案中所揭示的各種要素的所有組合均屬於本申請案的範疇。而且，本申請案的範疇並不限制於以下具體的記述。
為了達成本申請案的目的，本申請案的一實施方式提供一種包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物的用於生產塔格糖的組成物。
已知上述塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase，EC 2.7.1.144）是以ATP與D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產ADP與D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate）者，然而，例如可無限制地包括其他能夠以果糖為基質而生產塔格糖的物質。具體而言，以將作為基質的果糖轉化為塔格糖來定義轉化率，上述塔格糖-6-磷酸激酶的轉化率（轉化率（%）＝塔格糖重量/初始果糖重量×100）為0.01%以上、具體而言為1%以上、更具體而言為1.5%以上者。更具體而言，轉化率可為0.01%至40%的範圍、1%至30%的範圍、1.5%至25%的範圍或1.5%至23%的範圍。
具體而言，上述組成物可包括一種以上的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列構成的多肽、及與序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性的多肽。另外，只要為具有上述同源性且具有表現出與由上述序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列構成的蛋白質相應的功效（即，將果糖的第4碳位置差向異構化而轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性）的胺基酸序列的多肽，則即便具有一部分序列缺失、經修飾、經取代或經添加的胺基酸序列，亦當然包括於本申請案的範圍內。此外，作為由可根據公知的基因序列製備的探針、例如於嚴格的條件下與編碼上述多肽的鹼基序列的全部或一部分的互補序列雜交（hybridization）的聚核苷酸編碼的多肽，亦可無限制地包括具有果糖-4-差向異構化活性的多肽。
於本申請案中，揭示了“塔格糖-6-磷酸激酶”表現出將果糖的第4碳位置差向異構化而將果糖轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性，因此於本申請案中可與“果糖-4-差向異構酶”互換使用。
於本申請案中，用語“嚴格的條件”是指可實現聚核苷酸間的特異性雜交的條件。此種條件依存於聚核苷酸的長度及互補性程度，這些參數為本技術領域所熟知，諸如具體記載在文獻（例如，J. Sambrook等人，同源）中。例如，可列舉如下條件：同源性較高的基因彼此雜交、具有80%以上、90%以上、95%以上、97%以上或99%以上的同源性的基因彼此雜交、同源性低於上述的基因彼此不雜交的條件；或於通常的南方雜交的清洗條件，即於60℃、1×鹽水檸檬酸鈉（Saline Sodium Citrate，SSC）、0.1%十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）、具體而言60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、更具體而言68℃、0.1×SSC、0.1% SDS對應的鹽濃度及溫度下清洗1次、具體而言2次至3次的條件。上述雜交中所使用的探針可為鹼基序列的互補序列的一部分。此種探針能夠以根據公知序列製成的寡核苷酸為引子而藉由以包括此種鹼基序列的基因片段為模板的聚合酶鏈反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）製作。另外，業者可視需要而根據如探針長度的要素調節溫度及清洗溶液的鹽濃度。
於本申請案中，用語“同源性”是指兩個聚核苷酸或多肽部分間的一致性的百分比。自一個部分至另一部分為止的序列間同源性可藉由公知的相應技術而確定。例如，可藉由如下方式確定同源性：對序列資訊進行整列，利用可容易地獲得的電腦程式直接對兩個聚核苷酸分子或兩個多肽分子間的序列資訊（例如分值（score）、一致性（identity）及相似度（similarity）等參數）（parameter）進行整列（例如基礎局部比對檢索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）2.0）。另外，聚核苷酸間同源性可藉由如下方式確定：於在構成同源區域間的穩定雙鏈的條件下將聚核苷酸雜交後，分解成單鏈特異性核酸酶而確定所分解的片段的尺寸。
作為一實施例，申請案的果糖-4-差向異構酶可為來自耐熱性微生物的酶，例如，可為來自厭氧繩菌屬的酶、喜熱裂孢菌屬（The genus of Thermobifida）、熱厭氧桿菌屬（The genus of Thermoanaerobacter）的酶或其變異體、來自網團菌屬（The genus of Dictyoglomus）的酶或其變異體，具體而言，可為來自嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophila）、厭氧繩菌細菌（Anaerolineae bacterium）、Anaerolinea thermolimosa、喜熱裂孢菌桿菌（Thermobifida halotolerans）、Thermoanaerobacter indiensis或嗜熱網團菌（Dictyoglomus thermophilum）的酶或其變異體，但並不限制於此。
本申請案的果糖-4-差向異構酶或其變異體具有將D-果糖（fructose）的第4碳位置差向異構化而轉化成D-塔格糖的特徵，於本申請案中揭示了塔格糖-6-磷酸激酶（Tagatose-6-phosphate kinase）具有作為果糖-4-差向異構酶的活性。已知塔格糖-6-磷酸激酶是以D-塔格糖6-磷酸（D-tagatose 6-phosphate）為基質而生產D-塔格糖1,6-二磷酸（D-tagatose 1,6-biphosphate）者。也就是說，本申請案首次揭示塔格糖-6-磷酸激酶具有果糖-4-差向異構酶活性，因此，本申請案的一實施例是有關於一種包括於自果糖製備塔格糖時將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-4-差向異構酶的步驟的塔格糖-6-磷酸激酶的新的用途。另外，本申請案的一實施例是有關於一種將塔格糖-6-磷酸激酶用作果糖-4-差向異構酶而自果糖製備塔格糖的方法。
作為一實施例，本申請案的果糖-4-差向異構酶可為耐熱性較高的酶。具體而言，本申請案的果糖-4-差向異構酶可於50℃至70℃下表現出最大活性的50%至100%、60%至100%、70%至100%或75%至100%的活性。更具體而言，本申請案的果糖-4-差向異構酶可於55℃至60℃、60℃至70℃、65℃、60℃或70℃下表現出最大活性的80%至100%或85%至100%的活性。
進而，可分別為由序列號1構成的上述果糖-4-差向異構酶為由序列號2的核苷酸序列編碼者；由序列號3構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號4的核苷酸序列編碼者；由序列號5構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號6的核苷酸序列編碼者；由序列號7構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號8的核苷酸序列編碼者；由序列號9構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號10的核苷酸序列編碼者；由序列號11構成的果糖-4-差向異構酶為由序列號12的核苷酸序列編碼者，但並不限制於此。
本申請案的果糖-4-差向異構酶或其變異體可為藉由如下方式獲得者：於藉由表現本申請案的上述酶或其變異體的脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）（例如序列號2、序列號4、序列號6、序列號8、序列號10或序列號12的DNA）轉形至大腸桿菌（Escherichia coli，E. coli）等菌株後，對其進行培養而獲得培養物，對上述培養物進行粉碎而藉由管柱等進行精製。除大腸桿菌（Escherichia coli）以外，上述轉形用菌株還可為麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、米麴菌（Aspergillus oryzae）或枯草桿菌（Bacillus subtilis）等。
於具體例中，此種轉形的菌株為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANT_F4E（其另一名稱為大腸桿菌BL21（DE3）/pBT7-C-His-an1）、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_AB_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_DT_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANTA_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TH_F4E或大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TAI_F4E，其等分別依次以寄存編號KCCM11996P（寄存日期：2017年3月20日）、寄存編號KCCM12093P（寄存日期：2017年8月11日）、寄存編號KCCM12109P（寄存日期：2017年9月13日）、寄存編號KCCM12232P（寄存日期：2018年3月23日）、寄存編號KCCM12235P（寄存日期：2018年3月23日）、寄存編號KCCM12236P（寄存日期：2018年3月23日）寄存於作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms）。本申請案中使用的果糖-4-差向異構酶可利用編碼上述果糖-4-差向異構酶的核酸提供。
於本申請案中，用語“核酸”具有總括DNA分子或核糖核酸（Ribonucleic Acid，RNA）分子的含義，作為核酸的基本構成單元的核苷酸不僅可包括天然核苷酸，而且亦包括糖或鹼基位點經修飾的類似物（參照Scheit，核苷酸類似物（Nucleotide Analogs），John Wiley，New York (1980)；Uhlman及Peyman，化學綜述（Chemical Reviews），90: 543-584 (1990)）。
本申請案的核酸可為編碼本申請案的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列構成的多肽的核酸、或編碼與本申請案的果糖-4-差向異構酶具有至少80%、90%、95%、97%或99%的同源性且具有果糖-4-差向異構酶活性的多肽的核酸。具體而言，編碼由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列構成的上述果糖-4-差向異構酶的核酸可為分別與序列號2、序列號4、序列號6、序列號8、序列號10或序列號12的鹼基序列具有至少80%、90%、95%、97%、99%或100%的同源性的核酸。而且，本申請案的核酸可包括可藉由密碼簡並性（codon degeneracy）而轉譯成本申請案的果糖-4-差向異構酶的核酸，當然亦可包括如下核酸：於嚴格的條件下與由相對於序列號2、序列號4、序列號6、序列號8、序列號10或序列號12的上述鹼基序列為互補性的鹼基序列構成的核酸雜交，且編碼具有本申請案的果糖-4-差向異構酶活性的多肽。
可使用於本申請案的表現果糖-4-差向異構酶的微生物可為包括包含上述核酸的重組載體的微生物。上述載體可為以可使本申請案的核酸發揮作用的方式連接的形態。於本申請案中，用語“以可發揮作用的方式連接”通常是為了執行功能而鹼基表現調節序列與編碼靶蛋白的鹼基序列以可發揮作用的方式連接，從而可對編碼的鹼基序列的表現產生影響。可利用業界公知的基因重組技術以可發揮作用的方式與載體連接，可使用業界的剪切及連接酶等實現位點特異性DNA剪切及連接。
於本申請案中，用語“載體”是指用以將鹼基選殖及/或轉移至有機體（例如宿主細胞）的任意的介質。載體可為不同的DNA片段結合而可導入所結合的片段的複製的複製單元（replicon）。此處，“複製單元”是指於生物體內作為DNA自複製單元發揮功能、即可藉由自調節而實現複製的任意的遺傳單元（例如，質體、噬菌體、黏質體、染色體、病毒）。本申請案的用語“載體”可包括用以於試管內、生物體外或生物體內將鹼基導入至有機體（例如宿主細胞）的病毒介質及非病毒介質，可包括微環DNA、如睡美人（Sleeping Beauty）的轉位子（Izsvak等人，分子生物學雜誌（J. MoI. Biol.）302: 93-102 (2000)）、或人工染色體。作為通常使用的載體的示例，可列舉天然狀態或重組狀態的質體、黏質體、病毒及細菌噬菌體。例如，可使用pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A及Charon21A等作為噬菌體載體或黏質體載體，可使用pBR類、pUC類、pBluescriptII類、pGEM類、pTZ類、pCL類及pET類等作為質體載體。可使用於本申請案的載體並無特別限制，可使用公知的表現載體。
另外，上述載體可為以更包括各種抗生素抗性基因為特徵的重組載體。於本申請案中，用語“抗生素抗性基因”是對抗生素具有抗性的基因，具有該基因的細胞可存活於以相應的抗生素進行處理過的環境中，因此於在大腸桿菌中獲得大量質體的過程中有效地用作篩選標誌。於本申請案中，抗生素抗性基因並非為對本申請案的核心技術（即由載體的最佳組合實現的表現效率）產生較大影響的要素，因此可無限制地使用通常使用的抗生素抗性基因作為篩選標誌。作為具體的示例，可使用針對胺苄青黴素（ampicilin）、四環素（tetracyclin）、康黴素（kanamycin）、氯黴素（chloroamphenicol）、鏈黴素（streptomycin）或新黴素（neomycin）的抗性基因等。
可利用於本申請案的表現果糖-4-差向異構酶的微生物可利用將包括編碼上述酶的核酸的載體導入至宿主細胞內的方法，使上述載體轉形的方法可包括將核酸導入至細胞內的任一方法可選擇如於本技術領域內公知的適當的標準技術而執行。可包括電致孔（electroporation）、磷酸鈣共沉澱（calcium phosphate co-precipitation）、反轉錄病毒感染（retroviral infection）、顯微注射法（microinjection）、二乙胺乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）-葡聚糖（DEAE-dextran）、陽離子脂質體（cationic liposome）法及熱衝擊法等，但並不限制於此。
轉形的基因只要可於宿主細胞內表現，則可包括所有插入於宿主細胞的染色體內的形態及位於染色體外的形態。另外，上述基因只要為包括DNA及RNA作為可編碼多肽的聚核苷酸且可導入至宿主細胞內而表現者即可，因此可無限制地使用具有上述特徵者。例如，上述基因能夠以作為包括自表現所需的所有要素的聚核苷酸結構體的表現盒（expression cassette）形態導入至宿主細胞。上述表現盒通常可包括以可發揮作用的方式連接於上述基因的啟動子（promoter）、轉錄終止訊號、核糖體結合位點及轉譯終止訊號。上述表現盒可呈可實現自複製的表現載體形態。另外，上述基因亦可為如下者：以其本身的形態或聚核苷酸結構體的形態導入至宿主細胞而於宿主細胞內以可發揮作用的方式與表現所需的序列連接。
本申請案的微生物只要為包括本申請案的核酸或本申請案的重組載體而可生產本申請案的果糖-4-差向異構酶的微生物即可，因此可包括原核微生物及真核微生物中的任一種。例如，可包括屬於埃希氏菌（Escherichia）屬、歐文氏菌（Erwinia）屬、沙雷氏菌（Serratia）屬、普羅威登菌（Providencia）屬、棒狀桿菌（Corynebacterium）屬及短桿菌（Brevibacterium）屬的微生物菌株，具體而言，可為大腸桿菌（E. coli）或麩胺酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum），但並不限制於此。作為此種微生物的示例，有大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANT_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_AB_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_DT_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANTA_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TH_F4E或大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TAI_F4E。
本申請案的微生物可包括除上述核酸導入或載體導入以外可藉由各種公知方法表現本申請案的果糖-4-差向異構酶的所有微生物。
本申請案的微生物的培養物可為於培養基中培養表現本申請案的塔格糖-6-磷酸激酶的微生物而製備者。
於本申請案中，用語“培養”是指使上述微生物於適當地調節的環境條件下生長。本申請案的培養過程可利用業界熟知的適當的培養基與培養條件實現。此種培養過程可根據選擇的菌株而由業者容易地調整來使用。培養微生物的上述步驟並無特別限制，可藉由公知的批式培養方法、連續式培養方法、流加式培養方法等而執行。此時，培養條件並無特別限制，可使用鹼性化合物（例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀或氨）或酸性化合物（例如，磷酸或硫酸）調節最適pH值（例如，pH5至pH9，具體而言為pH7至pH9）。另外，可於培養中使用如脂肪酸聚二醇酯的消泡劑來抑制氣泡的產生，另外，為了保持培養物的好氧狀態而可向培養物中注入氧氣或含氧氣體，或為了保持厭氧狀態及微好氧狀態而可不注入氣體或注入氮氣、氫氣或二氧化碳氣體。培養溫度可保持為25℃至40℃、具體而言為30℃至37℃，但並不限制於此。培養時間可持續至獲得所期望的有用物質的生產量為止，具體而言，可培養約0.5小時至60小時，但並不限制於此。而且，使用的培養用培養基作為碳供給源可單獨或混合糖及碳水化合物（例如葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉及纖維素）、油脂及脂肪（例如，大豆油、葵花籽油、花生油及椰子油）、脂肪酸（例如，棕櫚酸、硬脂酸及亞麻油酸）、醇（例如，甘油及乙醇）與有機酸（例如，乙酸）等而使用，但並不限制於此。作為氮供給源，可單獨或混合含氮的有機化合物（例如，蛋白腖、酵母萃取液、肉汁、麥芽萃取液、玉米漿、大豆粕粉及尿素）或無機化合物（例如，硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨及硝酸銨）等而使用，但並不限制於此。作為磷供給源，可單獨或混合磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、與其對應的含鈉的鹽等而使用，但並不限制於此。另外，於培養基中可包括如金屬鹽（例如，硫酸鎂或硫酸鐵）、胺基酸及維生素的其他必需生長促進物質。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括果糖。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物包括具有將果糖直接轉化成塔格糖的果糖-4-差向異構化活性的塔格糖-6-磷酸激酶、表現上述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或上述微生物的培養物，能夠以不含有以果糖以外為底物的任何酶為特徵。
例如，能夠以如下情形為特徵：不包括α-葡聚糖磷酸化酶（α-glucan phosphorylase）、澱粉磷酸化酶（starch phosphorylase）、麥芽糊精磷酸化酶（maltodextrin phosphorylase）或蔗糖磷酸化酶（sucrose phosphorylase）、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物； 不包括葡萄糖激酶（glucokinase）、表現上述葡萄糖激酶的微生物或上述微生物的培養物； 不包括塔格糖-6-磷酸磷酸酶、表現上述塔格糖-6-磷酸磷酸酶的微生物或上述微生物的培養物；及/或 不包括α-澱粉酶（α-amylase）、支鏈澱粉酶（pullulanase）、葡萄糖澱粉酶（glucoamylase）、蔗糖酶（sucrase）或異澱粉酶（isoamylase）、表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物、或表現上述澱粉酶、支鏈澱粉酶、葡萄糖澱粉酶、蔗糖酶或異澱粉酶的微生物的培養物。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括通常使用於上述用於生產塔格糖的組成物的任意適當的賦形劑。作為此種賦形劑，例如可為保存劑、潤濕劑、分散劑、懸浮劑、緩衝劑、穩定劑或等張劑等，但並不限定於此。
本申請案的用於生產塔格糖的組成物可更包括金屬。於一實施例中，本申請案的金屬可為包括2價陽離子的金屬。具體而言，本申請案的金屬可為鎂、鎳或錳（Mn）。更具體而言，本申請案的金屬可為金屬離子或金屬鹽，更進一步具體而言，上述金屬鹽可為MgCl2 、MgSO4 、NiSO4 、NiCl2 、MnCl2 或MnSO4 。
本申請案的另一實施方式提供一種塔格糖製備方法，其包括使果糖（D-fructose）與本申請案的果糖-4-差向異構酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物接觸而將上述果糖轉化成塔格糖的步驟。
作為本申請案的一實施例，能夠以pH5.0至pH9.0的條件、30℃至80℃的溫度條件及/或0.5小時至48小時的條件執行上述接觸。
具體而言，可於pH6.0至pH9.0的條件或pH7.0至pH9.0的條件下執行本申請案的接觸。另外，可於35℃至80℃、40℃至80℃、45℃至80℃、50℃至80℃、55℃至80℃、60℃至80℃、30℃至70℃、35℃至70℃、40℃至70℃、45℃至70℃、50℃至70℃、55℃至70℃、60℃至70℃、30℃至65℃、35℃至65℃、40℃至65℃、45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、30℃至60℃、35℃至60℃、40℃至60℃、45℃至60℃、50℃至60℃或55℃至60℃的溫度條件下執行本申請案的接觸。而且，本申請案的接觸可執行0.5小時至36小時、0.5小時至24小時、0.5小時至12小時、0.5小時至6小時、1小時至48小時、1小時至36小時、1小時至24小時、1小時至12小時、1小時至6小時、3小時至48小時、3小時至36小時、3小時至24小時、3小時至12小時、3小時至6小時、6小時至48小時、6小時至36小時、6小時至24小時、6小時至12小時、9小時至48小時、9小時至36小時、9小時至24小時、9小時至12小時。
作為一實施例，可於存在金屬的條件下執行本申請案的接觸。
於本申請案的塔格糖製備方法中，本申請案的果糖-4-差向異構酶、表現上述酶的微生物、上述微生物的培養物、金屬、金屬離子及金屬鹽於其他實施方式中與上述實施方式相同。
本申請案的製備方法可更包括對所製備的塔格糖進行分離及/或精製的步驟。上述分離及/或精製可使用本申請案的技術領域內通常使用的方法，可使用透析、沉澱、吸附、電泳、離子交換層析法及分步結晶等作為非限制性的示例。上述精製可僅實施一種方法，亦可一併實施兩種以上的方法。
另外，本申請案的製備方法可更包括於上述分離及/或精製步驟前或上述分離及/或精製步驟後執行脫色及/或脫鹽的步驟。藉由實施上述脫色及/或脫鹽，可獲得品質更優異的塔格糖。
作為另一實施例，本申請案的製備方法於轉化成本申請案的塔格糖的步驟、進行分離及/或精製的步驟、或進行脫色及/或脫鹽的步驟後，可更包括將塔格糖結晶化的步驟。上述結晶化可使用通常使用的結晶化方法執行。例如，可使用冷卻結晶化方法執行結晶化。
作為另一實施例，本申請案的製備方法於上述結晶化步驟前，可更包括對塔格糖進行濃縮的步驟。上述濃縮可提高結晶化效率。
作為另一實施例，本申請案的製備方法可於本申請案的分離及/或精製步驟後，更包括使未反應的果糖與本申請案的酶、表現上述酶的微生物或上述微生物的培養物接觸的步驟，於本申請案的結晶化步驟後，更包括將結晶分離的母液再使用於上述分離及/或精製步驟的步驟或其組合。藉由上述追加步驟而能夠以更高的產率獲得塔格糖，可減少廢棄的果糖量而具有經濟性優點。
[發明效果]
本申請案的果糖-4-差向異構酶的耐熱性優異且可於產業上生產塔格糖，以較高的產率將普遍的糖（即果糖）轉化成塔格糖而具有經濟性較高的效果。
以下，藉由本申請案的實施例而更詳細地對本申請案進行說明。然而，下述實施例僅為本申請案的一示例，不可解釋為本申請案的內容限定於此。該等實施例用以更具體地對本發明進行說明，於本發明所屬的技術領域內具有常識者應明白，隨附的發明申請專利範圍中所揭示的本發明的範圍並不限制於該等實施例。
實 施例 1 ：塔格糖 -6- 磷酸激酶的製 備 及其 活性 評 估
實 施例 1-1 ： 包括 塔格糖 -6- 磷酸激酶基因的重 組 表 現 載體 及 轉 形體的製 備
為了提供新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自兩種嗜熱厭氧繩菌（Anaerolinea thermophilia）的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的載體及轉形微生物（轉形體）。
具體而言，以註冊於京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的嗜熱厭氧繩菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，向Bioneer委託合成基於嗜熱厭氧繩菌的胺基酸序列（序列號1）與鹼基序列（序列號2）及胺基酸序列（序列號7）與鹼基序列（序列號8）而插入至作為可表現於大腸桿菌中的載體的pBT7-C-His來製備的重組表現載體。為了使用重組表現載體，利用嗜熱厭氧繩菌的基因組（Genomic）DNA，利用引子1：ATATACATATGATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTG（序列號13）與引子2：TGGTGCTCGAGCCCGCACGCCGCAGCGTAATCTTCCAG（序列號14），且PCR條件如下：進行於94℃下變性2分鐘、於94℃下變性30秒、於60℃下退火30秒及於72℃下延長2分鐘的循環35次，最後於72℃下執行5分鐘的延長反應。
為了誘發蛋白質表現而轉形至作為大腸桿菌表現用菌株的BL21（DE3），命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANT_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANTA_F4E。於布達佩斯條約下，大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANT_F4E於2017年3月20日以寄存編號KCCM11996P寄存，大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANTA_F4E於2018年3月23日以寄存編號KCCM12232P寄存。
實 施例 1-2 ： 重 組 酶的製 備 及 精製
為了製備重組酶，將於上述實施例1-1中製備的作為轉形體的大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANT_F4E、大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_ANTA_F4E接種至包括包含胺苄青黴素（ampicillin）的5 ml的溶菌酶肉湯（Lysozyme Broth，LB）的液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB（Lysogeny broth）與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。上述培養過程中的攪拌速度為180 rpm，且培養溫度保持為37℃。於在4℃下以8,000 rpm對培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，再懸浮至包括10 mM的咪唑（imidazole）與300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液。利用細胞粉碎機（sonicator）對再懸浮的上述菌體進行粉碎，於在4℃下以13,000 rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。使用多聚組胺酸標籤（His-tag）親和層析法對上述上清液進行精製，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。最終流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製，利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析，之後獲得用以進行酶特性分析的兩種酶（CJ_ANT_F4E、CJ_ANTA_F4E）。其結果，確認到精製的重組果糖-4-差向異構酶藉由SDS-PAGE分析而CJ_ANT_F4E為約47 kDa（圖1）。
實 施例 1-3 ：自 果糖 向 塔格糖 的轉化活性的 評 估
為了測定於上述實施例1-2中獲得的酶的活性，使用30重量%的果糖，向此處添加50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）、1 mM的CoSO4 、於上述實施例1-2中分離的20 mg/ml的精製酶而於60℃的溫度下反應2小時。對藉由果糖-4-差向異構酶CJ_ANT_F4E、CJ_ANTA_F4E而轉化的塔格糖的濃度、與自果糖轉化成塔格糖的轉化率進行確認，結果CJ_ANT_F4E的轉化率為16.1%，CJ_ANTA_F4E的轉化率為21.9%。藉由下述式計算上述轉化率：轉化率＝塔格糖生成量/果糖基質濃度×100。
另外，利用HPLC對在反應後殘留的果糖與作為產物的塔格糖進行定量。使用的管柱為Shodex Sugar SP0810，將管柱溫度設為80℃，以1 ml/分的流速流加作為流動相的水。於圖2及圖10中，利用HPLC層析法對表示以果糖為基質的上述酶的反應的峰值進行檢測定量。
實 施例 1-4 ： 溫 度 對 果糖 -4- 差向 異構 化活性的影 響
為了調查溫度對本申請案的酶的差向異構化活性的影響，將於上述實施例1-2中製備的1 mg/ml的精製酶添加至包括果糖的50 mM的Tris HCl（pH值為8.0）緩衝溶液而於50℃至80℃下反應3小時，利用HPLC對反應結束液的塔格糖進行定量分析。其結果，本申請案的CJ_ANT_F4E酶於70℃下表現出最大活性（圖3）。
實 施例 2 ：塔格糖 -6- 磷酸激酶的製 備 及其 活性 評 估
實 施例 2-1 ： 包括 塔格糖 -6- 磷酸激酶基因的重 組 表 現 載體 及 轉 形體的製 備
本發明者等人獲得來自厭氧繩菌細菌（Anaerolineae bacterium）分類單元（Taxon）標識（Identity，ID）: 2654588098的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形微生物。
更具體而言，以註冊於KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）及歐洲核苷酸檔案（European Nucleotide Archive，ENA）的厭氧繩菌細菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於來自厭氧繩菌細菌的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_AB_F4E的胺基酸序列（序列號3）及鹼基序列（序列號4）資訊而製備包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組表現載體pBT7-C-His-CJ_AB_F4E（Bioneer（股份有限公司），韓國）。
上述各重組因子於藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook and Russell：分子選殖（Molecular cloning），2001）而轉形至大腸桿菌BL21（DE3）後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述轉形菌株命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_AB_F4E，於2017年8月11日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM12093P。
實 施例 2-2 ： 重 組 酶的製 備 及 精製
為了自來自根據上述實施例2-1而製備的轉形菌株大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_AB_F4E的CJ_AB_F4E獲得本申請案的重組酶，將上述各轉形微生物接種至包括包含胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180 rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。接著，於在4℃下以8,000 rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，再懸浮至包括10 mM的咪唑（imidazole）與300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液。利用細胞粉碎機（sonicator）對再懸浮的上述菌體進行粉碎，於在4℃下以13,000 rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。其次，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製，利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_AB_F4E。
實 施例 2-3 ： 重 組 酶的自果糖 轉化成 塔格糖 的活性的 評 估
為了測定於上述實施例2-2中獲得的本申請案的重組酶CJ_AB_F4E的活性，於30重量%的果糖中添加50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）、1 mM的NiSO4 及20 mg/mL的CJ_AB_F4E而於60℃下反應10小時。
利用HPLC對在反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度為80℃，以1 mL/min的流速流加作為流動相的水（圖4）。
根據實驗結果，確認到藉由上述酶而自果糖向塔格糖的轉化率為5.1%。
實 施例 2-4 ： 與溫 度 變 化 對應 的重 組 酶的活性的確 認
為了調查溫度對在上述實施例2-2中獲得的重組酶CJ_AB_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括10重量%的果糖的50 mM的Tris HCl（pH值為8.0）緩衝溶液中添加1 mg/mL的CJ_AB_F4E而於45℃、50℃、55℃、60℃及70℃的各溫度下反應3小時。於反應結束後，利用HPLC對反應液中的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果，可確認到CJ_AB_F4E酶於65℃下表現出最大活性，CJ_AB_F4E於50℃至70℃下保持最大活性的50%以上（圖5）。
實 施例 2-5 ： 藉由添加 金 屬 離子實現的重 組 酶的活性的確 認
已知先前公知的如葡萄糖異構酶及阿拉伯糖異構酶的異構酶及如阿洛酮糖3-差向異構酶的差向異構酶需要金屬離子。因此，亦對在上述實施例2-2中獲得的本申請案的重組酶CJ_AB_F4E確認金屬離子是否對果糖-4-差向異構化活性產生影響。
更具體而言，於包括10重量%的果糖的50 mM的Tris HCl（pH值為8.0）緩衝溶液中添加2 mg/mL的CJ_AB_F4E，且分別添加1 mM的各種金屬離子（NiSO4 、CaCl2 、ZnSO4 、MgSO4 、MnSO4 、FeSO4 、CuSO4 或(NH4 )2 SO4 ）而測定酶活性。將不進行金屬離子處理的情形設定為對照組。於上述反應結束後，利用HPLC對反應液中的塔格糖進行定量分析。
根據實驗結果可知，CJ_AB_F4E酶藉由添加MnSO4 或NiSO4 而活性增加，從而需要錳離子或鎳離子等金屬離子。特別是，確認到於添加NiSO4 的情形時表現出最大活性（圖6）。
實 施例 3 ：塔格糖 -6- 磷酸激酶的製 備 及其 活性 評 估
實 施例 3-1 ： 包括 塔格糖 -6- 磷酸激酶基因的重 組 表 現 載體 及 轉 形體的製 備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自嗜熱網團菌（Dictyoglomus thermophilum）DSM 3960的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形的重組微生物。
具體而言，以註冊於KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的嗜熱網團菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於來自嗜熱網團菌的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_DT_F4E的胺基酸序列（序列號5）及鹼基序列（序列號6）資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組表現載體pBT7-C-His-CJ_DT_F4E（Bioneer（股份有限公司），韓國）。
藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook and Russell：分子選殖，2001）將上述各重組載體轉形至大腸桿菌BL21（DE3）而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_DT_F4E，於2017年9月13日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM12109P。
實 施例 3-2 ： 重 組 酶的製 備 及 精製
為了自於在上述實施例3-1中製備的重組微生物菌株大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_DT_F4E製備重組酶CJ_DT_F4E，將各轉形微生物接種至包括包含胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180 rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000 rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10 mM的咪唑（imidazole）與300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液。利用細胞粉碎機（sonicator）對懸浮的上述菌體進行粉碎，於在4℃下以13,000 rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製，利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_DT_F4E。
實 施例 3-3 ： 重 組 酶的 自 果糖 轉化 成 塔格糖的 活性的 評 估
為了測定於上述實施例3-2中獲得的重組酶CJ_DT_F4E的活性，於30重量%的果糖中添加50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）、1 mM的MnSO4 及5 mg/mL的CJ_DT_F4E而於60℃下反應10小時。
利用HPLC對反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度為80℃，以1 mL/min的流速流加作為流動相的水（圖7）。
其結果，確認到藉由重組酶CJ_DT_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為2%。
實 施例 3-4 ： 與溫 度 對應 的重 組 酶的活性的確 認
為了調查溫度對在上述實施例3-2中獲得的重組酶CJ_DT_F4E的果糖-4-差向異構化活性的影響力，於包括5重量%的果糖的50 mM的Tris HCl（pH值為8.0）緩衝溶液中添加5 mg/mL的CJ_DT_F4E而於40℃、50℃、55℃、60℃及70℃下反應5小時。利用HPLC對反應結束液中的塔格糖進行定量分析。
其結果，確認到CJ_DT_F4E於60℃下表現出最大活性，於50℃至70℃下保持最大活性的80%以上的活性，於55℃至70℃下保持最大活性的95%以上的活性（表1及圖8）。
[表1]各溫 度的 相 對 活性 （ % ）
實 施例 3-5 ： 藉由添加 金 屬 實現的重 組 酶的活性的確 認
確認於上述實施例3-2中獲得的重組酶CJ_DT_F4E的金屬是否對果糖-4-差向異構化活性產生影響。
具體而言，於包括5重量%的果糖的50 mM的Tris HCl（pH值為8.0）緩衝溶液中添加5 mg/mL的CJ_DT_F4E，各添加1 mM的金屬離子MgSO4 、MnSO4 而測定酶活性。將不進行金屬離子處理的情形設定為對照組（w/o）。利用HPLC對上述反應結束液中的塔格糖進行定量分析。
其結果，CJ_DT_F4E藉由添加MnSO4 及MgSO4 而活性增加，從而確認到錳離子或鎂離子（或其鹽）可增加CJ_DT_F4E的果糖-4-差向異構化活性（圖9）。特別是，確認到添加MnSO4 的結果，CJ_DT_F4E的活性較對照組增加2.5倍以上（圖9）。
實 施例 4 ：塔格糖 -6- 磷酸激酶的製 備 及 其活性 評 估
實 施例 4-1 ： 包括 塔格糖 -6- 磷酸激酶基因的重 組 表 現 載體 及 轉 形體的製 備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自喜熱裂孢桿菌（Thermobifida halotolerans）的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形的重組微生物。
具體而言，以註冊於KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的喜熱裂孢桿菌基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於來自喜熱裂孢桿菌的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_DT_F4E的胺基酸序列（序列號9）及鹼基序列（序列號10）資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組表現載體pBT7-C-His-CJ_TH_F4E（Bioneer（股份有限公司），韓國）。
上述各重組因子於藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook and Russell：分子選殖，2001）轉形至大腸桿菌BL21（DE3）而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TH_F4E，於2018年3月23日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM12235P。
實 施例 4-2 ： 重 組 酶的製 備 及 精製
為了自於上述實施例4-1中製備的重組微生物菌株大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TH_F4E製備重組酶CJ_TH_F4E，將各轉形微生物接種至包括包含胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180 rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000 rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10 mM的咪唑（imidazole）與300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液。利用細胞粉碎機（sonicator）對懸浮的上述菌體進行粉碎，於在4℃下以13,000 rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製，利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_TH_F4E。
實 施例 4-3 ： 重 組 酶的自果糖 轉化成 塔格糖 的活性 評 估
為了測定於上述實施例4-2中獲得的重組酶CJ_TH_F4E的活性，於1重量%的果糖中添加50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）、1 mM的MnSO4 及4 mg/mL的CJ_TH_F4E而於55℃下反應4小時。
利用HPLC對反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度為80℃，以1 mL/min的流速流加作為流動相的水（圖11）。
其結果，確認到藉由重組酶CJ_TH_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為0.1%。
實 施例 5 ：塔格糖 -6- 磷酸激酶的製 備 及其 活性 評 估
實 施例 5-1 ： 包括 塔格糖 -6- 磷酸激酶基因的重 組 表 現 載體 及 轉 形體的製 備
為了發掘新的耐熱性的果糖-4-差向異構酶，獲得來自Thermoanaerobacter indiensis的塔格糖-6-磷酸激酶基因資訊而製備可表現於大腸桿菌中的重組載體及轉形的重組微生物。
具體而言，以註冊於KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）的Thermoanaerobacter indiensis基因序列為對象而選擇塔格糖-6-磷酸激酶基因序列，基於來自Thermoanaerobacter indiensis的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_TAI_F4E的胺基酸序列（序列號11）及鹼基序列（序列號12）資訊而合成包括上述酶的鹼基序列的可表現於大腸桿菌中的重組表現載體pBT7-C-His-CJ_TAI_F4E（Bioneer（股份有限公司），韓國）。
上述各重組載體於藉由熱衝擊（heat shock transformation，Sambrook and Russell：分子選殖，2001）轉形至大腸桿菌BL21（DE3）而製備重組微生物後，冷凍保管於50%甘油中待使用。將上述重組微生物命名為大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TAI_F4E，於2018年3月23日寄存至作為布達佩斯條約下的國際寄存機關的韓國微生物保存中心（Korean Culture Center of Microorganisms，KCCM）而被賦予寄存編號KCCM12236P。
實 施例 5-2 ： 重 組 酶的製 備 及 精製
為了自於上述實施例5-1中製備的重組微生物菌株大腸桿菌BL21（DE3）/CJ_TAI_F4E製備重組酶CJ_TAI_F4E，將各轉形微生物接種至包括包含胺苄青黴素（ampicillin）抗生素的5 mL的LB液體培養基的培養管，於37℃的振盪培養器中進行種菌培養直至600 nm的吸光度成為2.0為止。將種菌培養的該培養液接種至包括LB與含有作為蛋白質表現調節因子的乳糖的液體培養基的培養燒瓶而進行正式培養。於180 rpm的攪拌速度及37℃的條件下實施上述種菌培養及正式培養。此後，於在4℃下以8,000 rpm對上述培養液進行20分鐘的離心分離後回收菌體。利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液將所回收的菌體清洗2次，懸浮至包括10 mM的咪唑（imidazole）與300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液。利用細胞粉碎機（sonicator）對懸浮的上述菌體進行粉碎，於在4℃下以13,000 rpm對細胞粉碎物進行20分鐘的離心分離後僅取出上清液。於使用多聚組胺酸標籤親和層析法對上述上清液進行精製後，以填充劑的10倍的液量流加含有20 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液而去除可實現非特異性結合的蛋白質。此後，更流加含有250 mM的咪唑及300 mM的NaCl的50 mM的NaH2 PO4 （pH值為8.0）緩衝溶液進行溶出精製，利用50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）緩衝溶液進行透析而獲得用以進行酶特性分析的精製酶CJ_TAI_F4E。
實 施例 5-3 ： 重 組 酶的自果糖 轉化 成 塔格糖 的活性的 評 估
為了測定於上述實施例5-2中獲得的重組酶CJ_TAI_F4E的活性，於5重量%的果糖中添加50 mM的Tris-HCl（pH值為8.0）、1 mM的MnSO4 及5 mg/mL的CJ_TAI_F4E而於55℃下反應10小時。
利用HPLC對反應後殘留的果糖及作為產物的塔格糖進行定量。HPLC分析利用Shodex Sugar SP0810管柱，管柱溫度為80℃，以1 mL/min的流速流入作為流動相的水（圖12）。
其結果，確認到藉由重組酶CJ_TAI_F4E實現的自果糖向塔格糖的轉化率為8.7%。
無
圖1是表示藉由蛋白質電泳（十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE））對在本申請案的一實施例的轉形體中生成且分離的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_ANT_F4E）的分子量進行分析的結果。 圖2是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_ANT_F4E）具有果糖-4-差向異構酶活性的高效液相層析法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）的層析結果。 圖3是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_ANT_F4E）的果糖-4-差向異構化活性的與溫度變化對應的活性程度的圖表。 圖4是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_AB_F4E具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC層析圖表。 圖5是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_AB_F4E的與溫度變化對應的果糖-4-差向異構化活性的圖表。 圖6是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_AB_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。 圖7是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_DT_F4E表現出果糖-4-差向異構酶活性的HPLC層析圖表。 圖8是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_DT_F4E的與溫度變化對應的果糖-4-差向異構化活性的圖表。 圖9是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶CJ_DT_F4E的藉由添加金屬實現的果糖-4-差向異構化活性的圖表。 圖10是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_ANTA_F4E）具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果的圖表。 圖11是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_TH_F4E）具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果的圖表。 圖12是表示於本申請案的一實施例中製備的塔格糖-6-磷酸激酶（CJ_TAI_F4E）具有果糖-4-差向異構酶活性的HPLC層析結果的圖表。
[國外寄存資訊] 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM11996P 寄存日期：2017年3月20日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12093P 寄存日期：2017年8月11日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12109P 寄存日期：2017年9月13日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12232P 寄存日期：2018年3月23日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12235P 寄存日期：2018年3月23日 寄存機關名稱：韓國微生物保存中心 寄存編號：KCCM12236P 寄存日期：2018年3月23日
＜110＞ CJ CHEILJEDANG CORPORATION ＜120＞ 製備塔格糖組成物與使用其生產塔格糖之方法 ＜130＞ P18-6046 ＜150＞ KR 17/0042166 ＜151＞ 2017-03-31 ＜150＞ KR 17/0111494 ＜151＞ 2017-08-31 ＜150＞ KR 17/0158766 ＜151＞ 2017-11-24 ＜160＞ 14 ＜170＞ KoPatentIn 3.0 ＜210＞ 1 ＜211＞ 425 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_ANT_F4E,來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 1 Met Thr Ala Ile Leu Glu Asn Leu Ala Ala Ala Arg Arg Ala Gly Lys 1 5 10 15 Pro Ala Gly Ile Thr Ser Val Cys Ser Ala His Pro Val Val Leu Arg 20 25 30 Ala Ala Ile Arg Arg Ala Ala Ala Ser Gln Thr Ala Val Leu Ile Glu 35 40 45 Ala Thr Cys Asn Gln Val Asn His Leu Gly Gly Tyr Thr Gly Met Thr 50 55 60 Pro Arg Asp Phe Val Ala Phe Val Asn Ser Ile Ala Ala Glu Glu Gly 65 70 75 80 Leu Pro Ala Glu Leu Leu Ile Phe Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Asn 85 90 95 Pro Trp Arg Arg Glu Lys Ala Glu Asp Ala Leu Thr Lys Ala Ala Ala 100 105 110 Met Val Asp Ala Tyr Val Thr Ala Gly Phe Arg Lys Ile His Leu Asp 115 120 125 Ala Ser Met Gly Cys Ala Gly Glu Pro Ala Ala Leu Asp Asp Val Thr 130 135 140 Ile Ala His Arg Ala Ala Lys Leu Thr Ala Val Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Thr Glu Ala Gly Leu Pro Lys Pro Leu Tyr Ile Leu Gly Thr Glu Val 165 170 175 Pro Val Pro Gly Gly Ala Asp His Val Leu Glu Thr Val Ala Pro Thr 180 185 190 Glu Pro Gln Ala Ala Arg Asn Thr Ile Asp Leu His Arg Glu Ile Phe 195 200 205 Ala Gln His Gly Leu Ser Asp Ala Phe Glu Arg Val Ile Ala Phe Val 210 215 220 Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Ser Asp Asn Val Val Ala Tyr Asp 225 230 235 240 Pro Gln Ala Ala Gln Ser Leu Ser Ala Val Leu Asp Gly Glu Pro Arg 245 250 255 Leu Val Phe Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Glu Pro Ala Leu 260 265 270 Ala Ala Leu Val Arg Asp Gly Tyr Pro Ile Leu Lys Val Gly Pro Gly 275 280 285 Leu Thr Phe Ala Tyr Arg Glu Ala Leu Tyr Ala Leu Asp Met Ile Ala 290 295 300 Ser Glu Met Val Gly Thr Tyr Gly Asp Arg Pro Leu Ala Arg Thr Met 305 310 315 320 Glu Lys Leu Met Leu Ser Ala Pro Gly Asp Trp Gln Gly His Tyr His 325 330 335 Gly Asp Asp Ile Thr Leu Arg Leu Gln Arg His Tyr Ser Tyr Ser Asp 340 345 350 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Thr Arg Pro Glu Ala Leu Ala Ala Val Ser 355 360 365 Thr Leu His Lys Ala Leu Asp Gly Lys Thr Ile Pro Glu Thr Leu Leu 370 375 380 Arg Gln Tyr Leu Gly Glu Leu Pro Leu Ala Ala Val Ala Gly Lys Glu 385 390 395 400 Pro Glu Glu Val Leu Val Ala Ala Val Asp Gln Val Leu Ala Thr Tyr 405 410 415 His Ala Ala Thr Gly Glu Gly Arg His 420 425 ＜210＞ 2 ＜211＞ 1278 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_ANT_F4E,來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 2 atgaccgcca ttttggaaaa tctcgccgcc gcgcgccgcg ccggcaaacc tgcgggcatc 60 acttcggtct gctcggccca ccccgttgtc ctgcgcgccg caatccgccg cgccgccgcc 120 agtcaaacgg ccgtactgat cgaggccacc tgcaatcagg tcaatcatct cggtggttat 180 accggcatga caccgcgtga cttcgttgcc ttcgtcaaca gcatcgccgc ggaagaagga 240 ctgcccgccg aactgctgat ctttggcggc gatcatctcg gccccaatcc ctggcgcagg 300 gagaaggccg aggacgcgct gacaaaagcc gccgccatgg tcgacgccta tgtcacagct 360 ggttttcgca agatccacct tgatgcatcg atgggctgcg ccggtgagcc ggcagccctg 420 gatgacgtca ccatcgccca ccgcgccgcg aaactcacag ccgttgccga aaaggcagcc 480 actgaggctg gcctgccaaa accgctttat attctgggca ccgaagtgcc ggtgcccggc 540 ggtgccgacc atgtgcttga gaccgtcgca ccgaccgaac cgcaggcggc gcgcaacacc 600 atcgatcttc atcgcgaaat ctttgcgcag cacggtcttt ccgatgcgtt cgaacgggtc 660 atcgcctttg tcgtgcagcc gggtgtggaa ttcggcagcg acaatgtcgt cgcttatgat 720 ccgcaggcag cgcagagcct gagcgccgtg ctggatggcg aaccgcgact ggtcttcgaa 780 gcccattcga ccgattacca gaccgagcct gcccttgcgg cactggtacg cgacggatat 840 ccgatcctca aagttggacc gggcctcacc ttcgcttacc gggaagcgct ttatgcactc 900 gacatgatcg cctccgaaat ggtcggcacc tatggcgacc gaccgctggc gcggactatg 960 gaaaaattga tgttaagcgc gccgggcgac tggcagggcc attaccatgg cgacgacatc 1020 acgctccgat tgcaacgcca ttacagctac agcgaccgca tccgttacta ctggacgcga 1080 ccggaagcgc tcgcggccgt ttccaccttg cataaggcac tggatgggaa gacaattccc 1140 gaaaccctgc tgcgccaata tctcggcgaa ttgccgctcg cggcggttgc gggaaaggaa 1200 ccggaggagg ttctggtcgc ggcggtggat caggtgctgg cgacctatca cgcggcgacg 1260 ggcgaaggcc gccactga 1278 ＜210＞ 3 ＜211＞ 443 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_AB_F4E,來自Anaerolineae bacterium ＜400＞ 3 Met Thr Arg Asn Ser Pro Leu Ser Glu Val Ile Ala Ala Gln Lys Arg 1 5 10 15 Gly Glu Ser Arg Gly Ile Ala Ser Ile Cys Ser Ala Asn Pro Trp Val 20 25 30 Ile Glu Ala Met Leu Gln Gln Ala Arg Ala Thr Gly Glu Pro Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ser Thr Cys Asn Gln Val Asn Gln Phe Gly Gly Tyr Thr Gly 50 55 60 Trp Thr Pro Asp Gln Phe Met Ala Tyr Leu Arg Asp Leu Ala Pro Arg 65 70 75 80 Gln Glu Phe Pro Phe Asp His Ile Ile Val Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Ser Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ala Ala Ile Ala Met Asp Lys Ala 100 105 110 Lys Ile Leu Ile Arg Asp Cys Val Arg Ala Gly Tyr Thr Lys Ile His 115 120 125 Leu Asp Ala Ser Met Lys Cys Ala Asp Asp Asp Pro His Arg Pro Leu 130 135 140 Asp Thr Arg Ile Ser Ala Ala Arg Ala Ala Glu Leu Ala Gln Val Ala 145 150 155 160 Glu Lys Ala Phe Ser Glu His Pro Pro Gly Gly Ala Pro Pro Tyr Tyr 165 170 175 Val Ile Gly Thr Glu Val Pro Leu Pro Gly Gly Val Gln Glu Gln Glu 180 185 190 Glu Gly Leu Ser Val Thr Ser Ile Gly Asp Val Ala Gly Thr Ile Glu 195 200 205 Ser Thr Lys Glu Ala Phe Phe Ala Arg Gly Leu Glu Arg Ala Trp Glu 210 215 220 Arg Val Ile Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu Tyr Gly Asp Ala 225 230 235 240 Thr Leu Phe Glu Tyr Asp Arg Ala Arg Ala Ala Asp Leu Ala Arg Phe 245 250 255 Ile Glu Gly Tyr Asp Gly Leu Ile Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr 260 265 270 Gln Leu Ala Glu Ala Leu Arg Gln Leu Val Glu Asp His Phe Ala Ile 275 280 285 Leu Lys Val Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ser Phe Arg Glu Gly Val Phe 290 295 300 Ala Leu Ala Ala Ile Glu Glu Glu Leu Leu Ala Gly Arg Gln Asp Val 305 310 315 320 Glu Pro Ser Arg Val Arg Glu Val Leu Asp Lys Thr Met Leu Ala Asn 325 330 335 Pro Ile Tyr Trp Gln Lys Tyr Tyr Gln Gly Asp Asp Gln Ala Val His 340 345 350 Leu Lys Arg Lys Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ser Arg Tyr Tyr Trp Pro 355 360 365 Val Pro Glu Val Gln Phe Ser Leu Ser Arg Leu Ile Gln Asn Leu Gly 370 375 380 Glu Gln Pro Leu Pro Leu Thr Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Val Gln 385 390 395 400 Tyr Ala Arg Ile Arg Gly Gly Glu Ile Ala Asn Val Pro Arg Ala Ile 405 410 415 Leu Leu Asp Lys Val Arg Ser Val Leu Ser Asp Tyr Ser Tyr Ala Cys 420 425 430 Gly Tyr Leu Thr Gly Pro Ala Arg Arg Asn Arg 435 440 ＜210＞ 4 ＜211＞ 1332 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_AB_F4E,來自Anaerolineae bacterium ＜400＞ 4 atgactcgga actcgccctt atcagaggtg atcgctgccc agaaacgcgg cgagagcaga 60 gggatcgctt ccatatgctc ggccaatccc tgggtcatcg aggccatgct gcaacaggcc 120 cgcgcgaccg gcgaacctgt cctgatcgag tcgacctgca accaggtcaa tcaattcggc 180 ggctacaccg gttggacgcc ggatcaattc atggcctatc ttcgagattt ggcgccccgg 240 caagaatttc cctttgacca catcatcgtc ggcggcgatc atctcgggcc tagcccctgg 300 caagacgagc cggccgcgat agcgatggat aaggccaaga tcctgatccg ggattgcgtc 360 cgggcaggtt acaccaagat tcacctggac gccagcatga agtgcgccga cgacgatccc 420 catcggccgc tagataccag gatatctgcg gcccgggcgg ccgagctggc ccaggtggcc 480 gaaaaagcat tctccgagca cccaccaggc ggtgcgccgc cttattatgt gatcggcacc 540 gaggtgccct tgcccggtgg ggttcaggaa caggaggagg gattgagtgt taccagtata 600 ggcgacgtgg ccggaaccat tgaatcgacc aaagaagcct tttttgcacg aggcttagaa 660 agggcttggg aacgggtcat agccgtcgtg gtgcaacccg gcgtggagta tggtgatgcc 720 acgttatttg aatatgatcg ggctcgggcg gccgatctgg cccgatttat cgaaggttat 780 gatggcttga tatacgaagc gcattccact gattatcagt tagctgaggc actccggcag 840 ttggtagaag atcatttcgc catcttgaag gtggggccag cgctaacatt ttcatttcgg 900 gagggggttt ttgccctggc tgccatagaa gaggagctgt tggccgggcg acaggatgtc 960 gaaccgtcac gggtgcgcga agttctggat aagaccatgt tggctaatcc aatctactgg 1020 cagaagtatt atcagggaga tgaccaggcc gtacatttga aaaggaaata tagttttagt 1080 gaccgttccc gatactattg gccggttccc gaggtgcaat tttctttgtc ccgactaatt 1140 caaaatttgg gagagcagcc gctgcctcta acgctcttaa gccaatacct gccggtccaa 1200 tacgcccgaa tcagaggtgg cgaaatagcc aatgttcccc gggcgatcct cttggataag 1260 gtcagaagcg tactctctga ttactcatat gcatgcggtt atctgaccgg ccctgctaga 1320 agaaaccgct ga 1332 ＜210＞ 5 ＜211＞ 408 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_DT_F4E,來自Dictyoglomus thermophilum ＜400＞ 5 Met Trp Leu Ser Lys Asp Tyr Leu Arg Lys Lys Gly Val Tyr Ser Ile 1 5 10 15 Cys Ser Ser Asn Pro Tyr Val Ile Glu Ala Ser Val Glu Phe Ala Lys 20 25 30 Glu Lys Asn Asp Tyr Ile Leu Ile Glu Ala Thr Pro His Gln Ile Asn 35 40 45 Gln Phe Gly Gly Tyr Ser Gly Met Thr Pro Glu Asp Phe Lys Asn Phe 50 55 60 Val Met Gly Ile Ile Lys Glu Lys Gly Ile Glu Glu Asp Arg Val Ile 65 70 75 80 Leu Gly Gly Asp His Leu Gly Pro Leu Pro Trp Gln Asp Glu Pro Ser 85 90 95 Ser Ser Ala Met Lys Lys Ala Lys Asp Leu Ile Arg Ala Phe Val Glu 100 105 110 Ser Gly Tyr Lys Lys Ile His Leu Asp Cys Ser Met Ser Leu Ser Asp 115 120 125 Asp Pro Val Val Leu Ser Pro Glu Lys Ile Ala Glu Arg Glu Arg Glu 130 135 140 Leu Leu Glu Val Ala Glu Glu Thr Ala Arg Lys Tyr Asn Phe Gln Pro 145 150 155 160 Val Tyr Val Val Gly Thr Asp Val Pro Val Ala Gly Gly Gly Glu Glu 165 170 175 Glu Gly Ile Thr Ser Val Glu Asp Phe Arg Val Ala Ile Ser Ser Leu 180 185 190 Lys Lys Tyr Phe Glu Asp Val Pro Arg Ile Trp Asp Arg Ile Ile Gly 195 200 205 Phe Val Ile Met Leu Gly Ile Gly Phe Asn Tyr Glu Lys Val Phe Glu 210 215 220 Tyr Asp Arg Ile Lys Val Arg Lys Ile Leu Glu Glu Val Lys Lys Glu 225 230 235 240 Asn Leu Phe Val Glu Gly His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Lys Arg Ala 245 250 255 Leu Arg Asp Met Val Glu Asp Gly Val Arg Ile Leu Lys Val Gly Pro 260 265 270 Ala Leu Thr Ala Ser Phe Arg Arg Gly Val Phe Leu Leu Ser Ser Ile 275 280 285 Glu Asp Glu Leu Ile Ser Glu Asp Lys Arg Ser Asn Ile Lys Lys Val 290 295 300 Val Leu Glu Thr Met Leu Lys Asp Asp Lys Tyr Trp Arg Lys Tyr Tyr 305 310 315 320 Lys Asp Ser Glu Arg Leu Glu Leu Asp Ile Trp Tyr Asn Leu Leu Asp 325 330 335 Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp Glu Tyr Lys Glu Ile Lys Ile Ala Leu Asn 340 345 350 Arg Leu Phe Glu Asn Phe Ser Glu Gly Val Asp Ile Arg Tyr Ile Tyr 355 360 365 Gln Tyr Phe Tyr Asp Ser Tyr Phe Lys Val Arg Glu Gly Lys Ile Arg 370 375 380 Asn Asp Pro Arg Glu Leu Ile Lys Asn Glu Ile Lys Lys Val Leu Glu 385 390 395 400 Asp Tyr His Tyr Ala Val Asn Leu 405 ＜210＞ 6 ＜211＞ 1227 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_DT_F4E,來自Dictyoglomus thermophilum ＜400＞ 6 atgtggctta gtaaagatta tttgagaaaa aagggagttt attctatatg tagctctaat 60 ccatatgtga ttgaggcaag tgttgaattt gctaaggaga agaatgatta tattttaatt 120 gaggcgacac ctcatcagat aaaccagttt ggtggatatt caggtatgac tcccgaagat 180 tttaaaaact ttgtaatggg aataataaaa gaaaagggaa tagaagagga tagggtgatt 240 cttggagggg accatttagg ccctctccct tggcaagatg aaccttcttc ttctgcaatg 300 aaaaaggcaa aagaccttat aagggccttt gtggagagtg gttataagaa gatacacctt 360 gattgtagta tgtctctttc tgatgatcct gtagtgctct ctcccgagaa gatagcagaa 420 agggagaggg aacttcttga ggttgcagaa gagactgcta gaaagtacaa ttttcagcct 480 gtgtatgtgg tgggaactga tgtaccggta gctggaggag gcgaagagga aggtattacc 540 tcagtggagg attttagagt agcaatctcc tctttaaaaa aatattttga ggatgttcca 600 aggatatggg ataggataat tggttttgta ataatgcttg gtataggttt taattatgaa 660 aaagtgtttg agtatgacag gattaaggtg agaaaaattt tagaggaggt aaagaaagag 720 aatctttttg ttgaaggtca ctctactgac tatcagacaa aacgtgcatt gagagatatg 780 gtagaggatg gagtaagaat tcttaaggtt ggtcctgctt taacagcaag ttttagaagg 840 ggagtatttt tattaagtag cattgaggat gagcttatat cggaagataa aaggtctaat 900 attaagaaag ttgtgcttga gactatgtta aaagatgata aatattggag aaagtattat 960 aaggattcag aaagattaga attagatatt tggtacaact tacttgatag gattagatat 1020 tattgggaat ataaagagat aaaaatagct ttaaataggc tttttgaaaa tttttcggaa 1080 ggggttgata ttagatacat ctatcaatat ttttatgatt cgtattttaa agtaagagaa 1140 ggaaaaataa gaaatgatcc aagggagcta ataaagaatg aaataaagaa ggtcttggag 1200 gactatcact atgctgtaaa cttataa 1227 ＜210＞ 7 ＜211＞ 429 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_ANTA_F4E,來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 7 Met Met Phe Gly Ser Pro Ala Pro Leu Leu Asp Met Val Thr Ala Gln 1 5 10 15 Lys Gln Gly Met Ala Arg Gly Ile Pro Ser Ile Cys Ser Ala His Pro 20 25 30 Val Val Leu Ser Ala Ala Cys His Leu Ala Arg Arg Ser Gly Ala Pro 35 40 45 Leu Leu Ile Glu Thr Thr Cys Asn Gln Val Asn His Gln Gly Gly Tyr 50 55 60 Ser Gly Met Thr Pro Ala Asp Phe Val Arg Phe Leu Arg Glu Ile Leu 65 70 75 80 Glu Arg Glu Gly Ile Pro Pro Gln Gln Val Ile Leu Gly Gly Asp His 85 90 95 Leu Gly Pro Tyr Pro Trp Arg Lys Glu Pro Ala Glu Thr Ala Ile Ala 100 105 110 Gln Ala Leu Glu Met Val Arg Ala Tyr Val Gln Ala Gly Tyr Thr Lys 115 120 125 Ile His Leu Asp Ala Ser Met Pro Cys Ala Asp Asp Asp Pro Glu Arg 130 135 140 Pro Leu Pro Leu Glu Arg Ile Ala Arg Arg Ala Ala Gln Leu Cys Ala 145 150 155 160 Ala Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Val Gln Pro Val Tyr Val Ile Gly 165 170 175 Ser Glu Val Pro Pro Pro Gly Gly Ala Gln Gly Gln Glu Ala Arg Leu 180 185 190 His Val Thr Thr Pro Gln Glu Ala Gln Ala Ala Leu Asp Ala Phe Arg 195 200 205 Glu Ala Phe Leu Gln Ala Gly Leu Thr Pro Val Trp Glu Arg Val Ile 210 215 220 Ala Leu Val Val Gln Pro Gly Val Glu Phe Gly Val Asp Ser Ile His 225 230 235 240 Ala Tyr Gln Arg Glu Ala Ala Arg Pro Leu Lys Thr Phe Ile Glu Gly 245 250 255 Val Pro Gly Met Val Tyr Glu Ala His Ser Thr Asp Tyr Gln Thr Arg 260 265 270 Ala Ser Leu Arg Ala Leu Val Glu Asp His Phe Ser Ile Leu Lys Val 275 280 285 Gly Pro Ala Leu Thr Phe Ala Tyr Arg Glu Ala Val Phe Ala Leu Glu 290 295 300 His Ile Glu Arg Glu Ile Leu Gly Arg Gln Asp Met Pro Leu Ser Arg 305 310 315 320 Leu Ser Glu Val Leu Asp Glu Val Met Leu Asn Asp Pro Arg His Trp 325 330 335 Gln Gly Tyr Phe Ala Gly Ala Pro Ala Glu Gln Ala Leu Ala Arg Arg 340 345 350 Tyr Ser Phe Ser Asp Arg Ile Arg Tyr Tyr Trp His His Pro Ala Ala 355 360 365 Gln Glu Ala Val Arg Arg Leu Leu Ala Asn Leu Ile Glu Thr Pro Pro 370 375 380 Pro Leu Ser Leu Leu Ser Gln Tyr Leu Pro Arg Glu Tyr Glu Met Val 385 390 395 400 Arg Ala Gly Glu Ile Ser Ser His Pro Gln Asp Leu Ile Arg Ala His 405 410 415 Ile Gln His Thr Leu Glu Asp Tyr Ala Ala Ala Cys Gly 420 425 ＜210＞ 8 ＜211＞ 1290 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_ANTA_F4E,來自Anaerolinea thermophila ＜400＞ 8 atgatgttcg gctcgcctgc tcccctgctg gatatggtca ccgcgcagaa acagggcatg 60 gcgcggggta tcccatccat ttgttcggca catccggtgg tgctgagtgc cgcctgccat 120 cttgcccgcc ggagcggcgc gcccctgctc atcgaaacca cctgcaatca ggtcaaccac 180 caaggtgggt acagcggcat gacccccgcc gattttgtcc gctttctgcg cgaaattctg 240 gaacgggaag gtattccccc gcaacaggtc atcctgggcg gggatcacct gggtccttac 300 ccctggcgga aagagcctgc cgaaaccgcc atagcacaag cgctggaaat ggtgcgggca 360 tacgtgcagg caggctacac caaaattcat ctggacgctt ccatgccctg cgccgatgac 420 gaccccgagc gtcccctgcc gctggagcgc atagcccgac gggcggcgca gttgtgcgcc 480 gccgccgaag ccgccgcggg agcggttcag ccggtgtacg taattggcag tgaggtgccc 540 ccgcccggcg gcgcgcaggg tcaggaggca agacttcacg tcaccactcc gcaggaagcc 600 caagccgcgc tggatgcctt tcgggaagcc tttctgcagg caggcttgac tcccgtttgg 660 gagcgggtca ttgcgctggt agtccagccg ggggtggagt ttggcgtgga cagcattcac 720 gcctatcagc gcgaagccgc ccgcccgctg aagaccttca tcgagggcgt gcccggcatg 780 gtgtatgaag cccactcgac cgattaccag acccgtgcct ccctgcgtgc gctggtggaa 840 gaccactttt ccattctcaa ggttggtccg gcactaacct ttgcctaccg cgaagccgtg 900 ttcgccctgg aacacatcga acgggaaata ttgggcaggc aggatatgcc tctctcccgc 960 ctgagtgaag tcctcgacga ggtgatgctg aacgatccac gccactggca gggatacttt 1020 gccggcgctc ccgccgaaca ggcgctggcg cgccgctaca gtttcagcga ccgcattcgc 1080 tattactggc accatcccgc cgcgcaggaa gccgtgcgga gactgctcgc caacctgatc 1140 gaaaccccgc cgccgctgag tttgctcagc cagtacctgc cgcgcgagta tgagatggtg 1200 cgcgcggggg aaatctccag ccacccgcag gacctgattc gggcacatat ccagcacacg 1260 ctggaagatt acgctgcggc gtgcgggtaa 1290 ＜210＞ 9 ＜211＞ 394 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_TH_F4E,來自Thermobifida halotolerans ＜400＞ 9 Met Ser Val Ile Pro Lys Glu Thr Gly Val Ser Pro Ser Arg Leu Asn 1 5 10 15 Val Pro Ser Arg Leu Gly Val Gly Pro Met Ser Lys Asn Ala Val Asp 20 25 30 Ala Ala Ile Ser Val Ala Ala Arg Ala Asp Gln Pro Leu Met Leu Ile 35 40 45 Pro Ser Arg Arg Gln Val Glu Ala Ala Ser Gln Gly Gly Gly Tyr Val 50 55 60 Glu Gln Trp Asp Thr Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Val Arg Arg Asn Asp 65 70 75 80 Leu Val Gly Arg Ile Leu Leu Cys Arg Asp His Gly Gly Pro Tyr Gln 85 90 95 Ser Pro Arg Glu Arg Glu Gln Arg Leu Pro Leu Asp Ala Ala Met Ala 100 105 110 Ser Ala Leu Glu Ser Tyr Lys Glu Asp Ile Arg Cys Gly Phe Asp Leu 115 120 125 Leu His Ile Asp Thr Ser Met Asp Leu Asp Gly Val Ala Asp Glu Ser 130 135 140 Ala Ala Ile Asp Arg Ala Leu Glu Leu Tyr Gly Gln Cys Val Glu Phe 145 150 155 160 Ala Arg Ser Gln Gly Arg Glu Val Met Phe Glu Ile Gly Phe Glu Asp 165 170 175 Gln Gly Arg Asp Thr Asn Asp Pro Phe Glu Phe Gln Glu Leu Leu Asp 180 185 190 Glu Ala Leu Glu Gly Leu Arg Lys Ala Asp Leu Pro Ala Pro Thr Phe 195 200 205 Val Val Ala Gln Thr Gly Thr Lys Val Val Glu Thr Gly Asn Thr Gly 210 215 220 Gly Ile Gly Val Ala Pro Ser Ala Val Gly Val Ala Val Arg Ala Leu 225 230 235 240 Ala Asp Val Val Glu Arg Asn Gly Ile Ala Leu Lys Ala His Asn Cys 245 250 255 Asp Tyr Leu Asp Glu Ser Thr Val Gly Tyr Leu Ala Ala Ser Gly Val 260 265 270 His Ala Leu Asn Val Ala Pro Glu Phe Gly Val Val Glu Thr Arg Ala 275 280 285 Phe Ile Gly Val Leu Gln Glu Leu Gly Leu Gly Val Gln Arg Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Ala Leu Ala Tyr Glu Ser Gly Ser Trp Lys Lys Trp Met Ala 305 310 315 320 Gln Asn Thr Thr Ala Thr Asp Tyr Asp Arg Ala Val Ile Ala Gly His 325 330 335 Tyr Val Tyr Gly Thr Asp Glu Phe Lys Glu Ile Lys Thr Ala Ala Gln 340 345 350 Gln Ile Ala Gln Ser Arg Gly Ile Asp Val Asp Thr Arg Leu Arg Glu 355 360 365 Ala Val Ala Ala Ser Ile Glu Asn Tyr Ala Arg Pro Leu Arg Glu Val 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala Ala Ala 385 390 ＜210＞ 10 ＜211＞ 1185 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_TH_F4E,來自Thermobifida halotolerans ＜400＞ 10 atgtccgtta tcccgaaaga gaccggtgtt tccccgagcc gactgaatgt tccctcacgg 60 ctgggggtgg gaccgatgtc gaagaacgcg gtggacgcgg cgatcagcgt ggcggcccgc 120 gccgaccagc cgctgatgct catccccagc cggcgccagg tcgaggcggc gtctcagggc 180 ggcggctacg tcgagcagtg ggacaccgcg gcgttcgccg actacgtgcg ccgcaacgac 240 cttgtgggac ggatcctgct gtgcagggac cacggaggcc cctaccagtc cccgcgggag 300 cgggagcagc ggctccccct cgacgcggcg atggcctccg cgctggagtc ctacaaggag 360 gacatccgct gcggtttcga cctgctgcac atcgacacct ccatggacct cgacggagtc 420 gccgacgagt cggcggcgat cgaccgggcg ctggagctct acgggcagtg cgtcgagttc 480 gcccgttccc aggggcggga ggtgatgttc gagatcggct tcgaggacca gggaagggac 540 accaacgacc cgttcgagtt ccaggagctc ctcgacgagg cgctggaggg gctgcgcaag 600 gcggacctgc ccgccccgac cttcgtcgtc gcgcagacgg ggaccaaggt cgtcgagacc 660 ggcaacaccg gcgggatcgg ggtcgcgccc agcgcggtcg gtgtcgccgt gcgcgcgctg 720 gccgacgtcg tggagcggaa cggcatcgcc ctcaaggcgc acaactgcga ctacctggac 780 gagagcacgg tcgggtacct ggccgcctcc ggtgtgcacg cgctgaacgt cgctccggag 840 ttcggcgtgg tcgagacgcg ggcgttcatc ggcgtactgc aggagctggg cctgggcgtg 900 cagcgggagc gcttcctcgc cctggcctac gagtccggct cgtggaagaa gtggatggcc 960 cagaacacca cggccaccga ctacgaccgc gccgtgatcg ccggccacta cgtctacggc 1020 acggacgagt tcaaggagat caagaccgcg gcccagcaga tcgcgcagtc ccggggcatc 1080 gacgtcgaca cccggctgcg tgaggccgtc gccgcgtcga tcgagaacta cgcgcgaccg 1140 ctgcgcgaag tcgccgcggc ggcttccgcc cccgcggcgg cgtga 1185 ＜210＞ 11 ＜211＞ 446 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的胺基酸序列,CJ_TAI_F4E,來自Thermoanaerobacter indiensis ＜400＞ 11 Met Asn Thr Glu His Pro Leu Lys Asn Val Val Lys Leu Gln Lys Lys 1 5 10 15 Gly Ile Pro Ile Gly Ile Tyr Ser Val Cys Ser Ala Asn Glu Ile Val 20 25 30 Ile Gln Val Ala Met Glu Lys Ala Leu Ser Met Asp Ser Tyr Val Leu 35 40 45 Ile Glu Ala Thr Ala Asn Gln Val Asn Gln Tyr Gly Gly Tyr Thr Asn 50 55 60 Met Lys Pro Ile Asp Phe Arg Asp Phe Val Tyr Ser Ile Ala Lys Arg 65 70 75 80 Ile Asn Phe Pro Glu Asn Arg Ile Ile Leu Gly Gly Asp His Leu Gly 85 90 95 Pro Leu Pro Trp Lys Asn Gln Gln Ala Lys Lys Ala Met Glu Glu Ala 100 105 110 Lys Glu Leu Val Lys Gln Phe Val Met Ala Gly Phe Thr Lys Ile His 115 120 125 Val Asp Thr Ser Met Phe Leu Gly Asp Asp Asn Ile Asn Ile Lys Leu 130 135 140 Asp Thr Glu Thr Ile Ala Glu Arg Gly Ala Ile Leu Val Ser Val Ala 145 150 155 160 Glu Arg Ala Phe Glu Glu Leu Lys Lys Ser Asn Pro Tyr Ala Leu His 165 170 175 Pro Val Tyr Val Ile Gly Ser Glu Val Pro Val Pro Gly Gly Ser Gln 180 185 190 Lys Glu Asn Asn Asn Glu Ile Gln Val Thr Lys Pro Ala Asp Phe Glu 195 200 205 Glu Thr Val Glu Val Tyr Lys Ser Thr Phe Tyr Lys Tyr Gly Leu Gly 210 215 220 Asn Ala Trp Glu Asp Val Val Ala Val Val Val Gln Pro Gly Val Glu 225 230 235 240 Phe Gly Val Glu Asn Ile His Glu Tyr Asp His Gln Gln Ala Glu Asn 245 250 255 Leu Val Ser Ala Leu Lys Lys Tyr Pro Asn Leu Val Phe Glu Ala His 260 265 270 Ser Thr Asp Tyr Gln Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Met Val Arg Asp 275 280 285 Gly Phe Ala Ile Leu Lys Val Gly Pro Glu Leu Thr Phe Ala Leu Arg 290 295 300 Glu Gly Leu Phe Ala Leu Asn Ile Ile Glu Lys Glu Leu Phe Lys Asp 305 310 315 320 Asn His Asp Ile Glu Met Ser Asn Phe Ile Asp Ile Leu Asp Thr Ala 325 330 335 Met Leu Asn Asn Pro Lys Tyr Trp Glu Gln Tyr Tyr Tyr Gly Asp Asp 340 345 350 Asn Lys Ile Arg Ile Ala Arg Lys Tyr Ser Tyr Ser Asp Arg Cys Arg 355 360 365 Tyr Tyr Leu Ile Glu Asn Glu Val Arg Ala Ser Met Ser Arg Leu Phe 370 375 380 Lys Asn Leu Thr Asn Val Glu Ile Pro Leu Thr Leu Ile Ser Gln Tyr 385 390 395 400 Met Pro Ile Gln Tyr Glu Lys Ile Arg Met Gly Leu Leu Lys Asn Asp 405 410 415 Pro Glu Asn Leu Val Lys Asp Lys Ile Gly Asn Cys Ile Asp Lys Tyr 420 425 430 Leu Tyr Ala Thr Asn Pro Thr Ser Gly Glu Phe Lys Leu Ile 435 440 445 ＜210＞ 12 ＜211＞ 1341 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 塔格糖-6-磷酸激酶的DNA序列,CJ_TAI_F4E,來自Thermoanaerobacter indiensis ＜400＞ 12 atgaatacag aacatccttt gaaaaacgtt gttaaactac aaaaaaaggg aattccaata 60 ggtatttatt cagtttgtag tgcaaatgaa atagttattc aagttgcaat ggagaaggca 120 ttgagtatgg atagttatgt tttaattgaa gcaacggcta atcaagtaaa tcaatatggt 180 ggctatacga atatgaaacc tattgatttt agagattttg tgtattctat agccaaaagg 240 ataaacttcc cagaaaatag aataatcctt ggcggggacc acttaggacc tttgccatgg 300 aaaaatcaac aagcgaaaaa agcaatggaa gaagcaaaag aacttgttaa acaatttgtg 360 atggctggct ttacgaaaat tcatgtagat acaagtatgt ttcttggaga tgataacata 420 aatatcaaac tagatactga aactattgcg gagagaggag cgatacttgt atcagtagca 480 gaaagagctt ttgaggagtt aaaaaagtct aatccttatg ctcttcatcc agtttatgta 540 ataggtagtg aagttcctgt tccaggaggt tctcaaaaag aaaataataa tgaaatacaa 600 gtaacaaagc cggcggattt tgaagaaact gtggaagtgt ataaaagcac tttctataaa 660 tatggtttag gaaacgcatg ggaagatgtt gtagcagtgg ttgtgcagcc tggggtggaa 720 tttggagttg aaaatattca tgaatatgat caccaacagg ctgaaaattt agtaagtgct 780 ttaaaaaagt atcctaattt agtatttgaa gcccactcta cggattatca acctgcaaaa 840 ctactaaaag aaatggtgag agatggattt gctatactta aagttggacc tgaattgact 900 tttgcattaa gggaaggatt gtttgctctg aatattatag aaaaagaatt atttaaagat 960 aatcatgata ttgagatgtc aaattttatt gatatccttg atacagcaat gttaaataat 1020 ccgaagtatt gggaacagta ttattacggt gatgataata aaattagaat tgctagaaaa 1080 tacagctatt ctgatagatg taggtattat ctaatcgaaa atgaagttag agcatctatg 1140 tctaggttgt ttaaaaattt aacaaatgtt gagataccat taaccttaat aagtcagtat 1200 atgcctattc aatatgaaaa aattagaatg ggactattaa aaaatgatcc tgagaattta 1260 gtaaaagata aaattggaaa ttgcattgat aagtatttgt atgctactaa tccgacaagt 1320 ggagaattta aactaatata a 1341 ＜210＞ 13 ＜211＞ 38 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_ANT_F4E或CJ_ANTA_F4E的引子DNA序列 ＜400＞ 13 atatacatat gatgttcggc tcgcctgctc ccctgctg 38 ＜210＞ 14 ＜211＞ 38 ＜212＞ DNA ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ CJ_ANT_F4E或CJ_ANTA_F4E的引子DNA序列 ＜400＞ 14 tggtgctcga gcccgcacgc cgcagcgtaa tcttccag 38

Claims (6)

  1. 一種用於生產塔格糖的組成物，其包括塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖的組成物，其更包括果糖。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖的組成物，其包括一種以上的由序列號1、序列號3、序列號5、序列號7、序列號9或序列號11的胺基酸序列構成的塔格糖-6-磷酸激酶。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的用於生產塔格糖的組成物，其中所述塔格糖-6-磷酸激酶為來自厭氧繩菌屬、喜熱裂孢菌屬、熱厭氧桿菌屬或網團菌屬的酶或其變異體。
  5. 一種塔格糖的製備方法，其包括使果糖與塔格糖-6-磷酸激酶、表現所述塔格糖-6-磷酸激酶的微生物或所述微生物的培養物接觸而將所述果糖轉化成塔格糖的步驟。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的塔格糖的製備方法，其中以pH5.0至pH9.0的條件、30℃至80℃的溫度條件或0.5小時至48小時的條件執行所述接觸。
TW107111500A 2017-03-31 2018-03-31 用於生產塔格糖的組成物及利用其生產塔格糖的方法 TWI704227B (zh)

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