CN111206009B - 一种高产d-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高产D‑阿洛酮糖的基因工程菌及其应用。本发明利用食品级菌株枯草芽孢杆菌为宿主菌，通过基因重组高效表达D‑塔格糖3‑差向异构酶，形成直接利用D‑果糖产D‑阿洛酮糖的细胞工厂。筛选获得的高产D‑阿洛酮糖的基因工程菌，经发酵工艺优化，D‑阿洛酮糖产量达到4.56g/L，底物转化率56.26％，D‑阿洛酮糖生产效率0.19g/L·h。

Description

一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用。
背景技术
稀有糖(Rare sugar)，国际糖协会(ISRS)对稀有糖定义“自然界中存在但含量极少的一类单糖及其衍生物”。虽然在自然界中含量极少但这些物质却在膳食、保健、医药等领域中发挥极大的作用。D-阿洛酮糖(D-allulose)是D-果糖C-3位上的差向异构体，是一种重要的稀有糖。D-塔格糖3-差向异构酶(简称DTEase)可以催化多种酮糖C3位的差向异构，是有效生产D-阿洛酮糖的生物催化剂。应用基因工程菌发酵技术，可催化D-果糖和D-阿洛酮糖之间的异构化，直接利用底物D-果糖发酵生产D-阿洛酮糖。
随着过量高能量食物摄入引发的一系列慢性疾病，合理的膳食结构受到人们的广泛关注。新型蔗糖替代品的研究开发是功能性甜味剂领域的热点。D-阿洛酮糖是一种天然的己酮糖，又被称为D-核糖-2-己酮糖(D-ribo 2-hexulose)，甜度为蔗糖的70％，但热量值很低小于1.6kJ/g，约是蔗糖热量的10％，具有较高的溶解度极易溶于水，较低的血糖反应。因此它是一种理性的功能性甜味剂，也是蔗糖的完美替代品。FDA于2014年正式批准D-阿洛酮糖为GARS，允许其应用于食品、膳食补充剂以及医药制剂中。此外，D-阿洛酮糖还具有防龋齿、降低血糖、预防和改善糖尿病以及抑制体内脂肪的累积，在制药行业应用前景广阔。
制备D-阿洛酮糖的方法主要有化学合成法和生物转化法，化学合成法主要是通过一些催化加氢、加成反应、Ferrier重排等反应来合成，但是这些化学合成方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、产率较低、副产物多和分离纯化困难等缺点。而经D-塔格糖3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase，DTEase，EC 5.1.3.31)异构D-果糖为D-阿洛酮糖的生物转化法具有反应简单，产物单一，纯化步骤容易还能保持天然产品的品质等优点成为了D-阿洛酮糖商业化生产的热点和焦点。
目前生物合成制备D-阿洛酮糖大多数都聚焦于酶法转化，应用基因工程菌发酵生产的研究相对较少，但是更有助于产业化生产D-阿洛酮糖。利用基因工程菌株发酵法生产D-阿洛酮糖可以有效降低D-阿洛酮糖的生产成本且具有以下优势：(1)有利于产物的积累；(2)实现底物的充分转化；(3)分离纯化相对简单甚至可以直接用作添加剂。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为枯草杆菌的一个属，是非致病菌且不含内毒素以及致热致敏蛋白，被FDA和中国农业农村部等部门批准为食品级安全菌株。枯草芽孢杆菌发酵技术历史悠久且研究充分，其表达系统没有明显密码子偏好性，具有很强的蛋白分泌功能，细胞壁组成简单，严格好氧性生长，培养条件简单且生长迅速，遗传背景研究比较清楚，并且具有良好的发酵基础。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌，其保藏编号为：GDMCC No：60951。
本发明的第二个目的是提供所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌的应用。
优选，所述的应用，是所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌在产D-阿洛酮糖中的应用。
优选，所述的应用，是用所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌或利用其提取的D-塔格糖3-差向异构酶将底物D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
优选，所述的应用，将所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌接种到种子培养基中，加入D-果糖作为底物，发酵培养，D-果糖转化为D-阿洛酮糖；所述的种子培养基：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量为水。
优选，所述的发酵培养体系和条件为：取在种子培养基中培养16h的所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌的种子液接种，3％接种量，20％的装液量，种子培养基初始pH 7.0，加入5g/L的D-果糖、5mM的Mn2+，培养温度35℃，转速200rpm，发酵时间24h。
枯草芽孢杆菌表达载体pP43NMK是张晓舟通过利用P43启动子和NprB信号肽编码序列构建的高效分泌表达穿梭载体，宿主菌枯草芽孢杆菌WB800是缺失8种蛋白酶的菌株，是用来分泌表达外源蛋白的良好宿主。强启动子P43和分泌效率较高的NprB信号肽作为表达元件以便实现D-塔格糖3-差向异构酶(DTEase)在枯草芽孢杆菌中的高效分泌表达，此外该载体分泌的蛋白也会保持天然的N-末端。
本发明的有益效果：
本发明提供一株高产D-阿洛酮糖的食品级重组枯草芽孢杆菌，其可以直接利用底物D-果糖发酵生产D-阿洛酮糖。该基因工程菌首次实现了利用发酵法生产D-阿洛酮糖，有效地降低生产成本，这也为后期借助合成生物学的手段方法改造修饰产糖菌株奠定坚实的基础。此外，该重组枯草芽孢杆菌在食品化工和制药领域中具有重要的应用价值。
本发明的高产D-阿洛酮糖的重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800(即保藏证明中的Bacillus subtilis WB800)于2020年01月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏编号为：GDMCC No：60951。
附图说明
图1是基因工程菌表达载体DTEase-pP43NMK图谱；
图2是阳性克隆子菌液PCR琼脂糖凝胶电泳检测；
图3是基因工程菌发酵菌株产糖能力分析及选取；
图4是D-塔格糖3-差向异构酶聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白表达检测；
图5是重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800生长曲线；
图6是重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800发酵产D-阿洛酮糖曲线；
图7是重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800发酵过程D-葡萄糖和D-果糖含量变化图；
图8是HPLC分析D-果糖转化D-阿洛酮糖图谱。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
来源于球形红细菌SH1(Rhodopirellula baltica SH1)的DTEase基因的NCBI-Gene ID：NC_005027，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，共888bp。
DTEase-pMDTM18-T载体：DTEase基因由英潍捷基(上海)贸易有限公司全基因合成，具体是：将一系列化学合成的oligo DNA(Life)通过PCR的方法拼接成目的基因序列，并将合成好的序列装入pMD18-T载体并转化至感受态细胞TOP10，测序验证重组克隆中插入序列正确，再经由普通小量抽提试剂盒抽提，最终获得质粒DTEase-pMDTM18-T。
实施例1：DTEase基因目的片段扩增
通过PCR的方法，以DTEase-pMDTM18-T载体为模板，利用DTE-F和DTE-R为引物，扩增获得DTEase基因目的片段产物；
引物序列如下：
DTE-F：5’-TGCACTGCAGATGTTGATATCCCCTTTCGAG-3’(Pst I)，
DTE-R：5’-GGAAGCTTTCAGGCGTTCCGTGCGGC-3’(Hind III)。
PCR反应体系如下：
Figure BDA0002381500900000041
PCR反应程序如下：95℃预变性5 min；98℃10 s，56℃15 s，72℃1 min，进行35个循环；72℃延伸5 min。最终扩增获得DTEase基因目的片段(如SEQ ID NO.1所示)。
实施例2：克隆载体DTEase-
Figure BDA0002381500900000042
-T1的构建
将扩增获得的DTEase基因目的片段和
Figure BDA0002381500900000043
-T1(北京全式金生物技术有限公司)按照如下体系进行连接反应：
Figure BDA0002381500900000044
反应过程如下：轻轻混合反应混合物，PCR仪控温25℃反应10 min，反应结束后冰浴2～3min。
将连接产物加入100μL Trans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴30 min左右；42℃水浴热激30 s，立即置于冰上2 min；加250μL平衡至室温的SOC培养基，200 rpm、37℃培养1 h；取200μL菌液涂布到LB固体培养基(含50μg/mL Kan)上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，利用引物对M13-F/R菌液PCR验证后，测序再验证。验证正确的菌液，提取质粒，被命名为DTEase-
Figure BDA0002381500900000045
-T1。
引物序列如下：
M13-F：5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’，
M13-R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。
实施例3：表达载体DTEase-pP43NMK的构建
将质粒DTEase-
Figure BDA0002381500900000051
-T1和pP43NMK，分别用Pst I和Hind III进行双酶切，胶回收基因片段，利用Takara的DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒经T4连接酶进行连接反应(16℃反应30 min)后转化入E.coli DH5α感受态细胞(具体方法同实施例2中
Figure BDA0002381500900000052
-T1转化过程)，涂布含有Amp(50μg/mL)的LB平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，以DTE-F和DTE-R为引物菌液PCR筛选阳性克隆，抽提质粒，双酶切(Pst I和HindIII)和测序验证。验证及测序正确的重组质粒命名为DTEase-pP43NMK(图1)。
线性化基因片段试剂盒连接反应体系如下(目的片段：线性化载体＝1:100以上)：
Figure BDA0002381500900000053
实施例4：高产发酵菌株的选取
将正确的重组质粒DTEase-pP43NMK转化入枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)WB800感受态细胞，涂布含有Kan(50μg/mL)的LB固体平板上，37℃过夜培养。挑取阳性克隆，以DTE-F和DTE-R为引物菌液PCR筛选阳性转化子(图2)。将阳性单克隆过夜培养，然后接种在含有D-果糖(5 g/L)的基础发酵培养基中，37℃、200 rpm培养24 h，离心取上清HPLC分析发酵产D-阿洛酮糖的情况(图8)，依据测得阳性单克隆菌株1-7的D-阿洛酮糖的得率(图3)依次分别为：3.673％、1.32％、8.351％、5.422％、6.131％、9.897％、6.538％，筛选获得高产D-阿洛酮糖的发酵菌株6，命名为重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800。
所述的基础发酵培养基(下同)：每升含有葡萄糖10 g，酵母提取物15 g，NaCl 8g，MgSO4 1 g，Na2HPO4 1 g，余量为水。
实施例5：DTEase基因表达和酶活力测定
1、将选取的高产发酵菌株重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800进行发酵培养，挑取新鲜菌落至种子培养基中，37℃、200 rpm培养12～14 h，待其OD值达到0.6～0.8时，按3％接种量接种到基础发酵培养基中，37℃、200 rpm下继续培养16～20 h，将获得的菌液低温离心(4℃，8000 rpm，10 min)，弃去上清收集沉淀菌体。向沉淀菌体中加入适量的Tris-HCl缓冲溶液(50 mM，pH9.0)，超声破碎30 min～60 min，4℃、8000 rpm离心30 min，收集上清滤膜过滤获得粗酶液，并用SDS-PAGE检测表达蛋白，蛋白电泳显示DTEase大小约为32kDa与文献报道一致，表明DTEase基因成功表达(图4)。
所述的种子培养基(下同)：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量为水。
2、DTEase酶活定义及测定方法：在40℃、pH 9.0下，每分钟产生1μmol D-阿洛酮糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位，即通过测定D-果糖发生差向异构生成的D-阿洛酮糖的数量来确定酶活，反应在含有50mM D-果糖的甘氨酸/氢氧化钠缓冲液(50mM，pH 9.0)中进行，粗酶液加酶量0.5mL，40℃保温10min后对反应体系100℃加热3min终止酶反应，离心(15000g，20min，4℃)后取上清过滤(0.22um)，HPLC测定滤液D-阿洛酮糖含量。经测定，粗酶液酶活7.4U/mL。
实施例6：重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800产D-阿洛酮糖发酵优化
1、用接种环从平板上挑取新鲜菌落接种至种子培养基中，37℃、200rpm培养24h，定时取样，绘制种子生长曲线(图5)。后续实验中取培养时间为16h的种子液接种发酵。
2、单因素优化实验，分析不同条件对发酵产D-阿洛酮糖的影响。1L的摇瓶体系中，具体优化如下：
D-果糖浓度优化：37℃，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h；D-果糖浓度(5g/L-30g/L)。结果如表1所示，最佳D-果糖浓度为5g/L。
表1D-果糖浓度优化结果
Figure BDA0002381500900000061
发酵温度优化：5g/L果糖，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h；发酵温度(28℃-50℃)。结果如表2所示，最佳发酵温度为35℃。
表2发酵温度优化结果
Figure BDA0002381500900000071
pH优化：5g/L果糖，35℃，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h；培养基初始pH(6.0-9.0)。结果如表3所示，最佳培养基初始pH为7。
表3pH优化结果
Figure BDA0002381500900000072
金属离子优化：5g/L果糖，35℃，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h；不同金属离子及浓度(1、5和10mM的Ca2+，Mg2 +，Zn2+，Fe2+，Fe3+，Co2+，Cu2+，Mn2+，Ni2+)。结果如表4所示，5mM Mn2+条件下D-阿洛酮糖产量达4.285g/L。
表4金属离子优化结果
Figure BDA0002381500900000073
Figure BDA0002381500900000081
接种量优化：5g/L果糖，35℃，pH 7.0，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h；接种量(1％-5％)。结果如表5所示，最佳接种量为3％。
表5接种量优化结果
Figure BDA0002381500900000082
装液量优化：5g/L果糖，35℃，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，转速200rpm，发酵时间24h；装液量(10％-50％)。结果如表6所示，最佳装液量为20％。
表6装液量优化
Figure BDA0002381500900000083
转速优化：5g/L果糖，35℃，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，发酵时间24h；转速(150-250rpm)。结果如表7所示，最佳转速为200rpm。
表7转速优化结果
Figure BDA0002381500900000084
Figure BDA0002381500900000091
发酵时间优化：5g/L果糖，35℃，pH 7.0，3％接种量接种至种子培养基，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm；发酵时间(0-28h)。结果如表8所示，最佳发酵时间为24h。
表8发酵时间优化
Figure BDA0002381500900000092
3、利用重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800在以下的培养条件下发酵产D-阿洛酮糖，并定时取样，测定OD600，D-果糖和D-葡萄糖的消耗量(图7)以及产D-阿洛酮糖(图6)数据如图6-7所示。
本发明的重组枯草芽孢杆菌DTEase-pP43NMK-WB800经发酵工艺优化(发酵体系及条件：5g/L的D-果糖，培养基初始pH 7.0，培养温度35℃，5mM的Mn2+，取培养时间为16h的种子液接种，3％接种量，20％的装液量(种子培养基)，转速200rpm，发酵时间24h)，D-阿洛酮糖产量达到4.56g/L，而发酵过程中有2.813g/L的D-果糖酶促底物，其余的作为碳源，因而底物转化率56.26％，D-阿洛酮糖生产效率0.19g/L·h。经发酵工艺优化后，底物转化率明显提高，产D-阿洛酮糖量较未优化提高了9倍。
序列表
<110> 中国科学院广州能源研究所
<120> 一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 888
<212> DNA
<213> 球形红细菌SH1(Rhodopirellula baltica SH1)
<400> 1
ttgatatccc ctttcgagaa ctctgtagag aagaacatta tgaagtacgg catgaacctg 60
ctgttgtggt ccggcgaagt caccgaggaa atgctgcccg tttgtgagca gctcaaagga 120
atcggatacg acagcgtcga attgccaatg ttcaatctcg atttggacta cgccaagatt 180
ggcaagcgtc tcgatgagat cggattgggg cgaaccgctg tcacgattcg tggcgaagaa 240
gacaacccga tttcgtgcga cgccgcggtg cgagccaagg gcgtcgagtt gaacaagaag 300
acgttggatt gctgtgcggc ggctggcgtt gagattctgg tcggccctta tcactcggca 360
atcggattgt tcagcggtgc cggacccacc gaagatgaat ggaagtgggg cgttgaatcg 420
atgcgagcaa ccgccgaata cgccgagacc gttggcgtga aattgggcgt cgaagctctg 480
aaccgttttg aatgctactt gctgaactgc cacgccgact cggcccgctt tgctcgcgac 540
gtggatcacc catcctgtgg aatgatgtac gacactttcc acagcaacat cgaagagaag 600
tcgatcaccg aagcgatcca ggccggcggt gacaaattgt tccacattca catcagcgaa 660
aacgatcgca gcacgccggg caaaggtggc gtgaactgga aagagaactt cgacgcgatt 720
gtgaagtcgg gctatgacgg ctacctgacc atcgaagcct tcgggctggc tctgccggaa 780
atcgccgcag cgaccaagat ttggcggaag atgttctccg acgagctgac actcgccaaa 840
gagggcctcg agttcatgaa agctgaattg gccgcacgga acgcctga 888

Claims (5)

1.一种高产D-阿洛酮糖的基因工程菌，其特征在于，其保藏编号为：GDMCC No：60951。
2.权利要求1所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌在产D-阿洛酮糖中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌或利用其提取的D-塔格糖3-差向异构酶将底物D-果糖转化为D-阿洛酮糖。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌接种到种子培养基中，加入D-果糖作为底物，发酵培养，D-果糖转化为D-阿洛酮糖；所述的种子培养基：每升含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，余量为水。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的发酵培养的体系和条件为：取在种子培养基中培养16h的所述的高产D-阿洛酮糖的基因工程菌的种子液接种，3％接种量，20％的装液量，种子培养基初始pH 7.0，加入5g/L的D-果糖、5mM的Mn2+，培养温度35℃，转速200rpm，发酵时间24h。
CN202010084327.7A 2020-02-10 2020-02-10 一种高产d-阿洛酮糖的基因工程菌及其应用 Active CN111206009B (zh)

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