CN102925398A - 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸营养缺陷型大肠杆菌的构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)营养缺陷型埃希氏菌属(Escherichia)微生物的构建及其应用。通过向埃希氏菌属微生物引入NAD转运蛋白，并且阻断胞内NAD生物合成途径，构建出依赖于外源吡啶核苷酸辅酶生长的埃希氏菌属工程菌。NAD营养缺陷型埃希氏菌可在生物技术领域用于筛选吡啶核苷酸辅酶代谢的抑制药物、提高氧化还原生物转化效率、建立基因克隆和蛋白质异源表达的非抗生素筛选平台等。

Description

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸营养缺陷型大肠杆菌的构建及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)营养缺陷型埃希氏菌属(Escherichia)微生物的构建及其应用。更具体地讲，是在埃希氏菌属微生物胞内置入一种可表达NAD跨膜转运蛋白的载体，并阻断其天然的NAD生物合成途径，获得依赖于外源吡啶核苷酸辅酶生长的工程菌，并应用于生物催化、NAD跨膜转运蛋白抑制剂筛选、代谢调控、非抗生素筛选标记和蛋白质表达等。

背景技术

烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是非常重要的辅因子。NADH和NADPH分别是NAD和NADP的还原形态，它们在胞内可以相互转化。NAD、NADH、NADP和NADPH统称为吡啶核苷酸辅酶。原核微生物细胞内有300个以上的氧化还原反应以它们为辅因子，它们的浓度及相对含量变化会影响代谢网络及生长特性。在乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)中高表达来源于变形链球菌(Streptococcus mutans)的NADH氧化酶，NADH/NAD比例降低，结果导致乳酸乳球菌由单一乳酸发酵变成了混合酸发酵(de Felipe et al.，J Bacteriol，1998，180，3804)。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达乳酸乳球菌的NADH氧化酶，胞内NADH浓度降低5倍，导致代谢网络显著改变，甘油、乙醇、琥珀酸、羟基戊二酸产量明显降低，而一些氧化型产物乙醛、乙酸、乙偶姻产量增加(Heuxet al.，Metab Eng，2006，8，303)。在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达来源于博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)甲酸脱氢酶，胞内NADH含量增加，而NAD/NADH总量不变，结果乙醇/乙酸的比例从1.05提高到9.45(Sanchez et al.，J Biotechnol，2005，117，395)。以上研究成功通过表达甲酸脱氢酶或NADH氧化酶调节胞内NADH/NAD比例，但未能有效改变胞内吡啶核苷酸辅酶总水平。

通过操作NAD生物合成中间体形成的相关基因或NAD合酶基因，增加NAD(H)总水平的研究已有报道(San et al.，Metab Eng，2002，4，182；Heuser et al.，Eng Life Sci，2007，7，343)。但由于胞内吡啶核苷酸辅酶水平受到严格调控，其生物合成途径受到胞内辅因子反馈调控(Fosteret al.，J Bacteriol，1990，172，4187)，所以胞内总辅因子浓度维持在一定范围内，难以进行大幅度调控。

大肠杆菌中存在两种NAD生物合成途径，一是NAD从头合成途径，即以天冬氨酸为前体，经过喹啉酸生成烟酸单核苷酸(NAMN)，再经烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶(NadD)和NAD合酶(NadE)催化生成NAD。另一种途径是分支途径，即以NAD(H)分解中间产物烟酰胺单核苷酸(NMN)为原料，由NadD催化生成NAD(Begley et al.，Vitam Horm，2001，61，103；Hove-Jensen et al.，J Bacteriol，1996，178，714)。理论上敲除大肠杆菌基因组中的关键基因nadD和nadE，可得到NAD生物合成途径阻断的工程菌株。然而，敲除nadD或nadE后菌株不能正常产生NAD，并且微生物因缺少NAD(H)跨膜转运系统也无法从环境中获取NAD。因此，nadD或nadE因敲除菌株因缺少细胞生长代谢必需的辅因子NAD而无法生长，即nadD或nadE被认为是致死基因(Baba et al.，Mol Syst Biol，2006，2，20060008)。目前文献中尚没有成功获得nadE或nadE基因敲除或缺失的埃希氏菌属微生物工程菌株的报道。

发明内容

本发明通过在埃希氏菌属微生物胞内表达NAD跨膜转运蛋白，并阻断NAD生物合成途径，构建NAD营养缺陷型工程微生物，实现对胞内吡啶核苷酸辅酶的调控，并将应用于生物催化、NAD跨膜转运蛋白抑制剂筛选、代谢调控、非抗生素筛选标记和蛋白质表达等生物技术领域。

为解决NAD跨膜转运的问题，本发明采取的策略是在埃希氏菌属微生物中导入一种可自我复制并携带NAD转运蛋白编码基因的蛋白质表达载体。NAD跨膜转运蛋白编码基因包括以下基因，来源于衣原体Protochlamydiaamoebophila UWE25的ntt4(NCBI GeneID：2780098)(Haferkamp et al.，Nature，2004，432，622)；或来源于酿酒酵母S288C的ScNDT1(NCBI GeneID：854811)、ScNDT2(NCBI GeneID：856712)(Todisco et al.，J Biol Chem，2006，281，1524)；或来源于拟南芥的AtNDT1(NCBI GeneID：819362)、AtNDT2(NCBI GeneID：839124)(Palmieri et al.，J Biol Chem，2009，284，31249)或它们的具有相似功能的突变基因。其中来源于衣原体的ntt4编码的蛋白NTT4既能转运NAD，也能转运NADH，但对ATP或GTP等没有明显转运作用，因此，ntt4是优选基因。

本发明使用的可自我复制的蛋白质表达载体为常用的含有诱导型启动子tac、trc、lac或T7等的表达载体(Sambrook et al.，Molecular cloning：A laboratory manual，2001，pp.12171240，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press)；或含有组成型启动子的表达载体(Alperatal.，Proc Natl Acad Sci USA，2005，102，12678)。NAD跨膜转运蛋白编码基因采用成熟的基因克隆技术插入到蛋白质表达载体中，并进一步采用转化方法置入到埃希氏菌属微生物细胞内(Sambrook et al.，Molecularcloning：A laboratory manual，2001，pp.9699，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press)。

为阻断埃希氏菌属微生物NAD生物合成途径，本发明采取的策略是通过基因敲除(替换)或基因断裂的分子生物学方法，使菌株基因组中编码烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的基因nadD或编码NAD合酶的基因nadE的一种或两种失活。但是，同时失活基因nadD或基因nadE可更完全地去除胞内NAD生物合成能力。埃希氏菌属微生物基因失活可基于同源重组的原理进行(Nelson ed.，Lehninger Principles of Biochemistry，4th Edition，2005，pp.978991，Freeman Press)。依据同源重组臂间插入DNA序列的大小或同源重组臂所对应序列在基因组上位置的差异，所得工程菌株中靶基因对应的DNA片段可以被完全删除或部分删除、同时引入或不引入外源DNA序列。基于同源重组技术发展起来的Red重组系统操作简单、准确率高，是基因失活的优选方法(Datsenko et al.，Proc Natl Acad Sci USA，2000，97，6640)。

本发明在首先将埃希氏菌属微生物中导入了可自我复制并携带NAD转运蛋白编码基因的蛋白质表达载体的基础上，进行NAD生物合成途径阻断改造。因此，本发明获得的工程菌株具有NAD跨膜转运能力，其生长严格依赖于从环境中获取NAD(H)，即具有吡啶核苷酸辅酶营养缺陷型的表型。

本发明所述埃希氏菌属微生物是一类常见的兼性厌氧原核微生物，它们广泛应用在生物技术的各个领域，包括蛋白质表达、基因克隆、生物基化学品生产、生物活性物质筛选等。其中MG1655，BW25113等多个菌株已完成全基因组测序。埃希氏菌属微生物如大肠杆菌BW25113(CGSC No.7636)、MG1655(CGSC No.6300)、DH5α(CGSC No.12384)、W3110(CGSC No.4474)和DH1(CGSC No.6040)可从CGSC(美国耶鲁大学大肠杆菌菌种保藏中心)获得；BL21(ATCC No.BAA-1025)和JM109(ATCC No.53323)可从ATCC(美国典型菌种保藏中心)获得。以大肠杆菌BW25113为例，基因nadE(NCBIGene ID：945248)和基因nadE(NCBI Gene ID：946946)的DNA序列已知，可以准确地敲除或断裂这两个基因，阻断其NAD生物合成途径。由于埃希氏菌属微生物基因序列同源很高，采用本发明的策略完全可以对其他菌株进行相同的基因工程改造。

本发明构建了一系列埃希氏菌属微生物基因工程菌株，它们均具有吡啶核苷酸辅酶营养缺陷型的表型，其中E.coli YJE003(CGMCC 4988)或E.coli YJE004(CGMCC 4989)已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。

本发明获得的具有NAD营养缺陷型表型的埃希氏菌属微生物，可在一系列生物技术领域中应用。首先，通过改变培养环境中吡啶核苷酸辅酶的浓度，可在更大范围内调控胞内吡啶核苷酸辅酶的浓度，为氧化还原代谢提供更强的动力，促进生物基化学品生产。由于本发明获得的工程菌株的生长受NAD转运能力的制约，当培养环境中存在其他物质影响NAD转运过程时，工程菌株的生长也受到影响，利用该特征可评估和筛选NAD转运蛋白及相关生物化学过程的抑制剂，具有筛选新药物(如抗衣原体感染)的应用价值。本发明获得的工程菌株生长严格依赖于环境中NAD(H)的特点，还可作为非抗生素筛选平台，用于基因克隆和蛋白质表达，用在抗体和医药用蛋白质制备领域。

附图说明

图1为NAD营养型缺陷型大肠杆菌菌株YJE003表型的实验结果。取1mL菌体密度为10⁹/mL(OD₆₀₀＝1)的细胞分别稀释至10^-1 10^-6，取10μL点到对应平板上。YJE003能在含有NAD或NADH的LB平板上生长，但不能在含有NAD生物合成的中间体烟酰胺单核苷酸(NMN)，烟酸(NA)平板上生长。说明YJE003完全依赖于外源的NAD(H)才能生长，是NAD(H)营养型缺陷型菌株。

图2为AMP类似物6e和6i对大肠杆菌YJE003生长影响的实验结果。在含NAD的M9培养基中，加入AMP类似物6e和6i，72h后YJE003菌体密度OD₆₀₀分别为3.0和0.40；而不添加AMP类似物时OD₆₀₀达到3.1。同时，野生型菌株BW25113在含有AMP类似物6i的M9培养基中培养72h后菌体密度OD₆₀₀也为3.1。说明应用YJE003可以方便地筛选发现对NAD跨膜转运有抑制作用的活性化合物。

图3为大肠杆菌YJE003作为宿主提高甘油转化为二羟丙酮效率的实验结果。利用野生型菌株BW25113在不添加和添加NAD的条件下，二羟丙酮浓度分别为1.0g/L和7.0g/L；而利用大肠杆菌YJE003作为宿主，在添加NAD的条件下二羟丙酮浓度达到14.1g/L。说明NAD营养型缺陷型菌株可用于提高生物转化的效率。

保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的菌株大肠埃希氏菌E.coli YJE003(Escherichia coli YJE003)，保藏编号：CGMCC 4988；保藏时间：2011年6月24日；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的大肠埃希氏菌E.coli YJE004(Escherichia coli YJE004)，保藏编号：CGMCC4989；保藏时间：2011年6月24日；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

以下实施例有助于了解本专利，但不限定本发明所涉及的菌株、载体及基因材料。

实施例1：

(1)、将Red重组酶表达质粒pKD46(NCBI Accession No.AY048746)转化到BW25113中，获得菌株BW25113(pKD46)。

(2)、NAD转运蛋白NTT4表达载体构建：

参照衣原体ntt4(NCBI GeneID：2780098)的序列，委托TaKaRa公司(中国大连)通过全基因合成技术合成ntt4基因。以该合成基因材料为模板，利用ntt4-F/ntt4-R引物和PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行聚合酶链式反应克隆ntt4，将扩增产物和载体pET15b(Novagen，USA)进行NdeI和BamHII双酶切，并利用T4连接酶进行连接，得到质粒pET15b-NTT4。以pET24b(Novagen，USA)为模板，kan-F/kan-R为引物克隆卡那霉素抗性编码基因kan。然后采用RF克隆(van den Ent F and LoweJ，J Biochem Biophys Methods，2006，67，67)方法将kan替换氨苄青霉素抗性编码基因b1a，得到载体pET15k-NTT4，转化到大肠杆菌BW25113(pKD46)中，得到菌株BW25113(pKD46，pET15k-NTT4)。

ntt4克隆引物(下划线表示酶切位点)：

ntt4-F：5’-GAGCATATGAGTAAAACAAACCAG-3’(NdeI)

ntt4-R：5’-TACGGATCCTTATTTTTTTATAAAAG-3’(BamHI)

卡那霉素抗性编码基因kan克隆引物：

kan-F：5’

-TTAAACATGCCAGTGATGCAAAGGTAGTGCAAGAGCTATGACATATACCTGCCGTTCAC-3’

kan-R：5’

-TCAGGCGGTCAGTGTATCATCACTCATACTCTGCCCGACACCATGGTCATAGCTGTTTC-3’

(3)、nadE敲除盒的构建：

以nadE：cat-F/nadE：cat-R从模板质粒pKD3(NCBI Accession No.AY048742)中通过PCR反应扩增带有氯霉素抗性基因cat的敲除盒nadE：cat。

敲除盒nadE：cat构建引物：

nadE：cat-F：5’

-CTGTTGTGCCATAAACCCCTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGATATGAtgggaattagccatggtcc-3’

nadE：cat-R：5’

-CGCATCATGCCCTCCGTAACGACAGGTATCAGCGATACAAGCCTTGTTGgtgtaggctggagctgcttc-3’

(引物中大写碱基表示nadE基因外侧同源重组序列，小写部分为cat基因序列)。

(4)、敲除盒转化及筛选

将敲除片段nadE：cat电转化到BW25113(pKD46，pET15k-NTT4)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的SOB平板(20g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl，2.5mM KCl，1mM MgCl₂，1mM MgSO₄，15g/L琼脂)上，37C，培养24天。选取单菌落，于37

C在以下平板上梯度稀释培养，包括含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的LB平板(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl，15g/L琼脂)、含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NADH的LB平板、含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NMN的LB平板、含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM烟酸(NA)的LB平板和含有50μg/mL卡那霉素和25μg/mL氯霉素的LB平板。

实施例结果见图1。发现得到的工程菌株可以在含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的LB平板或含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NADH的LB平板上生长，但不能在其他3种平板上生长，说明构建的工程菌株具有NAD(H)营养缺陷型表型。

该菌株命名为大肠杆菌(E.coli)YJE003，已其由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏号为CGMCC 4988。

实施例2

(1)、nadD敲除盒的构建：

以nadD：cat-F/nadD：cat-R从模板质粒pKD3(NCBI Accession No.AY048742)中通过PCR反应扩增带有氯霉素抗性基因cat的敲除盒nadD：cat。

nadD：cat-F：5’

-CGGGTTAGCTTTAAGGAAGTTTTGTCTTTTCTGTCTGGAGGGGTTCAatgggaattagccatggtcc-3’

nadD：cat-R：5’

-CTTTTTCGCACAATCCAATATGTGCAAATTATTACTTTTTCCAGAAATCATCgtgtaggctggagctgcttc-3’

(引物中大写碱基表示nadD基因外侧同源重组序列，小写部分为cat基因序列)。

(2)、敲除盒转化及筛选

将敲除片段nadE：cat电转化到实施例1构建好的BW25113(pKD46，pET15k-NTT4)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的SOB平板上，37C，培养24天。选取单菌落，于37C在不同平板上梯度稀释培养，发现所得工程菌株和E.coli YJE003具有相同的NAD(H)营养缺陷型表型。

该菌株命名为大肠杆菌(E.coli)YJE004，已其由中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏号为CGMCC 4989。

实施例3：

(1)、将Red重组酶表达质粒pKD46(NCBI Accession No.AY048746)转化到MG1655中，获得菌株MG1655(pKD46)。

(2)、NAD转运蛋白ScNDT1表达载体构建：

以酿酒酵母S288C基因组DNA为模板，利用ScNDT1-F/ScNDT1-R引物和PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行聚合酶链式反应克隆ScNDT1，将扩增产物和载体pET15b(Novagen，USA)进行NdeI和BamHI双酶切，并利用T4连接酶进行连接，得到质粒pET15b-ScNDT1。然后采用RF克隆(van den Ent F and Lowe J，J Biochem Biophys Methods，2006，67，67)方法将卡那霉素抗性编码基因kan替换氨苄青霉素抗性编码基因b1a，得到载体pET15k-ScNDT1，转化到大肠杆菌MG1655(pKD46)中，得到菌株MG1655(pKD46，pET15k-ScNDT1)。

ScNDT1克隆引物(下划线表示酶切位点)：

ScNDT1-F：5’-GAGCATATGACACAGACTGATAATCC-3’(NdeI)

ScNDT1-R：5’-TACGGATCCTTAAATTACCATAGTGCTAATATT-3’(BamHI)

(3)、敲除盒转化及筛选

将实施例1构建的敲除盒nadE：cat电转化到MG1655(pKD46，pET15k-ScNDT1)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的SOB平板上，37C，培养24天。选取单菌落，于37C在不同平板上梯度稀释培养，发现所得工程菌株和E.coli YJE003具有相似的NAD(H)营养缺陷型表型，但其生长速度较慢。

实施例3说明利用其他NAD转运蛋白(ScNDT1)和不同埃希氏菌属微生物菌种(MG1655)，按照本发明的方法，均可以获得具有NAD营养缺陷型表型的工程菌株。

实施例4：

(1)、将Red重组酶表达质粒pKD46(NCBI Accession No.AY048746)转化到B121中，获得菌株B121(pKD46)。

(2)、NAD转运蛋白AtNDT2表达载体构建：

参照拟南芥AtNDT2(NCBI Gene ID：839124)的序列，委托TaKaRa公司(中国大连)通过全基因合成技术合成AtNDT2基因。以该合成基因材料为模板，利用AtNDT2-F/AtNDT2-R引物和PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行聚合酶链式反应克隆AtNDT2，将扩增产物和载体pET15b(Novagen，USA)进行NdeI和BamHI双酶切，并利用T4连接酶进行连接，得到质粒pET15b-AtNDT2。然后采用RF克隆(van den Ent F and Lowe J，JBiochem Biophys Methods，2006，67，67)方法将卡那霉素抗性编码基因kan替换氨苄青霉素抗性编码基因b1a，得到载体pET15k-A tNDT2，转化到大肠杆菌MG1655(pKD46)中，得到菌株MG1655(pKD46，pET15k-AtNDT2)。

AtNDT2克隆引物(下划线表示酶切位点)：

AtNDT2-F：5’-GAGCATATGATTGAACATGGGAACTCTAC-3’(NdeI)

AtNDT2-R：5’-TACGGATCCTTATTTGCTTCCAAGAGGGATATG-3’(BamHI)

(3)、敲除盒转化及筛选

将实施例1构建的敲除盒nadE：cat电转化到MG1655(pKD46，pET15k-AtNDT2)中，涂布于含有50μg/mL卡那霉素，25μg/mL氯霉素和500μM NAD的SOB平板上，37C，培养24天。选取单菌落，于37C在不同平板上梯度稀释培养，发现所得工程菌株和E.coli YJE003具有相似的NAD(H)营养缺陷型表型，但其生长速度非常慢，原因可能是AtNDT2来源于拟南芥，在大肠杆菌活性不足。

实施例4进一步说明利用其他NAD转运蛋白(AtNDT2)和不同埃希氏菌属微生物菌种(BL21)，按照本发明的方法，均可以获得具有NAD营养缺陷型表型的工程菌株。

实施例5：

工程菌株E.coli YJE003在37℃，含有100μM NAD的LB液体培养基(10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L NaCl)中培养12h，收集细胞并用M9培养基(葡萄糖4.0g/L，Na₂PO₄·7H₂O 12.8g/L，KH₂PO₄3.0g/L，NaCl 0.5g/L，NH₄Cl 1.0g/L，MgSO₄ 0.24g/L，CaCl₂0.01g/L)洗涤2遍，接种到含100μMAMP类似物6e或6i(Hou et al.，Bioorg Med ChemLett，2011，21，1667)和100μM NAD的LB液体培养基中，初始细胞光密度OD₆₀₀(细胞悬浊液在波长600nm处的吸收值，光路径长度为1cm)为0.04，72h后测定细胞光密度OD₆₀₀。

大肠杆菌BW25113在37℃，含有100μMNAD的LB液体培养基中培养12h，收集细胞并用M9培养基洗涤2遍，接种到含100μM AMP类似物6i和100μMNAD的LB液体培养基中，初始细胞光密度OD₆₀₀为0.04，72h后测定细胞光密度OD₆₀₀值。

实施例结果见图2。发现在含NAD的M9培养基中，加入AMP类似物6e和6i，72h后YJE003菌体光密度OD₆₀₀分别为3.0和0.40；而不添加AMP类似物时OD₆₀₀达到3.1。而野生型菌株BW25113在含有AMP类似物6i的M9培养基中培养72h后菌体密度OD₆₀₀也为3.1。表明AMP类似物6i对E.coliYJE003生长有抑制作用，而对BW25113没有抑制作用。由于E.coli YJE003Y生长依赖NTT4转运NAD，AMP类似物6i对E.coli YJE003生长有抑制作用说明，类似物6i对NAD转运过程具有抑制作用。因此，NAD营养缺陷型菌株可以方便地发现对NAD跨膜转运有抑制作用的活性化合物，用于建立抗衣原体的药物活性筛选平台。

实施例6：

(1)、催化甘油生成二羟丙酮菌株构建

以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，利用gldA-F/gldA-R引物和PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行聚合酶链式反应克隆得到甘油脱氢酶基因gldA(NCBI GeneID：948440)；以Enterococcusfaecalis V583基因组DNA为模板，利用EfNOX-F/EfNOX-R克隆得到NADH氧化酶基因Efnox(NCBI GeneID：1200486)。随后以gldA-F/EfNOX-R为引物、gldA及EfNOX为模板，通过重叠延伸PCR(Horton，R.M.et al，Gene，1989，77，61)获得双基因表达盒gldA-Efnox。然后通过RF克隆(van denEnt F and Lowe J，J Biochem Biophys Methods，2006，67，67)将gldA-Efnox克隆到pTrc99A(NCBI Accession No.U13872)载体的Trc启动子后面获得双基因表达质粒pTr99A-gldA-efNOX。分别将质粒pTr99A-gldA-efNOX转化到E.coli BW25113和E.coli YJE003中，得到菌株E.coli GN01和E.coli GN03。

双基因gldA-Efnox表达载体构建引物：

gldA-F：CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGACCGCATTATTCAATCAC

gldA-R：GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTATTCCCACTCTTGCAGG

efNOX-F：CTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAAGTCGTAGTCGTAGG

e FNOX-R：CAAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTACATATTTTCTAAAGCGGCTTG

(2)、工程菌株GN01和GN03细胞催化转化甘油生成二羟丙酮

E.coli GN01在37℃，含有100μM NAD的LB液体培养基中培养12h，收集细胞并用M9培养基洗涤2遍，接种到含100μM NAD的LB液体培养基中，初始细胞光密度OD₆₀₀为0.04，培养至细胞光密度OD₆₀₀为0.40.6，加0.5mM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导20h，收集细胞用100mM Na₂HPO₄缓冲液(pH 9.4)清洗2遍，重悬于含有100μM NAD的100mM Na₂HPO₄缓冲液(pH 9.0)中，细胞密度为2g干菌体(DCW)/L，加入30g/L甘油，37℃，200rpm反应3h，测定二羟丙酮浓度。

以E.coli GN03为菌株材料，按照上述条件操作，测定二羟丙酮浓度。

实施例结果见图3。利用E.coli GN03在不添加和添加NAD的条件下，二羟丙酮浓度分别为1.0g/L和7.0g/L；而利用E.coli GN01在添加NAD的条件下二羟丙酮浓度达到14.1g/L。说明NAD营养型缺陷型菌株可用于提高生物转化的效率。

实施例6说明NAD营养缺陷型菌株R.coli YJE003可作为氧化还原催化体系的宿主，通过在培养基中增加辅因子供给，提高催化转化效率。

实施例7：

(1)、催化丙酮酸生成D-乳酸菌株构建

以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，利用ldhA-F/ldhA-R引物和PrimeSTAR^TMHS DNA聚合酶(TaKaRa，中国大连)进行聚合酶链式反应，克隆得到D-乳酸脱氢酶基因ldhA(NCBI GeneID：946315)；以博伊丁假丝酵母C.boidinii ATCC 46498基因组DNA为模板，利用CbFDH-F/CbFDH-R克隆得到甲酸脱氢酶基因Cbfdh(NCBI Accession No.AF004096)。随后以ldhA-F/CbFDH-R为引物、ldhA及CbFDH为模板，通过重叠延伸PCR(Hortonet al.，Gene，1989，77，61)获得双基因表达盒ldhA-fdh。然后通过RF克隆(van den Ent F and Lowe J，J Biochem Biophys Methods，2006，67，67)将ldhA-fdh克隆到pTrc99A(NCBI Accession No.U13872)载体的Trc启动子后面，获得到双表达质粒pTr99A-ldhA-fdh。分别将质粒pTr99A-ldhA-fdh转化到E.coli YJE004和E.coli BW25113中，得到菌株E.coli LF01和E.coli LF03。

ldhA-F：CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACTCGCCGTTTATAG

ldhA-R：GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTAAACCAGTTCGTTCGG

cbFDH-F：GATCGCTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAGATCGTTTTAGTC

cbFDH-R：AAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTAC

(2)、工程菌株LF01和LF03细胞催化转化丙酮酸生成D-乳酸溶   E.coli LF01在37℃，含有100μM NAD的LB液体培养基中培养12h，收集细胞并用M9培养基洗涤2遍，接种到含100μM NAD的LB液体培养基中，初始细胞光密度OD₆₀₀为0.04，培养至细胞光密度OD₆₀₀为0.40.6，加0.5mM IPTG诱导30h，收集细胞用100mM Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)清洗2遍，重悬于含有100mM Na₂HPO₄缓冲液(pH 8.0)中，细胞密度为以2.5g DCW/L，加入一定浓度的丙酮酸钠和一定浓度的NADH，37℃，200rpm反应3h，测定乳酸浓度。

以E.coli LF03为菌株材料，按照上述条件操作，测定乳酸浓度。

实施例结果见表1。在不添加NADH的条件下，工程菌株LF01和LF03催化反应的乳酸没有明显差别。但是，当反应体系中加入100μM NADH后，工程菌株LF01比LF03取得了更高乳酸产率。并且，增加反应体系中NADH的浓度，可以促进乳酸生成。增加丙酮酸初始浓度，虽然乳酸产率下降，但乳酸浓度明显提高。说明NAD营养型缺陷型菌株可用于提高生物转化的效率。

实施例7说明NAD营养缺陷型菌株E.coli YJE004也可作为氧化还原催化体系的宿主，通过增加辅因子供给，提高催化效率。

表1：工程菌株LF01和LF03转化丙酮酸的实验结果

实施例8

1、无抗生素半乳糖甘酶基因表达载体构建

以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，分别用引物nadE：bla-F/nadE：bla-R和nadD：bla-F/nadD：bla-R扩增nadE和nadD，然后利用RF克隆方法(van den Ent F and Lowe J，J Biochem Biophys Methods，2006，67，67)将pTrc99A载体上的氨苄抗性基因bla替换为nadE或nadD，得到载体pTrc99A-nadE或pTrc99A-nadD。再以大肠杆菌BW25113基因组DNA为模板，用lacZ-F/lacZ-R扩增半乳糖甘酶表达基因lacZ(NCBI GeneID：945006)，然后通过RF克隆方法将laca插入到Trc启动子下游。得到无抗生素半乳糖甘酶基因表达载体pTrc99A-nadE-lacZ和pTrc99A-nadD-lacZ。

作为对照实验，将半乳糖甘酶表达基因lacZ通过RF克隆到pTrc99A的Trc启动子下游，得到载体pTrc99A-lacZ(该载体携带氨苄抗性基因bla)。

基因扩增引物：

nadE：bla-F：CAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGACATTGCAACAACAAATAAT

nadE：bla-R：GTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACTTTTTCCAGAAATCATC

nadD：bla-F：CAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAAATCTTTACAGGCTCTG

nadD：bla-R：GTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTCAGCGATACAAGCCTTGTTG

lacZ-F：CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACCATGATTACGGATTC

lacZ-R：CAAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTATTTTTGACACCAGACCAAC

2、无抗生素条件下表达半乳糖甘酶

分别将载体pTrc99A-nadE-lacZ和pTrc99A-nadD-lacZ转化到E.coliYJE003和E.coli YJE004中。

作为对照实验，将载体pTrc99A-lacZ转化到E.coliBW25113中。

上述转化菌液分别涂布在LB平板上，37℃过夜培养。

分别挑取单菌落，在含有100μM NAD或不添加NAD的LB液体培养基中培养至细胞光密度OD₆₀₀为0.40.6，加入1mM IPTG诱导10h。按文献方法测定半乳糖甘酶酶活(Pardee et al.，J Mol Biol，1959，1，165)。

实施例结果见表2。表明，NAD营养缺陷型工程菌株作为宿主在表达半乳糖甘酶基因时，其表达载体可不含有抗生素标记。另外，由于培养基中添加NAD，可调控胞内NAD浓度，有利于蛋白质表达，半乳糖甘酶酶活比没有添加NAD时分别增加了36％和29％，分别达到了8.4kU/g DCW和8.0kU/g CW。

表2：NAD营养缺陷型菌株作为宿主表达蛋白质的实验结果

实施例8说明NAD营养缺陷型菌株可用作蛋白表达宿主，并且蛋白质表达载体上可不含有抗生素基因。

Claims (7)

1.一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)营养缺陷型的埃希氏菌属(Escherichia)微生物，其构建过程如下，

1)将一种表达NAD跨膜转运蛋白编码基因的可自我复制的载体导入埃希氏菌属微生物细胞内；

2)采用基因敲除和/或基因断裂的方法使埃希氏菌属微生物基因组中编码烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶的基因nadD、编码NAD合酶的基因nadE中的一种或两种失活。

2.按照权利要求1所述的微生物，其特征在于：所述NAD跨膜转运蛋白编码基因是衣原体的基因ntt4(NCBI GeneID：2780098)、或酵母的基因ScNDT1(NCBI GeneID：854811)、或酵母的ScNDT2(NCBI GeneID：856712)、或拟南芥的基因AtNDT1(NCBI GeneID：819362)、或拟南芥的AtNDT2(NCBIGeneID：839124)、或它们的具有相似功能的突变基因。

3.按照权利要求1所述的微生物，其特征在于：其生长依赖于培养环境中存在的NAD或其还原态化合物NADH、或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或其还原态化合物NADPH中的一种或多种组合。

4.按照权利要求1、2或3所述的微生物，其特征在于：该微生物为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的菌株大肠埃希氏菌E.coli YJE003，保藏编号：CGMCC 4988；保藏时间：2011年6月24日；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；

或该微生物为保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的大肠埃希氏菌E.coli YJE004，保藏编号：CGMCC 4989；保藏时间：2011年6月24日；保藏地点：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

5.一种权利要求1、2、3或4所述微生物的应用，其特征在于：所述微生物生长培养时，通过在埃希氏菌属微生物培养基中添加总浓度为0.005mmo l/L 10mmol/L的吡啶核苷酸辅酶，调控胞内吡啶核苷酸辅酶的浓度，改善细胞的代谢行为，进而获得一种或多种埃希氏菌属微生物代谢物产量。

6.一种权利要求1、2、3或4所述微生物的应用，其特征在于：所述微生物生长培养时，通过在埃希氏菌属微生物培养基中添加终浓度分别为0.005mmol/L 10mmol/L的吡啶核苷酸辅酶和待筛选的化合物，通过观测该微生物的生长速度变化，获知被筛选的化合物对NAD跨膜转运蛋白的抑制性能。

7.一种权利要求1、2、3或4所述微生物的应用，其特征在于：所述微生物通过下述方式之一，应用于蛋白质表达：1)向所述微生物导入携带表达特定蛋白质编码基因的可自我复制的载体，或，2)向所述微生物导入携带表达特定蛋白质编码基因并且表达nadD基因或nadE基因的可自我复制的载体。

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