CN117384933B - 利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木糖生产3‑羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增xylA‑DTE‑Fuck‑FucA目的基因序列，插入载体中，得到第一载体质粒；S2：体外扩增Pcy‑MDIC‑MmsB目的基因序列，插入载体中，得到第二载体质粒；S3：将S1、S2所述载体质粒共同导入Halomonas lutescens MDF‑9菌株中。本发明的工程菌能够利用木糖为碳源合成3HP，降低了生产3HP的原材料成本，不产生中间产物3‑羟基丙醛，安全无毒性，减少生产工艺中原料对微生物的毒害作用，利于工业化大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，特别涉及一种利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用。
背景技术
3-羟基丙酸（3HP）是一种三碳无手性化合物，是大部分光学物质的前体，由于羟基位置的不同，其化学性质更加活泼，在一定的化学反应条件下可转化为系列产品，应用广泛。在工业中可用于合成多种重要的化学物质，例如丙烯酸、丙二酸，以及生物降解性塑料聚3-羟基丙酸。3-羟基丙酸还可以作为食品或饲料的添加剂和防腐剂。还能作为一种重要的生物基化学品，在生物塑料、生物柴油等领域具有广阔的应用前景。
木质纤维素是作为目前地球上天然可利用，最丰富可再生的绿色资源，不与人类可利用土地形成竞争。木糖作为一种丰富的生物质资源，其转化为有价值化合物的潜力备受瞩目。
目前，3HP的生产主要依赖于以甘油作为碳源，但这一方法存在限制，即会生成对细胞生长有不利影响的中间产物3-羟基丙醛，从而影响3HP的生产。因此，亟需一种以木糖为碳源、降低细胞毒性、提高3HP产量的方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用。
本发明提供一种利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株的构建方法，包括如下步骤：
S1：体外扩增xylA-DTE-Fuck-FucA目的基因序列，插入载体中，得到第一载体质粒；
S2：体外扩增Pcy-MDIC-MmsB目的基因序列，插入载体中，得到第二载体质粒；
S3：将S1、S2所述载体质粒共同导入菌株中；
步骤S3所述菌株为Halomonas lutescens MDF-9，保藏编号为GDMCC NO:61850。
本申请中使用的Halomonas lutescens MDF-9菌株已于2021年8月2日保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC地址：广州市先列中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮编510070）。保藏号为GDMCC NO.61850。菌株名称为Halomonas lutescensMDF-9，分类命名为盐单胞菌（Halomonas lutescens）。
进一步的，所述步骤S2的载体质粒中，还插入OrfZ目的基因序列；
所述OrfZ基因序列由体外扩增得到。
进一步的，所述步骤S1使用的载体为pSEVA321，步骤S2使用的载体为pSEVA341。
进一步的，所述步骤S1、S2中目的基因的扩增程序为：
（1）预变性：温度95℃，时间3 min；
（2）变性：温度95℃，时间15 sec；
（3）退火：温度56-60℃，时间15 sec；
（4）延伸：温度72℃，时间30-60 sec/Kb；
（5）步骤（2）~（4）循环35次；
（6）彻底延伸：温度72℃，时间5 min。
本发明还提供一种合成3-羟基丙酸的菌株，由所述的构建方法得到。
本发明还提供一种使用所述的菌株生产3-羟基丙酸的方法，包括如下步骤：（1）种子液制备；
（2）摇瓶种子培养；
（3）发酵培养。
进一步的，所述步骤（3）中发酵温度为36~38℃，pH为8-9，时间为45~50 h。
进一步的，所述步骤（3）中发酵培养基组分包括：木糖20 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O0.03 g/L，H2BO3 0.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1、本发明的工程菌能够利用木糖为碳源合成3HP及3HP的聚合物P3HP（聚3-羟基丙酸酯），降低了生产3HP的原材料成本。
2、本发明利用木糖为原料生产3HP，不产生中间产物3-羟基丙醛，安全无毒性，减少生产工艺中原料对微生物的毒害作用。
3、本发明利用发酵生产3HP，生产工艺简单，可进行工业化大规模生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的利用木糖生产3-羟基丙酸的通路图；
图2为本发明实施例1中构建过程使用的pSEVA321xylA-DTE-Fuck-FucA质粒图谱；
图3为本发明实施例1中xylA-DTE-Fuck-FucA目的片段电泳图；
图4为本发明实施例2中构建过程使用的pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB质粒图谱；
图5为本发明实施例2中Pcy-MDIC-MmsB目的片段电泳图；
图6为本发明实施例3中pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB-OrfZ质粒图谱；
图7为本发明实施例3中OrfZ目的片段电泳图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明第一部分在Halomonas lutescens MDF-9中过表达基因xylA-DTE-Fuck-FucA获得菌株MDF-9-1，在菌株MDF-9-1中再过表达Pcy-MDIC-MmsB-OrfZ，使Halomonas lutescens MDF-9能够利用木糖生产3HP及P3HP，具体合成途径如图1所示。
3HP代谢途径的菌株构建方法：
S1：体外扩增xylA-DTE-Fuck-FucA和Pcy-MDIC-MmsB引入Halomonas lutescensMDF-9，成功获得生产3HP的菌株MDF-9-3HP；
S2：在pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB表达载体中插入OrfZ并导入MDF-9-1中，成功获得生产P3HP的菌株MDF-9-P3HP。
利用Halomonas lutescens MDF-9改造菌生产3HP其步骤方法如下：
（1）平板种子培养：菌种活化；
（2）摇瓶种子培养；
（3）溶氧和pH电极校正；
（4）发酵参数的设定；
（5）接种；
（6）发酵过程控制；
（7）菌体中PHA的提取。
发酵罐温度：36～38℃；
pH 8～9。
实施例1 体外扩增xylA-DTE-Fuck-FucA
1．xylA-DTE-Fuck-FucA基因表达
（1）质粒构建
重叠延伸PCR扩增的xylA、DTE、Fuck、FucA片段和质粒pSEVA321骨架，在Gibson连接酶的作用下，xylA-DTE-Fuck-FucA片段和pSEVA321骨架重组形成新的质粒，命名为pSEVA321xylA-DTE-Fuck-FucA，通过PCR以pSEVA321xylA-DTE-Fuck-FucA为模板得到xylA-DTE-Fuck- FucA片段，取部分产物送生物公司测序，质粒信息如图2所示。
（a）利用PCR扩增xylA、DTE、Fuck、FucA片段及pSEVA321质粒骨架的引物序列（5’-3’）如下：
xylA-F：见SEQ ID No.1；
xylA-R：见SEQ ID No.2；
DTE-F：见SEQ ID No.3；
DTE-R：见SEQ ID No.4；
Fuck-F：见SEQ ID No.5；
Fuck-R：见SEQ ID No.6；
FucA-F：见SEQ ID No.7；
FucA-R：见SEQ ID No.8；
321-F：见SEQ ID No.9；
321-R：见SEQ ID No.10。
其扩增体系和扩增程序如表1和表2所示：
表1 扩增体系表
表2 扩增程序表
PCR反应完成后，配制相应浓度的琼脂糖凝胶，进行电泳以便观察DNA条带的大小，将凝胶置于紫外灯下，迅速的切下目的DNA片段的凝胶，尽可能的将多余的凝胶切掉。
（b）Gibson Assembly法连接
将回收的DNA检测其浓度，再根据目的片段和pSEVA321骨架的长度、浓度计算DNA的添加比例，并利用Gibson混合酶进行连接，其Gibson Assembly连接体系和程序如表3和表4所示：
表3 Gibson Assembly连接体系表
表4 Gibson Assembly连接程序
（2）S17-1大肠杆菌转化
步骤1：将提前制备好的S17-1大肠杆菌感受态细胞从-80℃拿出，在冰上解冻，5min后待菌块融化；
步骤2：往感受态细胞中加入5 μL连接产物，轻轻的弹管壁将反应液混匀（请勿振荡混匀）。注：连接产物转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的1/10；
步骤3：冰上冰浴30 min，42℃水浴热激2 min后，立即置于冰上冷却2 min，注：晃动会降低转化效率；
步骤4：向离心管中加入400 μL LB培养基（不含抗生素），混匀后放入37℃摇床中200 rpm复苏60 min；
步骤5：5000 rpm离心5 min收菌，弃掉350 μL上清留取100 μL轻轻吹打重悬菌块并涂布到含相应抗生素的LB培养基上；
步骤6：将培养基倒置到37℃培养箱中培养12-16 h。
（3）单克隆菌落阳性验证
在相对应的抗性LB板上挑出菌落，并进行菌落PCR验证，将条带大小正确的PCR产物送至生物公司进行测序。
（4）选择序列正确的单菌落进行扩培，12-16 h后与Halomonas lutescens MDF-9在20LB平板中进行接合，8 h后挑取少量接合后菌体涂布于相对应抗性的60LB板上；36-48h后再进行一次单克隆菌落验证。
（5）菌落PCR验证
菌落PCR结果表明本实施例Halomonas lutescens MDF-9菌株中成功转入了xylA- DTE-Fuck-FucA基因序列，并命名为MDF-9-1，通过目的产物的大小进行验证，如图3所示，目的片段为4381 bp，符合预期结果。
实施例2Pcy-MDIC-MmsB体外扩增
利用重叠延伸PCR扩增Pcy、MDIC、MmsB及pSEVA341骨架。Pcy、MDIC、MmsB及pSEVA341骨架在Gibson连接酶作用下，组成新的质粒并标记为pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB，质粒图谱如图4所示。以pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB为模板得到Pcy-MDIC-MmsB序列，取部分产物送生物公司进行测序。
利用PCR扩增Pcy、MDIC、MmsB及pSEVA341骨架的引物序列（5’-3’）如下：
Pcy-F：见SEQ ID No.11；
Pcy-R：见SEQ ID No.12；
MDIC-F：见SEQ ID No.13；
MDIC-R：见SEQ ID No.14；
MmsB-F：见SEQ ID No.15；
MmsB-R：见SEQ ID No.16；
pSEVA341-F：见SEQ ID No.17；
pSEVA341-R：见SEQ ID No.18。
将pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB转入MDF-9-1中，具体步骤参考实施例1中xylA-DTE-Fuck- FucA基因表达。结果表明MDF-9-1菌株中成功转入了Pcy-MDIC-MmsB基因序列，通过目的产物的大小进行验证，如图5所示，目的片段为6111 bp，符合预期结果。在MDF-9-1中导入Pcy-MDIC-MmsB后，该菌株则具备生产3HP的能力，并将该菌命名为MDF-9-3HP。
实施例3 辅酶A转移酶OrfZ的插入
插入编码辅酶A转移酶的OrfZ可将3HP催化生成3羟基丙酰辅酶A，再由MDF-9内源聚羟基烷酸合成酶聚合成P3HP。
质粒构建：在pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB中插入OrfZ辅酶A转移酶，利用重叠延伸PCR扩增OrfZ、pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB骨架。OrfZ与pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB骨架在Gibson连接酶作用下组成新的质粒并分别标记为pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB-OrfZ，质粒信息如图6所示。
以质粒为模板得到相对应的序列长度，取部分产物送生物公司进行测序，测序结果为952 bp，如图7所示，符合预期结果，将质粒转入Halomonas lutescens MDF-9-1中，具体步骤参考实施例1。
利用PCR扩增OrfZ及pSEVA341Pcy-MDIC-MmsB-OrfZ骨架的引物序列（5’-3’）如下：
OrfZ-F：见SEQ ID No.19；
OrfZ-R：见SEQ ID No.20；
pSEVA341-F：见SEQ ID No.17；
pSEVA341-R1：见SEQ ID No.21。
在MDF-9-1中导入编码辅酶A转移酶的OrfZ后，该菌株则具备生产P3HP的能力，将其命名为MDF-9-P3HP。
实施例4 利用改造菌生产3HP
使用实施例1~3构建的菌株进行发酵培养：
1、培养基：
（1）培养基：
60LB平板培养基：酵母浸粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠60 g/L、琼脂粉1.8 g/100 mL、氨苄青霉素50 μg/mL、卡那霉素30 g/mL，pH 8.0。
组分I：硫酸镁0.2 g/L、尿素1.0 g/L（配50倍浓缩的母液：10 g/L硫酸镁、3 g/L尿素）；
组分II：磷酸二氢钾5.2 g/L，配50倍母液260 g/L、葡萄糖溶液30 g/L：配葡萄糖母液500 g/L；
组分III（10 mL/L）：柠檬酸铁铵5 g/L，无水氯化钙1.5 g/L，12 mol/L盐酸41.7ml/L；
组分IV（1 mL/L）：七水硫酸锌100 mg/L、四水硫酸锰30 mg/L、硼酸300 mg/L、五水硫酸铜10 mg/L、钼酸钠30 mg/L。
发酵培养基（50MM培养基）：木糖20 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L， 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O0.03 g/L。
2、种子液制备
①菌种活化
于实验室-80℃冰箱取菌种，用枪头挑取菌液划线接种于平板固体培养基（酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L，pH为8.5）上，37℃培养24 h。
②一级种子培养：
挑取单菌落接种于12 mL摇菌管（5 mL 60LB培养基：酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L；pH为8.5）中，将培养液置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
③二级种子培养：
吸取一级菌液200 μL（1％接种量），接种于150 mL锥形瓶（20 mL 60LB培养基）中，将置于摇床37℃、220 rpm培养12 h。
（2）发酵培养基准备
发酵培养基（50MM培养基）：木糖20 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，H2BO30.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5 mL）于500 mL锥形瓶内，置于摇床37℃、220 rpm培养48h。
（4）细胞干重及PHA含量测定
细胞干重（CDW）：将30~35 mL发酵后菌液置于50 mL离心管中，室温离心6分钟，转速为8000 rpm，倒掉上清；加入适量去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，同等条件下离心，倒掉上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存2 h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时；称重，计算细胞干重（g/L）。
测定PHA含量：称取0.05 g研磨后的实施例4发酵得到的样品干菌体，3HP检测标准品3-羟基丙酸一样的处理，置于密封性良好的酯化管中，加入2 mL氯仿、1700 μL甲醇及300μL浓硫酸，在100℃油浴下反应1 h，室温冷却后加入1 mL体积的ddH2O，充分震荡混匀后，静置分层。待水相和有机相完全分离后，取氯仿层（一般为下层）采用0.22 μm的有机滤膜过滤至液相瓶中，进行GC检测采用GC-7800气相色谱仪、毛细管色谱柱（Rtx-5型，长30 m，内径0.25 mm和固定相0.25 μm）和氢火焰离子检测（FID）。载气采用高纯氮。程序升温设定如表5所示：
表5 程序温度设定
进样体积为1 μL，采用外标法对PHA进行定量分析，根据峰面积计算PHA的产量。
发酵结果如表6所示。
表6 重组菌发酵结果
Halomonas lutescens MDF-9通过引入3HP代谢途径后，提高了细胞干重和PHA含量，并促进3HP的合成。从结果看出OrfZ的表达提高细胞干重、PHA及3HP到11.65 g/L、88.22%及22.52%。
综合以上实施例，本发明公开了一种利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：体外扩增xylA-DTE-Fuck-FucA目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S2：体外扩增Pcy-MDIC-MmsB目的基因序列，插入载体中，得到载体质粒；S3：将S1、S2所述载体质粒共同导入Halomonas lutescens MDF-9菌株中。
Halomonas lutescens MDF-9本身不能利用木糖，本发明构建了利用木糖合成3HP途径相关基因，实现以木糖为前提化合物在Halomonas lutescens MDF-9菌株中生产3HP的效果。该生产3HP和P3HP的途径能够减少生产工艺中原料对微生物的毒害作用，降低原材料成本，提高生产效率。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
xylA-DTE-Fuck-FucA的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示，其中1~1323 bp为xylA基因序列，1324 bp~2242 bp为DTE基因序列，2243 bp~3709 bp为Fuck基因序列，3710 bp~4381 bp为FucA基因序列；Pyc-MDIC-MmsB的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示，其中1 bp~3543 bp为Pcy基因序列，3544 bp~5175 bp为MDIC基因序列，5176 bp~6111 bp为MmsB基因序列；OrfZ的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；Pcy-MDIC-MmsB-OrfZ的核苷酸序列如SEQID No.25所示，其中1 bp~3543 bp为Pcy基因序列，3544 bp~5175 bp为MDIC基因序列，5176bp~6111 bp为MmsB基因序列，6112 bp~7064 bp为OrfZ基因序列。
Claims (7)
1.一种利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：体外扩增xylA-DTE-Fuck-FucA目的基因序列，插入载体中，得到第一载体质粒；
S2：体外扩增Pcy-MDIC-MmsB目的基因序列，插入载体中，得到第二载体质粒；
S3：将S1、S2所述载体质粒共同导入菌株中；
步骤S3所述菌株为Halomonas lutescens MDF-9，保藏编号为GDMCC NO:61850；
所述xylA-DTE-Fuck-FucA目的基因序列如SEQ ID No.22所示；
所述Pcy-MDIC-MmsB目的基因序列如SEQ ID No.23所示；
所述步骤S1使用的载体为pSEVA321，步骤S2使用的载体为pSEVA341。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2的载体质粒中，还插入OrfZ目的基因序列；
所述OrfZ目的基因序列由体外扩增得到；
所述OrfZ目的基因序列如SEQ ID No.24所示。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1、S2中目的基因的扩增程序为：
（1）预变性：温度95℃，时间3 min；
（2）变性：温度95℃，时间15 sec；
（3）退火：温度56-60℃，时间15 sec；
（4）延伸：温度72℃，时间30-60 sec/Kb；
（5）步骤（2）~（4）循环35次；
（6）彻底延伸：温度72℃，时间5 min。
4.一种合成3-羟基丙酸的菌株，其特征在于，由权利要求1~3任一项所述的构建方法得到。
5.一种使用权利要求4所述的菌株生产3-羟基丙酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）种子液制备；
（2）摇瓶种子培养；
（3）发酵培养。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵温度为36~38℃，pH为8~9，时间为45~50 h。
7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中发酵培养基组分包括：木糖20 g/L，氯化钠50 g/L，酵母粉1.2 g/L，尿素0.2~3 g/L，无水硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾1.5~5.5 g/L，Fe(III)-NH4-Citrate 5 g/L，CaCl2·2H2O 2 g/L，HCl 12 mol/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·4H2O 0.03 g/L，H2BO3 0.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuSO4·5H2O0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，NaMoO4·2H2O 0.03 g/L。
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2023
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Non-Patent Citations (3)
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| Production of C2-C4 diols from renewable bioresources: new metabolic pathways and metabolic engineering strategies;Zhang Y 等;《Biotechnol Biofuels》(第10期);第1-20页 * |
| 生物法生产3-羟基丙酸研究进展;于新磊 等;《化工进展》;第37卷(第11期);第4427-4436页 * |
Also Published As
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