JP2020511974A - タガトース生産用組成物及びこれを用いたタガトースの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ATP+D−タガトース6−リン酸 <=> ADP+D−タガトース1,6二リン酸
グルコキナーゼ(glucokinase)、これを発現する微生物または前記微生物の培養物;
タガトース−6−リン酸脱リン酸化酵素、これを発現する微生物または前記微生物の培養物;及び/または
α−アミラーゼ(α−amylase)、プルラナーゼ(pullulanase)、グルコアミラーゼ(glucoamylase)、スクラーゼ(sucrase)またはイソアミラーゼ(isoamylase);前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物;または前記アミラーゼ、プルラナーゼ、グルコアミラーゼ、スクラーゼまたはイソアミラーゼを発現する微生物の培養物を含まないことを特徴としてもよい。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を提供するために、2種のAnaerolinea thermophileに由来したタガトース−6−リン酸キナーゼの遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能ベクター及び形質転換微生物(形質転換体)を製造した。
ATATACATATGATGTTCGGCTCGCCTGCTCCCCTGCTG(配列番号13)とプライマー2:
TGGTGCTCGAGCCCGCACGCCGCAGCGTAATCTTCCAG(配列番号14)を用いて、PCR条件は、94℃で2分間変性した後、94℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で2分の伸長を35回繰り返した後、72℃で5分間伸長反応を行った。
組換え酵素を製造するために、前記実施例1−1で製造した形質転換体であるE.coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E、E.coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4Eをアンピシリン(ampicillin)が含まれたLB液体培地5mlを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLB(Lysogeny broth)とタンパク質発現調節因子であるラクトースが含有された液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記培養過程中の撹拌速度は180rpmであり、培養温度は37℃が維持されるようした。培養液は8,000rpmで、4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体は、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mM イミダゾール(imidazole)及び300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に再懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物は13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液はHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製し、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。最終的に250mM イミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝液を流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析した後、酵素特性解析のための酵素2種(CJ_ANT_F4E、CJ_ANTA_F4E)を確保した。その結果、精製された組換え果糖−4−エピマー化酵素はSDS−PAGE分析を介してCJ_ANT_F4Eが約47kDaであることを確認した(図1)。
前記実施例1−2から得られた酵素の活性を測定するために、30重量%果糖を用い、ここに50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM CoSO4、前記実施例1−2で分離された20mg/mlの精製酵素を添加して、温度60℃で2時間反応した。果糖−4−エピマー化酵素CJ_ANT_F4E、CJ_ANTA_F4Eによって転換されたタガトースの濃度及び果糖からタガトースに転換された転換率を確認した結果、CJ_ANT_F4Eの転換率は16.1%、CJ_ANTA_F4Eの転換率は21.9%であった。前記換算率は次の式で計算された:転換率=タガトース生成量/果糖基質濃度×100
本出願の酵素のエピマー化活性に対する温度の影響性を調査するために、果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に、前記実施例1−2で製造した1mg/mlの精製酵素を添加して、50℃〜80℃で3時間反応し、反応終了液はHPLCを用いてタガトースを定量分析した。その結果、本出願のCJ_ANT_F4E酵素は70℃で最大活性を示した(図3)。
本発明者らは、Anaerolineae bacterium Taxon ID:2654588098由来のタガトース−6−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能な組換えベクター及び形質転換微生物を製造した。
前記実施例2−1に従って製造した形質転換菌株E.coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E由来のCJ_AB_F4Eから本出願換え酵素を収得するために、前記それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。続いて、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に再懸濁した。前記再懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して、酵素特性解析のための精製酵素CJ_AB_F4Eを確保した。
前記実施例2−2で確保した本出願組換え酵素CJ_AB_F4Eの活性を測定するために、30重量%果糖に50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM NiSO4、及び各20mg/mlのCJ_AB_F4Eを添加して、60℃で10時間反応させた。
前記実施例2−2で得られた組換え酵素CJ_AB_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に対する温度の影響力を調査するために10重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に1mg/ml CJ_AB_F4Eを添加して45℃、50℃、55℃、60℃及び70℃の様々な温度で3時間反応させた。反応が完了した後、反応液内のタガトースはHPLCを用いて定量分析した。
従来公知の異性化酵素、例えば、グルコース異性化酵素及びアラビノース異性化酵素及びエピマー酵素、例えば、プシコース3−エピマー化酵素は、金属イオンを必要とすることが知られていた。したがって、前記実施例2−2で得られた本出願の組換え酵素CJ_AB_F4Eも金属イオンが果糖−4−エピマー化活性に影響を与えるかどうかを確認した。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Dictyoglomus thermophilum DSM 3960由来のタガトース−6−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された微生物を製造した。
前記実施例3−1で製造した遺伝子組換え微生物菌株E. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4Eから組換え酵素CJ_DT_F4Eを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素CJ_DT_F4Eを確保した。
前記実施例3−2で確保した組換え酵素CJ_DT_F4Eの活性を測定するために、30重量%果糖に50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び5mg/mlのCJ_DT_F4Eを添加して、60℃で10時間反応させた。
前記実施例3−2で得られた組換え酵素CJ_DT_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に対する温度の影響を調査するために、5重量%果糖を含む50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液に5mg/mlのCJ_DT_F4Eを添加し、40℃、50℃、55℃、60℃及び70℃で5時間反応させた。反応完了液内のタガトースはHPLCを用いて定量分析した。
前記実施例3−2で得られた組換え酵素CJ_DT_F4Eの果糖−4−エピマー化活性に金属が影響を与えるかどうかを確認した。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Thermobifida halotolerans由来のタガトース−6−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保し、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された組換え微生物を製造した。
前記実施例4−1で製造した組換え微生物菌株E. coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4Eから組換え酵素CJ_TH_F4Eを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は、攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれた50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素CJ_TH_F4Eを確保した。
前記実施例4−2で確保した組換え酵素CJ_TH_F4Eの活性を測定するために、1重量%果糖に50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び4mg/mlのCJ_TH_F4Eを添加して、55℃で4時間反応させた。
新規耐熱性の果糖−4−エピマー化酵素を発掘するために、Thermoanaerobacter indiensis由来のタガトース−6−リン酸キナーゼ遺伝子情報を確保して、大腸菌発現可能組換えベクター及び形質転換された組換え微生物を製造した。
前記実施例5−1で製造した組換え微生物菌株E. coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4Eから組換え酵素CJ_TAI_F4Eを製造するために、それぞれの形質転換微生物をアンピシリン(ampicillin)抗生剤が含まれたLB液体培地5mLを含む培養チューブに接種し、600nmで吸光度が2.0になるまで37℃振とう培養器で種菌培養を行った。本種菌培養された培養液をLBとタンパク質発現調節因子である乳糖が含まれた液体培地を含む培養フラスコに接種して、本培養を行った。前記種菌培養及び本培養は攪拌速度180rpm及び37℃の条件で行った。その後、前記培養液を8,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、菌体を回収した。回収された菌体を50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で2回洗浄し、10mMイミダゾール(imidazole)と300mM NaClが含まれている50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液に懸濁した。前記懸濁された菌体を細胞破砕機(sonicator)を用いて破砕し、細胞破砕物を13,000rpmで4℃で20分間遠心分離した後、上澄み液のみを取った。前記上澄み液をHis−taq親和クロマトグラフィーを用いて精製した後、20mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を充填剤の10倍の液量で流して、非特異的結合が可能なタンパク質を除去した。その後、250mMイミダゾール及び300mM NaClを含有する50mM NaH2PO4(pH8.0)緩衝溶液を追加で流して溶出精製し、50mM Tris−HCl(pH8.0)緩衝溶液で透析して酵素特性解析のための精製酵素CJ_TAI_F4Eを確保した。
前記実施例5−2で確保した組換え酵素CJ_TAI_F4Eの活性を測定するために、5重量%果糖に50mM Tris−HCl(pH8.0)、1mM MnSO4及び5mg/mlのCJ_TAI_F4Eを添加して、55℃で10時間反応させた。
前記タガトース−6−リン酸キナーゼ(Tagatose−6−phosphate kinase, EC 2.7.1.144)は、ATPとD−タガトース−6−リン酸(D−tagatose 6−phosphate)を基質としてADPとD−タガトース1,6−二リン酸(D−tagatose 1,6−biphosphate)を生産すると知られているもの。
具体的には、前記組成物は、配列番号1、3、5、7、9または11のアミノ酸配列からなるポリペプチドであってもよく。
本願に至って「タガトース−6−リン酸キナーゼ」が果糖の4番炭素位置をエピマー化して果糖をタガトースに転換させる果糖−4−エピマー化活性を示すことを明らかにし、したがって、本願では「果糖−4−エピマー化酵素」と互換的に用いられてもよい。
一具現例として、本出願の果糖−4−エピマー化酵素は、耐熱性微生物由来の酵素であってもよく、例えば、Anaerolinea sp.由来の酵素、Thermobifida sp.、Thermoanaerobacter sp.、またはその変異体、Dictyoglomus sp.由来の酵素またはその変異体であってもよく、具体的には、Anaerolinea thermophila、 Anaerolineae bacterium、Thermobifida halotoleran、Thermoanaerobacter indiensisまたはDictyoglomus thermophilum由来の酵素またはその変異体であってもよいが、これに制限されるものではない。
本願の果糖−4−エピマー化酵素またはその変異体は、D−フルクトース(果糖)の4番炭素位置をエピマー化してD−タガトースに転換させる特徴があるもので本願でタガトース−6−リン酸キナーゼ(Tagatose−6−phosphate kinase)が果糖−4−エピマー化酵素としての活性を有することを明らかにした。タガトース−6−リン酸キナーゼはD−タガトース6−リン酸(D−tagatose 6−phosphate)を基質としてD−タガトース1,6−二リン酸(D−tagatose 1,6−biphosphate)を生産することが知られていた。つまり、タガトース−6−リン酸キナーゼが果糖−4−エピマー化酵素活性を有することを新たに明らかにすることによって、本出願の一具現例は果糖からタガトースを製造するに当たり、タガトース−6−リン酸キナーゼを果糖−4−エピマー化酵素として用いることを含むタガトース−6−リン酸キナーゼの新規用途に関する。
一具現例として、本出願の果糖−4−エピマー化酵素は、耐熱性の高い酵素であってもよい。具体的には、本出願の果糖−4−エピマー化酵素は、50℃〜70℃で最大活性の50%〜100%、60%〜100%、70%〜100%または75%〜100%の活性を示しうる。より具体的には、本出願の果糖−4−エピマー化酵素は、55℃〜60℃、60℃〜70℃、65℃、60℃、または70℃で最大活性の80%〜100%または85%〜100%の活性を示しうる。
さらに、これに制限されるものではないが、前記配列番号1からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号2のヌクレオチド配列によって;配列番号3からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号4のヌクレオチド配列によって;配列番号5からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号6のヌクレオチド配列によって;配列番号7からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号8のヌクレオチド配列によって;配列番号9からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号10のヌクレオチド配列によって;配列番号11からなる果糖−4−エピマー化酵素は、配列番号12のヌクレオチド配列によってそれぞれ暗号化されるものであってもよい。
本出願の果糖−4−エピマー化酵素またはその変異体は、本出願の前記酵素またはその変異体を発現するDNA、例えば、配列番号2、4、6、8、10または12のヌクレオチドでE. coliなどの菌株に形質転換させた後、これを培養して培養物を収得し、前記培養物を破砕して、カラムなどを介して精製して得られたものであってもよい。前記形質転換用菌株は、Escherichia coli などがある。
具体例では、これらの形質転換された菌株としてE. coli BL21(DE3)/CJ_ANT_F4E(これの別名はE.coli BL21(DE3)/pBT7−C−His−an1である)、E. coli BL21(DE3)/CJ_AB_F4E、またはE. coli BL21(DE3)/CJ_DT_F4E、E. coli BL21(DE3)/CJ_ANTA_F4E、E. coli BL21(DE3)/CJ_TH_F4E、E. coli BL21(DE3)/CJ_TAI_F4Eであり、これらはそれぞれ順にブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms)に寄託番号KCCM11996P(寄託日:2017年3月20日)、KCCM12093P(寄託日:2017年8月11日)、KCCM12109P(寄託日:2017年9月13日)、KCCM12232P(寄託日:2018年3月23日)、KCCM12235P(寄託日:2018年3月23日)及びKCCM12236P(寄託日:2018年3月23日)として寄託した。
前記ベクターを形質転換させる方法は熱ショック法などが含まれてもよいが、これに制限されない。
前記発現カセットは、通常、前記遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター(promoter)、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記遺伝子は、それ自体またはポリヌクレオチド構造体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
Claims (6)
- タガトース−6−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物を含む、タガトース生産用組成物。
- 前記組成物が、果糖をさらに含む、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 前記組成物が、配列番号1、3、5、7、9または11のアミノ酸配列からなるタガトース−6−リン酸キナーゼを1つ以上含むものである、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 前記タガトース−6−リン酸キナーゼが、Anaerolinea sp.、Thermobifida sp.、Thermoanaerobacter sp.、Dictyoglomus sp.由来の酵素またはその変異体である、請求項1に記載のタガトース生産用組成物。
- 果糖を、タガトース−6−リン酸キナーゼ、これを発現する微生物または前記微生物の培養物と接触させて、前記果糖をタガトースに転換させる段階を含む、タガトースの製造方法。
- 前記接触が、pH5.0〜pH9.0の条件で、30℃〜80℃の温度条件で、または0.5時間〜48時間行われる、請求項5に記載のタガトースの製造方法。
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