TWI752396B

TWI752396B - 用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物與生產衣康酸的方法

Info

Publication number: TWI752396B
Application number: TW108148337A
Authority: TW
Inventors: 鄒延鴻; 張珮菁; 朱向元; 林忠德; 林雅琳; 黃偕倫
Original assignee: 財團法人工業技術研究院; 臺灣中華化學工業股份有限公司
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2022-01-11
Also published as: TW202124706A

Abstract

一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物，包括：一突變之內源性icd 基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)，該突變之內源性icd 基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量，以及一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)，該第一外源性核酸序列連接至一啟動子，且其中該包括突變之內源性icd基因及第一外源性核酸序列的微生物係培養於一含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中進行一馴化，以獲得具有提升衣康酸(itaconic acid)表現量能力之該經基因改質的微生物。

Description

用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物與生產衣康酸的方法

本發明係關於衣康酸(itaconic acid)之生產，且特別是關於用於生產衣康酸之經基因改質的微生物及其製備方法、與利用此基因改質微生物生產衣康酸的方法。

自工業革命以來，對自然資源的需求日益增加，導致如石油之有限資源逐年升高而漸形枯竭，而仰賴以石化原料為基礎的工業也面臨可預期之威脅。隨著油價屢創新高、氣候異常突顯二氧化碳等溫室氣體亟需減量等環境議題，以生質(biomass)原料取代石化原料已成為化學工業永續發展的新出路。

為了尋找具潛力的生質原料，美國能源局(DOE)由眾多的碳水化合物原料中，透過石化產業及市場分析，挑選出12種最具有石化原料替代性的原料，衣康酸即為12種重點生質化學品之一，是未來相當具潛力優勢的生質化學品。

衣康酸，又稱為亞甲基丁二酸或亞甲基琥珀酸，是一種不飽和二元羧酸，也因具有不飽和雙鍵，使其能夠發生許多化學反應，是相當具有化學活性的原料，因而成為許多化工產品之原料的必需前驅物。應用方面，衣康酸所涉及的應用範疇相當廣泛，主要可用於化纖、樹脂、橡膠、塗料、造紙、醫藥、農藥、輕工、食品、絲綢、水處理等領域。實際產品方面，衣康酸已被使用於製造黏著劑、塗料、化學纖維、人工鑽石及鏡片等產品。

生產製程發展上，衣康酸主要的製程已由最早之工業化液態醱酵(Submerged Fermentation)演進為利用懸浮的菌絲球以批次醱酵(Batch Fermentation)的方式生產。近年，由於永續、環保、再生資源等議題，加上能源價格的持續攀升與生物科技進步等因素，如何利用價廉的碳源、開發可高效能生產衣康酸之微生物及其相關技術，都是當前衣康酸生產研發的關注方向。

目前，大規模工業生產衣康酸是使用土麴黴(Aspergillus terreus )。然而，土麴黴生長緩慢，生產週期為7天，且在產孢時期無法形成衣康酸。並且，土麴黴之醱酵培養需求較嚴苛，包括溫度、氧氣供給、培養基pH值、以及如Fe、Mn、Mg、Cu、Zn、P、N等元素成分之含量等，均需適當控制，對於大規模生產衣康酸而言實存在相當大的限制。除了土麴黴之外，日本磐田公司(Iwata)也試圖開發Ustilago 菌種以生產衣康酸，然而絲狀菌絲的培養不易，仍有待克服培養上的問題。

因此，提供一種可快速生產衣康酸之菌株，以及利用該菌株建立生產衣康酸之技術，以提升衣康酸的生產效能、降低生產成本、可大規模生產且與系統整合，進而提高衣康酸之市場競爭力，已成為目前業界亟欲解決的課題。

本發明提供一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物，包括：一突變之內源性icd 基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)，該突變之內源性icd 基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量，以及一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)，該第一外源性核酸序列連接至一啟動子，且其中該包括突變之內源性icd基因及第一外源性核酸序列的微生物係培養於一含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中進行一馴化，以獲得具有提升衣康酸(itaconic acid)表現量能力之該經基因改質的微生物。

本發明也提供一種新穎之大腸桿菌基因改質株，其寄存編號為BCRC 940689。上述新穎之大腸桿菌基因改質株包括一突變之內源性icd 基因、編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列、以及編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)之第二外源性核酸序列。

本發明另提供一種用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法，包括以下步驟：(a) 將一微生物之內源性icd 基因突變以獲得一經icd 基因突變的微生物；(b) 將編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)之一第一外源性核酸序列導入該經icd 基因突變的微生物，以獲得一經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物；以及(c) 以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對該經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物進行一馴化，以獲得該經基因改質的微生物。

本發明還提供一種生產衣康酸的方法，包括以下步驟：(a) 提供一經基因改質的微生物；(b) 提供一培養基，該培養基包含一濃度為0.1-100 g/L之甘油；(c) 將該經基因改質的微生物培養於該培養基中，以一培養溫度25-37°C及一pH值範圍6-7.5進行培養以產生一培養液，以使該經基因改質的微生物以甘油為代謝基質於該培養液中產生衣康酸； (d) 收取包含衣康酸之該培養液；以及 (e) 由包含衣康酸之該培養液分離出衣康酸。該經基因改質的微生物包括上述之經基因改質的微生物、上述之新穎之大腸桿菌基因改質株、或藉由上述之經基因改質的微生物的製備方法所製備的經基因改質的微生物。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵、和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：

本發明提供一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物。本發明之經基因改質的微生物係可用於高效率生產衣康酸。

本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物具有明顯改善且大幅提升衣康酸 (itaconic acid) 表現量之能力。藉由此高效率生產衣康酸之本發明之經基因改質的微生物，以及利用此菌株所建立之生產衣康酸的技術，可有效提升衣康酸的生產效能。

上述本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物之微生物來源可包括，但不限於細菌或真菌。

上述本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物之微生物來源之細菌的例子，可包括，艾氏菌屬(Escherichia )、腸桿菌屬(Enterobacter )、腸球菌屬(Enterococcus )、乳酸桿菌屬(Lactobacillus )、乳酸球菌屬(Lactococcus )、假單孢菌屬(Pseudomonas )、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter )、棒狀桿菌屬(Corynebacterium )、伊文氏桿菌屬(Erwinia )、克雷伯氏菌屬(Klebsiella )、摩根氏菌屬(Morganella )、團泛菌屬(Pantoea )、果膠桿菌屬(Pectobacterium )、變形桿菌屬(Proteus )、沙門桿菌屬(Salmonella )、沙雷氏菌屬(Serratia )或志賀氏桿菌屬(Shigella )等之細菌，但不限於此。而艾氏菌屬之細菌的例子可包括大腸桿菌(Escherichia coli )等，但不限於此。又，上述大腸桿菌可包括大腸桿菌BW25113、K12、DH5α、BL21、或XL1-blue，但不限於此。

而，上述本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物之微生物來源之真菌的例子，則可包括，耶氏酵母菌屬(Yarrowia )、畢赤酵母菌屬(Pichia )、膠紅酵母屬(Rhodotorula )、酵母菌屬(Saccharomyces )、德克酵母屬(Dekkera )、二形性酵母菌(Pseudozyma )、麴菌屬(Aspergillus )、克魯維酵母屬(Kluyveromyces )、青黴菌屬(Penicillium )或黑穗病菌屬(Ustilago )等之真菌，但也不限於此。

在一實施例中，本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物之微生物來源可為大腸桿菌，例如大腸桿菌BW25113。

請參照第1圖，特別是S1與S2所示步驟。在一實施例中，本發明之用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物，可包括編碼異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)之一突變的內源性icd 基因及編碼順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)之一第一外源性核酸序列，且此第一外源性核酸序列連接至一啟動子，但不限於此。

上述順式烏頭酸脫羧酶係指任何天然的順式烏頭酸脫羧酶，例如可為土麴菌(Aspergillus terreus )之順式烏頭酸脫羧酶(CAD)。而上述編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列可為任何序列，只要其所編碼出之蛋白質具有順式烏頭酸脫羧酶之功效即可。例如，上述編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列可包括與序列辨識號：1 (SEQ ID NO:1)之序列具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列可包括序列辨識號：1(SEQ ID NO:1)之序列。在另一實施例中，上述編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列可為序列辨識號：1 (SEQ ID NO:1)之序列，而其所編碼之順式烏頭酸脫羧酶的胺基酸序列可為序列辨識號：2 (SEQ ID NO:2)之序列。由於順式烏頭酸(cis-aconitate)為生產衣康酸的主要基質，而藉由順式烏頭酸脫羧酶的作用，可將順式烏頭酸轉化為衣康酸，因而透過導入順式烏頭酸脫羧酶，將有助於衣康酸的生產。

又，icd 基因為編碼三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle, TCA，亦稱為檸檬酸循環(citric acid cycle))中之異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)的基因。於三羧酸循環中，倘若異檸檬酸脫氫酶無法發揮正常效用，則無法催化異檸檬酸(isocitrate)氧化脫羧生成α-酮戊二酸(α-Ketoglutarate, α-KG)，如此一來，有較多的順式烏頭酸可直接成為生產衣康酸的基質，而藉此促進微生物生產衣康酸的效率。因此，本發明之經基因改質的微生物除了可包括編碼上述順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列外，其內源性icd 基因也可進行突變，以促進微生物產生衣康酸的效率。

上述包括突變之內源性icd 基因的經基因改質微生物，係指相對於野生型的微生物，其具有較低的異檸檬酸脫氫酶表現量。又，icd 基因存在於各種微生物中，包括土麴菌(Aspergillus terreus )、克氏檸檬酸桿菌(Citrobacter koseri )、醱酵乳酸桿菌(Lactobacillus fermentum )、釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae )、解脂耶氏酵母菌(Yarrowia lipolytica )以及大腸桿菌(Escherichia coli )等。例如，大腸桿菌之icd 基因的其中一編碼區域可為序列辨識號：3 (SEQ ID NO:3) 所示之核酸序列，或其所編碼之異檸檬酸脫氫酶的胺基酸序列可為序列辨識號：4 (SEQ ID NO:4)之序列，但不以此為限。

請繼續參照第1圖，特別是S21所示步驟。在另一實施例中，上述包括突變之內源性icd 基因及編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列的微生物，可更包括一第二外源性核酸序列，且此第二外源性核酸序列連接至一啟動子。其中，此第二外源性核酸序列可編碼至少一種多胜肽，且此多胜肽可包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)三者當中之至少其一，但不限於此。例如，此多胜肽可同時包括磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶與烏頭酸酶，但不以此為限。

在一實施例中，上述編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之第二外源性核酸序列可為任何序列，只要其所編碼出之蛋白質具有磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之功效即可。例如，上述編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之第二外源性核酸序列可包括與序列辨識號：5 (SEQ ID NO:5)之序列具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：5 (SEQ ID NO:5)之序列。在另一實施例中，上述編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶之第二外源性核酸序列可為序列辨識號：5 (SEQ ID NO:5)之序列，而其所編碼之磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的胺基酸序列可為序列辨識號：6 (SEQ ID NO:6)之序列。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PPC)被視為是葡萄糖發酵過程中將磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)轉化為草醯乙酸(oxaloacetic acid,OAA)的主要催化酶，而藉由磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的作用，可將磷酸烯醇丙酮酸直接轉化為草醯乙酸而進入三羧酸循環中，因而透過導入磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，將有助於衣康酸的生產。

在另一實施例中，上述編碼檸檬酸合成酶之第二外源性核酸序列可為任何序列，只要其所編碼出之蛋白質具有檸檬酸合成酶之功效即可。例如，上述編碼檸檬酸合成酶之第二外源性核酸序列可包括與序列辨識號：7(SEQ ID NO：7)之序列具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述編碼檸檬酸合成酶之第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：7(SEQ ID NO：7)之序列。在另一實施例中，上述編碼檸檬酸合成酶之第二外源性核酸序列可為序列辨識號：7(SEQ ID NO：7)之序列，而其所編碼之檸檬酸合成酶的胺基酸序列可為序列辨識號：8(SEQ ID NO：8)之序列。於三羧酸循環中，檸檬酸合成酶(citrate synthase)負責催化第一個反應，可將乙醯輔酶A(acetyl-CoA)與草醯乙酸轉化形成檸檬酸鹽(citrate)與輔酶A(coenzyme A)，而檸檬酸鹽再經後續的轉化可產生衣康酸，因而透過導入檸檬酸合成酶，將有助於衣康酸的生產。

在又一實施例中，上述編碼烏頭酸酶之第二外源性核酸序列可為任何序列，只要所編碼出之蛋白質具有烏頭酸酶A或烏頭酸酶B之功效即可。例如，上述編碼烏頭酸酶之第二外源性核酸序列可包括與序列辨識號：9或11(SEQ ID NO：9或11)之序列具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述編碼烏頭酸酶A或烏頭酸酶B之第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：9或11(SEQ ID NO：9或11)之序列。在另一實施例中，上述編碼烏頭酸酶A或烏頭酸酶B之第二外源性核酸序列可為序列辨識號：9或11(SEQ ID NO：9或11)之序列，而其所編碼之烏頭酸酶A或烏頭酸酶B的胺基酸序列可為序列辨識號：10或12(SEQ ID NO：10或12)之序列。於三羧酸循環中，烏頭酸酶(烏頭酸酶A或烏頭酸酶B)負責催化檸檬酸，使其轉化為順式烏頭酸(cis-aconitate)，並可將順式烏頭酸轉化形成異檸檬酸(isocitrate)，其中順式烏頭酸經轉化可直接產生衣康酸，因而透過導入烏頭酸酶，可助於衣康酸的生產。

在一實施例中，上述編碼多胜肽之第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：5、7、9或序列辨識號：5、7、11之序列。在另一實施例中，上述編碼多胜肽之第二外源性核酸序列可為序列辨識號：5、7、9或序列辨識號：5、7、11之序列。

請繼續參照第1圖，在一實施例中，上述微生物可進一步培養於含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中以進行馴化(S3)，進而可獲得更具有提升衣康酸表現量能力之經基因改質的微生物(S4)。其中，此經基因改質的微生物於進行馴化前，可包括已突變之內源性icd基因及已導入編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列(S1、S2)，但不限於此，尚可進一步導入編碼至少一種多胜肽之第二外源性核酸序列，且此多胜肽可選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶之至少其一(S21)。例如，此經基因改質的微生物於進行馴化前，可包括已突變之內源性icd 基因、已導入編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列、與已導入同時編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶之第二外源性核酸序列，但並不以此為限。

在一特定實施例中，上述本發明之經基因改質的微生物可為民國108年10月8日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940689的大腸桿菌基因改質株BW25113 CHC IA-01。

本發明也提供一種新穎之大腸桿菌基因改質株，其為於民國108年10月8日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940689的大腸桿菌基因改質株BW25113 CHC IA-01。

此外，本發明也提供一種用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法，其可包括以下步驟，但不限於此。

首先，請參照第1圖之S1所示步驟，將一目標微生物之內源性icd 基因突變以獲得一經icd 基因突變的微生物。

將上述目標微生物之內源性icd 基因突變的方法，並無特殊限制，只要可使標的內源性icd 基因失活，且不影響非標的基因的表現即可。使其基因突變的方式可包括，但不限於將整段基因剔除 (gene knockout)以致無法產生異檸檬酸脫氫酶，或使部分基因片段發生變異(modification)而無法產生相當於野生型微生物之異檸檬酸脫氫酶的表現量。而，使部分基因片段發生變異的方式可包括，使其缺失(deletion)部分核酸序列、插入(insertion)部分核酸序列、或重排(rearrangement)部分核酸序列，其中重排又可包括重複(duplication)、倒位(inversion)、易位(translocation)等，但並不限於此。例如，可以該技術領域中具有通常知識者所熟知之任何突變內源性標的基因的方法進行，如同源序列互換(homologous recombination)、噬菌體導入(phage transduction)、常間回文重複序列叢集-半胱氨酸蛋白酶9系統(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats- Cysteine asparate protease (Caspase) 9, CRISPER-Cas9 system)等，但不限於此。

在一實施例中，可透過於文獻Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5.中所記載之染色體基因之一步失活(one-step inactivation of chromosome gene)方法將大腸桿菌BW25113之內源性icd 基因剔除。此方法係藉由與於染色體上之icd 基因的序列互補的引子，透過同源序列互換(homologous recombination)，將大腸桿菌BW25113染色體上之icd 基因剔除。並可利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction)確認icd 基因之剔除情況。

上述目標微生物可包括，但不限於細菌或真菌。

關於上述細菌與真菌的例子及其相關說明，可為與上方本發明之經基因改質的微生物之相關段落中所記載之細菌與真菌的例子及其相關說明相同，故不於此重複以避免贅述。

接著，請參照第1圖之S2所示步驟，將編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)之一第一外源性核酸序列導入上述經icd 基因突變的目標微生物，以獲得一經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物。

此外，可參照第1圖之S21所示步驟，上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物，可更包括進一步導入編碼至少一種多胜肽之第二外源性核酸序列，且此多胜肽係選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)所組成群組中之至少其一，但不限於此。例如，可於上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物中，進一步導入同時編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶之第二外源性核酸序列，但並不以此為限。

將上述無論是第一或第二外源性核酸序列導入上述經icd 基因突變之方式並無特別限制，只要可將上述外源性核酸序列導入上述經icd 基因突變之目標微生物並可使其表現即可。例如，可經由一載體將上述外源性核酸序列導入上述經icd 基因突變之目標微生物中，但不限於此。又，上述載體之種類可依據所實際採用之目標微生物所適合的載體種類而定，例如可以特定質體(plasmid)作為載體，但不限於此。另外，也可透過將外源性核酸序列送入菌株之基因體中使其表現。在一實施例中，可經由一質體將上述第一及/或第二外源性核酸序列導入上述經icd 基因突變之目標微生物中。

上述第一外源性核酸序列可包括與序列辨識號：1 (SEQ ID NO:1)之序列具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述第一外源性核酸序列可包括序列辨識號：1 (SEQ ID NO:1)之序列。在另一實施例中，上述第一外源性核酸序列可為序列辨識號：1 (SEQ ID NO:1)之序列。

而，上述第二外源性核酸序列可包括與序列辨識號：5、7、9或11 (SEQ ID NO:5、7、9或11)之序列之至少其一具有至少85%之序列相似度的一序列，但不限於此。在一實施例中，上述第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：5、7、9或11 (SEQ ID NO:5、7、9或11)之序列中之至少其一。在另一實施例中，上述第二外源性核酸序列可為序列辨識號：5、7、9或11 (SEQ ID NO:5、7、9或11)之序列中之至少其一。在又一實施例中，上述第二外源性核酸序列可包括序列辨識號：5、7、11 (SEQ ID NO:5、7、11)之序列。在另一實施例中，上述第二外源性核酸序列可為序列辨識號：5、7、11 (SEQ ID NO:5、7、11)之序列。

上述之經基因改質的目標微生物可以習知重組方法構築完成，例如可參照Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 。特別是，此經基因改質的目標微生物可利用聚合酵素鏈鎖反應(PCR)由其天然來源(可來自基因銀行)獲得編碼上述一或複數個酵素的核酸片段，以過度表現上述一或複數個酵素。此核酸片段並連接至一適當的啟動子以形成一表現框架(expression cassette)。在一實施例中，一表現框架可包括一連接啟動子的編碼序列。在另一實施例中，一表現框架可包括複數個編碼序列，其皆連接至一啟動子。

上述之啟動子係指一核酸序列，在寄主微生物中，此核酸序列的一部份可開啟連接核酸序列的轉錄。啟動子至少包括一RNA聚合酶結合位。啟動子可更包括一或複數個調控部份，其可控制啟動子的開啟/停止狀態。例如當以E. coli 作為寄主微生物時，代表性的E. coli 啟動子可包括，但不限於，β-內醯胺酶及乳醣啟動子系統(Chang et al., Nature 275:615-624, 1978)，SP6、T3、T5及T7 RNAs聚合酶啟動子(Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89，1990)，lambda啟動子(Elvin et al., Gene 87:123-126, 1990)，trp啟動子(Nichols and Yanofsky, Meth. In Enzymology 101:155-164, 1983)以及Tac及Trc啟動子(Russell et al., Gene 20:231-243,1982)。當以酵母菌作為寄主微生物時，代表性的酵母菌啟動子包括，但不限於，3-磷酸甘油酸激酶啟動子、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)啟動子、半乳糖激酶(GAL1)啟動子、半乳糖表異構酶(galactoepimerase)啟動子、以及醇脫氫酶(ADH)啟動子。在其他微生物中，適合用於表現基因的啟動子亦為熟悉此技術領域人士所習知。

在一特定實施例中，於上述本發明之用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法中，所述經基因改質的微生物可為一經基因改質的大腸桿菌，其於民國108年10月8日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940689。

另外，依據上述，本發明還可提供藉由任何上述之本發明之用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法所製備出之任何經基因改質的微生物。

其後，請繼續參照第1圖之S3所示步驟，以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物進行馴化，以獲得一經馴化之目標微生物，而上述經馴化之目標微生物的衣康酸產率可高於上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物。於此培養基中，衣康酸及/或其鹽類之濃度可為約20-80 g/L，例如，約25-75 g/L、約20-70 g/L、約35-75 g/L、約30-70 g/L、約40-80 g/L、約45-75 g/L，約50-70 g/L、約40-65 g/L、約40-60 g/L、約40-50 g/L、約55-65 g/L、約50-60 g/L、約60-80 g/L等，但不限於此。

以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物進行馴化的方式可包括，但不限於，先以含有衣康酸及/或其鹽類濃度為20-80 g/L之培養液對經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的目標微生物進行培養(S31)。待培養至生長穩定期時，取其菌液塗佈於含有衣康酸及/或其鹽類濃度為20-80 g/L之平板培養基上(S32)，待其長出菌落後，一一挑出各個菌落並確認其耐受性(S33)，並一一鑑定所挑選菌落之基因型態為何(S34)。

在一實施例中，上述含有衣康酸及/或其鹽類的培養基可更包括酵母菌萃取液(yeast extract)、磷酸氫二鈉(sodium hydrogen phosphate, Na₂ HPO₄ )、磷酸二氫鉀(potassium dihydrogen phosphate, KH₂ PO₄ )、氯化鈉(sodium chloride, NaCl)與氯化銨(ammonium chloride, NH₄ Cl)，但不限於此。其中，酵母菌萃取液之濃度為約1-120 g/L、Na₂ HPO₄ 之濃度為約5-10 g/L、KH₂ PO₄ 之濃度為約1-5 g/L、NaCl之濃度為約0.1-2 g/L、而NH₄ Cl之濃度為約0.1-5 g/L。

在一實施例中，上述培養基中之酵母菌萃取液的濃度可為約5-100 g/L、5-85 g/L、10-80 g/L、10-50 g/L、20-80 g/L、30-70 g/L、40-60 g/L等，但不限於此。在一實施例中，上述培養基中之Na₂ HPO₄ 的濃度可為約5-8 g/L、6-10 g/L、7-10 g/L、5.5-8.5 g/L、6.5-9.5 g/L、5-9 g/L、8-10 g/L等，但不限於此。在另一實施例中，上述培養基中之KH₂ PO₄ 的濃度可為約1-3 g/L、2-5 g/L、3-5 g/L、1.5-4.5 g/L、2.5-4.5 g/L等，但也不限於此。在又另一實施例中，上述培養基中之NaCl的濃度可為約0.1-0.5 g/L、0.5-1 g/L、0.5-2 g/L、1-2 g/L、0.5-1.5 g/L等，但也不限於此。在又另一實施例中，上述培養基中之NH₄ Cl的濃度可為約0.1-3 g/L、0.5-5 g/L、1-3 g/L、2-5 g/L、1.5-4.5 g/L等，但也不限於此。

在一實施例中，於上述含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中，除衣康酸及/或其鹽類的濃度可為約20 g/L、約40 g/L、約60 g/L、約80 g/L之外，培養基中可更包括酵母菌萃取液的濃度可為約20 g/L、Na₂ HPO₄ 的濃度可為約6.78 g/L、KH₂ PO₄ 的濃度可為約3 g/L、NaCl的濃度可為約0.5 g/L與NH₄ Cl的濃度可為約1 g/L，但不限於此。

又，在一實施例中，上述含有衣康酸及/或其鹽類的培養基可更包含一碳源。碳源的種類並無特殊限制，只要是可被所培養之微生物作為碳源利用即可，例如，甘油、葡萄糖、乳糖等，但不限於此。於上述含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中，碳源的濃度可為約0.1-120 g/L，例如，約0.5-105 g/L、1-100 g/L、5-85 g/L、10-80 g/L、20-70 g/L、25-65 g/L、30-60 g/L、40-80 g/L等，但不限於此。在一特定實施例中，上述碳源為甘油，而於上述含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中，甘油的濃度可為約0.1-100 g/L，例如，約1-85 g/L、5-100 g/L、20-80 g/L、25-75 g/L、30-70 g/L、30-60 g/L、5-50 g/L、10-40 g/L、20-30 g/L等，但不限於此。

在一實施例中，上述以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物進行的馴化，可包括，但不限於，進行一第一濃度培養。而於第一濃度培養中，將上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物以含有一第一濃度之衣康酸及/或其鹽類的培養基培養至生長穩定期。上述衣康酸及/或其鹽類於培養基中之第一濃度可為約20-80 g/L，例如，約25-75 g/L、約20-70 g/L、約35-75 g/L、約30-70 g/L、約40-80 g/L、約45-75 g/L，約50-70 g/L、約40-65 g/L、約40-60 g/L、約40-50 g/L、約55-65 g/L、約50-60 g/L、約60-80 g/L等，但不限於此。在一實施例中，於上述含有衣康酸及/或其鹽類之培養基中，衣康酸及/或其鹽類的濃度可為約20 g/L、25 g/L、30 g/L、35 g/L、40 g/L、45 g/L、50 g/L、55 g/L、60 g/L、65 g/L、70 g/L、75 g/L或80 g/L，但不限於此。又，上述第一濃度培養視需要而定，可僅進行一次，也可進行複數次之循環，並無特殊限制。而在一特定實施例中，上述第一濃度培養可進行約1-6個循環，例如可接續進行2、3、4、5、6個循環之第一濃度培養，但不限於此，操作者可視實際情況調整循環次數。

此外，在上述第一濃度培養中，將微生物培養至生長穩定期的時間係根據微生物之種類、培養條件等而定，也無特殊限制。例如，在上述第一濃度培養中可將微生物培養約8-72小時，例如，約8-16小時、約12-24小時、約16-32小時、約24-36小時、約36-48小時、約48-60小時、約60-72小時、約8小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時等，以至生長穩定期，但不限於此。

再者，於第一濃度培養中，培養微生物所採用之溫度，也同樣根據微生物之種類、培養條件等而定，也無特殊限制。例如，在上述第一濃度培養中，可將微生物培養於約25-37^o C，例如，約25-35^o C、約27-34^o C、約28-36^o C、約26-32^o C、約28-30^o C、約30-32^o C、約32-36^o C、約25^o C、約27^o C、約28^o C、約29^o C、約30^o C、約31^o C、約32^o C、約35^o C、約37^o C，但不限於此。

而在另一實施例中，上述以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物進行的馴化，除了上述第一濃度培養外，可更包括，但不限於，於上述第一濃度培養之後，對上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物進行至少一回合之增加濃度培養，而於每回合之增加濃度培養中，將上述經突變icd 基因及導入第一外源性核酸序列的微生物以含有高於上述第一濃度之濃度的衣康酸及/或其鹽類的培養基培養至生長穩定期。又，每回合之增加濃度培養所使用之培養基的衣康酸及/或其鹽類濃度皆為高於前一回合之增加濃度培養。

又，上述至少一回合之增加濃度培養的數目並無特殊限制，可視微生物之生理情況，例如微生物的生長速率而定。舉例來說，倘若微生物於含有約40 g/L之衣康酸及/或其鹽類的培養基中的生長速率已達預期且至生長穩定期，則可接續進行增加濃度之培養，例如將其接續培養於含有約60 g/L之衣康酸及/或其鹽類的培養基中。相反地，倘若微生物於含有約40 g/L之衣康酸及/或其鹽類的培養基中的生長速率低或不如預期，此時將暫停增加濃度之培養，而繼續以含有約40 g/L之衣康酸及/或其鹽類的培養基時進行培養，直至其生長速率可到達預期且可達生長穩定期。在一實施例中，於上述第一濃度培養之後，可進行約1-5回合之增加濃度培養，例如可接續進行2、3、4、5回合之增加濃度培養，但不限於此。

此外，上述每回合之增加濃度培養為獨立地視需要而定，每回合之增加濃度培養可獨立地僅進行一次，也可進行複數次之循環，並無特殊限制。而在一特定實施例中，上述每回合之增加濃度培養可獨立地進行約1-6個循環，但不限於此，操作者可視實際情況調整循環次數。例如可視實際需求進行約2、3、4、5、6個循環，但不以此為限。

在一實施例中，上述之本發明之任何用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法所製備出之任何經基因改質的微生物，係可用於生產衣康酸，但不限於此。

再者，本發明也可提供一種生產衣康酸的方法。

本發明之生產衣康酸的方法可包括以下步驟，但不限於此。

於本發明之生產衣康酸的方法中，可將含有編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列且經突變icd 基因之經基因改質的微生物，培養於含有甘油濃度為0.1-100 g/L之一培養基中，且以一培養溫度25-37°C及一pH值範圍6-7.5進行培養約8-72小時以產生包含衣康酸之培養液，其中上述經基因改質的微生物係以甘油為主要碳源，而以甘油為主要代謝基質於上述培養液中產生衣康酸。接著，可收取包含衣康酸之培養液並由包含衣康酸之培養液中分離出衣康酸。

上述含有編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列且經突變icd 基因之經基因改質的微生物的例子，可包括，但不限於，上述任何之本發明之經基因改質的微生物、上述本發明之新穎之大腸桿菌基因改質株、或藉由任何上述之本發明之用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法所製備出之任何經基因改質的微生物。

又，上述含有編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列且經突變icd 基因之經基因改質的微生物係以上述培養基於一厭氧或含氧狀態下進行培養，其中含氧狀態係指溶氧量為1-50%，例如，約5-20%，約10-30%，約15-40%，約20-50%，約5-45%、約10-40%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%等，但不限於此。

於上述含有甘油之培養基中，甘油的濃度可為約0.1-100 g/L，例如，約1-85 g/L、5-100 g/L、20-80 g/L、25-75 g/L、30-70 g/L、30-60 g/L、5-50 g/L、10-40 g/L、20-30 g/L等，但不限於此。

而關於上述培養基中，可更包括之酵母菌萃取液、Na₂ HPO₄ 、KH₂ PO₄ 、NaCl與NH₄ Cl等成份的濃度範圍與相關說明，可為與上方本發明之用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法中之相關段落中所記載之成份的濃度範圍及其相關說明相同，故不於此重複以避免贅述。

此外，於本發明生產衣康酸之方法中，培養上述經基因改質之微生物的時間係根據微生物之種類、培養情況等而定，並無特殊限制。例如，可將上述經基因改質之微生物培養約8-72小時，例如可為約8-16小時、約12-24小時、約16-32小時、約24-36小時，約36-48小時、約48-60小時、約60-72小時、約8小時、約12小時、約24小時、約36小時、約48小時、約60小時、約72小時等，以至生長穩定期，但不限於此。

再者，於本發明生產衣康酸之方法中，培養上述經基因改質之微生物所採用之溫度，也同樣根據微生物之種類、培養情況等而定，也無特殊限制。例如，於本發明生產衣康酸之方法中，可將微生物培養於約25-37°C，例如可為約25^o C、約27^o C、約28°C、約29°C、約30°C、約31°C、約32°C、約35^o C、約37^o C等，但不限於此。

以及，於本發明生產衣康酸之方法中，培養上述經基因改質之微生物所採用之pH值，也同樣根據微生物之種類、培養情況等而定，也無特殊限制。例如，於本發明生產衣康酸之方法中，可將微生物培養於pH值範圍約6-7.5，例如可為約6.2-7.4、約6.5-7.2、約6.2-6.5、約6.3-6.8、約6.5-7、約6.8-7.2、約6.2、約6.4、約6.5、約6.8、約7.0、約7.2、約7.3、約7.4等，但不限於此。

藉由上述任何之本發明生產衣康酸之方法，可使微生物有效提升衣康酸之生產效率以及所培養之菌液中衣康酸的含量。

實施例

實施例1：用於提升衣康酸表現量菌株之製備

(1) 建立E. coli 之基因改質菌株

以E. coli BW25113為基因改質之來源菌株，製備表1中所示的各菌株。

表1

名稱	基因型或描述
質體
pZE12-1uc	ColE1 ori；Amp^R ；P_L lacO₁ ::luc (VF)
pPC 1	ColE1 ori；Kan^R ；P_L lacO₁ ::cad (AT)
pPC 2	pZE12，P_L lacO₁ ::acnA (EC)
pPC 3	ColE1 ori；Spe^R ；P_L lacO₁ : :gltA (EC)
pPC 4	ColE1 ori；Spe^R ；P_L lacO₁ ::ppc (EC)
菌株
E. coli BW25113	(rrnB_T14 ΔlacZ_WJ16 hsdR514 ΔaraBAD_AH33 ΔrhaBAD_LD78 )
E. coli A	(rrnB_T14 ΔlacZ_WJ16 hsdR514 ΔaraBAD_AH33 ΔrhaBAD_LD78 Δicd )
E. coli B	E. coli A表現基因cad ,acnA ,gltA ,ppc
E. coli C1	E. coli B以不同濃度之衣康酸進行馴化
E. coli C2
E. coli C3
E. coli C4
luc (VF)：V. fischeri 冷光酶(luciferase)cad (AT) ：A. terreus 順式烏頭酸脫羧酶基因acnA (EC) ：E. coli 烏頭酸酶A基因gltA (EC)：E. coli 檸檬酸合成酶基因ppc (EC)：E. coli 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因

(1-1)E. coli A（經剔除內源性icd 基因的大腸桿菌BW25113）的製備

透過於文獻Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 Jun 6;97(12):6640-5 .中所記載之染色體基因之一步失活(one-step inactivation of chromosome gene)方法將E. coli BW25113之內源性icd 基因剔除。此方法係藉由與於染色體上之icd 基因的序列互補的引子，透過同源序列互換(homologous recombination)，將E. coli BW25113染色體上之icd 基因剔除。

接著，可利用聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction)來確認經剔除icd 基因之E. coli BW25113。經確認染色體上沒有icd 基因的E. coli BW25113，即為E. coli A。

(1-2) 順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)表現之菌株的製備。

將上述可表現順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase, CAD)之基因（其來源物種為土麴菌Aspergillus terreus ，且其序列為序列辨識號：1之序列）的質體DNA (pPC 1)、可表現烏頭酸酶A (aconitase A)之基因（其來源物種為大腸桿菌Escherichia coli ，且其序列為序列辨識號：9之序列）的質體DNA (pPC 2)、可表現檸檬酸合成酶(citrate synthase) 之基因（其來源物種為大腸桿菌Escherichia coli ，且其序列為序列辨識號：7之序列）的質體DNA (pPC 3)、以及可表現磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)之基因（其來源物種為大腸桿菌Escherichia coli ，且其序列為序列辨識號：5之序列）的質體DNA (pPC 4)，經基因轉殖操作後，同步將cad 基因、acnA 基因、gltA 基因及pp c 基因導入上述所獲得之經剔除icd 基因的E. coli A。

接著，藉由抗生素篩選方式得到能夠同時表現順式烏頭酸脫羧酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶A之基因的菌株，並將所篩選出之菌株命名為E. coli B。

(2) 經馴化之E. coli 的製備

將所獲得之E. coli B，以逐步提升培養基內衣康酸濃度(20 g/L-80 g/L)的方式進行馴化。所採用之培養基的配方如表2中所示，另於培養基中添加甘油10 g/L作為碳源。

表2

培養基配方	濃度 (g/L)
yeast extract	20
KH₂ PO₄	3
Na₂ HPO₄	6.78
NaCl	0.5
NH₄ Cl	1

將E. coli B之單一菌落接入搖瓶中，並培養於30^o C。於培養72小時後，取適量菌液塗佈至含有一起始衣康酸濃度之平板培養基上，並於30^o C培養48-72小時。採用上述起始衣康酸濃度之培養基進行1-6個循環。之後，挑取大顆菌落進行下一回合具較高衣康酸濃度之培養，且同樣進行1-6個循環。依上述方式逐步增加衣康酸的濃度來培養菌株。

於每回合不同之衣康酸濃度的培養皆選出一菌株。所挑選出的菌株依據衣康酸培養濃度低至高分別為，E. coli C1、E. coli C2、E. coli C3與E. coli C4。

將E. coli B與E. coli C4進行菌株生長及衣康酸產率之分析。結果如表3所示。

表3

	菌株生長(OD₆₀₀ )	衣康酸產率（g/L/小時）
馴化前菌株E. coli B	78.6	0.98
馴化菌株E. coli C4	166	1.78

依據表3可知，相較於馴化前菌株E. coli B之衣康酸產率為0.98 g/L/小時，歷經馴化之菌株E. coli C4具有顯著較高之衣康酸產率約1.78 g/L/小時，將其命名為E. coli BW25113 CHC IA-01。

上述E. coli BW25113 CHC IA-01已於民國108年10月8日寄存於中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心，寄存編號為BCRC 940689。

實施例2：未經馴化之菌株與經馴化之菌株對衣康酸表現量的影響

分別將大腸桿菌菌株E. coli B與E. coli C4 (CHC IA-01)之單一菌落接入搖瓶中，以上述表2所示之培養基配方於30^o C培養72小時，並於培養基中添加甘油10 g/L作為碳源。之後，分別取1%之E. coli B菌液與CHC IA-01菌液接種至如上述之培養基中以進行醱酵槽培養。醱酵槽培養的條件為：醱酵槽溫度30^o C、pH 7.0、溶氧(dissolved oxygen, D.O.) 10%。其中，以未經衣康酸馴化之E. coli B作為比較菌株，而以經衣康酸馴化之E. coli C4 (CHC IA-01) 作為實驗菌株。

於48小時醱酵槽培養期間，分別於培養8小時、24小時、36小時及48小時之時間點取適量之E. coli B菌液與適量之CHC IA-01菌液，以分光光度計測量醱酵液之OD₆₀₀ 數值。其後，分別將E. coli B醱酵液與CHC IA-01醱酵液所測得之OD₆₀₀ 數值對照衣康酸(itaconic acid)濃度標準曲線以換算獲得各個時間點之衣康酸表現量(衣康酸濃度) (g/L)，並以培養48小時所換算獲得之衣康酸濃度作為由E. coli B與CHC IA-01所產生之最終衣康酸產量(g/L)。另，藉由上述E. coli B與CHC IA-01之最終衣康酸產量(g/L)與48小時的培養時間，可計算出E. coli B與CHC IA-01之衣康酸產率（g/L/小時）。

結果顯示於第2A圖、第2B圖與第2C圖。

由第2A圖顯示，相較於未經衣康酸馴化之比較菌株E. coli B，經衣康酸馴化之實驗菌株CHC IA-01於8、24、36及48小時之各個時間點的衣康酸表現量(衣康酸濃度g/L)皆較佳，且隨著時間的遞增，實驗菌株CHC IA-01的衣康酸表現量愈呈現大幅超越比較菌株E. coli B的衣康酸表現量之趨勢。

由第2B圖與第2C圖顯示，以48小時之最終衣康酸產量(g/L)而言，實驗菌株CHC IA-01的最終衣康酸產量為85.58 g/L，衣康酸產率為1.78 g/L/小時，比較菌株E. coli B的最終衣康酸產量為46.98 g/L，衣康酸產率為0.98 g/L/小時，實驗菌株CHC IA-01的最終衣康酸產量或產率幾乎是比較菌株E. coli B的最終衣康酸產量或產率的1.82倍。換言之，相較於比較菌株E. coli B的最終衣康酸產量或產率，實驗菌株CHC IA-01的最終衣康酸產量或產率幾乎成長了近1倍。

由上述結果可知，以經衣康酸馴化之大腸桿菌菌株CHC IA-01來生產衣康酸，應可有效提升衣康酸的產量與產率。

實施例3：未經馴化之菌株與經馴化之菌株於不同衣康酸濃度下對菌株生長的影響

分別將大腸桿菌菌株E. coli B與E. coli C4 (CHC IA-01)之單一菌落接入搖瓶中，以上述表2所示之培養基配方於30^o C培養72小時，並於培養基中添加甘油10 g/L作為碳源。之後，分別取1%之E. coli B菌液與CHC IA-01菌液接種至如上述之培養基中以進行培養。培養基中除添加甘油10 g/L作為碳源之外，另分別添加不等量之衣康酸，使衣康酸之最終濃度分別為20 g/L、40 g/L、60 g/L及80 g/L。接著，於30^o C、pH 6.8、溶氧10%之條件下，以200 rpm轉速培養24小時。其中，同樣以未經衣康酸馴化之E. coli B作為比較菌株，而以經衣康酸馴化之E. coli C4 (CHC IA-01) 作為實驗菌株。

於24小時培養後，分別取適量菌液以分光光度計測量菌液之OD₆₀₀ 數值。結果如表4與第3圖所示。

表4

添加衣康酸濃度測試菌株	20 g/L	40 g/L	60 g/L	80 g/L
馴化前菌株E. coli B	8.7	6.7	4.2	0.7
馴化菌株 CHC IA-01	9.2	9.7	9.0	4.7

由表4與第3圖顯示，未經衣康酸馴化之比較菌株E. coli B的生長狀況隨著衣康酸濃度的遞增而相形變差，尤其在高濃度衣康酸60 g/L及80 g/L的存在下，其生長狀況顯著不佳，顯示其受到高濃度衣康酸的影響較大。相對於此，經衣康酸馴化之實驗菌株CHC IA-01的生長狀況並未隨著衣康酸濃度的遞增而明顯變差，其在高濃度衣康酸60 g/L的存在下仍能維持相當於衣康酸濃度20 g/L的生長速度，且在更高濃度衣康酸80 g/L的存在下尚能維持衣康酸濃度20 g/L之培養條件時之超過50%的生長速度，顯示其受到高濃度衣康酸的影響較小。

由上述結果可知，相較於未經衣康酸馴化之比較菌株E. coli B，經衣康酸馴化後之大腸桿菌菌株CHC IA-01在面對高濃度衣康酸的培養條件仍可展現較佳的生長態勢，顯示透過馴化確實可改善目標微生物於高濃度衣康酸環境中的生長能力。

進一步，將本發明所提供之經衣康酸馴化的大腸桿菌菌株E.coli CHC IA-01與現行技術所開發之菌株，針對碳源種類、產量、生產時間及生產速率進行比較。其中，E.coli CHC IA-01係由本發明所提供之經衣康酸馴化的大腸桿菌菌株，A. terreus CECT 20365係參考文獻Applied biochemistry and biotechnology 168: 1311-1318. 2012 所示資訊，A. terreus DSM 23081係參考文獻Appl Microbiol Biotechnol 96: 1209-1216. 2012 所示資訊，A. terreu s MJL05係參考文獻Revista colombiana de biotecnologia 12: 187-193. 2010 所示資訊，Ustilago maydis DSM 17144係參考文獻Journal of Microbiology & Biotechnology Research 2. 2012 所示資訊，而E.coli ita36A係參考文獻Biotechnology and Bioengineering 115:156-164. 2018 所示資訊。比較結果如表5所示。

表5

菌株	碳源	產量(g/L)	生產時間(天)	生產速率 (g/L/小時)
E.coli CHC IA-01	甘油	85.58	2	1.78
A. terreus CECT 20365	甘油	30.2	10	0.13
A. terreus CECT 20365	葡萄糖	26.9	10	0.11
A. terreus DSM 23081	葡萄糖	86.2	7	0.51
A. terreus MJL05	甘油	27.6	8	0.14
Ustilago maydis DSM 17144	葡萄糖	29	5	0.24
E.coli ita36A	葡萄糖	47	5	0.39

由表5顯示，現行技術所開發之用於醱酵生產衣康酸的菌株仍多以土麴菌(A. terreus )為主。然而，土麴菌的生長緩慢，生產週期約需7~10天，其中以甘油為主要碳源之菌株的產率僅約0.13~0.14 g/L/小時。儘管土麴菌菌株A. terreus DSM 23081之產量可提升至86.2 g/L，但其需以成本較高之葡萄糖為主要碳源，且生產週期約需7天，產率僅提高至0.51 g/L/小時，恐不易滿足大規模工業生產之需求。

於土麴菌之外，現行技術尚有開發以玉米黑穗菌菌株Ustilago maydis DSM 17144生產衣康酸，此菌株之生產週期雖可縮短至5天，然其產率僅約0.24 g/L/小時，仍不足以符合工業生產之所需。再者，E.coli ita36A雖與本發明同為大腸桿菌菌株，但其仍是以葡萄糖為主要碳源，且生產週期需5天，產率相較於多數土麴菌菌株僅小幅提高至0.39 g/L/小時，距離進入工業生產的規模仍有不小的改善空間。

由上述比較結果可知，相較於現行技術所開發之用於醱酵生產衣康酸的菌株，本發明所提供之經衣康酸馴化的大腸桿菌菌株E.coli CHC IA-01，不僅是以甘油為主要碳源，且生產週期僅需2天，產率卻可達1.78 g/L/小時，大幅提升了醱酵生產衣康酸的效能約3.5~16倍，應具備進入工業生產規模之潛力。

綜上所述，在一些實施例中提供一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物、提供一種新穎之大腸桿菌基因改質株、提供一種用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法、或者提供一種生產衣康酸的方法。這些經基因改質的微生物或基因改質株及其製備方法、以及生產衣康酸的方法，至少具備以下優點：

(1) 本發明所提供之經基因改質的微生物，其醱酵生產衣康酸之週期明顯縮短，但效能顯著高於現行技術所開發之用於醱酵生產衣康酸的菌株，確實為可高效率生產衣康酸之菌株。

(2) 相較於土麴菌於產孢時期無法形成衣康酸，本發明所提供之新穎之大腸桿菌基因改質株E.coli CHC IA-01並無產孢時期的限制，於生產衣康酸之使用上更為便利。

(3) 相較於土麴黴菌株之衣康酸生產週期約需7~10天，以及其他目前所開發菌株之衣康酸生產週期約需為5天，本發明所提供之新穎之大腸桿菌基因改質株E.coli CHC IA-01的衣康酸生產週期僅需2天即可達到土麴黴菌株培養7天的產量，大幅縮減了衣康酸的生產時程，可預期能有效改善時間成本。

(4) 相較於現行技術所開發之用於醱酵生產衣康酸的菌株與方法，本發明所提供之經基因改質的微生物與生產衣康酸的方法，可使產率提高至3.5~16倍，極具潛力應用於後續的大規模工業生產。

(5) 以碳源而言，葡萄糖和蔗糖等原料皆為人類糧食的重要來源。基於此考量，本發明所提供之經基因改質的微生物與生產衣康酸的方法係以甘油為主要碳源，相較於現行技術所開發之用於醱酵生產衣康酸的菌株多以葡萄糖為主要碳源，既可排除與民爭糧的疑慮，且可降低生產所需的成本。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

無。

第1圖顯示，用於提升衣康酸表現量之經基因改質菌株的製備流程。第2A圖顯示，於相同培養條件下，分別以實驗菌株（CHC IA-01）與比較菌株（E. coli B）生產衣康酸的情形。第2B圖顯示，於相同培養條件下，分別以實驗菌株（CHC IA-01）與比較菌株（E. coli B）產生衣康酸的產量（g/L菌液）。第2C圖顯示，於相同培養條件下，分別以實驗菌株（CHC IA-01）與比較菌株（E. coli B）生產衣康酸的產率（g/L菌液/小時）。第3圖顯示，將實驗菌株（CHC IA-01）與比較菌株（E. coli B）分別以含有不同衣康酸濃度（20 g/L、40 g/L、60 g/L及80 g/L）之培養基培養的菌株生長情形。

1. 大腸桿菌菌株BW25113 CHC IA-01 中華民國食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心民國108年10月8日 BCRC 940689

Claims

一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物，包括：一突變之內源性icd基因，其編碼異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)，該突變之內源性icd基因的異檸檬酸脫氫酶表現量低於其野生型的表現量；以及一第一外源性核酸序列，其編碼順式烏頭酸脫羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)，該第一外源性核酸序列連接至一啟動子；其中，該微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，且該包括突變之內源性icd基因及第一外源性核酸序列的基因改質微生物係培養於一含有衣康酸及/或其鹽類的培養基中以逐步提升培養基內衣康酸濃度的方式進行一馴化，以使其具有提升衣康酸表現量之能力。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，其中該第一外源性核酸序列之核苷酸序列包括序列辨識號：1之序列，而該第一外源性核酸序列所編碼之蛋白質的胺基酸序列包括序列辨識號：2之序列。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，其中該突變之icd基因之核苷酸序列包括序列辨識號：3之序列，而該突變之icd基因所編碼之蛋白質的胺基酸序列包括序列辨識號：4之序列。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，更包括一第二外源性核酸序列，其編碼至少一種多胜肽選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)，且該烏頭酸酶為烏頭酸酶A(aconitase A)或烏頭酸酶B(aconitase B)，該第二外源性核酸序列連接至一啟動子。
如申請專利範圍第4項所述之經基因改質的微生物，其中該第二外源性核酸序列之核苷酸序列包括序列辨識號：5、7、9之序列之至少其一，或該第二外源性核酸序列之核苷酸序列包括序列辨識號：5、7、11之序列之至少其一。
如申請專利範圍第4項所述之經基因改質的微生物，其中該第二外源性核酸序列所編碼之蛋白質的胺基酸序列包括序列辨識號：6、8、10之序列之至少其一，或該第二外源性核酸序列所編碼之蛋白質的胺基酸序列包括序列辨識號：6、8、12之序列之至少其一。
如申請專利範圍第4項所述之經基因改質的微生物，其中該第二外源性核酸序列同時編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶。
如申請專利範圍第7項所述之經基因改質的微生物，其中該第二外源性核酸序列之核苷酸序列為序列辨識號：5、7、9或5、7、11之序列，而該第二外源性核酸序列所編碼之蛋白質的胺基酸序列為序列辨識號：6、8、10或6、8、12之序列。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，其中該經基因改質的微生物為大腸桿菌菌株BW25113 CHC IA-01，其寄存編號為BCRC 940689。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，其中該基因改質微生物係以甘油為代謝基質。
如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物，其中該培養基中之衣康酸的濃度為20-80g/L。
一種新穎之大腸桿菌基因改質株，其寄存編號為BCRC 940689，其中該新穎之大腸桿菌基因改質株包括一突變之內源性icd基因、編碼順式烏頭酸脫羧酶之第一外源性核酸序列、以及編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶及烏頭酸酶(aconitase)之第二外源性核酸序列。
一種用於提升衣康酸表現量之經基因改質的微生物的製備方法，包括以下步驟：(a)將一微生物之內源性icd基因突變以獲得一經icd基因突變的微生物，其中該微生物為大腸桿菌；(b)將編碼順式烏頭酸脫羧酶(CAD)之一第一外源性核酸序列導入該經icd基因突變的微生物，以獲得一經突變icd基因及導入第一外源性核酸序列的微生物；以及(c)以含有衣康酸及/或其鹽類的培養基對該經突變icd基因及導入第一外源性核酸序列的微生物以逐步提升培養基內衣康酸濃度的方式進行一馴化，以獲得該經基因改質的微生物。
如申請專利範圍第13項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中該微生物係用於生產衣康酸。
如申請專利範圍第13項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中(b)步驟更包括選擇性將編碼至少一種多胜肽之一第二外源性核酸序列導入該經icd基因突變及導入編碼第一外源性核酸序列的微生物，且該多胜肽係選自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 (phosphoenolpyruvate carboxylase)、檸檬酸合成酶(citrate synthase)及烏頭酸酶(aconitase)所組成群組中之至少其一。
如申請專利範圍第13項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中該馴化包括：進行一第一濃度培養，而於該第一濃度培養中，將該經突變icd基因及導入第一外源性核酸序列的微生物以含有一第一濃度之衣康酸及/或其鹽類的一培養基培養8-72小時至生長穩定期，且其中該第一濃度為20-80g/L。
如申請專利範圍第16項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中該第一濃度培養係進行1-6個循環。
如申請專利範圍第16項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中該馴化更包括：於該第一濃度培養之後，對該經突變icd基因及導入第一外源性核酸序列的微生物進行至少一回合之增加濃度培養，而於每回合之增加濃度培養中，將該經突變icd基因及導入第一外源性核酸序列的微生物以含有高於該第一濃度之濃度的衣康酸及/或其鹽類的培養基培養8-72小時至生長穩定期，且其中每回合之增加濃度培養所使用之培養基的衣康酸及/或其鹽類的濃度皆高於其前一回合之濃度。
如申請專利範圍第18項所述之基因改質的微生物的製備方法，其中每回合之增加濃度培養進行1-6個循環。
如申請專利範圍第13項所述之經基因改質的微生物的製備方法，其中該經基因改質的微生物為大腸桿菌(Escherichia coli)，其寄存編號為BCRC 940689。
一種生產衣康酸的方法，包括以下步驟： (a)提供一經基因改質的微生物；(b)提供一培養基，該培養基包含一濃度為0.1-100g/L之甘油；(c)將該經基因改質的微生物培養於該培養基中，以一培養溫度25-37℃及一pH值範圍6-7.5進行培養以產生一培養液，以使該經基因改質的微生物以甘油為碳源於該培養液中產生衣康酸；(d)收取包含衣康酸之該培養液；以及(e)由包含衣康酸之該培養液分離出衣康酸；其中，該經基因改質的微生物包括如申請專利範圍第1項所述之經基因改質的微生物、如申請專利範圍第12項所述之新穎之大腸桿菌基因改質株、或藉由如申請專利範圍第13項所述之用於提升衣康酸產量之經基因改質的微生物的製備方法所製備的經基因改質的微生物。
如申請專利範圍第21項所述之生產衣康酸的方法，其中該經基因改質的微生物係以該培養基於一含氧狀態下進行培養。
如申請專利範圍第21項所述之生產衣康酸的方法，其中該含氧狀態係指溶氧量為1-50%。
如申請專利範圍第21項所述之生產衣康酸的方法，其中該經基因改質的微生物係以該培養基培養8-72小時以產生包含衣康酸之該培養液。