CN112779205A - 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 - Google Patents
一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112779205A CN112779205A CN202110333623.0A CN202110333623A CN112779205A CN 112779205 A CN112779205 A CN 112779205A CN 202110333623 A CN202110333623 A CN 202110333623A CN 112779205 A CN112779205 A CN 112779205A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- proline
- gene
- genetically engineered
- engineered bacterium
- encoding gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/24—Proline; Hydroxyproline; Histidine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y105/00—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5)
- C12Y105/99—Oxidoreductases acting on the CH-NH group of donors (1.5) with other acceptors (1.5.99)
- C12Y105/99008—Proline dehydrogenase (1.5.99.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
- C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
- C12Y401/03001—Isocitrate lyase (4.1.3.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用微生物发酵生产L‑脯氨酸的方法,属于生物工程技术领域。本发明通过在大肠杆菌中敲除L‑脯氨酸降解以及转运基因putA、putP、proP及aceA,构建得到的基因工程菌能够显著提升L‑脯氨酸的含量,于5L发酵罐中培养60h得到32.2g·L‑1的L‑脯氨酸,L‑脯氨酸的生产效率提高至0.805g·L‑1·h‑1。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
L-脯氨酸被广泛应用于医药、农业、化工等方面。传统L-脯氨酸生产方式为水解法,蛋白质经过酸、碱或者酶解后,得到各类氨基酸的混合物,可从中提取到所需的L-脯氨酸。所用的原料为橡皮鱼、明胶、毛发等,但由于生产和纯化的步骤多导致最终产率低,原料利用率低,而且生产的过程加入大量有毒化工原料,无法实现大规模生产。微生物生物技术研究的不断发展,生物下游工业的革新,各种化学工业技术的不断引进,使得氨基酸微生物发酵的成本越来越低,微生物生物发酵法为实现工业化大生产L-脯氨酸提供了有力的支持。现今,市场上的脯氨酸大部分是以工业微生物发酵所得。大肠杆菌作为一种模式微生物,用于各类氨基酸及化合物的发酵,但是L-脯氨酸发酵水平产量较低,若能得到高产L-脯氨酸大肠杆菌,具备工业放大潜力,有助于提升L-脯氨酸产能。
发明内容
针对目前L-脯氨酸发酵水平低的问题,本发明以E.coli BL21(DE3)作为出发菌株,利用CRISPR/Cas9敲除技术,实现因putA、putP、proP或aceA的无痕敲除,构建高效合成L-脯氨酸的重组菌株。
本发明提供了基因工程菌,其特征在于,沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因putA、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因putP、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因proP、异柠檬酸裂合酶编码基因aceA中的一个或多个。
在一种实施方式中,所述基因putA的基因locus号为B21_01024;所述基因putP的locus号为B21_01025;所述基因proP的locus号为B21_03943;所述基因aceA的locus号为B21_03847。
在一种实施方式中,所述基因工程菌如(a)~(d)所示任一:
(a)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因;
(b)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因和脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因;
(c)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因;
(d)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因和异柠檬酸裂合酶编码基因。
在一种实施方式中,所述基因工程菌以大肠杆菌为出发菌株。
本发明提供了一种生产L-脯氨酸的方法,所述方法是以葡萄糖为碳源,利用所述基因工程菌发酵生产L-脯氨酸。
在一种实施方式中,将OD600为10~20的基因工程菌,以发酵体系体积的5%~15%的量加入。
在一种实施方式中,所述发酵体中含有酵母抽提物、胰蛋白胨、NaCl、柠檬酸、葡萄糖、微量元素。
在一种实施方式中,发酵体系中含有酵母抽提物5-10g·L-1,胰蛋白胨10-15g·L-1,NaCl 2-5g·L-1,柠檬酸1-3g·L-1,(NH4)2SO4 1-4g·L-1,葡萄糖100-200g·L-1,10-15ml微量元素溶液。
在一种实施方式中,所述微量元素溶液含有FeSO4·7H2O 5-10g·L-1,ZnSO4·7H2O1-2g·L-1,CoCl2·6H2O 1-3g·L-1,MnCl2·4H2O 10-20g·L-1,CuCl2·2H2O 1-2g·L-1,H3BO3 2-5g·L-1。
在一种实施方式中,反应时间不低于40h。
在一种实施方式中,反应时间为50-60h。
本发明提供了所述基因工程菌在制备L-脯氨酸的应用。
本发明的有益效果:
本发明在E.coli BL21(DE3)中成功重构TCA循环,敲除L-脯氨酸降解以及转运基因putA(编码脯氨酸脱氢酶)、putP(编码脯氨酸-Na+协同转运蛋白)、proP(编码脯氨酸渗透诱导蛋白)及aceA(编码异柠檬酸裂合酶)中的无痕敲除,成功构建了基因工程菌株E.coliBL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA。将E.coliBL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA于5L发酵罐中培养60h得到32.2g·L-1的L-脯氨酸,L-脯氨酸的生产效率提高至0.805g·L-1·h-1。
附图说明
图1为大肠杆菌改造菌发酵L-Pro产量。
具体实施方式
实施例1:putA基因的敲除
利用化学转化法,将pCas9质粒导入感受态宿主菌E.coli BL21(DE3)中,将宿主菌BL21(DE3)/pCas9,从冻管中划线分离,30℃培养,待长出单菌落,挑取单菌落于10ml/50mlLB小摇瓶中,置于30℃、180rpm过夜培养。按照1%的接种量,转接至50ml/250ml LB液体培养基中,培养1小时后,加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导,于30℃、180rpm培养至OD0.5左右,而后置于冰上冰浴30min,8000rpm、4℃离心5min收集菌体,用10%的甘油重悬吹吸,4000rpm、4℃离心10min,重复2次,后用10%的甘油重悬而后分装于灭菌的1.5ml EP管中,获得E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列,确定putA的序列位置,并下载putA前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,P1和P2为引物PCR扩增获得putA上游同源臂,P3和P4为引物PCR扩增获得putA下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将putA上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。通过网站(http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx)设计sgRNA_putA并合成引物P5和P6。将P5和P6引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-putA。将重组基因片段和pTarget-putA导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞,在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导,于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养,挑取单菌落,菌液PCR,选取正确克隆。得到正确的克隆子之后,挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中,加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putA质粒,得E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9,即可获得E.coliBL21(DE3)ΔputA。
P1(SEQ ID NO.1):
5’-TTCACAATCGATTTAACACACCATT-3’,
P2(SEQ ID NO.2):
5’-AACATCCTCCGGCTACCTGTGCCATTACTCCTGTTGTTCA-3’,
P3(SEQ ID NO.3):
5’-TGAACAACAGGAGTAATGGCACAGGTAGCCGGAGGATGTT-3’,
P4(SEQ ID NO.4):
5’-ATGGATGAACTGACGGGCGA-3’,
P5(SEQ ID NO.5):
5’-ACTGGAACTCGTACTGACCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’,
P6(SEQ ID NO.6):
5’-GGGTCAGTACGAGTTCCAGTACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例2:putP基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及菌株E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9,制备E.coli BL21(DE3)ΔputA/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列,确定putP的序列位置,并下载putP前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,P7和P8为引物PCR扩增获得putP上游同源臂,P9和P10为引物PCR扩增获得putP下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将putP上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_putP并合成引物P11和P12。将P11和P12引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-putP。将重组基因片段和pTarget-putP导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞,在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导,于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养,挑取单菌落,菌液PCR,选取正确克隆。得到正确的克隆子之后,挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中,加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putP质粒,得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9,即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP。
P1(SEQ ID NO.7):
5’-GTTAATAAAAGAAATCGATATGACA-3’,
P2(SEQ ID NO.8):
5’-ACCGCCGCAGGCTAAGTCCCCTAAAGTCTCCAAAAAATTATTATC-3’,
P3(SEQ ID NO.9):
5’-GATAATAATTTTTTGGAGACTTTAGGGGACTTAGCCTGCGGCGGT-3’,
P4(SEQ ID NO.10):
5’-ACAAAACTGTCCAGACTCAATGCATCAGAG-3’,
P5(SEQ ID NO.11):
5’-CGTCTGTTTGAAAGTACCTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’,
P6(SEQ ID NO.12):
5’-AAGGTACTTTCAAACAGACGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例3:proP基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及实施例2中菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9,制备E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列,确定proP的序列位置,并下载proP前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,P13和P14为引物PCR扩增获得proP上游同源臂,P15和P16为引物PCR扩增获得proP下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将proP上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_proP并合成引物P17和P18。将P17和P18引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-proP。将重组基因片段和pTarget-proP导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞,在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导,于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养,挑取单菌落,菌液PCR,选取正确克隆。得到正确的克隆子之后,挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中,加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-putP质粒,得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9。在42℃过夜培养消除质粒pCas9,即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP。
P1(SEQ ID NO.13):
5’-AATGCTCGAGGAAATCTTCT-3’,
P2(SEQ ID NO.14):
5’-ATCAGGCCATCCGTTTCAGCAGCTTTCCTCGCAGA-3’,
P3(SEQ ID NO.15):
5’-TCTGCGAGGAAAGCTGCTGAAACGGATGGCCTGAT-3’,
P4(SEQ ID NO.16):
5’-TATTGTCAGCCGCATTACACAGTTG-3’,
P5(SEQ ID NO.17):
5’-TCGATCAGTACGTTCTGTATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’,
P6(SEQ ID NO.18):
5’-ATACAGAACGTACTGATCGAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例4:aceA基因的敲除
根据实施例1中感受态制备方法及实施例3中菌株E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9,制备E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP/pCas9感受态细胞。从NCBI网站公布的E.coli BL21(DE3)基因组序列,确定aceA的序列位置,并下载aceA前后各500bp大小的一段基因片段作为上下游同源臂。以E.coli BL21(DE3)基因组为模板,P19和P20为引物PCR扩增获得aceA上游同源臂,P21和P22为引物PCR扩增获得aceA下游同源臂。利用重叠延伸PCR技术将aceA上、下游同源臂基因片段融合扩增得到一条1000b左右的重组基因片段。设计sgRNA_aceA并合成引物P23和P24。将P23和P24引物对pTarget质粒进行反向PCR并通过同源重组获得pTarget-aceA。将重组基因片段和pTarget-aceA导入E.coli BL21(DE3)/pCas9感受态细胞,在LB液体培养基中加入终浓度为10mM的L-arabinose诱导,于30℃、100rpm培养2h。将菌液先在双抗(Kanr+Smr)培养皿上划线培养,挑取单菌落,菌液PCR,选取正确克隆。得到正确的克隆子之后,挑取单菌落于单抗(Kanr)LB液体培养基中,加入终浓度0.5mM的IPTG置于30℃过夜培养消除pTarget-aceA质粒,得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA/pCas9。将E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA/pCas9在42℃过夜培养消除质粒pCas9,即可获得E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA。
P1(SEQ ID NO.19):
5’-GATGGAAGATGCGGCGACGGCT-3’,
P2(SEQ ID NO.20):
5’-AACGGTTGTTGTTGCGTGCAGATGCTCCAT-3’,
P3(SEQ ID NO.21):
5’-ATGGAGCATCTGCACGCAACAACAACCGTT-3’,
P4(SEQ ID NO.22):
5’-AGTCGGCCTGTTCGAAACGCTG-3’,
P5(SEQ ID NO.23):
5’-TTGAAGAATTACAGAAAGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC-3’,
P6(SEQ ID NO.24):
5’-CTCTTTCTGTAATTCTTCAAACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGC-3’。
实施例5:重组菌的5L发酵罐发酵实验
(1)种子培养
种子培养基为LB培养基:酵母粉5g·L-1、蛋白胨10g·L-1、NaCl 10g·L-1。
将菌株E.coli BL21(DE3)、重组菌E.coli BL21(DE3)ΔputA、E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputP、E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproP以及E.coli BL21(DE3)ΔputAΔputPΔproPΔaceA接种至LB平板中、37℃进行培养至长出单菌落,将单菌落接种于20mL LB培养基中37℃振荡培养12h,然后转接10%接种量接种于180mL种子培养基中,37℃培养12h,培养至OD600为12的种子液。
(2)发酵培养
摇瓶发酵培养基:酵母抽提物5-10g·L-1,胰蛋白胨10-15g·L-1,NaCl 2-5g·L-1,柠檬酸1-3g·L-1,(NH4)2SO4 1-4g·L-1,葡萄糖100-200g·L-1,10-15ml微量元素溶液;
微量元素溶液:FeSO4·7H2O 5-10g·L-1,ZnSO4·7H2O 1-2g·L-1,CoCl2·6H2O 1-3g·L-1,MnCl2·4H2O 10-20g·L-1,CuCl2·2H2O 1-2g·L-1,H3BO3 2-5g·L-1。
将步骤(1)中的种子液按体积比10%接种量接种于5L发酵罐中(含1.8L发酵培养基)进行发酵培养,发酵温度为37℃,发酵pH控制在7.0,发酵时间为72h。每隔12h取样一次,采用紫外分光光度仪在A600下测定细胞OD值,用生物传感分析仪测定(SBA-40ES,山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量。
表1不同菌株发酵生产L-脯氨酸
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种利用微生物发酵生产L-脯氨酸的方法
<130> BAA210140A
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttcacaatcg atttaacaca ccatt 25
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aacatcctcc ggctacctgt gccattactc ctgttgttca 40
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgaacaacag gagtaatggc acaggtagcc ggaggatgtt 40
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggatgaac tgacgggcga 20
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
actggaactc gtactgaccc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gggtcagtac gagttccagt actagtatta tacctaggac tgagctagc 49
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gttaataaaa gaaatcgata tgaca 25
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
accgccgcag gctaagtccc ctaaagtctc caaaaaatta ttatc 45
<210> 9
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gataataatt ttttggagac tttaggggac ttagcctgcg gcggt 45
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acaaaactgt ccagactcaa tgcatcagag 30
<210> 11
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgtctgtttg aaagtacctt gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 12
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aaggtacttt caaacagacg actagtatta tacctaggac tgagctagc 49
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aatgctcgag gaaatcttct 20
<210> 14
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
atcaggccat ccgtttcagc agctttcctc gcaga 35
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
tctgcgagga aagctgctga aacggatggc ctgat 35
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tattgtcagc cgcattacac agttg 25
<210> 17
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
tcgatcagta cgttctgtat gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 18
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atacagaacg tactgatcga actagtatta tacctaggac tgagctagc 49
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gatggaagat gcggcgacgg ct 22
<210> 20
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aacggttgtt gttgcgtgca gatgctccat 30
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atggagcatc tgcacgcaac aacaaccgtt 30
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
agtcggcctg ttcgaaacgc tg 22
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ttgaagaatt acagaaagag gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggc 55
<210> 24
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ctctttctgt aattcttcaa actagtatta tacctaggac tgagctagc 49
Claims (10)
1.基因工程菌,其特征在于,沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因、异柠檬酸裂合酶编码基因中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌,其特征在于,所述脯氨酸脱氢酶编码基因的基因locus号为B21_01024;所述脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因的locus号为B21_01025;所述脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因基因的locus号为B21_03943;所述异柠檬酸裂合酶编码基因的locus号为B21_03847。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌如(a)~(d)所示任一:
(a)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因;
(b)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因和脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因;
(c)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因;
(d)沉默表达脯氨酸脱氢酶编码基因、脯氨酸-Na+协同转运蛋白编码基因、脯氨酸渗透诱导蛋白编码基因和异柠檬酸裂合酶编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因工程菌,其特征在于,以大肠杆菌为出发菌株。
5.一种生产L-脯氨酸的方法,其特征在于,以葡萄糖为碳源,利用权利要求1~4任一所述基因工程菌发酵生产L-脯氨酸。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,将OD600为10~20的基因工程菌,以反应体系体积的5%~15%的量加入。
7.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述发酵体中含有酵母抽提物、胰蛋白胨、NaCl、柠檬酸、葡萄糖、微量元素。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,在30~40℃进行反应。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,反应时间不低于40h。
10.权利要求1~4任一所述基因工程菌在制备L-脯氨酸的应用。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110333623.0A CN112779205A (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202110333623.0A CN112779205A (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112779205A true CN112779205A (zh) | 2021-05-11 |
Family
ID=75762900
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202110333623.0A Pending CN112779205A (zh) | 2021-03-29 | 2021-03-29 | 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN112779205A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113564093A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-10-29 | 天津工微生物科技有限公司 | 一种大肠杆菌及其在高产制备d-脯氨酸中的应用 |
-
2021
- 2021-03-29 CN CN202110333623.0A patent/CN112779205A/zh active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MENGFEI LONG ET AL.: "Significantly enhancing production of trans-4-hydroxy-L-proline by integrated system engineering in Escherichia coli", 《SCI.ADV.》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113564093A (zh) * | 2021-09-28 | 2021-10-29 | 天津工微生物科技有限公司 | 一种大肠杆菌及其在高产制备d-脯氨酸中的应用 |
CN113564093B (zh) * | 2021-09-28 | 2021-12-10 | 天津工微生物科技有限公司 | 一种大肠杆菌及其在高产制备d-脯氨酸中的应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110272852B (zh) | 一种需钠弧菌及其应用 | |
CN113564093B (zh) | 一种大肠杆菌及其在高产制备d-脯氨酸中的应用 | |
CN110951667B (zh) | 一株丰原素高产菌株lpb-18n及其选育和应用 | |
CN112359005B (zh) | 一种酸胁迫能力得到提高的大肠杆菌工程菌及应用 | |
CN112779205A (zh) | 一种利用微生物发酵生产l-脯氨酸的方法 | |
CN117660277A (zh) | 代谢工程改造大肠杆菌及其在发酵制备红景天苷中的应用 | |
CN111019948A (zh) | 一种丰原素合成代谢调控基因FenSr3及其应用 | |
CN114277068B (zh) | 一种r-3-羟基丁酸乙酯微生物发酵制备方法 | |
CN116083332A (zh) | 一株产己二酸的重组大肠杆菌的构建及其应用 | |
CN115948402A (zh) | 产5-氨基乙酰丙酸的重组希瓦氏菌及其应用 | |
CN111041020B (zh) | 异柠檬酸裂合酶突变体、突变基因及其在制备维生素b12中的应用 | |
CN105602914B (zh) | 一种来源于马克斯克鲁维酵母的烷基过氧化物还原酶和硫氧还蛋白还原酶及其应用 | |
CN103421725A (zh) | 一种重组枯草芽孢杆菌及其构建方法与应用 | |
CN115637247A (zh) | 高效生物氧化脱硫的盐单胞菌工程菌株及其全细胞催化脱硫方法 | |
CN109097315B (zh) | 一种高产脂肽的基因工程菌及其构建方法和应用 | |
CN113493758A (zh) | 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用 | |
CN105647898A (zh) | 一种海洋褐藻酸裂解酶及其表达基因与应用 | |
CN117384933B (zh) | 利用木糖生产3-羟基丙酸的菌株及其构建方法和应用 | |
CN115851511B (zh) | 一种产琥珀酸的大肠杆菌及其构建方法和应用 | |
CN115960874B (zh) | 一种谷氨酸棒杆菌内源GlcNAc6P磷酸酶及提高GlcNAc产量的方法 | |
CN114276970B (zh) | 一种产1,3-丙二醇的基因工程菌 | |
CN116904492B (zh) | 一种产异戊二烯的沼泽红假单胞菌及其构建方法和应用 | |
CN111334445B (zh) | 长链二元酸生产菌株及其制备方法和应用 | |
TWI752396B (zh) | 用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物與生產衣康酸的方法 | |
CN106676052A (zh) | 一种产丁二酸大肠杆菌的构建方法及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |