CN112779205A - 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 - Google Patents

一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 Download PDF

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龙梦飞
乔郅钠
徐美娟
杨套伟
张显
邵明龙
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Abstract

本发明公开了一种利用微生物发酵生产L‑脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中敲除L‑脯氨酸降解以及转运基因putA、putP、proP及aceA，构建得到的基因工程菌能够显著提升L‑脯氨酸的含量，于5L发酵罐中培养60h得到32.2g·L‑1的L‑脯氨酸，L‑脯氨酸的生产效率提高至0.805g·L‑1·h‑1。

Description

一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-脯氨酸被广泛应用于医药、农业、化工等方面。传统L-脯氨酸生产方式为水解法，蛋白质经过酸、碱或者酶解后，得到各类氨基酸的混合物，可从中提取到所需的L-脯氨酸。所用的原料为橡皮鱼、明胶、毛发等，但由于生产和纯化的步骤多导致最终产率低，原料利用率低，而且生产的过程加入大量有毒化工原料，无法实现大规模生产。微生物生物技术研究的不断发展，生物下游工业的革新，各种化学工业技术的不断引进，使得氨基酸微生物发酵的成本越来越低，微生物生物发酵法为实现工业化大生产L-脯氨酸提供了有力的支持。现今，市场上的脯氨酸大部分是以工业微生物发酵所得。大肠杆菌作为一种模式微生物，用于各类氨基酸及化合物的发酵，但是L-脯氨酸发酵水平产量较低，若能得到高产L-脯氨酸大肠杆菌，具备工业放大潜力，有助于提升L-脯氨酸产能。
发明内容
针对目前L-脯氨酸发酵水平低的问题，本发明以E.coli BL21(DE3)作为出发菌株，利用CRISPR/Cas9敲除技术，实现因putA、putP、proP或aceA的无痕敲除，构建高效合成L-脯氨酸的重组菌株。
本发明提供了基因工程菌，其特征在于，沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因putA、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因putP、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因proP、异柠檬酸裂合酶编码基因aceA中的一个或多个。
在一种实施方式中，所述基因putA的基因locus号为B21_01024；所述基因putP的locus号为B21_01025；所述基因proP的locus号为B21_03943；所述基因aceA的locus号为B21_03847。
在一种实施方式中，所述基因工程菌如(a)～(d)所示任一：
(a)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因；
(b)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因和脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因；
(c)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因；
(d)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因和异柠檬酸裂合酶编码基因。
在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株。
本发明提供了一种生产L-脯氨酸的方法，所述方法是以葡萄糖为碳源，利用所述基因工程菌发酵生产L-脯氨酸。
在一种实施方式中，将OD600为10～20的基因工程菌，以发酵体系体积的5％～15％的量加入。
在一种实施方式中，所述发酵体中含有酵母抽提物、胰蛋白胨、NaCl、柠檬酸、葡萄糖、微量元素。
在一种实施方式中，发酵体系中含有酵母抽提物5-10g·L-1，胰蛋白胨10-15g·L-1，NaCl 2-5g·L-1，柠檬酸1-3g·L-1，(NH4)2SO4 1-4g·L-1，葡萄糖100-200g·L-1，10-15ml微量元素溶液。
在一种实施方式中，所述微量元素溶液含有FeSO4·7H2O 5-10g·L-1，ZnSO4·7H2O1-2g·L-1，CoCl2·6H2O 1-3g·L-1，MnCl2·4H2O 10-20g·L-1，CuCl2·2H2O 1-2g·L-1，H3BO3 2-5g·L-1。
在一种实施方式中，反应时间不低于40h。
在一种实施方式中，反应时间为50-60h。
本发明提供了所述基因工程菌在制备L-脯氨酸的应用。
本发明的有益效果：
本发明在E.coli BL21(DE3)中成功重构TCA循环，敲除L-脯氨酸降解以及转运基因putA(编码脯氨酸脱氢酶)、putP(编码脯氨酸-Na+协同转运蛋白)、proP(编码脯氨酸渗透诱导蛋白)及aceA(编码异柠檬酸裂合酶)中的无痕敲除，成功构建了基因工程菌株E.coliBL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA。将E.coliBL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA于5L发酵罐中培养60h得到32.2g·L-1的L-脯氨酸，L-脯氨酸的生产效率提高至0.805g·L-1·h-1。
附图说明
图1为大肠杆菌改造菌发酵L-Pro产量。
具体实施方式
实施例1：putA基因的敲除
利用化学转化法，将pCas9质粒导入感受态宿主菌E.coli BL21(DE3)中，将宿主菌BL21(DE3)/pCas9，从冻管中划线分离，30℃培养，待长出单菌落，挑取单菌落于10ml/50mlLB小摇瓶中，置于30℃、180rpm过夜培养。按照1％的接种量，转接至50ml/250ml LB液体培养基中，培养1小时后，加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导，于30℃、180rpm培养至OD0.5左右，而后置于冰上冰浴30min，8000rpm、4℃离心5min收集菌体，用10％的甘油重悬吹吸，4000rpm、4℃离心10min，重复2次，后用10％的甘油重悬而后分装于灭菌的1.5ml EP管中，获得E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列，确定putA的序列位置，并下载putA前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，P1和P2为引物PCR扩增获得putA上游同源臂，P3和P4为引物PCR扩增获得putA下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将putA上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。通过网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx)设计sgRNA_putA并合成引物P5和P6。将P5和P6引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-putA。将重组基因片段和pTarget-putA导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞，在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导，于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养，挑取单菌落，菌液PCR，选取正确克隆。得到正确的克隆子之后，挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中，加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putA质粒，得E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9，即可获得E.coliBL21(DE3)ΔputA。
P1(SEQ ID NO.1)：
5’-TTCACAATCGATTTAACACACCATT-3’，
P2(SEQ ID NO.2)：
5’-AACATCCTCCGGCTACCTGTGCCATTACTCCTGTTGTTCA-3’，
P3(SEQ ID NO.3)：
5’-TGAACAACAGGAGTAATGGCACAGGTAGCCGGAGGATGTT-3’，
P4(SEQ ID NO.4)：
5’-ATGGATGAACTGACGGGCGA-3’，
P5(SEQ ID NO.5)：
5’-ACTGGAACTCGTACTGACCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’，
P6(SEQ ID NO.6)：
5’-GGGTCAGTACGAGTTCCAGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例2：putP基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及菌株E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9，制备E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列，确定putP的序列位置，并下载putP前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，P7和P8为引物PCR扩增获得putP上游同源臂，P9和P10为引物PCR扩增获得putP下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将putP上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_putP并合成引物P11和P12。将P11和P12引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-putP。将重组基因片段和pTarget-putP导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞，在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导，于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养，挑取单菌落，菌液PCR，选取正确克隆。得到正确的克隆子之后，挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中，加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putP质粒，得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9，即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP。
P1(SEQ ID NO.7)：
5’-GTTAATAAAAGAAATCGATATGACA-3’，
P2(SEQ ID NO.8)：
5’-ACCGCCGCAGGCTAAGTCCCCTAAAGTCTCCAAAAAATTATTATC-3’，
P3(SEQ ID NO.9)：
5’-GATAATAATTTTTTGGAGACTTTAGGGGACTTAGCCTGCGGCGGT-3’，
P4(SEQ ID NO.10)：
5’-ACAAAACTGTCCAGACTCAATGCATCAGAG-3’，
P5(SEQ ID NO.11)：
5’-CGTCTGTTTGAAAGTACCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’，
P6(SEQ ID NO.12)：
5’-AAGGTACTTTCAAACAGACGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例3：proP基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及实施例2中菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9，制备E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列，确定proP的序列位置，并下载proP前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，P13和P14为引物PCR扩增获得proP上游同源臂，P15和P16为引物PCR扩增获得proP下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将proP上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_proP并合成引物P17和P18。将P17和P18引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-proP。将重组基因片段和pTarget-proP导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞，在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导，于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养，挑取单菌落，菌液PCR，选取正确克隆。得到正确的克隆子之后，挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中，加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putP质粒，得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9，即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP。
P1(SEQ ID NO.13)：
5’-AATGCTCGAGGAAATCTTCT-3’，
P2(SEQ ID NO.14)：
5’-ATCAGGCCATCCGTTTCAGCAGCTTTCCTCGCAGA-3’，
P3(SEQ ID NO.15)：
5’-TCTGCGAGGAAAGCTGCTGAAACGGATGGCCTGAT-3’，
P4(SEQ ID NO.16)：
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5’-TCGATCAGTACGTTCTGTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’，
P6(SEQ ID NO.18)：
5’-ATACAGAACGTACTGATCGAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例4：aceA基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及实施例3中菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9，制备E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列，确定aceA的序列位置，并下载aceA前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板，P19和P20为引物PCR扩增获得aceA上游同源臂，P21和P22为引物PCR扩增获得aceA下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将aceA上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_aceA并合成引物P23和P24。将P23和P24引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-aceA。将重组基因片段和pTarget-aceA导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞，在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导，于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养，挑取单菌落，菌液PCR，选取正确克隆。得到正确的克隆子之后，挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中，加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-aceA质粒，得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA/pCas9。将E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA/pCas9在42℃过夜培养消除质粒pCas9，即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA。
P1(SEQ ID NO.19)：
5’-GATGGAAGATGCGGCGACGGCT-3’，
P2(SEQ ID NO.20)：
5’-AACGGTTGTTGTTGCGTGCAGATGCTCCAT-3’，
P3(SEQ ID NO.21)：
5’-ATGGAGCATCTGCACGCAACAACAACCGTT-3’，
P4(SEQ ID NO.22)：
5’-AGTCGGCCTGTTCGAAACGCTG-3’，
P5(SEQ ID NO.23)：
5’-TTGAAGAATTACAGAAAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’，
P6(SEQ ID NO.24)：
5’-CTCTTTCTGTAATTCTTCAAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例5：重组菌的5L发酵罐发酵实验
(1)种子培养
种子培养基为LB培养基：酵母粉5g·L-1、蛋白胨10g·L-1、NaCl 10g·L-1。
将菌株E.coli BL21(DE3)、重组菌E.coli BL21(DE3)ΔputA、E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP、E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP以及E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA接种至LB平板中、37℃进行培养至长出单菌落，将单菌落接种于20mL LB培养基中37℃振荡培养12h，然后转接10％接种量接种于180mL种子培养基中，37℃培养12h，培养至OD600为12的种子液。
(2)发酵培养
摇瓶发酵培养基：酵母抽提物5-10g·L-1，胰蛋白胨10-15g·L-1，NaCl 2-5g·L-1，柠檬酸1-3g·L-1，(NH4)2SO4 1-4g·L-1，葡萄糖100-200g·L-1，10-15ml微量元素溶液；
微量元素溶液：FeSO4·7H2O 5-10g·L-1，ZnSO4·7H2O 1-2g·L-1，CoCl2·6H2O 1-3g·L-1，MnCl2·4H2O 10-20g·L-1，CuCl2·2H2O 1-2g·L-1，H3BO3 2-5g·L-1。
将步骤(1)中的种子液按体积比10％接种量接种于5L发酵罐中(含1.8L发酵培养基)进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵pH控制在7.0，发酵时间为72h。每隔12h取样一次，采用紫外分光光度仪在A600下测定细胞OD值，用生物传感分析仪测定(SBA-40ES，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量。
表1不同菌株发酵生产L-脯氨酸
Figure BDA0002996432720000071
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法
<130> BAA210140A
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatgctcgag gaaatcttct 20
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atcaggccat ccgtttcagc agctttcctc gcaga 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctgcgagga aagctgctga aacggatggc ctgat 35
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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tattgtcagc cgcattacac agttg 25
<210> 17
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
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tcgatcagta cgttctgtat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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atacagaacg tactgatcga actagtatta tacctaggac tgagctagc 49
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
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gatggaagat gcggcgacgg ct 22
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
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aacggttgtt gttgcgtgca gatgctccat 30
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<213> 人工序列
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atggagcatc tgcacgcaac aacaaccgtt 30
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<213> 人工序列
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agtcggcctg ttcgaaacgc tg 22
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ttgaagaatt acagaaagag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
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<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctctttctgt aattcttcaa actagtatta tacctaggac tgagctagc 49

Claims (10)

1.基因工程菌，其特征在于，沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因、异柠檬酸裂合酶编码基因中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述脯氨酸脱氢酶编码基因的基因locus号为B21_01024；所述脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因的locus号为B21_01025；所述脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因基因的locus号为B21_03943；所述异柠檬酸裂合酶编码基因的locus号为B21_03847。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌如(a)～(d)所示任一：
(a)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因；
(b)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因和脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因；
(c)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因；
(d)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因和异柠檬酸裂合酶编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株。
5.一种生产L-脯氨酸的方法，其特征在于，以葡萄糖为碳源，利用权利要求1～4任一所述基因工程菌发酵生产L-脯氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将OD600为10～20的基因工程菌，以反应体系体积的5％～15％的量加入。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵体中含有酵母抽提物、胰蛋白胨、NaCl、柠檬酸、葡萄糖、微量元素。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在30～40℃进行反应。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，反应时间不低于40h。
10.权利要求1～4任一所述基因工程菌在制备L-脯氨酸的应用。
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