KR20230115919A - 원-팟 d-알로스 생산용 조성물 및 이를 이용한 알로스의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카이스티아(Kaistia) 속 유래 D-알룰로스 3-에피머라제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물; 및 지오바실러스(Geobacillus) 속 유래 L-람노스 이소머라제, 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물을 포함하는 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물 및 이를 이용한 알로스의 제조방법에 관한 것이다.

Description

원-팟 D-알로스 생산용 조성물 및 이를 이용한 알로스의 제조방법{Composition for producing one pot D-allose and method for producing allose using the same}

본 발명은 카이스티아(Kaistia) 속 유래 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물; 및 지오바실러스(Geobacillus) 속 유래 L-람노스 이소머라제(L-rhamnose isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물을 포함하는 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물 및 이를 이용한 알로스의 제조방법에 관한 것이다.

알로스(allose)는 포도당 (D-glucose)의 3번 탄소 에피머(epimer)로서, 사이코스 (psicose)로도 불리는 알룰로스(allulose)의 이성질체인 희소성 단당류로 알려져 있다. 이러한 알로스는 암세포의 증식의 저해하는 특성을 가지기 때문에 항암물질로 사용되고, 허혈작용으로 인한 장기 손상을 억제하는 기능도 가지기 때문에 장기보존액으로도 사용될 수 있다. 또한, 알로스는 분절된 호중성 백혈구의 형성을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 혈소판의 감소도 억제하는 기능을 나타내는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 알로스는 현재 의학적으로 매우 주목을 받는 희소성 당류 중 하나이다.

이와 같이 알로스는 의약 산업 분야에서 높은 이용 가치가 있음에도 불구하고, 자연계에는 극히 미량만이 존재하기 때문에 효과적으로 의약적 응용 분야에 공급되기 위해서는 알로스를 충분한 양으로 확보하는 것이 필요하다.

또한, 지금까지 알로스는 효율적인 의약 및 식품 산업분야에서의 적용을 위해 충분한 양의 D-알로스의 확보가 필요한 시점에서 D-알로스는 화학적인 방법에 의하여 생산되어 왔다. 그러나, 이러한 화학적 생산 방법은 고온·고압을 요구하는 작업환경의 위험성, 화학적 반응 후의 부가적인 당 생성으로 인해 복잡한 D-알로스의 분리·정제 과정, 화학적 폐기물로 인한 환경오염의 문제 유발 등 여러 가지의 심각한 문제점을 가지고 있다.

더욱이 D-알로스의 화학적 합성은 낮은 수율, 선택성, 생산성 확보가 어렵고 독성 부산물을 생성할 수 있어 식품 용도로 적합하지 않다.

이와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 환경 친화적이며 높은 특이성으로 당을 효율적으로 생산할 수 있는 방법으로서 미생물에 의해 발현되는 효소를 이용하여 D-알로스를 고수율로 얻는 생물학적 생산 방법이 연구되고 있으며, L-람노스 이소머라제 (L-RhI), D-리보스-5-인산 이소머라제 (RPI), D-갈락토스-6-포스페이트 이소머라제(GPI), 글루코스 이소머라제 (GI)와 같은 당 이성화 효소를 이용하여 희소당 D-알룰로스를 기질로 epimerization함으로써 D-알로스의 상업적 생산이 가능하다.

D-알로스의 전구체인 D-알룰로스는 희소당이며 상당히 고가의 물질이다. 생산 비용을 줄이기 위해 미생물에서 케토즈 에피머라아제와 알도스 이소머라제를 사용하여 흔하고 값싼 기질에서 희소당을 합성하는 전략이 개발되었다.

D-알로스는 D-알룰로오스 3-에피머라아제(DAE) 및 L-람노오스 이소머라제(L-RhI)의 두 가지 효소 반응에 의해 D-알룰로스를 통해 D-과당과 같은 저렴한 당으로부터 합성될 수 있다(도 1).

도 1에 나타낸 반응은 DAE를 사용하여 D-과당을 D-알룰로스로 전환하고 L-RhI를 사용하여 D-알룰로스를 D-알로스로 전환하는 2단계 반응으로, 알로스의 전환율이 낮을 뿐만 아니라 두 효소를 분리하기 위해 정교하고 고가의 생산 공정이 필요한 문제가 있다(비특허문헌 1).

그러므로 D-알로스를 간단하고 비용 효율적으로 생산하는 공정 개발이 필요하다.

Bioprocess and Biosystems Engineering (2020) 43:645-653

이에, 본 발명자들은 2단계 반응이 아닌 one-pot의 1단계로 축소시킨 공정을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 식품첨가제로 사용하기 위한 알로스 생산에 있어 2단계 공정을 1단계로 동시에 작용할 수 있는 최적의 효소 선정 및 최적의 효소 활성 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은, 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물; 및 지오바실러스(Geobacillus) 속 유래 L-람노스 이소머라제(L-rhamnose isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물을 포함하는 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 과당 또는 이를 포함하는 기질 용액을 상기 알로스(allose) 생산용 조성물과 하나의 반응조(one-pot)에서 반응시키는 단계를 포함하는 알로스의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 상기 알로스 제조방법에 따라 제조된 알로스를 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.

지금까지 D-알로스 제조방법 중 하나로 알려진 바에 따르면, D-알룰로오스 3-에피머라아제(DAE)를 사용하여 D-과당과 같은 저렴한 당으로부터 D-알룰로스로 전환하고 L-람노오스 이소머라아제(L-RhI)를 사용하여 D-알룰로스를 D-알로스로 전환하는 2단계 반응(도 1)을 거쳐 D-알로스를 생산한다. 하지만 이러한 2단계 반응은 알로스의 전환율이 낮을 뿐만 아니라 두 효소를 분리하기 위해 정교하고 고가의 생산 공정이 필요한 문제가 있다.

이러한 기존 2단계 알로스 제법의 문제점을 해결하도록 간단하고 비용 효율적으로 알로스 생산할 수 있는 최적의 효소를 선정을 위해 다음과 같은 특징의 효소를 스크리닝하였다.

특히, 식품첨가제로 사용되는 알로스를 제조함에 있어, 식품첨가제로 허가받을 수 있도록 망간 이온에서, 열적 안정성이 뛰어난 효소 발굴이 필요하다.

또한, 과당과 포도당이 산업 상 실제 혼합당으로 사용되어 이들 기질 특이성이 없는 효소 선정이 중요하다.

따라서, 기질로 D-과당을 사용하고 원-팟(one-pot), 즉 1단계 반응으로 알로스를 생산할 수 있는 최적의 2가지 효소를 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase) 및 L-람노스 이소머라제(L-rhamnose isomerase)을 선정하였다.

본 발명은 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물; 및

지오바실러스(Geobacillus) 속 유래 L-람노스 이소머라제(L-rhamnose isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물을 포함하는 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물

을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "조성물"이란 2가지 이상의 성분이 균일하게 혼합되어 있는 상태의 물질을 의미하여, 완제품뿐만 아니라 완제품 제조를 위한 중간 소재를 포함하는 개념이다.

본 발명의 알로스(allose) 생산용 조성물의 일 예는 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 포함한다. 또한, 상기 알로스(allose) 생산용 조성물의 다른 예는 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 상기 미생물의 파쇄물을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase)는 D-과당을 기질로 하여 D-과당의 3번 탄소 위치를 에피머화하여 D-알룰로스로 전환시키는 효소로 알려져 있으며, 내열성 미생물 유래 효소인 것이 바람직하다. 내열성 미생물 유래 효소로는 예를 들어, 카이스티아(Kaistia) 속, Arthrobacter globiformis, Clostridium sp., Ruminococcus sp., Kaistia sp. Dorea sp., CAG317, Desmospora sp., Agrobacterium sp., Agrobacterium tumefaciens 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명 일 구현예에서, 본 발명의 원 팟 공정에 사용되는 D-알룰로스 3-에피머라제는 65~75℃의 온도 및 8.0~9.0의 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 60℃ 이하에서 열 안정성이 우수하고, 본 발명에서 사용되는 D-알룰로스 3-에피머라제는 Kaistia sp., 구체적으로 Kaistia defluvii KCTC 23766에서 유래된 것으로서, 이하 KD-DAE로 명명하였다.

상기 D-알룰로스 3-에피머라제는 Kaistia 속 유전체 DNA에 존재하는 무수한 DNA 중 특정 DNA을 중합효소반응에 의해 증폭시키고, 증폭된 특정 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다.

상기 D-알룰로스 3-에피머라제는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열로 이루어지나, 본 발명에 따른 D-알룰로스 3-에피머라제의 균등 범위는 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따른 D-알룰로스 3-에피머라제의 균등 범위는 과당을 알룰로스(allulose)로 전환하는 활성이 유지되는 한, SEQ ID NO: 1의 아미노산 중 일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 상기 D-알룰로스 3-에피머라제의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 D-알룰로스 3-에피머라제의 균등 범위는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

[SEQ ID NO: 1]

MKNKLGVHAQ VWVGGWSHAE AERAIASTAS LGYDYIEAPA LDPSLIDIDF TRKALEKHGL

GITTSLGLDD SCDISSGDPD KKARGQAHLM KVVSTTRDLG GTHITGILYS GFQKYFTPAT

PEGVAGAVEV LHHVAEEAAK SNITLGLEVV NRYETNVINT AAQGVELCKR VGMPNVKVHL

DCYHMNIEEA DAERAIIDTG DYLGYFHTGE SHRGYLGTGS IDFTRIFRGL VKANYQGPIC

FESFSSAVAG EPLSGILGIW RNLWTDSTDL CRHAMQFTQA QMQAAEQAQS IRTGADW

본 발명에서 사용된 내열성 균주 속 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 발현하는 미생물은 내열성 균주 속 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 의미한다. 구체적으로, Kaistia 속 유래 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는 D-알룰로스 3-에피머라제를 상기 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 상기 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 2의 염기서열일 수 있다.

[SEQ ID NO: 2]

atgaagaaca agctgggtgt gcacgcacag gtctgggtcg gcggctggag ccatgcggag

gcggagcgcg ccatcgccag caccgcctcg ctcggctacg actatatcga ggcgccggcg

ctcgacccgt cgctgatcga catcgacttc acccgcaaag cgctggaaaa gcatggtctc

ggcatcacga cgtcgctcgg cctcgacgac agctgcgaca tctcctcggg cgatcccgac

aagaaggcgc gcggccaggc gcacctgatg aaggtggtct ccaccacccg tgatctcggc

ggcacccaca tcaccggtat cctctattcc ggcttccaga aatacttcac gcccgcaacg

ccggagggcg tcgccggcgc cgtcgaggta ttgcaccacg tcgccgagga agcggcgaag

agcaacatca cgctcggcct cgaggtggtg aaccgctacg agaccaacgt gatcaacacc

gccgcccagg gcgtcgagct ctgcaagcgg gtcggcatgc cgaacgtcaa ggtgcacctc

gactgctacc acatgaacat cgaggaagcc gacgccgagc gcgccatcat cgataccggc

gactatctgg gttatttcca taccggtgaa tcgcatcgcg gctatctcgg caccggctcg

atcgacttca cccgcatctt ccgcggcctg gtgaaggcca actaccaggg tccgatctgc

ttcgaatcct tctcgtccgc cgtcgccggc gagccgctct ccggcattct cggcatctgg

cgcaatctct ggacggattc gaccgatctc tgccgccacg ccatgcagtt cacgcaggca

cagatgcagg cggccgagca ggcccagtcg atccgcaccg gcgcggactg gtag

본 발명의 알로스(allose) 생산용 조성물의 일 예는 지오바실러스 속(Geobacillus sp.) 유래 L-람노스 이소머라제를 포함한다. 또한, 상기 알로스(allose) 생산용 조성물의 다른 예는 지오바실러스 속 유래 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물, 상기 미생물의 배양물 또는 상기 미생물의 파쇄물을 포함한다.

L-람노스 이소머라제 (L-rhamnose isomerase, L-RI)은 D-알룰로스(allulose)를 D-알로스(allose)로 전환시킬 수 있는 효소로 알려져 있으며, 내열성 미생물 유래 효소일 수 있으며, 예를 들어, Thermobacillus composti, Clostridium sp., Bacillus pallidus, Bacillus subtilis, Thermoanaerobacterium saccharolyticum, Caldicellulosiruptor saccharolyticus, Geobacillus sp. BMUD 유래 효소 또는 그 변이체일 수 있다. 본원에서 사용되는 L-RI는 지오바실러스 속(Geobacillus sp.) 유래 L-RI가 바람직하다.

본 발명의 원 팟 공정에 사용되는 L-람노스 이소머라제는 60~80℃의 온도 및 6.5~8.0의 pH에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 최대 활성을 가지고, 열 안정성이 우수하고, 본 발명에서 사용되는 L-람노스 이소머라제는 효소 코드 넘버 5.3.1.14를 가지며, 지오바실러스 속(Geobacillus sp.)에서 유래된 것으로서, 이하 GS-LRI로 명명하였다.

상기 L-람노스 이소머라제는 지오바실러스 속 유전체 DNA에 존재하는 무수한 DNA 중 특정 DNA을 중합효소반응에 의해 증폭시키고, 증폭된 특정 DNA를 발현 벡터에 삽입하여 재조합 발현 벡터를 제조한 후, 상기 재조합 발현 벡터로 숙주 균주를 형질전환시켜 재조합 균주를 제조한 후, 상기 재조합 균주를 배양하여 발현시키는 방법으로 얻어질 수 있다.

본 발명에 따른 L-람노스 이소머라제는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열로 이루어지나, 상기 L-람노스 이소머라제의 균등 범위는 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 상기 L-람노스 이소머라제의 균등 범위는 알룰로스(allulose)를 알로스(allose)로 전환하는 활성이 유지되는 한, SEQ ID NO: 3의 아미노산 중일부가 치환, 삽입 및/또는 결실된 것일 수 있다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 단백질의 특성이 바뀌지 않는 보존적 아미노산 치환(conservative amino acid replacement)에 의해 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 상기 아미노산의 변형은 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등에 의해 이루어질 수 있다. 또한, 상기 L-람노스 이소머라제의 균등 범위는 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환에 대한 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 람노스 이성화효소의 균등 범위는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 99% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

[SEQ ID NO: 3]

MVRDQFDEAK QAYEQWGINV DEALRTLEKV SISIHCWQGD DITGFETQKR ELSGGIDVTG

NYPGKARTPD ELRQDLDKAL SLIPGKHRVN LHAIYAETKG KTVERDELAP EHFENWVEWA

KERGIGLDFN PTLFSHEKAV DGLTLSHPNE EIRQFWIRHC IASRKIGAYF GEKLGTPCLT

NIWIPDGYKD IPSDRLTPRQ RLKDALDEIF AEPIDEAYNL DSVESKLFGI GSEAYVVGSH

EFYLGYALTR NKIYLLDTGH FHPTETISNK ISALMLYFDK LALHVSRPMR WDSDHVVVLD

DELREIALEL VRNKALDRVM IGLDFFDASI NRVAAWVIGT RNMIKALLYA LLLPHDHLKR

LQEEGRFTER LALMEEFKTY PFGAVWDEYC AAMGVPVRER WLVEVEQYEA EVLRKR

본 발명에서 사용된 지오바실러스 속 유래 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물은 지오바실러스 속 유래 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주를 의미한다. 구체적으로, SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 L-람노스 이소머라제를 상기 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환되거나 상기 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주일 수 있다. 예컨대, 상기 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 4의 염기서열일 수 있다.

[SEQ ID NO: 4]

ATGGTCCGTGACCAATTTGATGAAGCAAAACAAGCGTATGAACAGTGGGGGATCAATGTCGATGAAGCGTTGCGCACGTTAGAGAAAGTATCGATTTCTATTCATTGCTGGCAAGGTGATGATATTACCGGCTTTGAGACGCAAAAGCGAGAGTTGTCCGGTGGGATCGATGTCACGGGCAATTATCCTGGCAAGGCACGTACACCAGACGAGTTGAGACAAGACTTGGACAAGGCGCTATCTTTAATCCCTGGAAAACATCGCGTCAACTTGCATGCCATTTATGCGGAAACGAAGGGCAAGACAGTCGAACGTGACGAATTGGCCCCAGAACATTTTGAGAACTGGGTTGAGTGGGCGAAGGAACGCGGAATCGGATTGGATTTCAATCCGACGCTCTTTTCTCATGAAAAAGCCGTTGATGGCTTGACGTTATCCCATCCGAACGAGGAAATTCGCCAATTTTGGATTCGTCATTGCATCGCCAGTCGGAAAATCGGGGCCTATTTCGGTGAGAAACTCGGCACGCCATGTTTAACGAACATTTGGATTCCCGACGGTTACAAGGATATTCCAAGCGACCGACTGACTCCAAGACAACGACTGAAAGACGCACTTGATGAAATTTTTGCCGAACCGATTGATGAGGCATACAACCTCGATTCCGTCGAAAGCAAGCTGTTCGGCATCGGCTCGGAAGCATATGTTGTCGGATCACATGAATTTTATCTCGGCTATGCCTTAACTCGCAATAAAATCTACTTGCTCGATACGGGTCATTTCCATCCAACCGAGACGATTTCGAATAAAATTTCCGCGCTTATGCTTTATTTTGATAAACTAGCGTTACACGTCTCGCGTCCGATGCGCTGGGATAGCGACCATGTCGTTGTGCTTGACGATGAACTGCGGGAGATCGCCCTTGAGCTTGTCCGTAACAAGGCGCTCGACCGAGTCATGATCGGACTTGACTTTTTCGATGCCAGCATCAACCGGGTGGCAGCGTGGGTCATCGGTACGCGGAATATGATTAAAGCGCTGTTGTATGCGCTCTTGTTGCCGCACGACCATTTGAAGCGGCTGCAAGAAGAAGGACGATTCACCGAGAGGCTCGCGTTGATGGAAGAGTTTAAGACTTATCCATTTGGTGCAGTATGGGATGAGTATTGCGCGGCGATGGGAGTGCCGGTAAGAGAGCGGTGGTTGGTCGAAGTTGAGCAGTATGAAGCGGAAGTTTTACGGAAACGGTGA

상술한 바와 같이, 본원에서 사용될 수 있는 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 미생물일 수 있다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 유기체, 예컨대 숙주세포로 염기의 클로닝 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말한다. 벡터는 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있다. 여기서, "복제단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능 한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 말한다. 본 발명의 용어 "벡터"는 시험관 내, 생체 외 또는 생체 내에서 유기체, 예컨대, 숙주 세포로 염기를 도입하기 위한 바이러스 및 비바이러스 매개물을 포함할 수 있고, 미니구형 DNA, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty)같은 트랜스포존(Izsvak et al. J. MoI. Biol. 302:93-102 (2000)), 또는 인공 염색체를 포함할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 상기 벡터는 다양한 항생제 저항성 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터일 수 있다. 본 발명에서 용어, "항생제 저항성 유전자"란 항생제에 대하여 저항성을 가지는 유전자로서, 이것을 가지고 있는 세포는 해당 항생제를 처리한 환경에서도 생존하므로, 대장균에서 대량으로 플라 스미드를 얻는 과정에 선별 마커로서 유용하게 사용된다. 본 발명에서 항생제 저항성 유전자는 본 발명의 핵심적 기술인 벡터의 최적의 조합에 따른 발현 효율에 크게 영향을 미치는 요소가 아니므로, 선별 마커로서 일반적으로 사용되는 항생제 저항성 유전자를 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적인 예로는, 암피실린(ampicilin), 테트라사이클린(tetracyclin), 카나마이신(kanamycin), 클로람페니콜(chloroamphenicol), 스트렙토마이신 (streptomycin), 또는 네오마이신(neomycin)에 대한 저항 유전자 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 pBT28a-(+)-KDDAE, 도 2의 개열지도를 가질 수 있으며, 상기 지오바실러스(Geobacillus) 속 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 pBT7-GSLRI, 도 7의 개열지도를 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물은, 상기 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내로 도입하는 방법을 이용할 수 있으며, 상기 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함될 수 있으며, 당해 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 및 열 충격법 등이 포함될 수 있으나, 이로 제한되지 않는다.

형질전환된 유전자는 숙주세포 내에 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체내에 삽입된 형태 및 염색체 외에 위치하고 있는 형태 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자는 폴리펩티드를 암호화할 수 있는 폴리뉴 클레오티드로 DNA 및 RNA를 포함하며, 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결 신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포에 도입되어, 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있다.

본 발명의 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제 미생물은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 재조합 벡터를 포함하여 본 발명의 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 생산할 수 있는 미생물이라면, 원핵 미생물 및 진핵 미생물 어느 것이나 포함될 수 있다. 예를 들면 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 프로비덴시아(Providencia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로, 대장균(E. coli) 또는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. D-알룰로스 3-에피머라제 생산할 수 있는 미생물의 구체예로는 E. coli BL21(DE3)/pBT28a-(+)-KDDAE 등일 수 있다. 또한, L-람노스 이소머라제 생산할 수 있는 미생물의 구체예로는 E. coli BL21(DE3)/pBT7-GSLRI 등일 수 있다.

본 발명의 미생물은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터 도입 이외에도 다양한 공지의 방법에 의해 상기 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 발현할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다.

본 발명의 미생물의 배양물은 상기 D-알룰로스 3-에피머라제 또는 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물을 배지에서 배양하여 제조된 것일 수 있다.

본 발명에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균 주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 미생물을 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 7 내지 9)를 조절할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있고, 또한, 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양온도는 25℃내지 40 ℃, 구체적으로는 30℃ 내지 37 ℃를 유지할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 배양기간은 원하는 유용 물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로는 약 0.5 시간 내지 60 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출 액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암 모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.

본 발명의 알로스 생산용 조성물은 상술한 효소들의 각각의 기질에 해당하는 물질, 성분, 또는 조성물을 추가로 포함할 수 있다

본 발명의 알로스 생산용 조성물은 당해 알로스 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 부형제로는, 예를 들어, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 알로스 생산용 조성물은 금속을 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 금속은 2가 양 이온을 포함하는 금속일 수 있다. 구체적으로 상기 금속은 니켈, 코발트, 알루미늄, 마그네슘(Mg) 및 망간 (Mn)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 금속은 금속이온 또는 금속염일 수 있으며, 보다 더 구체적으로 상기 금속염은 NiSO₄, MgSO₄, MgCl₂, NiCl₂, CoCl₂, CoSO₄, MnCl₂ 및 MnSO₄로 이루어진 군에서 선택된 1 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 D-과당(D-fructose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을, 상기 알로스 생산용 조성물과 원-팟(one pot) 반응시키는 단계를 포함하는 D-알로스(allose)의 제조방법에 관한 것이다.

상기 알로스 생산용 조성물에 관한 사항은 상기 알로스 제조방법에 동일하게 적용될 수 있다.

상기 원-팟 반응은 pH 6.0 내지 pH 8.0 조건에서, 50℃ 내지 80℃온도 조건에서, 및/또는 1시간 내지 24시간 동안 수행할 수 있다. 구체적으로, pH 6.5 내지 pH 8.0 조건, pH 6.0 내지 pH 7.5 조건 또는 pH 6.5 내지 pH 7.5 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 55℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 75℃, 50℃ 내지 70℃, 55℃ 내지 75℃, 60℃ 내지 75℃, 또는 60℃ 내지 70℃의 온도 조건에서 수행할 수 있다. 더불어, 1시간 내지 24시간 동안, 1시간 내지 23시간 동안, 1시간 내지 22시간 동안, 1.5시간 내지 24시간 동안, 1.5시간 내지 23시간 동안, 1.5시간 내지 22시간 동안, 2시간 내지 24시간 동안, 2시간 내지 23시간 동안, 2시간 내지 22시간 동안, 5시간 내지 20시간, 6시간 내지 18시간, 8시간 내지 15시간 또는 12시간 내지 24시간 동안 수행할 수 있다.

일 구현예로, 상기 원-팟 반응은 금속, 금속 이온 또는 금속염의 존재 하에서 수행할 수 있다.

상기 금속 이온은 Mn²⁺, Co^2+, Ni²⁺, Ca²⁺ 및 Na²⁺ 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 식품 첨가제로 사용하기 위하여 바람직하게는 상기 두가지 효소 모두 최대 활성을 나타내는 금속이온인 Mn²⁺일 수 있다. 또한, 본 발명에서 알룰로스(allulose)의 알로스(allose)로의 전환 반응시 전체 반응물 내 금속 이온의 농도는 0.1~6 mM인 것이 바람직하고 0.5~5 mM인 것이 더 바람직하다.

또한, 상기 과당으로부터 알로스(allose)를 제조하는 방법에서 상기 효소 또는 상기 재조합 균주는 바람직하게는 담체에 고정화된다. 상기 담체는 고정된 효소의 활성이 장기간 유지될 수 있는 환경을 조성할 수 있는 것으로, 효소 고정화 용도로 사용할 수 있는 공지된 모든 담체에서 선택될 수 있다.

일 구현예로서, 본 발명은 기질로서 과당을 사용하여 알룰로스로 전환시키고 알룰로스를 다시 알로스로 전환시키는 2단계 공정을 하나의 반응조(one-pot) 내에 최종 선정된 당전환효소 2가지를 함께 첨가하여 상기 과당을 알로스로 한번에 당전환시키는 단계를 포함하는 알로스의 제조 방법을 제공한다. 상기 과당으로부터 알로스의 당전환 단계는 하나의 공정 (one-step)으로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 명세서에서, 당전환효소를 "하나의 반응조(one-pot) 내에 함께 첨가" 한다는 의미는, 종래의 제조방법에서 당전환효소를 각각 따로 순차적으로 첨가하여, 기질로부터 알룰로스로 당전환효소르 전환하는 단계 (1차 단계)와 알룰로스를 당전환효소를 처리하여 알로스로 전환시키는 단계 (2차 단계)를 각각 별개로 순차적으로 수행하였던 것과는 달리, 2가지 당전환효소를 하나의 단일 용기 내에 한번에 첨가함으로써 당전환 중 형성된 중간 생성물을 분리하거나 또는 효소를 중간에 제거하는 단계 없이, 당전환이 하나의 공정으로 함께 이루어질 수 있도록 한 것을 의미한다. 이와 같이 하여, 본 발명에서는, 2가지 당전환효소를 하나의 반응조(one-pot) 내에 함께 첨가함으로써, 종래 공정에서 지나치게 장 시간이 소요되었던 문제를 해결할 수 있을 뿐 아니라, 알로스의 수율이 높아지고, 생산성이 향상된 알로스를 얻을 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서 제안되는 알로스의 제조 방법은 당전환 공정을 one-pot 반응으로 수행할 수 있어, 전체 제조 공정을 현저히 단순화 내지 간소화시킬 수 있으며, 이에 따라 단시간 내에 보다 효율적으로 알로스를 제조할 수 있다. 또한, 상기 제조 방법은 에피머화 공정과 이성화 공정을 각각 별개로 수행하는 경우(2단계 공정)와 비교하여, 반응 후의 워크업 (work up) 또는 중간체 회수과정, 효소 제거과정이나 용기 이동 과정 중에 발생할 수 있는 물질의 손실을 방지할 수 있으므로, 수득되는 알로스를 포함하는 알로스의 수율 및 순도를 현저히 향상시킬 수 있다.

상기 당전환 단계는 D-과당 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.7중량부(바람직하게는 0.05 내지 0.5 중량부)의 D-알룰로스 3-에피머라제 및 0.05 내지 1.5 중량부(바람직하게는 0.15 내지 1 중량부)의 L-람노스 이소머라제를 상기 D-과당에 첨가하여 50℃ 내지 80℃의 온도, pH 6 내지 8에서, 1 시간 내지 24 시간 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 수득된 최종 반응액의 알로스의 함량은, 최종 반응액의 중량 기준으로, 20 내지 40 중량% 또는 30 내지 40 중량%일 수 있다.

알로스로 전환되지 않고 남아있는 알룰로스의 함량은 60 내지 80 중량% 또는 60 내지 70 중량%일 수 있다.

상기 알로스의 제조 방법은, 알로스가 제조된 후, 반응에 참가한 효소의 활성을 중단하여 실활시키기 위한 단계(효소 불활성화 단계)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 효소 불활성화 단계는, 승온, pH 조정 등 당 분야에 알려진 물리, 화학적인 통상의 효소 실활 방법을 사용하여 이루어질 수 있다. 예컨대, 상기 효소 불활성화 단계는 상기 당전환 단계를 통해 제조된 알로스가 함유된 반응 용액을 70 내지 100℃또는 70 내지 90℃온도 범위에서, 30 내지 120분 또는 30 내지 60분간 가열함으로써, 상기 당전이효소를 불활성화시키는 것일 수 있다. 그러나, 각 단계에서 반응에 참가한 효소들이 완전히 반응한 경우에는, 필요에 따라 상기 효소 불활성 단계를 생략할 수도 있다.

또한, 상기 알로스의 제조 방법은 알로스가 제조된 후 (즉 당전환 단계 이후 또는 효소 불활성화 단계를 거친 경우에는 효소 불활성화 단계 이후), 미반응 물질과 고형분 (단백질, 염류 등 포함) 등을 제거하기 위해, 당전환 단계 이후 또는 효소 불활성화 단계를 거친 경우에는 효소 불활성화 단계에서 얻어진 반응액을 여과, 정제 및/또는 농축하는 과정을 추가로 수행할 수 있다.

상기 여과, 정제 및/또는 농축 단계는 특별히 제한되지 않고, 본 발명이 속하는 기술 분야에 알려진 통상의 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 여과는 필터 또는 규조토 등에 의하여 수행될 수 있고, 상기 정제는 이온수지를 이용한 정제과정을 통해 수행될 수 있으며 (이를 통하여 이온성 물질 제거 및/또는 탈색 및/ 또는 pH 조절이 될 수 있음), 상기 농축은 진공 농축, 감압농축 등의 과정을 통하여 수행될 수 있다. 또한, 여기에 냉각과정을 추가로 수행함으로써, 제품화될 수 있다

앞서 설명한 바와 같이, 상기 알로스의 제조 방법은 반응 시간을 현저히 단축하고 제조 공정을 보다 간소화할 수 있음은 물론이고, 나아가 포도당, 과당, 자당 등의 단당류 및/또는 2당류의 함량이 현저히 저감된 알로스를 제조할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기 알로스의 제조 방법은 기존 제조방법에 비해 향상된 알로스 함량을 가지면서, 당류(포도당, 과당, 자당 등의 단당류/2당류) 함량이 감소된, 저당류 알로스 제조에 큰 의의가 있다. 또한, 상기 제조방법에 의하여 제조된 알로스는 생산성 향상에 유리한 효과를 거둘 수 있다. 알로스 고유의 유익한 점인 암세포 증식 저해, 허혈작용으로 인한 장기 손상 억제, 호중성 백혈구의 형성 억제 및 혈소판 감소 억제 기능 등의 발현하면서도, 당류(포도당, 과당, 자당 등의 단당류 및/또는 2당류)의 함량은 낮아져서, 국민의 건강 증진에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

다른 구현예로서 본 발명은 상기 알로스의 제조방법에 따라 제조된 알로스를 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 식품이라 함은 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미한다. 또한, 통상적인 의미 로서, 각종 식품, 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 및 음료 첨가제를 모두 포함하는 의미로 사용된다. 상기 식품은 알로스가 포함될 수 있는 식품이라면 특별한 제한이 없으며, 액상 감미료, 물엿, 유가공품, 발효유, 음료, 소스, 과자, 양념 (조미료) 및 가공식품 등의 식품 전반 분야에 사용할 수 있다.

구체적인 예시로, 본 명세서에서 식품은 특수영양식품 (예컨대, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제 품 (예컨대, 햄, 소시지 등), 두부류, 묵류, 면류 (예컨대, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품 (예컨대, 간장, 된장, 고추장, 혼합장, 마요네즈, 식초 등), 소스류, 과자류 (예컨대, 스넥류, 캔디, 껌, 파이, 아이스크림류, 빙과류 등), 베이커리 제품 (예컨대, 빵, 케익, 쿠키 등), 유가공품 (예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품 (예컨대, 각종 김치류, 장아찌 등), 음료 (예컨대, 과실 음료, 채소류 음료, 커피, 탄산음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료 (예컨대, 라면 스프 등), 액상 감미료 (예컨대, 물엿, 액상 올리고당 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 건강기능 식품, 음료, 식품 첨가제 또는 음료 첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

다른 예는 상기 감미용 조성물을 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 상기 의약 조성물에 포함된 감미용 조성물은 쓴맛 차폐, 감미 부여 등을 위한 부형제, 코팅제, 등으로 포함될 수 있다. 예컨대, 상기 의약 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 또는 시럽 등 형태의 경구 제형일 수 있다.

상기 식품 조성물 또는 의약 조성물 내의 감미용 조성물의 함량은 식품 조성물 또는 의약 조성물의 종류에 따라서 적절하게 조절할 수 있으며, 예컨대, 식품 조성물 또는 의약 조성물 총 중량 기준으로, 0.0001 내지 90중량 %, 0.001 내지 80 중량%, 0.01 내지 50 중량%, 또는 0.01 내지 30 중량% 범위에서 적절하게 조절될 수 있다.

본 발명에서는 내열성 균주 유래 DAE와 GS-LRI를 이용한 원-포트 효소반응을 통해 저가 기질인 D-과당으로부터 D-allose를 제조하는 방법을 개발하였다. D-allose를 제조하기 위해, 내열성 균주 유래 D-allulose 3-epimerase와 Geobacillus sp.의 L-rhamnose 이성질화효소의 One-pot 반응 시 최적의 효소 활성 조건을 확립하였다.

기질 특이성과 관련하여, 내열성 균주 유래 DAE는 D-allulose와 L-rhamnose에서 각각 가장 높은 활성도를 보였다. 특히, GS-LRI는 D-포도당 및 D-과당에 대한 기질 특이 활성을 보이지 않았다. 이는 D-포도당 및 D-과당이 GS-LRI의 경쟁적 저해제로 작용하지 않으므로 효소 활성을 저해하지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 내열성 균주 유래 DAE와 GS-LRI를 사용한 다중 효소 반응에서 GS-LRI에 의해 D-알룰로스에서 D-과당으로의 역반응이 아닌 것으로 간주되어, 효율적으로 D-알로스를 생성할 수 있음을 알 수 있다.

내열성 균주 유래 DAE와 GS-LRI의 특성 실험에 의해 효소의 최적 조건에서 다중 효소 반응이 수행되었다. 자유 효소 DAE와 L-RhI를 사용하는 D-알로스와 D-알로스의 평형 비율은 각각 31%와 30%이다. 내열성 균주 유래 DAE와 GS-LRI를 이용한 Two-step 효소반응에 의한 D-과당 내 D-알로스의 전환율은 9%였으며, One-pot 반응에 의한 D-알로스의 생산량은 12.8%로 약 1.4배 높은 것으로 확인되었다.

이러한 결과를 바탕으로 효소 고정화를 수행하여 One-pot 효소 반응을 이용하여 저렴한 기질인 D-과당으로부터 D-알로스를 생성하였다. 이것은 생산 공정이 간단하고 비용이 저렴하기 때문에 산업 응용 분야에서 큰 잠재력을 가질 수 있다.

도 1은 KD-DAE와 GS-LRI를 이용한 Two-step 효소반응을 나타낸 것이다.
도 2는 pET-28a-(+)에서 K. defluvii의 DAE 유전자 구성한 pET-28a-(+)-KDAE의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 3은 재조합 KD-DAE 의 생산 및 정제 결과이다 [(a) 각 정제 단계에서 D-알룰로스 3-에피머라제의 SDS-PAGE 분석. 레인 1 분자량 마커; 세포 파괴 후 레인 1 불용성 단백질; 대장균 세포로부터의 레인 2 조 추출물; 레인 3 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 후 정제된 재조합 KD-DAE. (b) 크기 배제 크로마토그래피에 의한 재조합 KD-DAE의 분자량 결정. 재조합 KD-DAE(□를 단백질 표준과 함께 플로팅했다. 단백질 표준(■에는 페리틴(440kDa), 알돌라제(158kDa), 콘알부민(75kDa), 오브알부민(44kDa), 무수탄산(29kDa) 및 리보뉴클레아제 A(13.7kDa)가 포함된다. KD 값은 방정식 KD = (Ve - Vo) / (VT - Vo)를 사용하여 추정되었다. 여기서 Ve, VT 및 Vo는 각각 용출 부피, 컬럼 총 액체 부피 및 컬럼 공극 부피를 나타낸다].
도 4는 효소 활성에 대한 금속 양이온의 영향(a) 및 Mn2+의 효과 (b)을 나타낸 것이다 [(a) Non은 10mmol L-1 EDTA를 처리하지 않은 효소이다. 금속이 없는 효소는 Mn²⁺, Mg²⁺, Co²⁺, Ca²⁺ 및 Ni²⁺와 같은 다양한 시약에서 1mmol L^-1로 배양되었다. 효소 반응은 최적의 조건에서 수행되었다. (b) 반응은 70℃에서 0-5mmol L-1Mn2+ 및 Tris-HCl(pH 8.5) 완충액 조건에서 1시간 동안 표준 반응으로 수행하였다. 데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 5는 (a) pH 및 (b) 온도가 KD-DAE의 활성에 미치는 영향. 및 (c) KD-DAE의 열안정성의 영향을 나타낸 것이다 [pH 실험에 사용된 완충액은 50mmol L-1 Tris-HCl 완충액이었다. (c) KD-DAE의 열안정성의 영향. pH 8.5에서 시간 간격을 달리하여 50℃(●), 55℃(▲), 60℃(■), 65℃(○)에 효소를 노출시켜 열적 안정성을 조사하였다. 데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 6은 D, L-케토헥소스가 있는 DAE의 기질 특이성을 나타낸 것이다 [100으로 설정된 D-알룰로스의 최대 활성과 함께 상대 활성이 표시된다. D-all: D-알루로스; D-fru: D-과당; L-all: L-알룰로스; D-tag: D-타가토스; D-sor: D-소르보스; L-tag: L-타가토스; L-sor: L-소르보스; L-fru: L-과당].
도 7 pBT7에서 Geobacillus sp.의 L-RhI 유전자 구성한 pBT7- L-RhI의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 L-RhI의 생산 및 정제 결과이다 (a) 각 정제 단계에서 L-rhamnose 이소머라제의 SDS-PAGE 분석. 레인 1 분자량 마커; 세포 파괴 후 레인 1 불용성 단백질; 대장균 세포로부터의 레인 2 조 추출물; 레인 3 Ni-NTA 친화성 크로마토그래피 후 정제된 재조합 GS-LRI. (b) 크기 배제 크로마토그래피에 의한 재조합 GS-LRI의 분자량 결정. 재조합 GS-LRI(□는 단백질 표준과 함께 플롯되었다. 단백질 표준(■에는 페리틴(440kDa), 알돌라제(158kDa), 콘알부민(75kDa), 오브알부민(44kDa), 무수탄산(29kDa) 및 리보뉴클레아제 A(13.7kDa)가 포함된다. KD 값은 방정식 KD = (Ve - Vo) / (VT - Vo)를 사용하여 추정되었다. 여기서 Ve, VT 및 Vo는 각각 용출 부피, 컬럼 총 액체 부피 및 컬럼 공극 부피를 나타낸다.].
도 9는 효소 활성에 대한 금속 양이온의 영향(a) 및 Mn²⁺ 의 효과 (b)을 나타낸 것이다 [(a) Non은 10mmol L-1 EDTA를 처리하지 않은 효소이다. 금속이 없는 효소는 Mn2²⁺ , Co²⁺ , Ca²⁺ +, Na²⁺, Mg²⁺ 및 Ni²⁺ 와 같은 다양한 시약에서 1mmol L-1로 배양되었다. 효소 반응은 최적의 조건에서 수행되었다. (b) 반응은 70 ℃에서 0-5 mmol L-1 Mn²⁺ 및 Tris-HCl(pH 7.0) 완충액 조건에서 1시간 동안 표준 반응으로 수행하였다. 데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 10은 (a) pH 및 (b) 온도가 GS-LRI의 활성에 미치는 영향. 및 (c) GS-LRI의 열안정성의 영향을 나타낸 것이다 [pH 실험에 사용된 완충액은 50mmol L-1 Tris-HCl 완충액이었다. (c) 열적 안정성은 효소를 pH 7.0에서 시간 간격을 달리하여 55℃(●), 60℃(▲), 65℃(■), 70℃(○), 75℃(□)에 노출시켜 조사하였다. 데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 11은 D, L-케토헥소스가 있는 L-RhI의 기질 특이성을 나타낸 것이다 [100으로 설정된 D-알룰로스의 최대 활성과 함께 상대 활성이 표시된다. D-all: D-알루로스; D-fru: D-과당; L-all: L-알룰로스; D-tag: D-타가토스; D-sor: D-소르보스; L-tag: L-타가토스; L-sor: L-소르보스; L-fru: L-과당].
도 12는 최적의 조건에서 서로 다른 시간 간격에 대한 60℃(▲), 65℃(□), 70℃(●), 75℃(○), 80℃(■)에서의 (a) KD-DAE 및 (b) GS-LRI의 평형 비율을 나타낸 것이다 [데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 13은 최적화된 조건에서 D-알룰로오스(채워진 막대) 및 D-알로오스(빈 막대) 생산에 대한 두 효소의 pH 효과를 나타낸 것이다 [데이터는 세 가지 실험의 수단을 나타내고 오차 막대는 표준 편차를 나타낸다].
도 14는 D-과당(채워진 사각형)에서 KD-DAE 및 GS-LRI에 의한 최적의 반응 조건에서 원팟 반응으로 생산된 D-알룰로오스(빈 원), D-알로오스(채워진 원)를 나타낸 것이다.
도 15는 D-알로스의 생산을 위한 One-pot 반응을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

참조예 1: D-알룰로스 3-에피머라제 효소 선정

Geobacillus sp. 유래 L-rhamnose isomerase와 복합 반응을 위해 비슷한 반응 조건을 가지는 효소 선별하였다.

특히, K. defluvii 유래 D-allulose 3-epiemrase는 내열성을 가지며, 70℃의 높은 온도 조건에서 최적 활성을 가질 뿐만 아니라, GS-LRI와 같은 금속 요구성을 나타냄을 확인하였다.

참조예 2: L-람노스 이소머라제 효소 선정

기존 보고된 효소들 중 D-allulose로부터 가장 효율적으로 D-allose를 생성한다고 보고되어진 Clostridium stercorarium 유래 L-rhamnose isomerase와 서열 상동성이 높으며, 내열성을 가진 Geobacillus sp. 균주 유래 L-rhamnose isomerase 선정하였다.

[실시예]

1. 재료 및 방법

1.1. 미생물, 중간체 및 성장 조건

K. defluvii와 Geobacillus sp., pET28a-(+) 및 pBT7 플라스미드의 게놈 DNA는 KD-DAE와 GS-LRI의 DAE 및 L-RhI 유전자의 공급원으로 사용되었다. 대장균주 DH5α와 BL21(DE3)은 각각 표적 유전자의 복제 및 발현을 위한 숙주 세포로 사용되었다. 균주는 10 g L^-1 트립톤, 5 g L^-1 효모 추출물, 10 g L^-1 NaCl을 포함하는 Luria-broth(LB)로 이송되었다. 카나마이신과 암피실린은 필요할 때 LB 배지에서 최종 농도 50μg mL^-1에 첨가되었다.

1.2. 대장균 BL21(DE3)에서 효소의 유전자 복제, 합성 및 발현

1.2.1 대장균 BL21(DE3)에서 KD-DAE의 복제 및 발현

K. defluvii KCTC 23766의 게놈은 Wizard 게놈 DNA 정제 키트를 사용하여 추출되고, K. defluvii KCTC 23766의 정제된 염색체 DNA는 PCR의 템플릿으로 사용된다. 이 서열은 K. defluvii KCTC 23766에서 DAE 유전자를 증폭하기 위한 프라이머를 생성하는데 사용되었다. K. granuli KCTC 12575(NCBI 가입 번호: WP_018373.1)의 DAE를 기반으로 PET-28a-(+)에서 증폭된 유전자의 삽입을 위해 NdeⅠ와 HindⅢ제한효소를 포함(표 1)하여 정방향 프라이머(SEQ ID NO: 5) 및 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 6), 두 올리고뉴클레오티드를 설계하였다. 재조합 pET28a-(+)-KDDAE는 열충격변환분석에 의해 대장균 DH5α로 변형되어 염기서열분석에 의해 정확하게 검증되고 대장균 BL21(DE3)으로 변형된다.

[표 1]

KD-DAE 증폭용으로 사용된 프라이머

1.2.1 대장균 BL21(DE3)에서의 GS-LRI 합성 및 발현

Geobacillus sp. BMUD의 전체 게놈 서열은 GenBank(NCBI 가입번호: SDLA000000)에서 공개되었으며, L-RhI 유전자의 전장 뉴클레오티드 배열(NCBI 가입번호: WP_171661112.1)을 찾아 Bioneer Co.에서 합성하였다. L-RhI 염기서열에 기초하여 pBT7-C-His plasmid에 증폭된 유전자를 삽입하여 pBT7-GSLRI plasmid를 구성하기 위해 EcoRⅠ제한효소 사이트를 붙여 정방향 프라이머(SEQ ID NO: 7) 및 역방향 프라이머(SEQ ID NO: 8), 두 올리고뉴클레오티드를 설계하였다 (표 2). 재조합 pBT7-GSLRI는 열충격변환분석을 통해 대장균 DH5α로 변형되고 염기서열분석에 의해 정확하게 검증되어 대장균 BL21(DE3)으로 변형된다.

[표 2]

GS-LRI 증폭용으로 사용된 프라이머

1.3. 조제 및 정제된 효소의 제조

대장균 BL21(DE3)/pET28a-(+)-KDDAE의 단일 콜로니를 선택하여 카나마이신 50 μg mL^-1이 함유된 5m LB 배지에 접종하고 37 ℃, 220 rpm에서 밤새도록 배양하였다. 과성장 배양액을 카나마이신 50 μg mL^-1이 포함된 200 mL LB 배지에 접종하고 37 ℃, 150 rpm에서 배양한다. 배지의 OD₆₀₀이 0.6~0.8이 되면 0.5 mmol L^-1(최종 농도) IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도한다. pET28a-(+)-KDDAE를 함유하는 재조합 대장균 BL21(DE3) 는 16 ℃, 150 rpm에서 약 16 시간 동안 배양하였다.

대장균 BL21 (DE3) / pBT7-GSLRI 단일 콜로니를 선택하여 암피실린 50 μg mL^-1이 포함된 5 mL LB 배지에 접종하고, 하룻밤 동안 37 ℃, 220 rpm에서 배양하였다. 과성장 배양액을 5 mmol L^-1 D-Lactose(최종 농도)와 50 μg mL^-1의 암피실린이 함유된 200 mL LB 배지에 접종하여 단백질 발현을 유도한다. pBT7-GSLRI/재조합 대장균 BL21(DE3)는 30 ℃, 150 rpm에서 약 18시간 동안 배양한다.

배양액을 4 ℃에서 20분 동안 4,000 xg의 원심분리법으로 2개의 재조합 세포를 채취하였다. 배양 육수에서 채취한 세포는 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH7.0) 버퍼에 다시 매달고 얼음 위에서 세포파쇄기를 사용하여 5분간 파쇄한다. 셀 찌꺼기를 4 ℃에서 30분 동안 8,000 xg에서 원심분리하여 제거하고 상등액을 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼로 맞춰진 Ni-NTA 개방형 컬럼 크로마토그래피에 도포하였다. 결합 단백질은 50 mmol L^-1 이미다졸을 함유한 완충제를 사용하여 세척되었다. 세척된 결합 단백질은 200 mmol L^-1 이미다졸을 포함하는 동일한 완충액에 의해 용출되었다. 활성 단백질 fraction은 SDS-PAGE에 의해 수집 및 확인되었습니다. 확인된 단백질 fraction은 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼로 교환하고, 10 mmol L^-1 EDTA를 밤새 처리 및 냉장 처리하였다. 그런 다음 EDTA 처리된 단백질 용액을 얼음 위의 동일한 완충액에서 24시간 동안 투석하였다. 정제된 효소로 얻어진 용액을 사용하였으며, Bradford assay를 통해 BSA (bovine serum albumin)을 표준으로 하여 농도를 확인하였다.

1.4. 분자량 측정

DAE와 L-RhI의 subunit 분자량은 미리 염색된 단백질 ladder(Bio-Rad, California, USA)를 기준단백질로 사용하여 변성조건 하에서 SDS-PAGE에 의해 조사되었다. 모든 단백질 밴드는 시각화를 위해 Coomassie brilliant blue R250으로 염색되었다. 고유 효소의 분자량은 AKTA FPLC(Cytiva, Seoul, Korea)를 이용한 겔 여과 크로마토그래피로 추정하였다. 효소 용액을 겔 여과 컬럼(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg)과 용출 평형 완충제(150 mmol L^-1 NaCl, 20 mmol L^-1 Tris-HCl; pH 7.5)에 1 ml/min의 유량으로 도포하였다. 기준단백질로서 K _D 값을 계산하기 위하여 Ferritin, Aldolase, Conalbumin, Ovalbumin, Carbonic anhydrase 및 Ribonuclease A로 보정하였으며, 기준단백질의 이동길이와 비교하여 고유효소의 분자량을 계산하였다.

[표 3]

분자량 결정에 사용된 참조 단백질 목록

1.5. KD-DAE의 생화학적 특성 및 운동 파라미터

1.5.1. KD-DAE의 효소 분석

KD-DAE의 효소 활성은 단위 시간 당 D-과당으로부터 생성되는 D-알룰로스의 양을 측정함으로써 측정된다. 특별한 언급이 없는 한, 반응은 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 8.5) 버퍼와 1.7 U mL^-1의 효소를 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 포함하는 0.1 mL 반응 혼합물에서 수행되었다. 반응은 18 g L^-1 D-과당(최종 농도)을 첨가함으로써 시작되었고 70 ℃에서 10분간 배양되었다. 그리고 나서, 그 용액은 즉시 얼음 위에서 10분 동안 불활성화되었다. 불활성화 후 시료를 PVDF 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과하고 HPLC 시스템에 주입하여 생성된 D-allulose를 검출하였다. DAE 활성의 1 unit은 pH 8.5 및 70 ℃에서 D-과당으로부터 1 μmol D-allulose를 1분 동안 생성하는 DAE의 양으로 정의되었다.

1.5.2. KD-DAE의 최적 금속이온, pH, 온도 및 내열성 효과

금속이온이 DAE에 미치는 영향을 조사하기 위해 10 mmol L^-1 EDTA로 처리된 정제된 효소에 Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺ 등의 각 금속이온 1 mmol L^-1을 첨가하여 효소 분석을 수행하였다. 반응은 70 ℃에서 1시간 동안 18 g L^-1 D-과당(최종 농도)이 함유된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH8.5) 완충액에서 수행하였다. 재조합 효소에 Mn²⁺가 필요하므로 Mn²⁺ 농도가 효소에 미치는 정확한 영향을 0~5 mmol L^-1 범위에서 조사하였다.

DAE의 최적 pH를 측정하기 위해 70 ℃에서 1시간 동안 18 g L^-1 D-과당 및 1 mmol L^-1 Mn²⁺를 포함하는 50 mmol L^-1 Tris-HCl 버퍼를 사용하여 pH를 7.0에서 9.0까지 변화시켰다. 효소 활성에 대한 온도의 영향을 45~75℃의 온도에서 18 g L^-1 D-과당과 1 mmol L^-1 Mn²⁺가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH8.5) 완충액에서 조사하였다. 최적의 금속 이온, pH 및 온도의 결과를 상대 활성으로 비교한다.

반감기(t _1/2 ) 및 열안정성 시험은 4가지 다른 온도(50, 55, 60, 65 ℃)에서 Tris-HCl(pH 8.5) 버퍼에 효소를 사전 배양하여 수행하였다. 샘플은 6개의 다른 시간 간격(0, 1, 2, 3, 4, 5시간)에서 인출되었으며, 상대 활성은 표준 분석 조건에서 측정되었다. 배양하지 않은 효소의 초기 활성은 100%로 측정되었다. 모든 용액은 10분 동안 얼음에서 즉시 비활성화되었다.

1.5.3. KD-DAE의 특이 활성 및 운동 파라미터

DAE에 대한 특이적 활성을 측정하기 위해, 효소 반응을 70 ℃에서 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 18 g L^-1 단당류와 1.7 U mL^-1의 효소가 함유된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 완충액에서 10분간 수행하였다. 특이 활성은 반응 시간당 생성된 생성물에 대한 효소의 양으로 정의되었다. DAE의 운동 파라미터를 결정하기 위해 5 ~ 200 mmol L^-1 D-과당 및 D-allulose의 다양한 농도가 사용되었다. 반응은 특정 활성도 측정과 마찬가지로 70 ℃에서 1 mM Mn²⁺가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 8.5)에서 10분간 진행하였으며, 즉시 얼음 위에서 10분간 불활성화하였다. 기질에 대한 효소의 K _m(mM)과 K _cat(min^-1) 값은 Lineweaver-Burk plots와 Michaelis-Menten equation 방법으로 계산되었다.

1.6. GS-LRI의 생화학적 특성 및 운동 파라미터

1.6.1. GS-LRI의 효소 분석

상기 L-RhI의 활성에 대해서는 달리 언급하지 않는 한, 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼와 0.5 U mL^-1의 효소를 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 포함하는 0.1 mL 반응 혼합물에서 반응을 실시하였다. 상기 기재로는 18 g L^-1 D-allulose를 사용하였으며, 반응 혼합물에서의 첨가에 의해 개시되었다. 상기 반응은 70 ℃에서 10분간 배양한 후, 얼음 위에서 10분간 즉시 불활성화시킨다. 불활성화 후 시료를 PVDF 0.22 μm syringe 필터를 통해 여과하고 HPLC 시스템에 주입하여 생성된 D-allose를 검출하였다. L-RHI 활성의 1 unit은 pH 7.0 및 75 ℃에서 1분 동안 D-allulose로부터 1μmol D-allose를 생성하는 L-RhI의 양으로 정의되었다.

1.6.2. GS-LRI의 최적 금속 이온, pH, 온도 및 내열성 영향

금속이온이 L-RhI에 미치는 영향을 조사하기 위해 10 mmol L^-1 EDTA로 처리된 정제된 효소에 Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺, Na²⁺ 등의 각 금속이온 1 mmol L^-1을 첨가하여 효소 분석을 수행하였다. 반응은 18 g L^-1 D-allulose(최종 농도)가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH7.0) 완충액에서 75 ℃에서 1시간 동안 실시하였다. 효소에 Mn²⁺가 필요하였으므로, Mn²⁺ 농도가 효소에 미치는 정확한 영향을 0~5 mmol L^-1 범위에서 조사하였다.

L-RhI의 최적 pH를 위해 pH는 50 mM 인산 칼륨 완충용액 5.5 내지 7.0, 50 mmol L^-1 Tris-HCl 버퍼 7.0 내지 8.5로 변화시켰다. 반응은 75 ℃에서 18 g L^-1 D-allulose와 1 mmol L^-1 Mn²⁺를 1시간 동안 첨가하여 실시하였다.

효소 활성에 대한 온도의 영향을 18 g L^-1 D-allulose와 1 mmol L^-1 Mn²⁺가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH7.0) 완충액에서 40 ~ 90 ℃의 온도에서 조사하였다. 최적의 금속 이온, pH 및 온도의 결과를 상대 활성으로 비교한다.

반감기(t _1/2 ) 및 항온성 시험은 5가지 다른 온도(55, 60, 65, 70, 75 ℃)에서 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼에 효소를 사전 배양하여 수행하였다. 검체는 6개의 다른 시간 간격(0, 1, 2, 3, 4, 5시간)에서 인출되었으며, 상대 활성은 표준 검사 조건에서 측정되었다. 배양하지 않은 효소의 초기 활성은 100%로 측정되었다. 모든 용액은 10분 동안 얼음에서 즉시 불활성화되었다.

1.6.3. GS-LRI의 특이 활성 및 운동 파라미터

L-RhI에 대한 특이 활성을 측정하기 위해, L^-1 단당류 18 g과 효소 0.5 U mL^-1가 포함된 50 mmol L-1 Tris-HCl(pH 7.0) 완충액에서 75 ℃에서 10분 동안 효소 반응을 수행하였다. 특이 활성은 반응 시간당 생성된 생성물에 대한 효소의 양으로 정의되었다. L-RhI의 운동 파라미터를 결정하기 위해 5 ~ 200 mmol L^-1 D-allulose 및 D-allose의 다양한 농도를 사용하였다. 상기 반응은 특이적 활성도 측정과 마찬가지로 75 ℃에서 1 mmol L^-1 Mn²⁺가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0)에서 10분간 진행하였으며, 즉시 얼음 위에서 10분간 불활성화하였다. 기질에 대한 효소의 K _m(mM)과 K _cat(min^-1) 값은 Lineweaver-Burk plots와 Michaelis-Menten equation 방법으로 계산되었다.

1.7. DAE 및 L-RhI를 사용한 D-과당으로부터의 D-allose의 제조

1.7.1. D-과당으로부터 D-알로스를 생성하기 위한 반응 조건 최적화

D-알룰로스에 대한 D-알룰로오스 대 D-과당 및 D-알로오스 대 D-알룰로스의 평형비를 확인하기 위해 다양한 온도에서 서로 다른 시간 간격으로 KD-DAE와 GS-LRI를 측정하였다. D-과당으로부터 D-알룰로스를 생성하기 위한 KD-DAE의 반응은 18 g L^-1 D-과당 및 0.06 g L^-1 효소를 1 mmol L^-1 Mn²⁺ 존재 하에 포함하는 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 8.5) 완충액에서 수행되었다. 또한, D-allulose로부터 D-allose를 생성하기 위한 GS-LRI의 반응은 18 g L^-1 D-allulose와 0.15 g L^-1의 효소를 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 포함하는 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼에서 수행되었다. 두 효소의 반응에 대한 최적 pH는 65 ℃에서 3시간 동안 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 18 g L^-1 D-과당이 함유된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0 내지 9.0) 완충액에서 측정하였다.

1.7.2. Two-step 방법에 의한 D-과당으로부터의 D-알로스의 생성

D-과당의 D-allulose를 통해 D-allose를 생성하기 위해 Two-step 및 One-pot 반응을 위한 최적의 조건에서 두 개의 효소를 수행하였다. 상기 2단계 반응에서 D-과당으로부터 D-알룰로오스 생성을 위한 반응은 65℃에서 1 mmol L^-1 D-과당 및 0.06 g L^-1 KD-DAE를 포함하는 50 mmol L-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼에서 수행하였다. 반응 후에 초원심분리기 필터(Micro-Conal Filter, micro-10K Dember)를 사용하여 효소를 제거하였다. D-allose를 제조하기 위해 상기 반응용액에 0.15 g L^-1 GS-LRI를 첨가하여 65 ℃에서 3시간 동안 반응하였으며, 두 효소의 One-pot 반응은 18 g L^-1 D-과당과 0.06 g L^-1 KD-DAE, 0.15 g L^-1 GS-LRI가 함유되어 있는 50 mmol L^-1 Tris-HCl (pH 7.0) 완충용액을 65℃에서 반응하여 매 시간 간격마다 측정하였다.

1.7.3. One-pot 반응에 의한 D-과당으로부터의 D-알로스의 생성

D-과당의 D-allulose를 통해 D-allose를 생성하기 위해 One-pot 반응을 위한 최적의 조건에서 두 개의 효소를 수행하였다.

두 효소의 One-pot 반응은 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 18 g L^-1 D-과당과 0.06 g L^-1 KD-DAE, 0.15 g L^-1 GS-LRI가 함유되어 있는 50 mmol L^-1 Tris-HCl (pH 7.0) 완충용액을 65℃에서 반응하여 12시간 동안 매 시간 간격마다 측정하였다.

1.8. 분석방법

반응 시료의 단당류 농도는 분리 컬럼(SUPELCOGELTM Pb), 6% Crosslinked Pb, HPLC Column 및 굴절률 검출기(Agilent GL62A RID, Santa Clara, USA, Agilent 1100 Series)를 사용하여 측정하였다. 시료는 PVDF 0.22 μm 주사기 필터를 통해 투입하였으며, 20 μl의 시료를 분리 컬럼에 주입하였다. 컬럼은 80 ℃에서 탈이온수를 1 mL min^-1의 유량으로 용출하였다.

2. 결과

2.1. KD-DAE의 다양한 측정 결과

2.1.1. DAE 계열 효소의 아미노산 배열 및 KD-DAE 복제 및 염기서열 분석

K. defluvii의 완전히 배열된 게놈 DNA를 기반으로 DAE 유전자를 분리하기 위해 두 개의 프라이머(표 1)가 설계되었다. DAE 유전자는 PCR에 의해 성공적으로 분리되고 증폭되었다. 증폭된 DAE 유전자는 열충격변환분석을 통해 대장균 DH5α로 변형되었으며, 염기서열분석(sequencing)을 통해 정확하게 검증되었다. 재조합 KD-DAE 유전자는 pET28a-(+)-KDDAE로 명명되고 발현을 위해 대장균 BL21(DE3)로 변형되었다(도 2). K. defluvii KCTC 23766에서 복제된 DAE는 K. granuli KCTC 12575 DAE(GenBank: ZP_04858451.1)와 100% 아미노산 동일성을 보였으며, Arthrobacter globiformis DAE(GenBank: AB981957.1), Clostridium scindens DAE(GenBank: WP_004607502.1), Rminococcus sp. DAE (GenBank: ZP_04858451.1)와 상대적으로 각각 44%, 32%, 27%의 상동성을 가진다.

2.1.2. KD-DAE의 발현, 정제, 분자량

재조합 pET28a-(+)-KDDAE 삽입 대장균 BL21(DE3)을 0.5 mmol L^-1 IPTG 유도로 성공적으로 발현하였으며, 6개의 His-tag DAE 단백질을 Ni-NTA 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 절차에 의해 조 추출물로부터 정제하였다. 전반적인 정화 절차의 결과는 표 4에 요약되어 있다. 최종 정제 단계까지 효소의 비활성은 17.5 U mg^-1에서 1.5배 정제되었으며, 회수율은 7.5%였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합 KD-DAE의 분자량은 약 33 kDa로 추정되었으며, 이는 894개의 아미노산 잔기와 6개의 히스티딘 잔기에 대해 계산된 33,410 Da와 일치한다(도 3a). 겔 여과 컬럼(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg)이 장착된 FPLC를 사용하여 변성되지 않는 조건에서 효소의 분자량을 추가로 분석하였다. 분자량은 검정곡선(도 3b) 대비 132 kDa로 계산하였으며, SDS-PAGE에 의해 결정되는 분자량으로 인해 4개의 소단위로 일치하였다. 따라서, KD-DAE는 homo-tetrameric 단백질이며, 이전에 보고된 문헌들[Kim HJ, Hyun EK, Kim YS, Lee YJ, Oh DK (2006) Characterization of an Agrobacterium tumefaciens D-psicose 3-epimerase that converts D-fructose to Dpsicose. Appl Environ Microbiol 72: 981-985; Mu W, Chu F, Xing Q, Yu S, Zhou L, et al. (2011) Cloning, expression, and characterization of a D-psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10. J Agric Food Chem 59: 7785-7792;- Chan HC, Zhu Y, Hu Y, Ko TP, Huang CH, et al. (2012) Crystal structures of D-psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10 and its complex with ketohexose sugars. Protein Cell 3: 123-131]의다른 DAE와 일치한다.

[표 4]

재조합 대장균 BL21(DE3)에서 KD-DAE 정제

2.1.3. KD-DAE의 금속이온, pH, 온도 및 항온성의 영향

KD-DAE의 활성은 10 mmol L^-1 EDTA로 처리한 후 Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺가 없거나 존재하는 상태에서 1 mmol L^-1 농도로 측정하였다. 시험한 금속 이온 중 Mn²⁺가 가장 효과적이었으며(도 4a), 그 최적 농도는 1 mmol L^-1(도 4b)이었다. 따라서, KD-DAE에 대한 모든 후속 실험은 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에서 수행되었다.

KD-DAE의 최적 pH 활성은 70 ℃에서 7.0 내지 9.0의 pH 범위에 걸쳐 조사되었다. 최적의 효소활성은 pH 8.5에서 확인되었으며, pH 8.0과 9.0에서는 효소활성이 최적활성의 약 90%를 나타내었다(도 5a). 1 mmol L^-1 Mn²⁺ 및 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 8.5)의 존재 하에 45 내지 75 ℃의 온도 범위에서 효소 활성에 대한 온도의 영향을 조사하였다. 최적 온도 활성은 70 ℃에서 확인되었으며, 65 ℃와 75 ℃에서 효소 활성은 최대 활성의 약 95%였다(도 5b).

효소의 항온성은 효소의 생체변환에 대한 산업적 적용에서 매우 중요한 요소이다. 따라서 KD-DAE의 항온성은 50, 55, 60, 65 ℃에서 시간 경과에 따른 상대 활성을 측정하여 조사하였다(도 5c). 도 5c에 나타난 바와 같이, KD-DAE의 활성은 모든 온도에서 반응 시간에 걸쳐 감소하였다. KD-DAE는 60℃ 이하에서 비교적 높은 열안정성을 보였으며, 상대적인 활성을 보였으며, 0시간을 100으로 설정하면 50℃에서 1, 2, 3, 4, 5h의 노출 후 91, 83, 76, 65, 56%, 55℃에서 노출 후 90, 79, 70, 56%, 55h의 노출 후 48%를 유지하였다(도 5). 또한 60 ℃에서는 1, 2, 3, 4, 5 h에서 각각 91, 70, 52, 42, 38%를 나타내었다. 단, 65 ℃에서 배양하였을 때 효소의 활성은 3 h exposure 후 90% 이상 소실되었으며, 70 ℃에서 1 h 후 모든 활성은 소실되었다(데이터 미표시). 반감기(t _1/2 )를 계산하기 위해 1차 불활성화 운동 모델을 수행하였다. 붕괴 상수 K _d 는 50, 55, 60, 65 ℃에서 각각 0.1142, 0.1478, 0.518, 0.5179 h^-1로 측정되었다. 반감기(t _1/2 ) = ln2/K _d 에 따르면, t _1/2 는 50, 55, 60, 65 ℃에서 각각 6.07, 4.7, 3.6, 1.34 h로 계산되었다.

2.1.4. KD-DAE의 기질특이성

KD-DAE를 DAE로 특성화함으로써 다양한 케토스 당에 대한 기질 특이성을 조사할 수 있었다. KDDAE의 기질특이성을 조사하기 위하여 D-fructose, D-allulose, D-tagatose, D-sorbose, L-allulose, L-tagatose, L-sorbose(100 mmol L^-1)를 사용하였다. KD-DAE는 D-allulose(43.38 U mg^-1)에 가장 높은 기질 특이도를 보였으며, 이는 D-fructose(19.38 U mg^-1)로 얻은 기질 특이도보다 약 2.23배 높았다. 기질특이성은 D-알룰로오스, D-과당 다음으로 L-알룰로오스(14.78 U mg^-1), D-타가토스(11.42 U mg^-1), D-소르보스(8.08 U mg^-1), L-타가토스(2.32 U mg^-1), L-소르보스(0.6 U mg^-1) 순으로 나타났으나, L-fructose 활성은 나타나지 않았다 (도 6).

2.1.5. KD-DAE의 운동학적 분석

다양한 기질 농도(5~200 mmol L^-1)에서 KD-DAE를 10분간 반응시킨 후 효소 활성은 전형적인 Michaelis-Menten 동역학을 따랐다. Lineweaver-Burk plots을 기반으로 D-fructose과 D-allulose를 기질로 사용하여 최적의 반응 조건(70℃, pH 8.5, 1 mmol L^-1 Mn²⁺)에서 KD-DAE의 운동 파라미터를 조사하였다. 표 5에서 보는 바와 같이, 기질로서 D-과당에 대한 K _m, k _cat 및 촉매 효율-시(k _cat/K _m)는 각각 3597.11 min^-1, 241.87 mM^-1, 14.87 mM^-1 min^-1이었다. D-allulose를 기질로 하여 해당 값은 5693.59 min^-1, 91.25 mM, 62.4 mM^-1 min^-1이었다. 이러한 결과에서 D-과당에 대한 KD-DAE의 k _cat, K _m 및 k _cat/K _m은 Ruminococcus sp. DAE의 k _cat, K _m 과 유사했다. D-과당에 대한 k _cat 과 K _m 은 상대적으로 유사하며, k _cat/K _m은 알려진 케토스 3-에피머라아제에 비해 두드러지지 않는다.

[표 5]

단당류에 대한 KD-DAE의 운동 파라미터

2.2. GS-LRI의 다양한 측정 결과

2.2.1. L-RhI 계열 효소의 아미노산 서열 정렬 및 GS-LRI 합성

Geobacillus sp.의 전체 게놈 서열. BMUD는 GenBank(NCBI 가입번호: SDLA00000000)에서 방출되었으며, L-RhI 유전자의 전장 뉴클레오티드 배열(NCBI 가입번호: WP_171661112.1)을 찾아 Bioneer Co.(한국 대전)에서 합성하였다.

L-RhI 염기서열에 기초하여, 두 개의 올리고뉴클레오타이드에서 PBT7 유전자의 삽입을 위해 증폭된 프라이머(표 2)로 설계되었다. 재조합 pBT7-GSLRI는 열충격변환분석에 의해 대장균 DH5α로 변형되어 염기서열분석에 의해 정확하게 검증되고 대장균 BL21(DE3)로 변형된다(도 7). Geobacillus sp. BMUD에서 복제된 L-RhI는 Bacillus subtilis WB600 L-RhI(GenBank: AL009126)와 78% 아미노산 동일성을 보였으며, Thermobacillus composti KWC4 L-RhI(GenBank: WP015254186.1), Clostridium stercorarium L-RhI(GenBank: AGC67668.1), Bacillus pallidus Y25 L-RhI(GenBank: BAF80456.1)와 상대적으로 각각 67%, 58%, 57%의 상동성을 가진다.

2.2.2 GS-LRI의 발현, 정제, 분자량

재조합 pBT7-GSLRI 삽입 대장균 BL21(DE3)을 5 mmol L^-1 Lactose 유도로 성공적으로 발현하였으며, 6개의 His-tag L-RhI 단백질을 Ni-NTA 수지를 이용한 친화성 크로마토그래피 절차에 의해 조 추출물로부터 정제하였다. 전반적인 정제 절차의 결과는 표 6에 요약되어 있다. 최종 정제 단계까지 효소의 비활성은 4.2 U mg^-1에서 2.4배 정제되었으며, 회수율은 35.6%였다. SDS-PAGE에 의해 확인된 재조합 GS-LRI의 분자량은 약 48 kDa로 추정되었으며, 이는 1,251개의 아미노산 잔기와 6개의 히스티딘 잔기에 대해 계산된 47,970 Da와 일치한다(도 8a). 겔 여과 컬럼(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg)이 장착된 FPLC를 사용하여 변성되지 않는 조건에서 효소의 분자량을 추가로 분석하였다. 분자량은 검정곡선(도 8b) 대비 143 kDa로 계산하였으며, SDS-PAGE에 의해 결정되는 분자량으로 인해 3개의 소단위체와 일치하였다. 따라서, 재조합 GS-LRI는 homo-trimeric 단백질이다.

[표 6]

재조합 대장균 BL21(DE3)로부터 GS-LRI의 정제

2.2.3 GS-LRI의 금속이온, pH, 온도 및 온도조절성의 영향

GS-LRI의 활성은 10 mmol L^-1 EDTA로 처리한 후 Mn²⁺, Co²⁺, Mg²⁺, Ni²⁺, Ca²⁺가 없거나 존재하는 상태에서 1 mmol L^-1 농도로 측정하였다. 시험한 금속 이온 중 Mn²⁺가 가장 효과적이었으며(도 9a), 그 최적 농도는 1 mmol L^-1(도 9b)이었다. 따라서 GS-LRI에 대한 모든 후속 실험은 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에서 수행되었다.

GS-LRI의 최적 pH 활성은 75 ℃에서 5.5 내지 8.5의 pH 범위에 걸쳐 조사되었다. 최적 효소활성은 pH 7.0에서 확인되었으며, pH 6.5와 7.5에서는 효소활성이 최적 활성의 약 85%를 나타내었다 (도 10a). 1 mmol L^-1 Mn²⁺ 및 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0)의 존재 하에 40 내지 90 ℃의 온도 범위에서 효소 활성에 대한 온도의 영향을 조사하였다. 최적 온도 활성은 75 ℃에서 확인되었다. 70℃와 80℃에서 효소 활성은 각각 약 90%, 80%였다 (도 10b).

GS-LRI의 항온성은 55, 60, 65, 70, 75 ℃에서 시간 경과에 따른 잔류 활성을 측정하여 조사하였다. 효소의 열안정성은 효소의 생체변환에 대한 산업적 적용에서 매우 중요한 요소이다. 따라서 GS-LRI의 thermostability은 55, 60, 65, 70, 75 ℃에서 시간 경과에 따른 상대 활성을 측정하여 조사하였다. 도 10c에 나타난 바와 같이, GS-LRI의 활성은 모든 온도에서 반응 시간에 걸쳐 감소하였다. GS-LRI는 70℃ 이하에서 비교적 높은 항온성을 보였다. 상대 활성은 0시간을 100으로 설정하면 55℃에서 1, 2, 3, 4, 5h 노출 후 97, 93, 92, 89, 85%의 초기 활성을 유지하였고, 60℃에서 1, 2, 3, 4, 5h 노출 후 각각 95, 90, 83, 77, 72%를 유지하였다. 또한 65 ℃에서는 1, 2, 3, 4, 5 h에서 각각 90, 84, 76, 72, 67%를 나타내었다. 단, 70 ℃에서 배양하였을 때에는 4시간 노출 후 효소의 활성이 50% 이상 상실되었으며, 75 ℃에서 2시간 후 모든 활성이 상실되었다. 반감기(t _1/2 )를 계산하기 위해 1차 불활성화 운동 모델을 수행하였다. 붕괴 상수 K _d 는 55, 60, 65, 70, 75 ℃에서 각각 0.032, 0.064, 0.079, 0.254 및 0.495 h-1로 측정되었다. 반감기(t _1/2 ) = ln2/K _d 에 따르면, t _1/2 는 55, 60, 65, 70, 75 ℃에서 각각 21.76, 10.77, 8.77, 2.73, 1.4 h로 계산되었다.

2.2.4 GS-LRI의 기질특이성

GS-LRI를 L-RhI로 특성화함으로써 다양한 케토스 및 알도스에 대한 기질 특이성을 조사할 수 있었다. GS-LRI의 기질특이성은 알도스 기질로서 L-람노스, L-만노스, D-알로오스, D-글루코스, D-글루코스(50 mmol L^-1)를, 케토스 기질로서 D-과당(50 mmol L^-1)을 사용하여 조사하였다. 알도스 기질 중 특이 활성은 L-람노스(123.84 U mg^-1)가 가장 높았고, 다음으로 D-알로오스(14.21 U mg^-1), L-만노스(13.31 U mg^-1), D-글루오스(3.55 U mg^-1) 순으로 나타났으나, D-글루코스는 극히 미량으로 활성이 나타났다 (도 11). 케토스 기질 중 가장 높은 특이성을 나타내는 기질은 D-allulose(4.6 U mg^-1)로 관찰되었으나, D-fructose에 대해서는 기질 특이성이 극히 미량으로 나타났다. 상기 결과에서 L-RhI는 경쟁적 억제제로서 효소 활성을 저해하는 D-포도당 및 D-과당에 대한 기질 특이성이 상대적으로 아주 낮다. 따라서 KD-DAE와 GS-LRI를 사용한 복합 반응에서 D-allulose로부터 D-과당으로의 역반응이 L-RhI에 의해 진행되지 않았기 때문에 D-포도당과 D-과당은 L-RhI의 경쟁억제제로 작용하지 않는 것이 확인되었다.

2.2.5. GS-LRI의 운동학적 분석

다양한 기질 농도(5-200 mmol L^-1)로 GS-LRI를 배양한 후 효소 활성은 전형적인 Michaelis-Menten kinetics를 따랐다. Lineweaver-Burk plots을 기반으로 D-allulose와 D-allose를 기질로 사용하여 10분간 반응 조건(75 ℃, pH 7.0, 1 mmol L-1 Mn²⁺)에서 GS-LRI의 운동 파라미터를 조사하였다. 상기 표 7에서 보는 바와 같이, 기질로서 D-allulose에 대한 k _cat , Km 및 촉매 효율(k _cat /K_m)은 각각 271.74 min^-1, 19.84 mM-1, 13.7 mM^-1 min^-1이었다. D-allose를 기질로 하여 해당 값은 1230.77 min^-1, 88.96 mM, 13.83 mM^-1 min^-1이었다.

[표 7]

단당류에 대한 GS-LRI의 운동파라미터

2.3 DAE 및 L-RhI를 이용한 D-과당으로부터의 D-allose의 제조

2.3.1 D-과당으로부터 D-알로스를 생성하기 위한 반응 조건 최적화

상기 결과에 따르면 KD-DAE는 70 ℃에서 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 8.5) 버퍼에서 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에서 최대 활성을 보였다. 반면 GS-LRI는 75 ℃에서 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에서 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼에서 최대 활성을 보였다. 각 효소의 최적 조건에서 D-과당에 대한 D-알룰로스의 평형 상수비는 D-알룰로스에 대한 D-알로스의 평형 상수비는 각각 31, 30%였다(도 12). 두 효소 반응에서 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에서 pH를 7.0에서 9.0으로 조절하였을 때, D-과당으로부터 D-allose의 최대 생산량은 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0) 버퍼(도 13)에서 나타났다.

이러한 결과에 기초하여 KD-DAE와 GS-LRI에 의한 D-알로오스 생성에 대한 최적의 반응 조건은 1 mmol L^-1 Mn²⁺ 65 ℃에서 18 g L^-1 D-과당을 포함하는 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0)에서 결정되었다.

2.3.2 Two-step 반응에 의한 D-과당으로부터의 D-알로스의 생성

D-과당의 D-allulose를 통해 D-allose를 생성하기 위해 two-step 및 One-pot 반응을 위한 최적의 조건에서 두 개의 효소를 수행하였다. Two-step 반응에서 D-과당으로부터의 D-allulose의 전환율은 KD-DAE의 0.06 g L^-1을 사용하여 29.4%였다. 반응 후 KD-DAE는 대부분 원심필터를 통해 제거하였으며, 반응용액에 GS-LRI를 첨가하여 D-allose를 생성하였을 때 D-fructose로부터 D-allose로 전환율이 9%로 나타났다(표 8).

2.3.3 One-pot 반응(두 효소의 동시 복합 반응)에 의한 D-과당으로부터의 D-알로스의 생성

D-과당의 D-allulose를 통해 D-allose를 생성하기 위해 One-pot 반응을 위한 최적의 조건에서 두 개의 효소를 수행하였다.

두 효소의 One-pot 반응은 1 mmol L^-1 Mn²⁺의 존재 하에 18 g L^-1 D-과당, 0.06 g L^-1 KD-DAE, 0.15 g L^-1 GS-LRI가 포함된 50 mmol L^-1 Tris-HCl(pH 7.0)에서 65 ℃에서 12 h 동안 매 시간마다 반응을 실시하였다. 이러한 조건에서 D-과당으로부터 D-알로스의 전환율은 KD-DAE와 GS-LRI에 의해 12.8%로 나타났다(표 8, 도 14).

이러한 결과를 바탕으로 KD-DAE와 GS-LRI를 이용한 One-pot 반응에 의한 D-과당으로부터의 D-allose의 생성은 Two-step 반응에 비해 전환율이 1.4배 증가하였다(표 8). 이는 One-pot 반응에서 두 효소의 동시 반응의 push-pull 효과로 인해 전환율이 증가함을 나타낸다.

[표 8]

2단계 및 1단계 효소 반응에 의한 D-과당으로부터의 D-알룰로오스 및 D-알로오스의 전환율

Claims (14)

1. 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제(D-allulose 3-epimerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물; 및
   지오바실러스(Geobacillus) 속 유래 L-람노스 이소머라제(L-rhamnose isomerase), 이를 발현하는 미생물 또는 상기 미생물의 배양물, 상기 미생물의 파쇄물을 포함하는 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   내열성 균주는 카이스티아(Kaistia) 속인 원-팟(one pot) D-알로스(allose) 생산용 조성물.
   
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 D-알룰로스 3-에피머라제는 SEQ ID NO: 1로 표시되는 원-팟 D-알로스 생산용 조성물.
   
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 L-람노스 이소머라제는 지오바실러스 속(Geobacillus sp.) 유래인 D-알로스 생산용 조성물.
   
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 L-람노스 이소머라제는 SEQ ID NO: 3으로 표시되는 원-팟 D-알로스 생산용 조성물.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 발현하는 미생물은 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주이며,
   상기 지오바실러스(Geobacillus) 속 L-람노스 이소머라제를 발현하는 미생물은 지오바실러스(Geobacillus) 속 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 재조합 균주인것을 특징으로 하는　원-팟 D-알로스(allose) 생산용 조성물.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 내열성 균주 유래 D-알룰로스 3-에피머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 도 2의 개열지도를 가지며,
   상기 지오바실러스(Geobacillus) 속 L-람노스 이소머라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 도 7의 개열지도를 갖는 원-팟 D-알로스(allose)의 제조방법.
   
8. D-과당(D-fructose) 또는 이를 포함하는 기질 용액을,
   청구항 1의 조성물과 원-팟(one pot) 반응시키는 단계를 포함하는 원-팟 D-알로스(allose)의 제조방법.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 반응은 50℃ 내지 80℃의 온도, pH 6 내지 8에서, 1시간 내지 24시간 동안 수행하는 D-알로스(allose)의 제조방법.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 반응은 금속이온 존재 하에 수행하는 D-알로스(allose)의 제조방법.
    
11. 제 8 항에 있어서,
    상기 금속이온의 농도는 0.1~6 mM인 D-알로스(allose)의 제조방법.
    
12. 제 8 항에 있어서,
    알로스 전환율이 10% 이상인 D-알로스(allose)의 제조방법.
    
13. 제 8 항에 있어서,
    D-과당 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.7 중량부의 D-알룰로스 3-에피머라제 및 0.05 내지 1.5 중량부의 L-람노스 이소머라제를 상기 D-과당에 첨가하여 반응을 수행하는, 원-팟 D-알로스(allose)의 제조방법.
    
14. 청구항 8의 방법에 의해 제조된 알로스를 포함하는 식품 조성물.