KR20180026820A - 신규한 퓨코오스 이성화 효소 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규한 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase) 및 상기 퓨코오스 이성화 효소 변이 효소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고온에서 생육이 가능한 초고온성 세균인 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1)로부터 얻어진 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)의 변이 효소로 효소활성이 우수하고, 높은 온도 조건에서도 반응이 가능한 내열성을 갖는 변이 효소에 관한 것이다.
본 발명의 퓨코오스 이성화 효소는 고온에서 반응이 가능하고, 기존 보고된 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 반응 활성이 우수하며, 상기 퓨코오스 이성화 효소 유래 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 기존 야생형(wild type) 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 현저하게 우수한 효소활성을 갖는 것이 확인되었고, 상기 퓨코오스 이성화 효소 및 퓨코오스 이성화 효소 유래 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 모두 특정 이온의 존재 여부에 따라 효소 활성을 조절할 수 있으므로, 산업적인 측면에서 간단하게 반응 활성의 조절이 가능하여, 갈락토오스 등의 당로부터 최근 각광을 받은 천연 감미료인 타가토스 등 기능성 물질을 용이하게 생산할 수 있어, 산업적으로 유용하게 사용될 수 있을 것으로 예상된다.

Description

신규한 퓨코오스 이성화 효소 및 그 용도{A FUCOSE ISOMERASE AND A USE OF THE SAME}
본 발명은 퓨코오스 이성화 효소에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 기존 보고된 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 이성화 효율이 우수하고, 내열성이 뛰어난 신규한 퓨코오스 이성화 효소 및 상기 신규한 퓨코오스 이성화 효소의 야생형(wild type)에 비하여 효율성이 현저하게 개선된 퓨코오스 이성화 효소 변이 효소 및 그 이용방법에 관한 것이다.
경제수준 향상에 의한 영양과잉, 환경오염, 운동부족, 스트레스 증가 등에 따른 각종 생활 습관병 및 만성퇴행성질환의 만연이 우리 사회의 큰 문제로 대두되고 있다. 이 중, 최근에 가장 관심이 집중되고 있는 질병이 비만이다. 상기 비만은 일반적으로 음식물로 섭취한 에너지(energy intake)가 신체활동 등으로 소비한 에너지(energy expenditure)와 균형을 이루지 못하여, 잉여의 에너지가 체내에 지방세포(adipocyte)의 양적, 수적 증가를 일으켜 지방조직이 과다하게 축적된 상태를 의미하며, 유전적 요인, 환경적 요인, 정신적 요인 또는 식사습관 및 운동부족 등의 생활습관 등에 의하여 신체 내 에너지 밸런스가 무너져 생기는 질환을 의미한다.
국민건강영양조사에 따르면 우리나라 비만 유병률은 2001년 전체 평균 29.2% 였던 것에 비해, 2012년 32.8%로 점점 증가하는 추세를 나타내고 있다. 또한 보건복지부는 우리나라 인구의 38%가 권장섭취 기준 이상의 칼로리를 섭취하고 있으며, 이로 인한 심혈관 질환의 위험 또한 증가하고 있다고 보고하였다. 이러한 식습관의 변화로 인해 신체는 여러 위험요소에 노출되고 있으며, 특히 포화지방산이 다량 함유된 식품은 혈중 지질 농도를 증가시켜 고콜레스테롤혈증을 유발하며, 나아가 고지혈증, 심근경색 등 순환기 계통의 질환 발병률을 증가시킨다.
따라서, 이러한 비만과 관려된 다양한 질환 치료법 등의 해결책이 제시되고 있으나, 우선적으로 비만의 예방 또는 치료를 위해서는 적절한 운동과 식이조절이 요구되며, 이러한 차원에서 다양한 질환의 원인이 되는 비만과 직접적인 관련이 있는 설탕(sucrose)의 섭취를 줄이기 위한 대체 감미료에 대한 개발 요구가 증가되고 있는 실정이다.
여러 대체 감미료가 제시되고 있으며, 이러한 대체 감미료 중 하나로 최근 각광을 받고 있는 천연 감미료가 타카토스이다.
상기 타가토스는 새로운 기능성 천연 감미료로써 감미는 설탕의 92% 이면서 칼로리는 약 30% 정도로 낮고, 혈당 상승을 저해하며, 충치 예방 효과와 장내 유익균 증식의 역할 등 건강 유지에 여러 이점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다.
상기 타카토스를 제조하는 방법으로 대표적인 것이, 갈락토오스(L-Galactose)를 효소를 이용해 이성질화하여 제조하는 방법이다.
이러한 이성질화에 사용되는 효소는 천연 효소(natural enzyme) 즉, 자연에서 얻을 수 있는 야생형(wild type) 퓨코오스 이성화 효소(L - Fucose Isomerase)를 이용하는 방법이다.
그러나, 일반적으로 이러한 야생형의 천연효소는 반응 효율이 떨어지거나 일정한 온도 이상에서는 실활되어 효소 활성이 극히 낮아지는 등의 문제점이 있으므로, 이러한 문제점을 해결하는 것이 요구된다.
이러한 문제점을 해결하는 방법 중 하나로, 넓은 범위의 반응 조건에서도 반응활성이 유지되고, 높은 활성을 나타내는 새로운 효소를 찾아내는 것이 있다. 또 다른 해결책으로는 극한 환경에서 생존 가능한 미생물(extremophiles)로부터 내열성 효소 등 고온 등의 조건에서 반응이 가능한 효소를 얻는 것이다.
KR 10-0779160 B KR 10-1179914 B KR 10-1648352 B KR 2010-0053294 A KR 10-0667039 B
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해소하기 위하여, 본 발명은 기존 보고된 퓨코오스 이성화 효소(L - Fucose Isomerase)에 비하여 반응 효율이 우수하고 내열성을 가진 즉, 높은 온도에서도 퓨코오스 이성화 반응을 수행할 수 있는 퓨코오스 이성화 효소(L - Fucose Isomerase)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해, 야생형 퓨코오스 이성화 효소(wild type L - Fucose Isomerase)에 비하여 활성이 현저히 개선된 변이 퓨코오스 이성화 효소(mutant L - Fucose Isomerase)를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 초고온성 세균 유래로 종래 효소의 일반적인 반응 온도인 25 내지 35의 온도조건보다 높은 온도조건에서도 반응 효율이 유지되거나 향상될 수 있는 내열성을 가지고, 기존 보고된 퓨코오스 이성화 효소(L - Fucose Isomerase)에 비하여 반응 효율도 우수한 퓨코오스 이성화 효소(L - Fucose Isomerase) 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제공된 야생형 퓨코오스 이성화 효소(wild type L - Fucose Isomerase)에 비하여 활성이 현저히 개선된 변이 퓨코오스 이성화 효소(mutant L - Fucose Isomerase) 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)를 제공한다.
상기 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 제공한다.
상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 제공한다.
상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 제공한다.
상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 상기 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase) 또는 상기 본 발명의 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 이용하여 타가토스(L-Tagatose)를 제조하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 갈락토오스(L-Galactose)에 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase) 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈락토오스(L-Galactose)에 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant), 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant) 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법을 제공한다.
상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있다.
상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있다.
상기 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있다.
본 발명에 있어서, 푸코오스(Fucose)는 메틸당의 일종으로 6-디옥시당에 해당하며, D 및 L체의 두 종류가 천연에 존재하고, C6H12O5의 화학식을 가지며, 분자량이 164인 6-데옥시갈락토오스이다. 일반적으로, L-푸코오스를 의미한다. 생체에서의 역할은 사람 혈액형의 형결정기, 간으로의 혈청당단백질　이입 및 대식세포유주저지인자　수용체 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
상기 L-푸코오스(L-Fucose)는 해초 세포벽의 구성 성분으로, 해초, 특히 뜸부기과나 다시마과 등 갈조류에 풍부하고, 혈액형 다당류의 구성 성분이며, 주로 갈조류를 산으로 가수 분해하고 중화한 후, 공존하는 갈락토스　등의 발효성 당을　효모를 사용하여 분해하고 잔액으로부터 정제하여 제조한다.
본 발명에 있어서, 퓨코오스 이성화 효소(Fucose isomerase)는 주로 L-푸코오스 이성화효소(L-Fucose isomerase, L-FI, EC 5.3.1.25)를 의미한다. 상기 퓨코오스 이성화 효소, 구체적으로 L-푸코오스 이성화효소(L-Fucose isomerase)는 분자 내 산화환원 효소군의 하나로 알도오스와 케토오스의 변환을 촉매하는 효소군에 속하며, 전환반응에 보조인자로 2가 양이온(divalent metal ion), 구체적으로, Mn2 +과 같은 2가 금속이온이 요구된다. 상기 L-푸코오스 이성화효소는 도 1에 나타낸 바와 같이, L-퓨코오스(L-fucose)를 L-퓨쿨로스(L-fuculose)로 전환시키며, 효소적 이성화반응을 통해 L-갈락토스(L-galactose)를 L-타카토스(L-tagatose)로, D-아라비노스(D-arabinose)를 D-리불로스(D-ribulose)로, D-알트로스(D-altrose)를 D-프시코스(D-psicose)로 효율적으로 전환시키는 과정을 촉매하기 때문에 산업적으로 중요한 가치가 있는 효소이다. 현재 보고된 바에 의하면, 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래 L-푸코오스 이성화효소는 D-아라비노스(D-arabinose)를 D-리불로스(D-ribulose)로 효율적으로 전환시킬 수 있고, 호열균(thermophilic bacterium)인 칼디셀루로시럽토 사카로리티쿠스(Caldicellulosiruptor saccharolyticus) 유래 L-푸코오스 이성화효소는 L-갈락토스(L-galactose)를 L-타카토스(L-tagatose)로 효율적으로 전환시키고, D-알트로스(D-altrose)를 D-프시코스(D-psicose)로 효율적으로 전환시킬 수 있는 것으로 보고되어 있다.
본 발명에 있어서, 이성화 효소는 이성질화 효소라고도 불리우며, 한 분자 내에서 구조변화를 촉매하는 효소의 총칭을 의미한다.
상기 이성화 효소는 촉매하는 구조변화의 성질에 따라 5군으로 구분한다. 구체적으로, 분자 내 산화환원 효소군의 하나로 알도오스와 케토오스의 변환을 촉매하는 효소군(EC　5.3.1)이 있으며, 촉매하는 당의 종류에 따라 약 20종의 효소가 알려지고 있다. 일 예로, 자일로오스 이성질화 효소(xylose　isomerase,　EC　5.3.1.5)로, 자일로오스를 자일룰로오스(xylulose)로 변환하는 효소이며, 글루코오스를 변환하는 활성도 강하여 관용적으로 글루코오스 이성질화 효소(glucoseisomerase)라고도 불리운다.
이 외에, 유산균인 락토바실러스 속 등의 세균에 의한 광학활성 젖산의 라세미(racemi)화에 작용하는 락테이트 레세마아제(lactate　recemase), 유디피-디-글루코스(UDP-D-glucose)와 유디피-디-갈락토스(UDP-D-galactose)의 상호 변환을　촉매하는 유디피-디-글루코스-4-에피메라아제(UDP-D　glucose　4-epimerase),　말산(malic　acid)과　퓨마르산(fumaric　acid)의 상호 변화에 작용하는 말레에이트 아이소메라아제(maleate cis　trans-isomerase),　리놀렌산의　이성질체화에 작용하는 리놀레에이트 아이소메라아제(linoleate　isomerase), 아미노산의　이성질체화에 작용하는 효소로　아미노산의 알파 탄소에 작용하여　아미노산의 입체적 구조를 변화시키는 라세마아제(racemase), 에피메라아제(epimerase) 등이 있다
상기 이성화 효소는 이성질화 당 등 고부가물질의 생산에 요구되는 당 이성질체를 생산할 수 있는 이성화 효소가 산업적으로 중요하며, 이로 인해 식품분야에서는 이성화 효소라 하면　글루코오스 이성질화 효소(xylose　isomerase(glucose　isomerase)) 등을 가리키는 경우가 많다.
본 발명에 있어서, 타가토스(Tagatose)는 설탕을 대체하기 위한 천연 감미료 중 하나로, 갈락토오스의 입체이성질체이다. 상기 타가토스는 설탕과 유사한 감미도(설탕의 약 92%)를 가지고 있으며, 체내에서 대사 속도가 낮고 흡수율 또한 낮아, 부작용이 없고 소장에서 잘 흡수되지 않기 때문에 혈당치에 영향을 주지 않고, 칼로리도 낮으며(설탕의 약 30%, 1.5 kcal/g), 설탕과 물리적 성질 또한 비슷하기 때문에, 설탕 대체 감미료로 사용될 수 있음이 알려져 있다. 상기 타가토스는 미국 FDA로부터 GRAS(Generally Recognized As Safe) 식품으로 인정되어, 식품, 음료, 건강식품, 다이어트 첨가물 등에 기능성 감미료로서 사용되고 있다. 상기 타가토스는 혈당 상승을 저해하며, 충치를 예방하고, 소장에서 흡수되지 않고 대부분(80%) 대장으로 이동되어 장내 미생물에 의해 발효되어 유익한 유산균의 증식을 촉진하는 전생물적 효과(prebiotic effect)와 이 과정에서 대장암을 예방하는 부티릭산(butyrate)를 다량을로 생성하는 기능성도 있는 것으로 알려져 있다. 이런 유용한 활성을 갖는 설탕 대체 천연 감미료인 타가토스는 자연계에 흔하게 존재하지 않는 희소당이므로, 저칼로리의 기능성 감미료로 사용되기 위해서는 저렴한 원료로부터 대량 생산할 수 있는 기술이 개발이 요구된다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명의 발명자들은 기존 효소와 달리 초고온성 혐기 세균으로부터 효율적으로 타가토스(Tagatose)를 생성할 수 있는 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)를 확인하기 위한 연구를 진행하던 중, 도 2에 나타낸 바와 같이, 온천과 심해 열수구에서 주로 발견되고, 50℃ 내지 85℃의 온도 범위에서 생장하며, 포자를 생성하지 않는 그람음성의 간균인 퍼비도박테리움 이슬란디컴(Fervidobacterium islandicum) 중 갈락토오스로부터 타가토스를 생성하는 퓨코오스 이성화 효소 활성이 우수한 초고온성 혐기세균인 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1)를 분리하였고, 도 3에 나타낸 바와 같이, 상기 초고온성 혐기세균인 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1로부터 우수한 이성화 활성을 갖는 신규한 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)를 분리하여 본 발명을 완성하였다.
또한, 일반적으로 고온에서도 반응이 가능한 초호열균(hyperthermophile) 유래의 효소들은 산업적으로 많이 사용되고 있으나, 기질인 당의 농도가 높아지는 경우, 효소공정에서의 효소와 기질과의 마찰계수가 증가하여 반응이 느리게 진행되어 상대적으로 생산량이 적어지게 되는 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 발명자들은 기질인 L-갈락토오스(L-galactose)와 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)의 친화도를 개선하는 연구를 진행하던 중, 상기 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1 유래 퓨코오스 이성화 효소에 대해 돌연변이생성법(mutagenesis)을 수행하여, 다양한 돌연변이체 즉, 변이효소(mutant)를 제작하고, 이 중에서 L-갈락토오스와 기질 친화도가 증가된 활성을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose isomerase mutant)를 제조하여, 이 발명을 완성하였다.
본 발명은 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)에 관한 것이다.
상기 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1 유래 퓨코오스 이성화 효소는 종래 보고된 퓨코오스 이성화 효소와 서열 상동성이 낮은 신규한 효소로, 기존 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 높은 활성을 가지고, 높은 온도 범위에서도 효소 활성이 유지되는 특성을 갖는다.
상기 퓨코오스 이성화 효소는 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래의 내열성 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)의 변이효소(mutant)에 관한 것이다.
상기 변이 효소는 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1 유래의 퓨코오스 이성화 효소의 특정위치의 아미노산을 변경하여 모효소인 상기 야생형(wild type) 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 효소활성이 우수하고, 내열성이 유지될 수 있는 특징을 갖는 변이 효소일 수 있다.
상기 변이 효소는 야생형 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 효소활성이 우수할 뿐만 아니라, 최적 반응 온도와 반응온도 범위의 측면에서 우수한 열안정성도 유지된다.
상기 변이효소는 다양한 효소 개량 방법을 통해 제조된 돌연변이 효소일 수 있다. 일 예로, 산업용 효소 개량에 널리 이용되는 방법인 error-prone PCR법은 무작위적 돌연변이 제조법(random mutagenesis)이라고 불리며, 특정 단백질의 아미노산서열을 무작위로 변경시키는 방법이다. 즉, 유전자를 PCR로 증폭시킬 때 DNA 복제의 정확도가 낮아져서 일부 위치에 돌연변이가 일어남을 이용하여 효소를 개량하는 방법이다. 상기 PCR 과정에서 유발되는 돌연변이율 (mutation rate)은 첨가해주는 MnSO4와 dGTP의 양을 변화시켜 조절이 가능하다.
상기 본 발명의 변이 효소는 바람직하게는 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있고, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 변이효소는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있고, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 변이효소는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있으며, 상기 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 변이효소는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있다.
상기 변이효소의 아미노산 서열에 의해 보호되는 범위에는 상기 변이효소의 특성을 유지하는 한, 상기 변이효소를 생산하기 위하여 특정 서열, 일 예로 특정 제한효소의 제한부위(restriction enzyme site)와 관련된 서열이나 특정 프로모터(promoter)와 관련된 결합부위에 의해 암호화되는 아미노산 서열이 상기 변이효소의 아미노산 서열에 결합된 것이 포함될 수 있다.
상기 변이효소는 더욱 바람직하게는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소 변이효소일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1 유래의 내열성 퓨코오스 이성화 효소의 변이효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
상기 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열번호의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 염기서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 더욱 바람직하게는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 것일 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 의해 보호되는 범위에는 상기 변이효소의 특성을 유지하는 한, 상기 변이효소를 생산하기 위하여 특정 서열, 일 예로 특정 제한효소의 제한부위(restriction enzyme site)와 관련된 서열이나 특정 프로모터(promoter)에 관한 서열이 상기 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된 것을 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 실시예에 의해 번역개시와 관련된 개시코돈(ATG)이나 번역종결과 관련된 종결코돈(TAA)가 삽입되는 벡터 내에 개시코돈 또는 종결코돈의 유무에 따라 추가 또는 삽입될 수 있으며, 일 예로, 제조합 벡터를 제조하기 위한 벡터에 의해 결합되기 위한 제한부위를 갖는 폴리뉴클레오티드 서열이 추가되거나, 개시코돈과 함께 야생형(wild-type)에 존재하는 신호서열(signal sequencing)을 추가 또는 제거할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다. 상기 벡터는 통상의 발현용 벡터, 예컨대 Pet-28a 벡터에 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 제조한 재조합 벡터일 수 있으며, 일 예로 도 4의 개열지도를 갖는 벡터일 수 있다. 상기 발현용 벡터는 숙주 세포의 종류에 따라 적합한 벡터를 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 서열번호 4, 서열번호 6 및 서열번호 8로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 아미노산 서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소 변이 효소를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 변이효소 제조방법은 상기 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 아미노산 서열을 갖는 내열성 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3, 서열번호 5 및 서열번호 7로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 하나의 서열의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 이용하는 방법일 수 있으며, 상기 재조합 벡터를 원핵생물, 진핵생물 또는 진핵생물에서 유래된 진핵세포에 형질전환시켜 형질전환체를 제조하고, 상기 형질전환체를 배양하고, 상기 형질전환체가 배양된 배양액으로부터 상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 수득하는 방법으로 상기 변이효소를 수득할 수 있다. 상기 재조합벡터의 제조 및 형질전환체의 통상의 유전공학적 방법에 따라 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 신규한 퓨코오스 이성화 효소 또는 퓨코오스 이성화 효소 변이 효소를 이용하여 갈락토오스(L-galactose)로부터 타가토스(L-Tagatose)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 상기 본 발명의 상기 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase) 또는 상기 본 발명의 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 이용하여 타가토스(L-Tagatose)를 제조하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법이다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 갈락토오스(L-Galactose)에 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase) 또는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 갈락토오스(L-Galactose)에 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant), 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant) 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법을 제공한다.
상기 타가토스 제조방법은 바람직하게는 2가 금속 양이온, 더욱 바람직하게는 Mn2 +를 첨가하여 수행할 수 있다. 상기 이온의 첨가는 Mn2 +를 첨가할 수 있는 물질을 첨가하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 2가 금속 양이온, 바람직하게는 Mn2 +의 첨가는 효소 활성 및 내열성을 현저하게 증가시킬 수 있는 것으로 확인되었다.
본 발명의 제조방법에 의해서 생성된 타가토스는 우수한 감미도를 가지고 있으면서도, 체내 흡수율이 낮아 소장에서 거의 흡수되지 않으므로, 혈당상승이 거의 없으며, 대장에서 미생물에 의해 발효되어, 유산균 증식에 도움이 되고, 대장암을 예방할 수 있는 부티릭산이 부산물로 생산되어 대장암 예방 효과가 있으며, 이 외에 다양한 기능성을 가지고 있어, 설탕에 대한 천연 대체 감미료로 각광받고 있는 고부가가치 재료이므로, 저렴하고 자연계에 다량 존재하는 갈락토오스로부터 다량으로 생성된 타가토스는 식품 감미료, 기능성 식품 및 의약품 소재 등 관련 산업 분야에 널리 활용될 수 있다.
본 발명의 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1)로부터 분리된 신규한 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)는 40 이상의 높은 온도에서 반응 수행이 가능하고, 종래 보고된 퓨코오스 이성화 효소에 비하여 효소 활성이 우수할 뿐만 아니라, 상기 신규한 퓨코오스 이성화 효소 유래 신규한 퓨코오스 이성화 효소 변이효소(L-Fucose Isomerase mutant)는 기존 호열성 또는 초고온성 세균 유래 효소의 경우, 산업적 사용에서 기질과 기질과의 마찰계수가 증가하여 반응이 느리게 진행되어 상대적으로 생산량이 적어지게 되는 문제점을 해결하여, 갈락토오스와 친화도가 높은 효소로, 기존 야생형 효소에 비해 효소 활성이 현저하게 개선된 것이므로, 이러한 효소를 이용하여, 안전하면서도 혈당 상승 및 칼로리가 낮아 설탕 대체 천연 감미료로 각광받고 있는 고부가가치 기능성 소재인 타가토스를 효과적으로 생산할 수 있어, 식품소재, 기능성 식품 및 의약품 관련된 산업에 크게 기여할 것으로 예상되어, 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase, L-fi)에 의한의 이성화 반응을기질(L-fucose, L-Galactose)과 반응 결과물(L-fuculose, L-Tagatose)을 구분하여 나타낸 도식이다.
도 2는본 발명의 일 실시예에 따른 분리균인 AW-1의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 확인하여, 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1)를 확인한 그림이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)의 아미노산 서열을 기초로 다른 효소와의 계통발생론적 관계를 확인한 그림이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 5601 bp 크기의 pET28a(+)의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)의 재조합 효소의 SDS-PAGE 분석 결과를 나타낸 사진이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 96-웰 플레이트 분석(96-well plate assay)을 이용하여 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)의 변이효소의 기능성 분석을 수행한 결과를 나타낸 표이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)의 변이효소의 기질 갈락토오스(L-Galactose)에 대한 친화도 기준 효소 활성(enzyme activity)를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위하여 제조예 및 실시예를 제시한다. 그러나, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 예시한 것을 뿐, 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 예들에 한정되는 것은 아니다.
준비예 : DNA, 시약 및 배지
고온성 L-퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose isomerase)를 암호화하는 유전자의 발굴을 위해 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1)의 genomic DNA를 이용하였다. 대장균(E. coli DH5α)를 유전자 클로닝을 위한 숙주로 사용하였고, Luria-Bertani(LB) 배지(1% bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl)를 이용하여, 37℃ 조건에서 배양하였다.
상기 대장균 형질전환체의 선별을 위해 kanamycin을 최종농도 50 μg/ml가 되게 첨가한 LB 한천배지를 사용하였다. 제한효소, DNA ligation kit는 Roche Korea에서 구입하였다. Error-prone PCR을 이용한 돌연변이 DNA 라이브러리 제작를 위한 Diversity PCR Random mutagenesis kit는 Clontech에서 구입하였다.
실시예 1: 유전자 확보 및 클로닝
퓨코오스 이성화 효소를 얻기 위해, 본 발명의 발명자가 분리한 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1의 genomic DNA를 주형으로 nPfu-Forte DNA polymerase(Enzynomics)를 이용하여 증폭시켰다.
상기 초고온성 혐기성 세균인 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1의 genomic DNA로부터 L-퓨코오스 이성화 효소 유전자를 확보하였다.
상기 Fervidobacterium islandicum의 genome sequence를 참고하여 제작한 프라이머인 FucI-AW1-F(5’- cat atg caa gca aaa aga aag ctc aag - 3’, inserted NdeI site under-lined)와 FucI-AW1-R (5’- gga tcc tta atc caa gag ttt ata gtt ctg - 3’, inserted BamHI site underlined)이 사용되었다. 증폭된 1.45 kb의 DNA 단편을 pTOP-Blunt V2 vector(Enzynomics)에 연결시켜 pTOPV2-FIFI를 제작하였고, 상기 벡터를 E. coli DH5α세포에 삽입하여, 형질전환체를 제조하였다. 제조된 형질전환체에 삽입된 DNA 염기서열의 확인은 Solgent 사(대한민국)에 의뢰하여 분석하였다.
상기 분석결과, 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1 유래 L-퓨코오스 이성화 효소 유전자는 1,446 bp로 구성되어 있고, 482 개의 아미노산을 암호화하는 것으로 확인되었다. BLAST를 이용한 FIFI의 아미노산 서열은 도 3에 나타낸 바와 같이, Fervidobacterium pennivorans hypothetical protein, Meiothermus cerbereus FI, Dictyoglomus turgidum L-FI-like protein 및 Thermotoga neapolitana FI와 각각 88%, 31%, 28%, 및 26%의 상동성을 보여 기존의 연구된 퓨코오스 이성화 효소와 보존성이 낮음이 확인되었다.
실시예 2: 재조합 L- 퓨코오스 이성화 효소의 발현
상기 실시예 1에서 제조된 L-퓨코오스 이성화 효소 유전자를 포함하는 pTOPV2-FIFI 를 제한효소 NdeI/BamHI으로 처리한 후 확보한 1.45 kb의 DNA 단편을 대장균 발현벡터인 pET-28a(Novagen)에 삽입하여 재조합 벡터인 pET-28a-FIFI를 제조하였고, E. coli DH5a 세포에 상기 재조합 벡터를 삽입시켜, 형질전환시켰다. 이후, 상기 pET-28a-FIFI를 제한효소 NdeI/BamHI으로 절단하여 1.45 kb의 L-퓨코오스 이성화 효소 유전자 단편의 삽입 여부를 확인하였다.
상기 재조합벡터 pET-28a-FIFI를 삽입시킨, 재조합균주를 항생제 kananycin이 첨가된 3 ml의 LB배지를 이용하여 37℃의 온도조건에서 14시간 동안 배양하였다. 상기 배양액 1%를 kananycin이 첨가된 3 ml의 LB배지를 이용하여 37℃에서 2시간 배양한 후, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 최종농도 1 mM 로 첨가하여 T7 promoter를 활성화시켰다. 구체적으로, IPTG를 첨가한 후 추가로 37℃에서 4시간 더 배양하였다.
상기 재조합 벡터에 의해 L-퓨코오스 이성화 효소가 발현되었는지 여부를 확인하기 위하여, SDS-PAGE를 수행하였다.
상기 SDS-PAGE는 12% polyacrylamide gel을 이용하여 Laemmli의 방법으로 수행하였다. 구체적으로, 재조합 단백질이 발현된 세포를 Laemmli’s sample buffer와 혼합하여 10분간 끓인 후, 겔(gel)에 주입하고, 전기영동을 수행한 후, coomassie reagent를 이용하여 단백질을 가시화하였다. 상기 SDS-PAGE를 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 재조합 숙주(E. coli BL21(DE3))에 재조합 벡터인 pET-28a-FIFI 플라스미드가 잘 삽입되었고, 상기 재조합 벡터로부터, 재조합 L-퓨코오스 이성화 효소가 성공적으로 발현된 것이 확인되었다. 상기 이성화 효소의 SDS-PAGE는 분자량 55 kDa에 밴드를 보이는 것으로 나타났고, 이는 염기서열을 토대로 추산한 것과 일치하였다.
추가로, L-퓨코오스와 L-갈락토오스로부터 각각 L-퓨쿨로스와 L-타카토스를 생산하는 이성질화 활성을 측정하고자, 효소활성은 cysteine-carbazole activity assay을 이용하여 측정하였다. 여러 조건 및 기질에 대해 실험한 결과, 정제된 L-퓨코오스 이성화 효소는 pH 7.0 내지 7.5의 pH 조건 및 75 내지 80℃ L-의 온도 조건과 1 mM Mn2 +에서 최적활성을 보였고, 기질로 L-fucose, D-arabinose, D-altrose, and L-galactose에 각각 100, 90, 182, 143%의 상대 활성을 가지는 것으로 확인되었다.
실시예 3: 재조합 L- 퓨코오스 이성화 효소 변이효소의 선택
변이효소를 제조하기 위한, Random mutagenesis DNA 라이브러리는 Clontech 의 Diversify PCR Random mutagenesis kit를 사용하였고, 1000 bp 당 2개의 mutation rate에 해당하는 조건을 선택하였다. Error-prone PCR 반응액 50μl 안에 5μl 10× TITANIUM Taq buffer, 1μl 8 mM MnSO4, 1μl 2 mM dGTP, 1μl 50× Diversify dNTP Mix, 1μl each 10 pmol primer, 1μl template DNA, 그리고 1 μl TITANIUM Taq polym이 포함되었다. 단편 증폭시 T7 forward primer 5’- TAATACGACTCACTATAGGG - 3’와 T7 terminator reverse primer 5’- GCTAGTTATTGCTCAGCGG - 3’를 사용하였다. PCR 반응은 94℃ 1분, 94℃ 30초, 68℃ 1분 40초, 68℃ 5분 하여 전체 25회 반복을 실행하였다.
증폭된 PCR 산물을 제한효소 NdeI/BamHI로 절단하고 동일한 제한효소로 처리된 1μg pET-28a vector와 연결시켰다. 전기천공법(electroporation)을 이용하여 E. coli BL21(DE3) competent cells에 형질전환하였다. 상기 형질전환된 세포는 선별 항생제 kanamycin 50 μg/ml이 포함된 LB 한천배지에 도말하여 37℃에서 14 시간 배양하였다. 제작된 DNA 라이브러리의 다양성을 알아보기 위해 무작위로 transformants 10개를 선발하여 LB배지에 배양하여 플라스미드를 추출하여 DNA 서열을 분석하였다.
상기 E. coli BL21(DE3) 에 형질전환된 pET-28a-FIFI random mutagenesis DNA 라이브러리의 사이즈는 1.1 ×106 로 확인되었다. pET-28a-FIFI 라이브러리를 제한효소 Nde I/BamHI으로 절단하여 1.45 kb의 L-퓨코오스 이성화 효소 유전자를 확인하였다. 제작된 라이브러리의 다양성을 플라스미드 추출 및 DNA 서열 분석을 수행한 결과 DNA nucleotide 상의 돌연변이 도입이 0 내지 2개/ 1000 bp임을 확인하였다.
제작된 pET-28a-TNAI 돌연변이 DNA 라이브러리를 activity-based 스크리닝하기 위해 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시켜 항생제 kanamycin이 포함된 LB 한천배지에 도말하였다. 구축된 FIFI 돌연변이 라이브러리 중 1차적으로 활성형 (active form-positive mutant)를 선별하기 위해 1,000개의 콜로니를 무작위로 선택하여 L-퓨코오스 를 기질로 하여 효소 활성 측정을 96 well plate상에서 실시하였다. 1차 선별된 콜로니를 대상으로 2차로 L-갈락토스를 기질로 사용하여 효소활성을 수행하였다. ELISA-96 well plate를 이용한 1차 스크리닝 후 확보된 기질친화도가 증가된 개량효소의 nucleotide sequencing을 통해 유전자 mutation site를 확인하고, his-taq 정제를 통해 개량효소의 활성을 측정하여 비교하였다.
상기 구축된 1.1×106 개의 TNAI 돌연변이 라이브러리 중 1차적으로 활성형(active form-positive mutant)을 선별하기 위해 1,000개의 콜로니를 무작위로 선택하여 L-fucose를 기질로 하여 효소 활성 측정을 96 well plate상에서 실시하였다. 이를 통해 1,000 개의 콜로니중 야생형 (wild-type)에 비해 활성이 높게 나타나는 약 74 개의 콜로니를 1차적으로 선별하였다. 1차 선별된 74개의 콜로니를 대상으로 L-갈락토스를 기질로 하여 L-타가토스로의 이성화 활성을 측정하고자 cysteine-carbazole assay를 수행하였다. 상기 수행한 결과를 도 6에 나타내었다. 상기 도 6에 나타낸 바와 같이, TNAI의 야생형(wild-type)보다 높은 활성을 나타내는 돌연변이체 3종(C3, C4, and F4)을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 돌연변이체의 효소 활성을 개량여부를 확인하고자, L-갈락토스를 기질로, 셀양(optimal density)를 동일하게 하여 야생형 효소와 활성을 비교하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 상기 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 3종의 돌연변이체는 야생형 효소에 비해 2배 내지 3배 이상 효소 활성이 증가된 것이 확인되었다.

Claims (13)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 퍼비도박테리움 이슬란디컴 AW-1(Fervidobacterium islandicum AW-1) 유래 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase).
  2. 제1항에 있어서, 상기 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase)는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 퓨코오스 이성화 효소(L-Fucose Isomerase).
  3. 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  4. 제3항에 있어서, 상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 3의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  5. 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  6. 제5항에 있어서, 상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  7. 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  8. 제7항에 있어서, 상기 퓨코오스 이성화 효소 변이효소는 서열번호 7의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소.
  9. 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 갈락토오스(L-Galactose)에 제1항 또는 제2항 중 어느 한 항에 따른 퓨코오스 이성화 효소를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법.
  13. 갈락토오스(L-Galactose)에 제3항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 퓨코오스 이성화 효소 변이효소를 반응시키는 단계를 포함하는 타가토스(L-Tagatose) 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021040385A1 (ko) * 2019-08-29 2021-03-04 고려대학교 산학협력단 신규한 퓨코스 이성화효소 및 이를 이용한 퓨코스 생산방법
KR20210026170A (ko) * 2019-08-29 2021-03-10 고려대학교 산학협력단 신규한 퓨코스 이성화효소 및 이를 이용한 퓨코스 생산방법
CN114555801A (zh) * 2019-08-29 2022-05-27 高丽大学校产学协力团 新型岩藻糖异构酶及使用其生产岩藻糖的方法

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