CN110564660B - 生产乳清酸的重组微生物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了多种生产乳清酸的重组微生物以及利用重组微生物生产乳清酸的方法，这些重组微生物菌种含有一个或几个下列特征或全部特征，这些特征是：（1）乳清酸代谢途径中的磷酸核糖转移酶或乳清酸核苷单磷酸脱羧酶的合成减弱了或完全丧失了；（2）通过超表达参与乳清酸合成途径中的酶的五个基因来增加相应的酶量；（3）通过超表达从胞内转运乳清酸的转运蛋白编码基因来增加相应的转运蛋白。

Description

生产乳清酸的重组微生物及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及利用基因工程等方法改造微生物，改造后的微生物菌种能够积累大量的乳清酸。
背景技术
乳清酸，化学名称尿嘧啶-6-羧酸，分子式C5H5N2O4，分子量156.10。其形状为白色有光泽的针状晶体白色晶体或结晶性粉末，无臭，有酸味。熔点345～346℃，难溶于冷水和乙醇及有机溶剂，微溶于热水，不溶于乙醚。乳清酸是一种营养药，又名维生素B13，乳清酸盐类，例如乳清酸钙，乳清酸镁和乳清酸锂很好的营养品。
目前乳清酸以化学生产为主，报道的有两种路线：一种是由草酸二乙酯经缩合、合环得到5-乙氧基甲叉以内酰脲，再经扩环、酸析得到乳清酸，此工艺条件复杂，成本高，产率低，因此该路线已经被工业生产所淘汰。目前大多厂家采用第二条生产路线，该路线以溴化钠、氯气和马来酰脲为原料，先制备5-溴-2，6-二氧代-六氢嘧啶-4-羧酸，然后和氢氧化钠反应并经酸化制得粗品乳清酸，再用浓氨水精制，该反应中溴化钠和反复利用。随着中国的改革开发，国内的企业对化学合成乳清酸进行了创新，降低了乳清酸的生产成本，从而使化工合成的乳清酸占领了一定的市场。但随着中国对环保要求的日益严格，化学合成乳清酸的成本也相应的提高，环保和低成本的生物制造乳清酸的方式就显得非常重要了。
因此，需要开发一种低成本、低污染的乳清酸生物合成方法。
发明内容
本发明的目的是构建具有强大的乳清酸生物合成和积累能力的重组微生物，从而在菌种发酵过程中生产大量乳清酸，达到环保，绿色，低成本的乳清酸生产。
本发明的技术方案可以应用大肠杆菌，枯草杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳杆菌或者其他的微生物，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。
乳清酸是生物体嘧啶合成途径中的重要前体，许多微生物的嘧啶缺陷型或渗漏型都具有积累乳清酸的能力，如链孢霉、产气气杆菌和石蜡节杆菌，但它们的乳清酸产量均很低。本发明是在嘧啶饥饿型大肠杆菌菌株基础上，通过将乳清酸降解路径进行阻断，再将嘧啶合成路径基因进行过表达，使最终的重组菌株摇瓶生产2g/L乳清酸，5L发酵罐可生产120g/L以上的乳清酸。1大肠杆菌的转运蛋白基因yfcJ过表达可促进乳清酸积累
本发明发现转运蛋白基因yfcJ的过表达可以使细胞积累较多的乳清酸。我们在未进行基因改造的饥饿性大肠杆菌中过表达YfcJ转运蛋白基因，与未过表达菌株比较有明显的乳清酸积累。
2去除利用和降解乳清酸或乳清酸核苷单磷酸的酶的编码基因使乳清酸不再参与细胞中的代谢
乳清酸是嘧啶合成代谢路径的中间产物，大肠杆菌嘧啶合成途径主要由6步催化合成：(1)由氨基甲酰磷酸合成酶(CarAB)催化HCO3 -与谷氨酰胺缩合生成氨基甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)；(2)由天冬氨酸氨基甲酰转移酶(PyrB)催化天冬氨酸与氨基甲酰磷酸生成氨基甲酰天冬氨酸(carbamoyl aspartate)；(3)由二氢乳清酸酶(PyrC)催化氨基甲酰天冬氨酸脱水、分子内重排形成具有嘧啶环的二氢乳清酸；(4)由二氢乳清酸还原酶(PyrD)催化二氢乳清酸氧化生成乳清酸(orotate) (5)乳清酸经由乳清酸磷酸核糖转移酶(PyrE)催化合成乳清酸核苷酸(OMP)；(6)最后乳清酸单核苷酸脱羧酶(PyrF)催化OMP脱羧生成尿苷单核苷酸(UMP)。
为了让细胞可以积累足够多的乳清酸，1)对细胞中利用乳清酸的酶PyrE的编码基因进行阻断或敲除，这样乳清酸就不能继续代谢；2)对乳清酸的合成产物乳清酸核苷单磷酸OMP的下游利用基因pyrF进行阻断或敲除，由于细胞无法积累OMP，因此乳清酸会进行积累。
3增强细胞中乳清酸合成的代谢流
将利用乳清酸或乳清酸核苷单磷酸OMP的酶的编码基因阻断或敲除后，菌株在丰
富培养基或者添加尿嘧啶或胞苷的基础培养基可以继续生长，还能积累一定量的乳清酸，因此在此菌株上将嘧啶合成代谢路径的4个酶(氨基甲酰磷酸合成酶CarA/B、氨甲酰基转移酶PyrB、二氢乳清酸酶PyrC、二氢乳清酸还原酶PyrD)进行共表达，增强乳清酸合成的代谢流，进一步提高乳清酸的产量。
附图说明：
图1为大肠杆菌嘧啶合成途径示意图；
图2-3为乳清酸及其生产过程中副产物的HPLC检测图谱；
其中：carbamoyl phosphate：氨基甲酰磷酸；carbamoyl aspartate：氨甲酰天冬氨酸；dihydro orotate：二氢乳清酸；orotate：乳清酸盐；OMP：乳清酸-5 '-单磷酸；UMP：尿苷-5 '-单磷酸；CarA/B：氨基甲酰磷酸合成酶；PyrB：天冬氨酸氨甲酰基转移酶(催化亚基)；PyrI：天冬氨酸氨甲酰基转移酶(调控序列)；PyrC：二氢乳清酸酶；PyrD：二氢乳清酸还原酶；PyrE：乳清酸磷酸核糖转移酶；PyrF：尿苷-5’磷酸脱羧酶。
具体实施方式
下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。
本发明的技术方案可以应用大肠杆菌，枯草杆菌，谷氨酸棒杆菌，乳杆菌或者其他的微生物，下面以大肠杆菌为例，对技术方案进行进一步说明。
实施例1在大肠杆菌中基因敲除的方法
本发明采用Datsenko的方法在大肠杆菌中进行基因敲除(Datsenko 2000 .ProcNatl Acad Sci USA ,97(12):6640-6645)，相应的基因敲除引物见Baba 2006 .Mol SystBiol ,2(1)0008。
实施例2摇瓶发酵验证重组菌株的方法
验证重组菌株在摇瓶发酵中生产乳清酸的发酵培养基，具体为每升培养基中YC溶液100ml，5倍的盐溶液200ml，TM2溶液1ml，柠檬酸铁10mg，无水硫酸镁120mg，氯化钙111mg，硫胺素1ug，以去离子水定容，其中YC溶液为甘油2g，蛋白胨0.6g，酵母粉0.2g，去离子水100ml；5倍的盐溶液含有磷酸氢二钠30g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵5.0g，以去离子水定容至1L；TM2溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100ml，以离子水定容至1L。上面溶液灭菌为115℃，20-30分钟。对于嘧啶缺陷型菌株在发发酵培养基中补加尿嘧啶或者胞苷20mg/L。
摇瓶发酵过程如下：首先接种重组菌株至含有抗生素的LB培养基(著[美]J .莎姆布鲁克黄培堂译 ,子克隆指南2002，1595)中，置34℃摇床中，250rpm培养过夜；取过夜种子200μl转移到至2ml含有抗生素的LB，于34℃摇床中，250rpm培养5小时至OD600值为1左右；随后将2ml二级种子全部转入装有18ml发酵培养基M11的摇瓶中，置34℃摇床中，250rpm培养4-6小时，添加IPTG至终浓度0 .1mM后，继续培养20小时左右，取1毫升的发酵液离心后(7000rmp，4分钟)，取上清检测，检测方法见实施例3。
实施例3 5L发酵罐验证重组菌株生产乳清酸的方法
验证重组菌株在发酵罐中发酵生产乳清酸的发酵培养基，具体为每升培养基中含硫酸铵10g，氯化钠10g，磷酸二氢钾5g，七水硫酸镁1g，葡萄糖50g，氯化钙105mg，氯化锌10mg，TM3微量元素溶液1mL，柠檬酸铁94mg，酵母膏5g，玉米浆20g，胞苷0.04g，以去离子水定容。其中TM3微量元素溶液为氯化锌1.31g，氯化钙1.01g，四水合钼酸铵1.18g，硫酸铜3.9g，一水硫酸锰7.5g盐酸10mL，以去离子水定容。补料培养基为每升含葡萄糖500g。
发酵工艺如下：首先准备种子，从LB平板上挑取单克隆到含有抗生素的LB试管37℃过夜培养，按接种量2％接入装100mL LB的500mL摇瓶，37℃培养4小时，OD至1.5～2；以接种量5％接种至装有2L发酵培养基的5L发酵罐，37℃培养，用氨水控制pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30％。等到溶氧反弹开始固定转速设置溶氧偶联补料，使溶氧维持在30％-45％波动。发酵6小时，OD600至8～12时，降低温度至35℃，加入IPTG，使其终浓度为0.5mmol/L进行诱导，发酵24h开始检测，根据菌株状态的产量变化判断，检测方法见实例4。
实施例4 HPLC测定发酵液中的乳清酸和相关副产物
吸取1ml发酵液于2ml离心管中，100℃加热5分钟，冷却至室温，稀释一定的倍数，离心过0.22μm的滤膜，用高效液相色谱(HPLC)检测，HPLC的参数如下：采用Agilent SB C184.6*150mm 5μm，流动相为甲醇和10mM PBS(pH4 .0)，流动相比例0.01-2.80分钟甲醇比例为2％，2.80-3.50分钟甲醇比例由2％上升到10％，3.50-3.60分钟甲醇比例由10％降至2％，3.60-8.5分钟甲醇比例为2％，利用紫外检测器检，测波长260nm；初始流动相的流速为1.0mL/min，发酵液的上样量为5μL，柱温30℃。
实施例5过表达膜蛋白基因yfcJ可提高细胞中乳清酸的积累
由于大肠杆菌W3110和MG1655等为嘧啶饥饿型，即在无尿嘧啶的培养基中生长速度会降低10％-15％。主要原因是：在上述菌种中，因为乳清酸核糖磷酸转移酶基因pyrE上游rph基因的移码导致乳清酸核糖磷酸转移酶PyrE的表达不足，从而造成乳清酸磷酸化乳清酸单磷酸的速度较慢，导致宿主菌中会有极少量的乳清酸积累。
本发明发现转运蛋白基因yfcJ的过表达可以使细胞积累较多的乳清酸。我们构建过表达乳清酸转运蛋白的菌株，首先构建过表达此基因的质粒pTR44：以W3110基因组为模板，利用引物对pTR41-F/pTR41-R扩增yfcJ基因片段(表1)，得到的片段回收后与NcoI-XhoI酶切的载体pEZ07 (载体pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3中)进行无缝克隆(GBclonart无缝克隆试剂盒，苏州神洲基因有限公司)，转化宿主TG1，通过菌液PCR和酶切验证构建成功表达质粒pEZ07-yfcJ，编号pTR41，其中，乳清酸转运蛋白的基因序列是SEQID NO 1，乳清酸转运蛋白的氨基酸序列是SEQ ID NO 2，然后转化宿主W3110进行摇瓶发酵。
结果显示，未进行基因改造的饥饿型大肠杆菌中过表达YfcJ转运蛋白后有明显的乳清酸积累。重组菌株W3110/pTR41，即表达yfcJ基因的重组菌株产生检测到350mg/L的乳清酸，对照菌株W3110/pEZ07中只有15mg/L左右的乳清酸。现有文献中对yfcJ基因及其编码蛋白的功能研究很少，本发明发现YfcJ和乳清酸的分泌有关，其过表达有助于细胞分泌乳清酸，提高乳清酸的产量。
表1 pTR41构建引物设计
Figure 210899DEST_PATH_IMAGE001
实施例6pyrE或pyrF敲除菌株生产乳清酸
嘧啶核苷酸的合成是先合成嘧啶环，然后再与磷酸核糖相连而成的。见图1所示，嘧啶合成途径主要由6步催化合成：(1)由氨基甲酰磷酸合成酶(CarAB)催化HCO3 -与谷氨酰胺缩合生成氨基甲酰磷酸(carbamoyl phosphate)；(2)由天冬氨酸氨基甲酰转移酶(PyrB)催化天冬氨酸与氨基甲酰磷酸生成氨基甲酰天冬氨酸(carbamoyl aspartate)；(3)由二氢乳清酸酶(PyrC)催化氨基甲酰天冬氨酸脱水、分子内重排形成具有嘧啶环的二氢乳清酸；(4)由二氢乳清酸还原酶(PyrD)催化二氢乳清酸氧化生成乳清酸(orotate)；(5)乳清酸经由乳清酸磷酸核糖转移酶(PyrE)催化合成乳清酸核苷酸(OMP)；(6)最后乳清酸单核苷酸脱羧酶(PyrF)催化OMP脱羧生成尿苷单核苷酸(UMP)。
参照实施例1在大肠杆菌W3110基础上敲除pyrF基因得到菌株LH03K(即W3110△pyrF：：kan-FRT)，此菌株参照实施例2进行摇瓶发酵，如图2所示，不仅可以得到360mg/L的乳清酸，而且还检测到一定量乳清苷；在此菌株基础上表达促进乳清酸分泌的转运蛋白，菌种LH03K/pTR41生产的乳清酸可以达到400mg/L，但是也有少量的乳清苷。
由于pyrF敲除有乳清苷的积累，可能会影响后期纯化，因此参照实施例1，在大肠杆菌W3110基础上敲除pyrE基因得到菌株LH04K(即W3110△pyrE：：kan-FRT)，此菌株参照实施例2进行摇瓶发酵，如图3所示，乳清酸产量380mg/L，而且没有检测到乳清苷；在此菌株基础上进一步表达质粒pTR41，乳清酸产量高达560mg/L。
实施例7purR敲除菌株有助于提高乳清酸产量
嘧啶核苷酸合成途径催化第一步由氨基甲酰磷酸合成酶催化合成氨基甲酰磷酸。该酶的编码基因 ca r A B分别受到代谢终产物嘌呤、嘧啶以及精氨酸的反馈阻遏作用(Devroede N2006 ,JBacteriol .188(9):3236-45 .)，相应阻遏蛋白分别为PurR、PepA、ArgR (Kim2015 .Microb Cell Fact 14:98)，在其他核苷类项目研究中发现通过对阻遏蛋白编码的基因purR的敲除，可以解除CarAB的转录的抑制，加快氨基甲酰磷酸合成。
参照实施例1，在重组菌株LH04(即W3110△pyrE)菌株基础上敲除purR基因，得到菌株LH05K(即LH04△purR：：kanFRT)。将LH04和LH05K菌株参照实施例2进行摇瓶发酵，LH04菌株OD为2.45，乳清酸产量390mg/L，LH05K菌株OD为3.5左右，乳清酸产量达到680mg/L，说明purR敲除不仅可以有利于重组菌种的生长，还能进一步提高乳清酸产量。
实施例8通过超表达表达嘧啶合成路径基因提高乳清酸产量
乳清酸是嘧啶核苷酸合成途径的中间产物，为了进一步提高乳清酸产量，可以考虑将其上游编码基因进行串联共表达，进一步提高嘧啶合成途径通量，提高乳清酸的产量。
例如，将参与乳清酸从头合成路径中的一系列基因如氨基甲酰磷酸合成酶基因(carAB)、天冬氨酸氨基甲酰转移酶基因(pyrB)、二氢乳清酸酶基因(pyrC)以及二氢乳清酸还原酶基因(pyrD)进行串联共表达，构建得到质粒pW10，参与乳清酸合成的酶的基因操纵子表达质粒序列是SEQ ID NO 3。天冬氨酸氨基甲酰转移酶由一个起调控作用的亚基(PyrI)和一个起催化亚基(PyrB)组成，在CTP浓度高的时候，CTP会结合PyrI从而降低酶的活性。因此pyrI不表达可以解除终产物CTP对其的反馈抑制作用(Coudray L 2009 ,BioorgMed Chem .17(22):7680-9)。
将质粒pW10转化宿主LH03K、LH04K和LH05K后参照实施例2进行摇瓶发酵，结果显示，乳清酸产量大幅提高，重组菌株LH03K/pW10乳清酸产量达到了1.88g/L，LH04K/pW10乳清酸产量达到了1.8g/L，LH05K/pW10重组菌株乳清酸高达2.2g/L，说明嘧啶合成路径基因的超表达可以有效提高乳清酸的产量。
将上述菌株进行5L发酵罐上罐检测，重组菌株LH03K/pW10发酵48h乳清酸产量可达110g/L，但是有少量乳清苷积累，可能会影响后期纯化；重组菌株LH04K/pW10发酵48h乳清酸产量可达105g/L，无乳清苷积累；重组菌株LH05K/pW10发酵48h乳清酸产量可达123g/L。
其中，重组菌株LH03K/pW10，重新编号为LH03K10，其分类命名为大肠埃希氏菌
(Escherichia coli.)，该菌株已于2019年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC No .18250。
以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司
<120> 生产乳清酸的重组微生物及方法
<130> 2019.9
<141> 2019-09-18
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
gtatcgatta aataaggagg aataaaccat gactgctgta agccaaaccg 50
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cttcgaattc ccatatggta ccttaacccc gacgaaatga cagtatc 47
<210> 3
<211> 1179
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgactgctg taagccaaac cgaaacacga tcttctgcca atttttcgct cttccgcatc 60
gcttttgcgg tttttctcac ctacatgacc gtagggttgc cgttgccggt tatcccgctg 120
tttgttcatc atgaactggg ctatggcaat accatggtcg gcattgccgt cgggattcag 180
tttctggcta cggtgctgac gcgtggttac gccgggcgac tggccgatca atatggtgca 240
aaacgttcgg cgcttcaggg aatgttagct tgtggtctgg ctggcggcgc gttgctgctg 300
gcggcgattt tgcctgtctc cgcaccgttc aaatttgctc tgttggtcgt cgggcgtttg 360
attcttggct ttggtgaaag ccagttactg acaggcgctc tgacctgggg actaggcatc 420
gtagggccaa aacactctgg caaagtgatg tcatggaacg gaatggcgat ttacggtgcc 480
ctcgctgttg gtgctccgct tggcctgttg attcatagcc attacggttt tgccgcactg 540
gcgatcacca caatggtatt acccgtactg gcgtgggcct gtaacggcac agtgcgcaaa 600
gtaccggccc tggcgggaga acgtccatcg ctgtggagcg ttgtcgggct tatctggaaa 660
ccagggttag gtctggcact acaaggcgtt ggttttgctg ttatcgggac tttcgtttcg 720
ctctactttg ccagcaaagg atgggcgatg gcgggcttta ctcttaccgc gtttggcggc 780
gcatttgtcg tgatgcgcgt catgtttggc tggatgccgg accgttttgg cggcgtgaaa 840
gtggcgattg tctctctgct tgtagaaacg gtgggcttgt tgctgctctg gcaagcccca 900
ggtgcatggg tcgcattagc gggcgcggcg ttaaccggag ccggatgttc gcttatcttt 960
cctgcgctgg gcgtggaggt ggttaaacgc gtcccctcac aagttcgcgg caccgcactg 1020
ggcggttacg ccgcgtttca ggatatcgcc ctcggcgtct ccgggccgct ggcgggaatg 1080
ctggcgacca cgtttggtta ctcttcggta tttcttgccg gggcgatctc tgcggtgctg 1140
ggtattattg tcacgatact gtcatttcgt cggggttaa 1179
<210> 4
<211> 392
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Met Thr Ala Val Ser Gln Thr Glu Thr Arg Ser Ser Ala Asn Phe Ser
1 5 10 15
Leu Phe Arg Ile Ala Phe Ala Val Phe Leu Thr Tyr Met Thr Val Gly
20 25 30
Leu Pro Leu Pro Val Ile Pro Leu Phe Val His His Glu Leu Gly Tyr
35 40 45
Gly Asn Thr Met Val Gly Ile Ala Val Gly Ile Gln Phe Leu Ala Thr
50 55 60
Val Leu Thr Arg Gly Tyr Ala Gly Arg Leu Ala Asp Gln Tyr Gly Ala
65 70 75 80
Lys Arg Ser Ala Leu Gln Gly Met Leu Ala Cys Gly Leu Ala Gly Gly
85 90 95
Ala Leu Leu Leu Ala Ala Ile Leu Pro Val Ser Ala Pro Phe Lys Phe
100 105 110
Ala Leu Leu Val Val Gly Arg Leu Ile Leu Gly Phe Gly Glu Ser Gln
115 120 125
Leu Leu Thr Gly Ala Leu Thr Trp Gly Leu Gly Ile Val Gly Pro Lys
130 135 140
His Ser Gly Lys Val Met Ser Trp Asn Gly Met Ala Ile Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Ala Val Gly Ala Pro Leu Gly Leu Leu Ile His Ser His Tyr Gly
165 170 175
Phe Ala Ala Leu Ala Ile Thr Thr Met Val Leu Pro Val Leu Ala Trp
180 185 190
Ala Cys Asn Gly Thr Val Arg Lys Val Pro Ala Leu Ala Gly Glu Arg
195 200 205
Pro Ser Leu Trp Ser Val Val Gly Leu Ile Trp Lys Pro Gly Leu Gly
210 215 220
Leu Ala Leu Gln Gly Val Gly Phe Ala Val Ile Gly Thr Phe Val Ser
225 230 235 240
Leu Tyr Phe Ala Ser Lys Gly Trp Ala Met Ala Gly Phe Thr Leu Thr
245 250 255
Ala Phe Gly Gly Ala Phe Val Val Met Arg Val Met Phe Gly Trp Met
260 265 270
Pro Asp Arg Phe Gly Gly Val Lys Val Ala Ile Val Ser Leu Leu Val
275 280 285
Glu Thr Val Gly Leu Leu Leu Leu Trp Gln Ala Pro Gly Ala Trp Val
290 295 300
Ala Leu Ala Gly Ala Ala Leu Thr Gly Ala Gly Cys Ser Leu Ile Phe
305 310 315 320
Pro Ala Leu Gly Val Glu Val Val Lys Arg Val Pro Ser Gln Val Arg
325 330 335
Gly Thr Ala Leu Gly Gly Tyr Ala Ala Phe Gln Asp Ile Ala Leu Gly
340 345 350
Val Ser Gly Pro Leu Ala Gly Met Leu Ala Thr Thr Phe Gly Tyr Ser
355 360 365
Ser Val Phe Leu Ala Gly Ala Ile Ser Ala Val Leu Gly Ile Ile Val
370 375 380
Thr Ile Leu Ser Phe Arg Arg Gly
385 390
<210> 5
<211> 12206
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtaa gttagcgcga 60
attgatctgg tttgacagct tatcatcgac tgcacggtgc accaatgctt ctggcgtcag 120
gcagccatcg gaagctgtgg tatggctgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc 180
gctcaaggcg cactcccgtt ctggataatg ttttttgcgc cgacatcata acggttctgg 240
caaatattct gaaatgagct gttgacaatt aatcatccgg ctcgtataat gtgtggaatt 300
gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agcgccgctg agaaaaagcg aagcggcact 360
gctctttaac aatttatcag acaatctgtg tgggcactcg accggaatta tcgattaact 420
ttattattaa aaattaaaga ggtatatatt aatgtatcga ttaaataagg aggaataaac 480
catgattaag tcagcgctat tggttctgga agacggaacc cagtttcacg gtcgggccat 540
aggggcaaca ggttcggcgg ttggggaagt cgttttcaat acttcaatga ccggttatca 600
agaaatcctc actgatcctt cctattctcg tcaaatcgtt actcttactt atccccatat 660
tggcaatgtc ggcaccaatg acgccgatga agaatcttct caggtacatg cacaaggtct 720
ggtgattcgc gacctgccgc tgattgccag caacttccgt aataccgaag acctctcttc 780
ttacctgaaa cgccataaca tcgtggcgat tgccgatatc gatacccgta agctgacgcg 840
tttactgcgc gagaaaggcg cacagaatgg ctgcattatc gcgggcgata acccggatgc 900
ggcgctggcg ttagaaaaag cccgcgcgtt cccaggtctg aatggcatgg atctggcaaa 960
agaagtgacc accgcagaag cctatagctg gacacaaggg agctggacgt tgaccggtgg 1020
cctgccagaa gcgaaaaaag aagacgagct gccgttccac gtcgtggctt atgattttgg 1080
tgccaagcgc aacatcctgc ggatgctggt ggatagaggc tgtcgcctga ccatcgttcc 1140
ggcgcaaact tctgcggaag atgtgctgaa aatgaatcca gacggcatct tcctctccaa 1200
cggtcctggc gacccggccc cgtgcgatta cgccattacc gccatccaga aattcctcga 1260
aaccgatatt ccggtattcg gcatctgtct cggtcatcag ctgctggcgc tggcgagcgg 1320
tgcgaagact gtcaaaatga aatttggtca ccacggcggc aaccatccgg ttaaagatgt 1380
ggagaaaaac gtggtaatga tcaccgccca gaaccacggt tttgcggtgg acgaagcaac 1440
attacctgca aacctgcgtg tcacgcataa atccctgttc gacggtacgt tacagggcat 1500
tcatcgcacc gataaaccgg cattcagctt ccaggggcac cctgaagcca gccctggtcc 1560
acacgacgcc gcgccgttgt tcgaccactt tatcgagtta attgagcagt accgtaaaac 1620
cgctaagtaa tcaggagtaa aagagccatg ccaaaacgta cagatataaa aagtatcctg 1680
attctgggtg cgggcccgat tgttatcggt caggcgtgtg agtttgacta ctctggcgcg 1740
caagcgtgta aagccctgcg tgaagagggt taccgcgtca ttctggtgaa ctccaacccg 1800
gcgaccatca tgaccgaccc ggaaatggct gatgcaacct acatcgagcc gattcactgg 1860
gaagttgtac gcaagattat tgaaaaagag cgcccggacg cggtgctgcc aacgatgggc 1920
ggtcagacgg cgctgaactg cgcgctggag ctggaacgtc agggcgtgtt ggaagagttc 1980
ggtgtcacca tgattggtgc cactgccgat gcgattgata aagcagaaga ccgccgtcgt 2040
ttcgacgtag cgatgaagaa aattggtctg gaaaccgcgc gttccggtat cgcacacacg 2100
atggaagaag cgctggcggt tgccgctgac gtgggcttcc cgtgcattat tcgcccatcc 2160
tttaccatgg gcggtagcgg cggcggtatc gcttataacc gtgaagagtt tgaagaaatt 2220
tgcgcccgcg gtctggatct ctctccgacc aaagagttgc tgattgatga gtcgctgatc 2280
ggctggaaag agtacgagat ggaagtggtg cgtgataaaa acgacaactg catcatcgtc 2340
tgctctatcg aaaacttcga tgcgatgggc atccacaccg gtgactccat cactgtcgcg 2400
ccagcccaaa cgctgaccga caaagaatat caaatcatgc gtaacgcctc gatggcggtg 2460
ctgcgtgaaa tcggcgttga aaccggtggt tccaacgttc agtttgcggt gaacccgaaa 2520
aacggtcgtc tgattgttat cgaaatgaac ccacgcgtgt cccgttcttc ggcgctggcg 2580
tcgaaagcga ccggtttccc gattgctaaa gtggcggcga aactggcggt gggttacacc 2640
ctcgacgaac tgatgaacga catcactggc ggacgtactc cggcctcctt cgagccgtcc 2700
atcgactatg tggttactaa aattcctcgc ttcaacttcg aaaaattcgc cggtgctaac 2760
gaccgtctga ccactcagat gaaatcggtt ggcgaagtga tggcgattgg tcgcacgcag 2820
caggaatccc tgcaaaaagc gctgcgcggc ctggaagtcg gtgcgactgg attcgacccg 2880
aaagtgagcc tggatgaccc ggaagcgtta accaaaatcc gtcgcgaact gaaagacgca 2940
ggcgcagatc gtatctggta catcgccgat gcgttccgtg cgggcctgtc tgtggacggc 3000
gtcttcaacc tgaccaacat tgaccgctgg ttcctggtac agattgaaga gctggtgcgt 3060
ctggaagaga aagtggcgga agtgggcatc actggcctga acgctgactt cctgcgccag 3120
ctgaaacgca aaggctttgc cgatgcgcgc ttggcaaaac tggcgggcgt acgcgaagcg 3180
gaaatccgta agctgcgtga ccagtatgac ctgcacccgg tttataagcg cgtggatacc 3240
tgtgcggcag agttcgccac cgacaccgct tacatgtact ccacttatga agaagagtgc 3300
gaagcgaatc cgtctaccga ccgtgaaaaa atcatggtgc ttggcggcgg cccgaaccgt 3360
atcggtcagg gtatcgaatt cgactactgt tgcgtacacg cctcgctggc gctgcgcgaa 3420
gacggttacg aaaccattat ggttaactgt aacccggaaa ccgtctccac cgactacgac 3480
acttccgacc gcctctactt cgagccggta actctggaag atgtgctgga aatcgtgcgt 3540
atcgagaagc cgaaaggcgt tatcgtccag tacggcggtc agaccccgct gaaactggcg 3600
cgcgcgctgg aagctgctgg cgtaccggtt atcggcacca gcccggatgc tatcgaccgt 3660
gcagaagacc gtgaacgctt ccagcatgcg gttgagcgtc tgaaactgaa acaaccggcg 3720
aacgccaccg ttaccgctat tgaaatggcg gtagagaagg cgaaagagat tggctacccg 3780
ctggtggtac gtccgtctta cgttctcggc ggtcgggcga tggaaatcgt ctatgacgaa 3840
gctgacctgc gtcgctactt ccagacggcg gtcagcgtgt ctaacgatgc gccagtgttg 3900
ctggaccact tcctcgatga cgcggtagaa gttgacgtgg atgccatctg cgacggcgaa 3960
atggtgctga ttggcggcat catggagcat attgagcagg cgggcgtgca ctccggtgac 4020
tccgcatgtt ctctgccagc ctacacctta agtcaggaaa ttcaggatgt gatgcgccag 4080
caggtgcaga aactggcctt cgaattgcag gtgcgcggcc tgatgaacgt gcagtttgcg 4140
gtgaaaaaca acgaagtcta cctgattgaa gttaacccgc gtgcggcgcg taccgttccg 4200
ttcgtctcca aagccaccgg cgtaccgctg gcaaaagtgg cggcgcgcgt gatggctggc 4260
aaatcgctgg ctgagcaggg cgtaaccaaa gaagttatcc cgccgtacta ctcggtgaaa 4320
gaagtggtgc tgccgttcaa taaattcccg ggcgttgacc cgctgttagg gccagaaatg 4380
cgctctaccg gggaagtcat gggcgtgggc cgcaccttcg ctgaagcgtt tgccaaagcg 4440
cagctgggca gcaactccac catgaagaaa cacggtcgtg cgctgctttc cgtgcgcgaa 4500
ggcgataaag aacgcgtggt ggacctggcg gcaaaactgc tgaaacaggg cttcgagctg 4560
gatgcgaccc acggcacggc gattgtgctg ggcgaagcag gtatcaaccc gcgtctggta 4620
aacaaggtgc atgaaggccg tccgcacatt caggaccgta tcaagaatgg cgaatatacc 4680
tacatcatca acaccacctc aggccgtcgt gcgattgaag actcccgcgt gattcgtcgc 4740
agtgcgctgc aatataaagt gcattacgac accaccctga acggcggctt tgccaccgcg 4800
atggcgctga atgccgatgc gactgaaaaa gtaatttcgg tgcaggaaat gcacgcacag 4860
atcaaataat cggatccttt agcgttaaga aggagatata tatggctaat ccgctatatc 4920
agaaacatat catttccata aacgacctta gtcgcgatga ccttaatctg gtgctggcga 4980
cagcggcgaa actgaaagca aacccgcaac cagagctgtt gaagcacaaa gtcattgcca 5040
gctgtttctt cgaagcctct acccgtaccc gcctctcttt cgaaacatct atgcaccgcc 5100
tgggggccag cgtggtgggc ttctccgaca gcgccaatac atcactgggt aaaaagggcg 5160
aaacgctggc cgataccatt tcggttatca gcacttacgt cgatgcgata gtgatgcgtc 5220
atccgcagga aggtgcggcg cgcctggcca ccgagttttc cggcaatgta ccggtactga 5280
atgccggtga tggctccaac caacatccga cgcaaacctt gctggactta ttcactattc 5340
aggaaaccca ggggcgtctg gacaatctcc acgtcgcaat ggttggtgac ctgaaatatg 5400
gccgcaccgt tcactccctg actcaggcgt tagcgaagtt cgacggcaac cgtttttact 5460
tcatcgcgcc ggacgcgctg gcaatgccgc aatacattct ggatatgctc gatgaaaaag 5520
ggatcgcatg gagtctgcac agctctattg aagaagtgat ggcggaagta gacatcctgt 5580
acatgacccg cgtgcaaaaa gagcgtctgg acccgtccga gtacgccaac gtgaaagcgc 5640
agtttgttct tcgcgccagc gatctccaca acgccaaagc caatatgaaa gtgctgcatc 5700
cgctgccgcg tgttgatgag attgcgacgg atgttgataa aacgccacac gcctggtact 5760
tccagcaggc aggcaacggg attttcgctc gccaggcgtt actggcactg gttctgaatc 5820
gcgatctggt actgtaagct tctaaggaaa taataggaga ttgaaaatga ctgcaccatc 5880
ccaggtatta aagatccgcc gcccagacga ctggcacctt cacctccgcg atggcgacat 5940
gttaaaaact gtcgtgccat ataccagcga aatttatgga cgggctatcg taatgcccaa 6000
tctggctccg cccgtgacca ccgttgaggc tgccgtggcg tatcgccagc gtattcttga 6060
cgccgtacct gccgggcacg atttcacccc attgatgacc tgttatttaa cagattcgct 6120
ggatcctaat gagctggagc gcggatttaa cgaaggcgtg ttcaccgctg caaaacttta 6180
cccggcaaac gcaaccacta actccagcca cggcgtgacg tcaattgacg caatcatgcc 6240
ggtacttgag cgcatggaaa aaatcggtat gccgctactg gtgcatggtg aagtgacaca 6300
tgcagatatc gacatttttg atcgtgaagc gcgctttata gaaagcgtga tggaacctct 6360
gcgccagcgc ctgactgcgc tgaaagtcgt ttttgagcac atcaccacca aagatgctgc 6420
cgactatgtc cgtgacggaa atgaacggct ggctgccacc atcactccgc agcatctgat 6480
gtttaaccgc aaccatatgc tggttggagg cgtgcgtccg cacctgtatt gtctacccat 6540
cctcaaacgt aatattcacc aacaggcatt gcgtgaactg gtcgccagcg gttttaatcg 6600
agtattcctc ggtacggatt ctgcgccaca tgcacgtcat cgcaaagaga gcagttgcgg 6660
ctgcgcgggc tgcttcaacg ccccaaccgc gctgggcagt tacgctaccg tctttgaaga 6720
aatgaatgct ttgcagcact ttgaagcatt ctgttctgta aacggcccgc agttctatgg 6780
gttgccggtc aacgacacat tcatcgaact ggtacgtgaa gagcaacagg ttgctgaaag 6840
catcgcactg actgatgaca cgctggtgcc attcctcgcc ggggaaacgg tacgctggtc 6900
cgttaaacaa taactaaaat tcagttagga ggtatttgat gtactacccc ttcgttcgta 6960
aagccctttt ccagctcgat ccagagcgcg ctcatgagtt tacttttcag caattacgcc 7020
gtattacagg aacgccgttt gaagcactgg tgcggcagaa agtgcctgcg aaacctgtta 7080
actgcatggg cctgacgttt aaaaatccgc ttggtctggc agccggtctt gataaagacg 7140
gggagtgcat tgacgcgtta ggcgcgatgg gatttggatc gatcgagatc ggtaccgtca 7200
cgccacgtcc acagccaggt aatgacaagc cgcgtctctt tcgtctggta gatgccgaag 7260
gtttgatcaa ccgtatgggc tttaataatc ttggcgttga taacctcgta gagaacgtaa 7320
aaaaggccca ttatgacggc gtcctgggta ttaacatcgg caaaaataaa gatacgccag 7380
tggagcaggg caaagatgac tatctgattt gtatggaaaa aatctatgcc tatgcgggat 7440
atatcgccat caatatttca tcgccgaata ccccaggatt acgcacgctg caatatggtg 7500
aagcgctgga tgatctctta accgcgatta aaaataagca aaatgatttg caagcgatgc 7560
accataaata tgtgccgatc gcagtgaaga tcgcgccgga tctttctgaa gaagaattga 7620
tccaggttgc cgatagttta gttcgccata atattgatgg cgttattgca accaatacca 7680
cactcgatcg ttctcttgtt cagggaatga aaaattgcga tcaaaccggt ggcttaagtg 7740
gtcgtccgct tcagttaaaa agcaccgaaa ttattcgccg cttgtcactg gaattaaacg 7800
gtcgcttacc gatcatcggt gttggcggca tcgactcggt tatcgctgcg cgtgaaaaga 7860
ttgctgcggg tgcctcactg gtgcaaattt attctggttt tatttttaaa ggtccgccgc 7920
tgattaaaga aatcgttacc catatctaac tcgagaattc gaagcttggg cccgaacaaa 7980
aactcatctc agaagaggat ctgaatagcg ccgtcgacca tcatcatcat catcattgag 8040
tttaaacggt ctccagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca 8100
gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc 8160
ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag 8220
tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc 8280
agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgacgc 8340
ctgatgcggt attttctcct tacgcatcta gacggtattt cacaccgcat atggtgcact 8400
ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 8460
gctgacgagc ttagtaaagc cctcgctaga ttttaatgcg gatgttgcga ttacttcgcc 8520
aactattgcg ataacaagaa aaagccagcc tttcatgata tatctcccaa tttgtgtagg 8580
gcttattatg cacgcttaaa aataataaaa gcagacttga cctgatagtt tggctgtgag 8640
caattatgtg cttagtgcat ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc 8700
ttgaacgaat tgttagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt 8760
ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat 8820
aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc 8880
agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg 8940
acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg 9000
ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat cctgttcagg aaccggatca aagagttcct 9060
ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca 9120
gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt 9180
ctccaaattg cagttcgcgc ttagctggat aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa 9240
caatggtgac ttctacagcg cggagaatct cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca 9300
aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca 9360
gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta 9420
cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct cgatgacgcc aactacctct gatagttgag 9480
tcgatacttc ggcgatcacc gcttccctca tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc 9540
cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg 9600
cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact gtaccccaaa aaaacagtca taacaagcca 9660
tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc tgcgttcggt caaggttctg gaccagttgc 9720
gtgagcgcat acgctacttg cattacagct tacgaaccga acaggcttat gtccactggg 9780
ttcgtgcctt catccgtttc cacggtgtgc gtcacccggc aaccttgggc agcagcgaag 9840
tcgaggcatt tctgtcctgg ctggcgaacg agcgcaaggt ttcggtctcc acgcatcgtc 9900
aggcattggc ggccttgctg ttcttctacg gcaaggtgct gtgcacggat ctgccctggc 9960
ttcaggagat cggaagacct cggccgtcgc ggcgcttgcc ggtggtgctg accccggatg 10020
aagtggttcg catcctcggt tttctggaag gcgagcatcg tttgttcgcc cagcttctgt 10080
atggaacggg catgcggatc agtgagggtt tgcaactgcg ggtcaaggat ctggatttcg 10140
atcacggcac gatcatcgtg cgggagggca agggctccaa ggatcgggcc ttgatgttac 10200
ccgagagctt ggcacccagc ctgcgcgagc aggggaatta attcccacgg gttttgctgc 10260
ccgcaaacgg gctgttctgg tgttgctagt ttgttatcag aatcgcagat ccggcttcag 10320
ccggtttgcc ggctgaaagc gctatttctt ccagaattgc catgattttt tccccacggg 10380
aggcgtcact ggctcccgtg ttgtcggcag ctttgattcg ataagcagca tcgcctgttt 10440
caggctgtct atgtgtgact gttgagctgt aacaagttgt ctcaggtgtt caatttcatg 10500
ttctagttgc tttgttttac tggtttcacc tgttctatta ggtgttacat gctgttcatc 10560
tgttacattg tcgatctgtt catggtgaac agctttgaat gcaccaaaaa ctcgtaaaag 10620
ctctgatgta tctatctttt ttacaccgtt ttcatctgtg catatggaca gttttccctt 10680
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tggttcgttg tttttgcgtg agccatgaga acgaaccatt gagatcatac ttactttgca 10860
tgtcactcaa aaattttgcc tcaaaactgg tgagctgaat ttttgcagtt aaagcatcgt 10920
gtagtgtttt tcttagtccg ttatgtaggt aggaatctga tgtaatggtt gttggtattt 10980
tgtcaccatt catttttatc tggttgttct caagttcggt tacgagatcc atttgtctat 11040
ctagttcaac ttggaaaatc aacgtatcag tcgggcggcc tcgcttatca accaccaatt 11100
tcatattgct gtaagtgttt aaatctttac ttattggttt caaaacccat tggttaagcc 11160
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tctctatatt tgccttgtga gttttctttt gtgttagttc ttttaataac cactcataaa 11280
tcctcataga gtatttgttt tcaaaagact taacatgttc cagattatat tttatgaatt 11340
tttttaactg gaaaagataa ggcaatatct cttcactaaa aactaattct aatttttcgc 11400
ttgagaactt ggcatagttt gtccactgga aaatctcaaa gcctttaacc aaaggattcc 11460
tgatttccac agttctcgtc atcagctctc tggttgcttt agctaataca ccataagcat 11520
tttccctact gatgttcatc atctgagcgt attggttata agtgaacgat accgtccgtt 11580
ctttccttgt agggttttca atcgtggggt tgagtagtgc cacacagcat aaaattagct 11640
tggtttcatg ctccgttaag tcatagcgac taatcgctag ttcatttgct ttgaaaacaa 11700
ctaattcaga catacatctc aattggtcta ggtgatttta atcactatac caattgagat 11760
gggctagtca atgataatta ctagtccttt tcctttgagt tgtgggtatc tgtaaattct 11820
gctagacctt tgctggaaaa cttgtaaatt ctgctagacc ctctgtaaat tccgctagac 11880
ctttgtgtgt tttttttgtt tatattcaag tggttataat ttatagaata aagaaagaat 11940
aaaaaaagat aaaaagaata gatcccagcc ctgtgtataa ctcactactt tagtcagttc 12000
cgcagtatta caaaaggatg tcgcaaacgc tgtttgctcc tctacaaaac agaccttaaa 12060
accctaaagg cgtcggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg 12120
tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa ttcgcgcgcg 12180
aaggcgaagc ggcatgcatt tacgtt 12206
<210> 6
<211> 3
<212> DNA
<213> 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
<400> 6

Claims (8)

1.生产乳清酸的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中过表达乳清酸转运蛋白YfcJ，其氨基酸序列为SEQ ID NO 2，所述的微生物为大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物中串联过表达参与乳清酸合成的酶，所述参与乳清酸合成的酶为氨基甲酰磷酸合成酶、天冬氨酸氨甲酰基转移酶、二氢乳清酸酶、二氢乳清酸还原酶。
3.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物缺失编码乳清酸磷酸核糖转移酶的基因或者缺失乳清酸苷单磷酸脱羧酶基因。
4.根据权利要求1所述的重组微生物，其特征在于：所述的重组微生物缺失编码氨基甲酰磷酸合成酶阻遏蛋白的基因purR和乳清酸磷酸核糖转移酶基因pyrE。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生产乳清酸的重组微生物，其特征在于：所述乳清酸转运蛋白的基因序列是SEQ ID NO 1。
6.根据权利要求2所述的生产乳清酸的重组微生物，其特征在于：所述参与乳清酸合成的酶的基因操纵子表达质粒的序列是SEQ ID NO 3。
7.根据权利要求1所述的生产乳清酸的重组微生物，其特征在于：乳清酸磷酸核糖转移酶或者乳清酸苷单磷酸脱羧酶的酶活低于野生型的菌种。
8.一种生产乳清酸的方法，其特征在于：通过权利要求1-7任一项所述的生产乳清酸的重组微生物经发酵，得到所述乳清酸。
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