发明内容
本发明的一个方面是提供属于肠肝菌科的细菌,其可以属于埃希氏菌属,更具体的,属于大肠杆菌物种,其已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。
本发明的另一个方面是提供了使用如后文所述的肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法,例如L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-瓜氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,L-鸟氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸或L-缬氨酸。
通过以下出乎意料的发现实现了这些目的,即在属于肠肝菌科的细菌中yajL基因的过表达对该微生物赋予更高的L-氨基酸生产率(productivity),如特别是但不限于,丙酮酸家族的L-氨基酸如L-缬氨酸,和芳香族L-氨基酸如L-苯丙氨酸,所述细菌可以属于埃希氏菌属,且更具体的,属于大肠杆菌物种。
本发明的一个方面是提供用于生产L-氨基酸的方法,包括:
(i)在培养基中培养肠杆菌科的产L-氨基酸的细菌,以在所述细菌中或所述培养基中,或所述培养基和所述细菌中生产L-氨基酸;和
(ii)从所述细菌或所述培养基,或从所述细菌和所述培养基收集所述L-氨基酸,
其中所述细菌已经以过表达yajL基因的方式进行了修饰。
本发明的进一步的方面提供了如上文所述的方法,其中所述细菌属于埃希氏菌属。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中所述细菌是大肠杆菌。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中通过增加yajL基因的拷贝数或修饰yajL基因的表达控制序列,使得与未修饰的细菌相比所述基因的表达增强来过表达yajL基因。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中所述L-氨基酸选自L-苯丙氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸,L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-瓜氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,L-鸟氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸和L-缬氨酸。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中所述L-氨基酸选自L-丙氨酸,L-异亮氨酸,L-缬氨酸和L-苯丙氨酸。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。
本发明的进一步方面提供了如上文所述的方法,其中所述L-氨基酸是L-缬氨酸。
发明详述
本发明在下面详细地描述。
1.细菌
短语“产L-氨基酸的细菌”可以表示当在培养基中培养该细菌时,具有产生,排泄(excrete)或分泌L-氨基酸,和/或引起L-氨基酸在培养基和/或细菌细胞中积累的能力的肠杆菌科细菌。
短语“产L-氨基酸的细菌”也可以表示与野生型或亲本菌株,例如大肠杆菌K-12相比能够以更大的量产生,排泄或分泌L-氨基酸,和/或引起L-氨基酸在培养基中积累的细菌,且也可以表示该微生物能够引起不少于0.5g/L或不少于1.0g/L量的目标L-氨基酸在培养基中积累。
短语“产L-氨基酸的能力”可以表示当在培养基中培养细菌时,所述细菌以下述水平产生,排泄或分泌L-氨基酸,和/或引起L-氨基酸在所述培养基或所述细菌细胞内积累的能力,所述水平使得可以从所述培养基或所述细菌细胞中收集L-氨基酸。
短语“L-氨基酸”可以表示L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-瓜氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,L-鸟氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸和L-缬氨酸。
短语“芳香族L-氨基酸”包括,例如L-苯丙氨酸,L-色氨酸和L-酪氨酸。由于L-组氨酸具有芳香族部分,如咪唑环,除了上述芳香族L-氨基酸之外,短语“芳香族L-氨基酸”也可以包括L-组氨酸。
短语“非芳香族L-氨基酸”包括,例如L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-瓜氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,L-鸟氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸和L-缬氨酸。由于芳香族氨基酸如L-苯丙氨酸,L-色氨酸和L-酪氨酸的合成途径与L-组氨酸的生物合成途径不同,除了上述非芳香族L-氨基酸之外,短语“非芳香族L-氨基酸”也可以包括L-组氨酸。
L-氨基酸可以属于一个或多个L-氨基酸家族。作为例子,L-氨基酸可以属于谷氨酸家族,包括L-精氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,和L-脯氨酸;丝氨酸家族,包括L-半胱氨酸,甘氨酸,和L-丝氨酸;天冬氨酸家族,包括L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-异亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,和L-苏氨酸;丙酮酸家族,包括L-丙氨酸,L-异亮氨酸,L-缬氨酸,和L-亮氨酸;且芳香族家族包括L-苯丙氨酸,L-色氨酸和L-酪氨酸。由于一些L-氨基酸可以是特定L-氨基酸的生物合成途径中的中间体氨基酸,上述氨基酸家族也可以包括其它L-氨基酸,例如非生蛋白性(non-proteinogenic)L-氨基酸。例如,L-瓜氨酸和L-鸟氨酸是来自精氨酸生物合成途径的氨基酸。因此,谷氨酸家族可以包括L-精氨酸,L-瓜氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,L-鸟氨酸,和L-脯氨酸。
L-精氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-赖氨酸,L-鸟氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸和L-缬氨酸是具体的例子。丙酮酸家族氨基酸如L-丙氨酸,L-异亮氨酸,L-缬氨酸,和L-亮氨酸是优选的例子。芳香族氨基酸如L-苯丙氨酸,L-色氨酸和L-酪氨酸仍是优选的例子。L-缬氨酸和L-苯丙氨酸是更优选的例子。
短语“L-氨基酸”不仅包括游离形式的L-氨基酸,而且还可以包括L-氨基酸的盐或水合物,或由L-氨基酸和另一种有机或无机化合物形成的加合物。
属于肠杆菌科的细菌可以来自肠杆菌属(Enterobacter),欧文氏菌属(Erwinia),埃希氏菌属,克雷伯氏菌属(Klebsiella),摩根氏菌属(Morganella),泛菌属,发光杆菌属(Photorhabdus),普罗威登斯菌属(Providencia),沙门氏菌属(Salmonella),耶尔森氏菌属(Yersinia)等等,并且可以具有产生L-氨基酸的能力。特别地,可以使用根据NCBI(国家生物技术信息中心)数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543)中使用的分类法归入肠杆菌科的那些细菌。可以修饰的来自肠肝菌科的菌株的例子包括埃希氏菌属,肠杆菌属,或泛菌属的细菌。
可以经修饰以获得依照本公开的主题的埃希氏菌属细菌的埃希氏菌属细菌菌株没有具体限制,并且特别地,可以使用Neidhardt等的工作中描述的那些菌株(Bachmann,B.J.,Derivations and genotypes of some mutant derivatives ofE.coli K-12,p.2460-2488.In F.C.Neidhardt et al.(ed.),E.coli and Salmonella:cellular and molecular biology,2nd ed.ASM Press,Washington,D.C.,1996)。大肠杆菌物种是具体的例子。大肠杆菌的具体例子包括大肠杆菌W3110(ATCC27325),大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等等,其来源于原型野生型菌株,大肠杆菌K-12菌株。这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(P.O.Box 1549,Manassas,VA 20108,United States ofAmerica)获得。也就是说,对于每个菌株给出了登记号,并且可以通过使用这些登记号订购菌株(参见http://www.atcc.org)。菌株的登记号列在美国典型培养物保藏中心的目录中。
肠杆菌属细菌的例子包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)等等。泛菌属细菌的例子包括菠萝泛菌(Pantoeaananatis)等等。基于16S rRNA的核苷酸序列分析等,成团肠杆菌的一些菌株最近重新分类为成团泛菌(Pantoea agglomerans),菠萝泛菌,或斯氏泛菌(Pantoea stewartii)。可以使用属于肠杆菌属或泛菌属的任一个的细菌,只要它是分类为肠杆菌科的细菌。当通过遗传工程技术培育菠萝泛菌时,可以使用菠萝泛菌AJ13355菌株(FERM BP-6614)、AJ13356菌株(FERM BP-6615)、AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生物。这些菌株当它们被分离时鉴定为成团肠杆菌,并且以成团肠杆菌保藏。然而,如上文所述,基于16S RNA的核苷酸测序等,它们最近重新分类为菠萝泛菌。
产L-氨基酸的细菌
可以使用属于肠杆菌科并以过表达yajL基因的方式修饰的细菌,其能够生产芳香族或非芳香族L-氨基酸。
所述细菌可以固有地具有产L-氨基酸的能力,或可以通过使用突变方法或DNA重组技术修饰以具有产L-氨基酸的能力。可以通过在固有地具有产L-氨基酸的能力的细菌中过表达yajL基因来获得所述细菌。或者,可以通过将产L-氨基酸的能力赋予已经使yajL基因过表达的细菌来获得所述细菌。
所述细菌可以单独或以两种或更多种L-氨基酸的混合物产生L-氨基酸。
产L-精氨酸的细菌
可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请No.2002/058315 A1)和其含有突变体N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(RU2215783),大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP 1170358A1),一种产精氨酸的菌株,向其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因(EP1170361A1)等等。
可以用于衍生产L-精氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基因:N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸还原酶(acetyl-γ-glutamylphosphatereductase,argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(ornithine acetyltransferase,argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(N-acetylglutamate kinase,argB)、N-乙酰鸟氨酸转氨酶(N-acetylornithine aminotransferase,argD)、鸟氨酸氨基甲酰转移酶(ornithinecarbamoyltransferase,argF)、精氨基琥珀酸合酶(argininosuccinate synthase,argG)、精氨基琥珀酸裂合酶(argininosuccinate lyase,argH),和氨甲酰磷酸合成酶(carbamoyl phosphate synthetase,carAB)。
产L-瓜氨酸的细菌
可以用于衍生产L-瓜氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌突变体N-乙酰谷氨酸合酶菌株237/pMADS11,237/pMADS12,和237/pMADS13(俄罗斯专利No.2215783,欧洲专利No.1170361B1,美国专利No.6,790,647B2),大肠杆菌333菌株(VKPM B-8084)和374菌株(VKPM B-8086),两者都含有突变体反馈抗性的氨甲酰磷酸合成酶(俄罗斯专利RU2264459C2),其中α-酮戊二酸合酶活性增加,并且铁氧还原蛋白NADP+还原酶,丙酮酸合酶,或α-酮戊二酸脱氢酶活性另外修饰的大肠杆菌菌株(EP 2133417A1),以及菠萝泛菌NA1sucAsdhA菌株,其中琥珀酸脱氢酶和α-酮戊二酸脱氢酶活性降低(美国专利申请No.2009286290)等等。
由于L-瓜氨酸是L-精氨酸生物合成途径的中间体,可以用于衍生产L-瓜氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括其中编码L-精氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达增强的菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以下酶的基因:N-乙酰谷氨酸合酶(argA)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、N-乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶(argE)、鸟氨酸氨甲酰转移酶(argF/I)、和氨甲酰磷酸合成酶(carAB),或其组合。
还可以通过由argG基因编码的精氨基琥珀酸合酶的失活,容易地从任何产L-精氨酸的细菌,例如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)获得产L-鸟氨酸的细菌。
产L-半胱氨酸的细菌
可以用于衍生产L-半胱氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如使用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15(美国专利No.6,218,168,俄罗斯专利No.2279477),具有过表达的编码适合于分泌细胞毒性物质的蛋白质的基因的大肠杆菌W3110(美国专利No.5,972,663),具有降低的半胱氨酸脱巯基酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571 A2),具有由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调控物的活性增加的大肠杆菌W3110(WO0127307 A1)等等。
产L-谷氨酸的细菌
可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433 A1)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是一种具有thrC和ilvA基因中的突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利No.4,278,765)。通过使用在野生型大肠杆菌K-12菌株(VKPM B-7)细胞上培养的噬菌体P1进行的通用转导方法转移thrC基因的野生型等位基因。结果,得到了L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961),其能够产生L-谷氨酸。
可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于其中编码L-谷氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基因:谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA、acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF、lpdA)、丙酮酸激酶(pykA、pykF)、磷酸烯醇式丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA、pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、磷酸丙糖异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA,pfkB),和磷酸葡糖异构酶(pgi)。
经修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的例子包括EP 1078989 A2、EP955368 A2和EP952221 A2中公开的那些菌株。
可以用于衍生产L-谷氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括具有降低或消除的酶活性的菌株,所述酶通过从L-谷氨酸生物合成途径分叉而催化与L-谷氨酸不同的化合物的合成。此类酶的例子包括异柠檬酸裂合酶(aceA)、α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)、磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸合酶(ilvG)、乙酰乳酸合酶(ilvI)、甲酸乙酰转移酶(pfl)、乳酸脱氢酶(ldh),和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性的属于埃希氏菌属的细菌和用于获得它们的方法描述于美国专利No.5,378,616和5,573,945。具体地,这些菌株包括以下:
大肠杆菌W3110sucA::KmR,
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853),
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854),
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)。
大肠杆菌W3110sucA::KmR是通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(此后称为“sucA基因”)获得的菌株。该菌株是α-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷的。
产L-谷氨酸的细菌的其它例子包括属于埃希氏菌属并且对天冬氨酸抗代谢物具有抗性的那些菌株。这些菌株也可以在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷,并包括例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利No.5,908,768),FFRM P-12379,其另外具有低的L-谷氨酸分解能力(美国专利No.5,393,671),AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利No.6,110,714)等等。
产L-谷氨酸的细菌的例子包括属于泛菌属的突变体菌株,其在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷或具有降低的α-酮戊二酸脱氢酶活性,并且可以如上文所述获得。此类菌株包括菠萝泛菌AJ13356(美国专利No.6,331,419)。菠萝泛菌AJ13356于1998年2月19日以保藏号FERM P-16645保藏在NationalInstitute of Bioscience and Human Technology,Agency of Industrial Science andTechnology,Ministry of International Trade and Industry(目前,IncorporatedAdministrative Agency,National Institute of Technology and Evaluation,International Patent Organism Depositary(NITE-IPOD),#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken 292-0818,JAPAN)。然后,于1999年1月11日依据布达佩斯条约的规定将它转为国际保藏物,并且接受了保藏号FERM BP-6615。由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏,菠萝泛菌AJ13356在α-酮戊二酸脱氢酶活性中有缺陷。上述菌株当它被分离时鉴定为成团肠杆菌,并且保藏为成团肠杆菌AJ13356。然而,基于16S rRNA核苷酸测序等,它最近重新分类为菠萝泛菌。虽然AJ13356在上述保藏单位作为成团肠杆菌保藏,为了本说明书的目的,将它们描述为菠萝泛菌。
产L-组氨酸的细菌
可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945,RU 2003677)、大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536)、大肠杆菌NRRL B-12116-B-12121(美国专利No.4,388,405)、大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERMBP-6676)(美国专利No.6,344,347)、大肠杆菌H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087)、大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)等。
可以用于衍生产L-组氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-组氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括编码以下酶的基因:ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP环水解酶/磷酸核糖基-ATP焦磷酸酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑甲酰胺核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase,hisA)、酰胺转移酶(amidotransferase,hisH)、组胺醇磷酸氨基转移酶(histidinolphosphate aminotransferase,hisC)、组胺醇磷酸酶(histidinol phosphatase,hisB)和组胺醇脱氢酶(histidinol dehydrogenase,hisD)等等。
已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶受到L-组氨酸的抑制,并且因此也可以通过将对赋予反馈抑制抗性的突变引入ATP磷酸核糖基转移酶中来有效增强产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利No.2003677和2119536)。
具有产L-组氨酸的能力的菌株的具体例子包括大肠杆菌FERM-P 5038和5048,其已经使用携带编码L-组氨酸-生物合成酶的DNA的载体转化(JP56-005099 A),使用rht(一种用于氨基酸输出的基因)转化的大肠杆菌菌株(EP1016710 A),赋予磺胺胍,DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270,RU2119536)等等。
产L-异亮氨酸的细菌
可以用于衍生产L-异亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于具有对6-二甲基氨基嘌呤抗性的突变体(JP 5-304969A),具有对异亮氨酸类似物,如硫代异亮氨酸和异亮氨酸异羟肟酸盐抗性的突变体,和另外地具有对DL-乙硫氨酸和/或精氨酸异羟肟酸盐(arginine hydroxamate)抗性的突变体(JP5-130882 A)。另外,用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白,如苏氨酸脱氨酶和乙酰醇酸合酶(acetohydroxate synthase)的基因转化的重组菌株也可以用作亲本菌株(JP 2-458A,EP0356739 A1,和美国专利No.5,998,178)。
产L-亮氨酸的细菌
可以用于衍生产L-亮氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如对亮氨酸(例如,57菌株(VKPM B-7386,美国专利No.6,124,121))或对亮氨酸类似物抗性的大肠杆菌菌株,所述亮氨酸类似物包括β-2-噻吩丙氨酸(β-2-thienylalanine)、3-羟基亮氨酸(3-hydroxyleucine)、4-氮杂亮氨酸(4-azaleucine)和5,5,5-三氟亮氨酸(5,5,5-trifluoroleucine)(JP 62-34397 B和JP 8-70879 A);通过WO96/06926中所述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株;大肠杆菌H-9068(JP 8-70879 A)等等。
可以通过增强参与L-亮氨酸生物合成的一种或多种基因的表达改进所述细菌。例子包括leuABCD操纵子的基因,其可以以突变体leuA基因代表,所述突变体leuA基因编码解除L-亮氨酸的反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(α-isopropylmalate synthase)(美国专利No.6,403,342)。另外,可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达改进所述细菌。此类基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。
产L-赖氨酸的细菌
属于埃希氏菌家族的产L-赖氨酸的细菌的例子包括具有对L-赖氨酸类似物的抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长,但是当L-赖氨酸存在于培养基中时,该抑制被完全或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的例子包括但不限于氧杂赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸异羟肟酸盐(lysinehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺(α-chlorocaprolactam)等等。可以通过将属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理,获得对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体。可用于生产L-赖氨酸的细菌菌株的具体例子包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543、NRRLB-12185;见美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中,L-赖氨酸对天冬氨酸激酶(aspartokinase)的反馈抑制是脱敏的。
可以用于衍生产L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中编码L-赖氨酸生物合成酶的一种或多种基因的表达得到增强的菌株。此类基因的例子包括但不限于编码以下酶的基因:二氢吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinatesynthase,dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利No.6,040,160)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、和天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A1)。另外,所述亲本菌株可以具有参与能量效率的基因(cyo)(EP1170376 A1),编码烟酰胺核苷酸转氢酶(nicotinamide nucleotidetranshydrogenase)的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390),或其组合的表达水平升高。
产L-氨基酸的细菌可以具有降低的酶活性或无酶活性,所述酶催化引起从L-氨基酸生物合成途径分叉,并且导致另一种化合物的产生的反应。另外,所述细菌可以具有降低的酶活性或无酶活性,所述酶负面作用于L-氨基酸合成或积累。参与L-氨基酸产生的此类酶的例子包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(cadA,ldcC)、苹果酸酶等等,并且其中这些酶的活性被减少或删除的菌株公开于WO95/23864、WO96/17930、WO2005/010175等等。
为了减少或删除赖氨酸脱羧酶活性,可以减少编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因两者的表达。可以通过例如WO2006/078039中所述的方法减少两个基因的表达。
产L-赖氨酸的细菌的例子可以包括大肠杆菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株(WO2006/078039)。通过向具有被破坏的编码赖氨酸脱羧酶的cadA和ldcC基因的WC196菌株中引入含有赖氨酸生物合成基因的质粒pCABD2(美国专利No.6,040,160)获得该菌株。
WC196菌株从W3110菌株培育,其来源于大肠杆菌K-12,通过使用编码突变体天冬氨酸激酶III的突变体lysC基因代替W3110菌株染色体上的野生型lysC基因得到,所述突变体天冬氨酸激酶III中位置352处的苏氨酸被异亮氨酸替代,导致对L-赖氨酸反馈抑制的脱敏(美国专利No.5,661,012),并对所得的菌株赋予AEC抗性(美国专利5,827,698)。WC196菌株指定为大肠杆菌AJ13069,于1994年12月6日保藏在National Institute of Bioscience andHuman Technology,Agency of Industrial Science and Technology(目前,NITEIPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan),并且指定了保藏号FERM P-14690。然后,于1995年9月29日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏,并且分配了保藏号FERM BP-5252(美国专利No.5,827,698)。
WC196ΔcadAΔldcC菌株自身也是例示性的产L-赖氨酸的细菌。WC196ΔcadAΔldc指定为AJ110692,并于2008年10月7日以保藏号FERMBP-11027作为国际保藏物保藏在National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology,International Patent Organism Depositary(目前,NITEIPOD,#120,2-5-8Kazusakamatari,Kisarazu-shi,Chiba-ken,292-0818,Japan)。产L-甲硫氨酸的细菌
产L-甲硫氨酸的细菌及可以用于衍生产L-甲硫氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于大肠杆菌菌株,如AJ11539(NRRL B-12399)、AJ11540(NRRL B-12400)、AJ11541(NRRL B-12401)、AJ11542(NRRL B-12402)菌株(专利GB2075055);对正亮氨酸(L-甲硫氨酸类似物)有抗性的218菌株(VKPMB-8125)(专利RU2209248)和73菌株(VKPM B-8126)(专利RU2215782)等等。大肠杆菌73菌株于2001年5月14日在保藏号VKPM B-8126下保藏于俄罗斯国家工业微生物保藏中心(Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms)(VKPM)FGUP GosNII Genetika(1Dorozhny proezd,1Moscow 117545,Russian Federation),并于2002年2月1日依据布达佩斯条约的规定转为国际保藏物。此外,甲硫氨酸阻遏物缺陷菌株和使用编码参与L-甲硫氨酸生物合成的蛋白质如高丝氨酸转琥珀酰基酶(homoserinetranssuccinylase)和胱硫醚γ-合酶的基因转化的重组菌株(JP 2000-139471A)也可以用作其亲本菌株。
产L-鸟氨酸的细菌
可以通过由argF和argI基因两者编码的鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活,从任意产L-精氨酸的细菌,如大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)容易地得到产L-鸟氨酸的细菌。用于鸟氨酸氨甲酰基转移酶的失活的方法描述于本文。
产L-苯丙氨酸的细菌
可以用于衍生产L-苯丙氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPM B-8179),含有突变体pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC 55371)(美国专利No.5,354,672),大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681),大肠杆菌NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。另外,大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-arpG4,pACMAB],命名为AJ12604(FERM BP-3579)可以用作亲本菌株(EP488424B1)。此外,还可以使用属于大肠埃希氏菌属的产L-苯丙氨酸的细菌,其具有提高的由yedA基因或yddG基因编码的蛋白质的活性(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
产L-脯氨酸的细菌
可以用于衍生产L-脯氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012),其在ilvA基因中是缺陷的且能够产生L-脯氨酸(EP1172433A1)。可以通过增强参与L-脯氨酸生物合成的一种或多种基因的表达来改进该细菌。可以用于产L-脯氨酸的细菌中的基因的例子包括编码具有脱敏的L-脯氨酸反馈抑制的谷氨酸激酶的proB基因(DE3127361A1)。另外,可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一种或多种基因的表达来改进该细菌。此类基因通过b2682和b2683基因(ygaZH基因)示例(EP1239041A2)。
具有产生L-脯氨酸的活性的属于埃希氏菌属的细菌的例子包括以下大肠杆菌菌株:NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB专利2075056)、VKPM B-8012(俄罗斯专利申请No.2000124295),DE312761A1中描述的质粒突变体,由Bloom F.R.等在“The 15th Miami winter symposium”,1983,p.34中描述质粒突变体等等。
产L-苏氨酸的细菌
可以用于衍生产L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,例如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美国专利No.5,175,107,美国专利No.5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC 98081)(美国专利No.5,631,157)、大肠杆菌NRRL B-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner M.等,Genetika(Russian),1978,14:947-956)、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911 A2)等等。
TDH-6菌株是thrC基因缺陷以及蔗糖-同化(sucrose-assimilative)的,并且ilvA基因具有渗漏突变(leaky mutation)。该菌株在rhtA基因中也具有突变,其赋予对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株含有质粒pVIC40,其是通过将thrA*BC操纵子插入RSF1010-衍生的载体中获得,所述操纵子包括突变体thrA基因。该突变体thrA基因编码具有实质性脱敏的苏氨酸反馈抑制的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。该B-3996菌株于1987年11月19日在保藏号RIA 1867下保藏在All-Union Scientific Center of Antibiotics(RussianFederation,117105Moscow,Nagatinskaya Street 3-A)。该菌株还于1987年4月7日在保藏号VKPM B-3996下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)FGUP GosNII Genetika(1Dorozhny proezd,1Moscow 117545,Russian Federation)。
大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792A1)也可以用作亲本菌株用于衍生产L-苏氨酸的细菌。B-5318菌株就异亮氨酸而言是原养型的;且温度敏感型λ-噬菌体C1阻遏物和PR启动子替代质粒pVIC40中的苏氨酸操纵子的调控区。VKPM B-5318菌株于1990年5月3日在保藏号VKPM B-5318下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)FGUP GosNII Genetika(1Dorozhnyproezd,1Moscow 117545,Russian Federation)。
该细菌可以另外地经修饰以增强一种或多种以下基因的表达:
-突变体thrA基因,其编码对苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I;
-thrB基因,其编码高丝氨酸激酶;
-thrC基因,其编码苏氨酸合酶;
-rhtA基因,其编码苏氨酸和高丝氨酸流出系统的推定跨膜蛋白;
-asd基因,其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶;和
-aspC基因,其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶);
已经阐明了编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因(KEGG,Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,条目号b0002;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:337至2,799;基因ID:945803)。该thrA基因位于大肠杆菌K-12的染色体上的thrL和thrB基因之间。
已经阐明了编码大肠杆菌的高丝氨酸激酶的thrB基因(KEGG条目号b0003;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:2,801至3,733;基因ID:947498)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。
已经阐明了编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因(KEGG条目号b0004;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3,734至5,020;基因ID:945198)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrB基因和yaaX基因之间。全部三个基因作为单个的苏氨酸操纵子thrABC发挥功能。为了增强该苏氨酸操纵子的表达,期望从该操纵子移除影响转录的弱化子区(WO2005049808 A1,WO2003097839 A1)。
突变体thrA基因,其编码对L-苏氨酸反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶I和高丝氨酸脱氢酶I,以及thrB和thrC基因可以作为一个操作子从公知的质粒pVIC4获得,所述质粒存在于产L-苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPM B-3996中。质粒pVIC4详细描述于美国专利5,705,371中。
已经阐明了rhtA基因,其编码大肠杆菌的苏氨酸和高丝氨酸流出系统的蛋白(内膜转运蛋白)(KEGG条目号b0813;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:848,433至849,320,互补物;基因ID:947045)。rhtA基因位于大肠杆菌K-12的染色体上的dps和ompX基因之间,与glnHPQ操纵子(其编码谷氨酰胺转运系统的组分)接近。rhtA基因与ybiF基因(KEGG条目号b0813)相同。
已经阐明了asd基因,其编码大肠杆菌的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶(KEGG条目号b3433;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:3,571,798至3,572,901,互补物;基因ID:947939)。asd基因位于在大肠杆菌K-12的染色体上的同一条链上的glgB和gntU基因(相反链上的yhgN基因)之间。
另外,已经阐明了aspC基因,其编码大肠杆菌的天冬氨酸氨基转移酶(KEGG条目号b0928;GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:983,742至984,932,互补物;基因ID:945553)。aspC基因位于大肠杆菌K-12的染色体上相反链上的ycbL基因和同一条链上的ompF基因之间。
产L-色氨酸的细菌
可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于属于埃希氏菌属的菌株,如大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123),其在由突变体trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶上缺陷(美国专利No.5,756,345),大肠杆菌SV164(pGH5),其具有编码解除丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码解除色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶的trpE等位基因(美国专利No.6,180,373),酶色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美国专利No.4,371,614),大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps,其中磷酸烯醇式丙酮酸生产能力得到增强(WO9708333,美国专利No.6.319,696)等等可以使用。还可以使用具有由yedA基因或yddG基因编码的鉴定蛋白质的活性增强的属于埃希氏菌属的产L-色氨酸的细菌(美国专利申请No.2003148473 A1和2003157667 A1)。
可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中选自邻氨基苯甲酸合酶,磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶的酶的一种或多种活性增强的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者都受到L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制,因此,可以将脱敏该反馈抑制的突变引入这些酶中。具有此类突变的菌株的具体例子包括大肠杆菌SV 164,其含有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶,和通过向大肠杆菌SV164导入质粒pGH5获得的转化体菌株(WO94/08031),所述质粒pGH5含有编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变体serA基因。
可以用于衍生产L-色氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括其中已经引入了色氨酸操纵子的菌株,所述色氨酸操纵子含有编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP 57-71397 A,JP 62-244382 A,美国专利No.4,371,614)。此外,可以通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达,赋予产L-色氨酸的能力。所述色氨酸合酶由分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基组成。另外,可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达,改进产L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。
产L-缬氨酸的细菌
可以用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子包括但不限于以过表达ilvGMEDA操纵子的方式修饰的菌株(美国专利No.5,998,178)。期望除去ilvGMEDA操纵子中对于弱化所要求的区域,使得该操纵子的表达不被产生的L-缬氨酸弱化。此外,期望的是该操纵子中的ilvA基因被破坏,使得苏氨酸脱氨酶活性降低。
用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的例子还包括具有氨基酰基tRNA合成酶中具有突变的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如,可以使用大肠杆菌VL1970,其在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日在保藏号VKPM B-4411下保藏在俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)FGUP GosNII Genetika(1Dorozhnyproezd,1Moscow 117545,Russian Federation)。
此外,需要硫辛酸用于生长和/或缺乏H+-ATP酶的突变体也可以用作亲本菌株(WO96/06926)。
用于衍生产L-缬氨酸的细菌的亲本菌株还包括大肠杆菌H81菌株(VKPM B-8066;见例如EP1942183B1),NRRL B-12287和NRRL B-12288(美国专利No.4,391,907),VKPM B-4411(美国专利No.5,658,766),VKPM B-7707(欧洲专利申请EP1016710 A2)等等。
属于肠杆菌科的本发明的细菌已经以过表达yajL基因的方式修饰。
短语“以过表达yajL基因的方式修饰的细菌”可以表示所述细菌以下述方式进行了修饰,从而在该修饰的细菌中,对应的基因蛋白产物如YajL的总酶促活性与未修饰的菌株,例如如上文和下文所述的野生型或亲本菌株相比增加,或yajL基因的表达水平比未修饰的菌株,例如如上文和下文所述的野生型或亲本菌株中的水平更高。充当参照用于以上比较的未修饰的菌株的例子可以包括属于埃希氏菌属的微生物的野生型菌株,如大肠杆菌MG1655菌株(ATCC 47076),W3110菌株(ATCC 27325)等等。
短语“yajL基因是过表达的”可以表示与未修饰的菌株相比,对应的基因蛋白产物如YajL蛋白的总酶活性增加,例如通过向细菌基因组中引入和/或增加yajL基因的拷贝数,或增加由所述基因编码的蛋白的每分子活性(可以称作比活性)进行。可以修饰该细菌使得每细胞的YajL蛋白活性增加到未修饰菌株的150%或更多,200%或更多,300%或更多。YajL的分子伴侣活性可以用于确定每mg蛋白质的比酶活性。例如,柠檬酸合酶可以用作对照蛋白以测量还原或氧化条件下YajL的重折叠活性(Kthiri F.等,J.Biol.Chem.,2010,285:10328-10336)。可以通过Bradford蛋白测定(Bradford M.M.,Anal.Biochem.,1976,72:248-254)使用牛血清白蛋白作为标准品确定蛋白浓度。
短语“yajL基因是过表达的”也可以表示yajL基因的表达水平比未修饰的菌株中的该水平高。因此,“yajL基因是过表达的”等同于短语“yajL基因的表达增强”。
可以用于增强yajL基因的表达的方法包括但不限于,根据本领域技术人员已知的遗传工程化方法增加细菌基因组中(染色体中和/或自主复制质粒中)yajL基因拷贝数和/或将yajL基因引入载体中,所述载体能够增加肠肝菌科的细菌中yajL基因的拷贝数和/或yajL基因的表达水平。
载体的例子包括但不限于宽宿主范围质粒,如pMW118/119、pBR322、pUC19等等。也可以通过例如同源重组,Mu-驱动的整合等将yajL基因的多个拷贝引入细菌的染色体DNA中。可以使用在染色体DNA中具有多个拷贝的序列进行同源重组。在染色体DNA中具有多个拷贝的序列包括但不限于,存在于可转座元件末端的反向重复或重复DNA。另外,将yajL基因整合到转座子中并允许其转移以将yajL基因的多个拷贝引入染色体DNA中是可能的。通过使用Mu-驱动的整合,可以在单次行为期间将基因的多于3个拷贝引入染色体DNA中(Akhverdyan V.Z.等,Biotechnol.(Russian),2007,3:3-20)。
还可以通过yajL基因的临近调控区的修饰或引入天然和/或经修饰的外来调控区,通过增加yajL基因的表达水平实现增强yajL基因表达。调控区或序列可以通过启动子,增强子,弱化子和终止信号,抗终止信号,核糖体结合位点(RBS)和其它表达控制元件(例如,与抑制子或诱导子结合的区域和/或转录和翻译调控蛋白的结合位点,例如,在转录的mRNA中)示例。此类调控区描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.,“MolecularCloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中。使用已知的方法可以将对控制基因表达的区域的修饰与增加细菌基因组中该修饰的基因的拷贝数组合(见,例如Akhverdyan V.Z.等,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2011,91:857-871;Tyo K.E.J.等,NatureBiotechnol.,2009,27:760-765)。
增强yajL基因表达的示例性启动子可以是有力的启动子,其比天然yajL启动子更强。例如,已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lambda噬菌体的PR或PL启动子都是有力的启动子。可以使用在属于肠肝菌科的细菌中提供高水平的基因表达的有力的启动子。或者,可以通过例如向yajL基因的启动子区中引入突变以获得更强的启动子功能来增强启动子的效果,从而导致位于该启动子下游的yajL基因的增加的转录水平。此外,已知Shine-Dalgarno(SD)序列中,和/或SD序列和起始密码子之间的间隔物中,和/或核糖体结合位点中起始密码子紧接上游和/或紧接下游的序列中几个核苷酸的取代极大地影响mRNA的翻译效率。例如,取决于起始密码子前的三个核苷酸的特性,发现了表达水平的20倍范围(Gold L.等,Annu.Rev.Microbiol.,1981,35:365-403;Hui A.等,EMBO J.,1984,3:623-629)。
可以测量基因的拷贝数,存在或不存在,例如通过限制化处理染色体DNA,接着使用基于基因序列的探针的Southern印迹,荧光原位杂交(FISH)等进行。可以使用多种公知的方法,包括Northern印迹法,定量RT-PCR等,通过测量从基因转录的mRNA的量确定基因表达的水平。可以通过已知的方法,包括SDS-PAGE,接着进行免疫印迹法测定(Western印迹法分析),或蛋白样品的质谱术分析等,测量由基因编码的蛋白质的量。
用于操作重组DNA分子和分子克隆的方法,如质粒DNA的制备,DNA的消化,连接和转化,选择寡核苷酸作为引物,掺入突变等的方法可以是对于本领域的技术人员公知的普通方法。这些方法描述于例如Sambrook J.,Fritsch E.F.和Maniatis T.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,2nd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)或Green M.R.和Sambrook J.R.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,4th ed.,Cold Spring HarborLaboratory Press(2012);Bernard R.Glick,Jack J.Pasternak和Cheryl L.Patten,“Molecular Biotechnology:principles and applications of recombinant DNA”,4thed.,Washington,DC,ASM Press(2009)。
yajL基因编码氧化应激抗性的分子伴侣YajL(KEGG,Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes,条目号b0424;Protein Knowledgebase,UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q46948)。yajL基因(GenBank登录号NC_000913.2;核苷酸位置:442275至442865,互补物;基因ID:945066)位于大肠杆菌K-12菌株染色体上相同链上的panE基因和相反链上的thiI基因之间。yajL基因的核苷酸序列和由yajL基因编码的YajL蛋白的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中。在一些微生物中,YajL蛋白被错误地描述为参与硫胺素代谢的ThiJ(EcoGene:EG13272;http://www.ecogene.org/old/geneinfo.php?eg_id=EG13272)。该表型现在被归因于临近的thiI基因(T.Begley,personal communication cited in Mueller E.G.等,Identification of a gene involved in the generation of 4-thiouridine in tRNA,Nucleic Acids Res.,1998,26(11):2606-2610)。
由于在肠肝菌科的属,种或菌株之间DNA序列可能存在一些差异,yajL基因不限于SEQ ID NO:1中所示的基因,而可以包括作为SEQ ID NO:1的变体核苷酸序列或与SEQ ID NO:1同源,且编码YajL蛋白的变体的基因。
短语“变体蛋白”可以表示与SEQ ID NO:2相比序列中具有一个或多个变化的蛋白,不论它们是取代,缺失,插入和/或添加一个或几个氨基酸残基,但仍然维持了与YajL蛋白相似的活性或功能,或相对于野生型或未修饰的蛋白,YajL蛋白的三维结构没有显著变化。变体蛋白中的变化数目取决于蛋白的三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可以是但不严格限于,SEQ IDNO:2中的1至30个,在另一个例子中1至15个,在另一个例子中1至10个,和在另一个例子中1至5个。这是因为一些氨基酸彼此具有高同源性,使得这样的改变不影响活性或功能,或YajL的三维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著改变。因此,相对于SEQ ID NO:2中所示的完整氨基酸序列,由yajL基因编码的蛋白变体可以具有不少于70%,不少于80%,不少于90%,不少于95%,不少于98%,或不少于99%的同源性(其在使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”),只要维持了YajL蛋白的活性或功能,或YajL的三维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著改变。
示例性的取代,缺失,插入,和/或添加一个或几个氨基酸残基可以是保守突变。代表性的保守突变为保守取代。保守取代可以是但不限于取代,其中如果取代位点是芳香族氨基酸,那么取代在Phe、Trp和Tyr之间相互发生;如果取代位点是疏水氨基酸,那么在Ala、Leu、Ile和Val之间相互发生;如果取代位点是亲水性氨基酸,在Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、His和Thr之间相互发生;如果取代位点是极性氨基酸,在Gln和Asn之间相互发生;如果取代位点是碱性氨基酸,在Lys、Arg和His相互发生;如果取代位点是酸性氨基酸,在Asp和Glu之间相互发生;如果取代位点是具有羟基的氨基酸,在Ser和Thr之间相互发生。保守取代的例子包括Ser或Thr取代Ala;Gln,His或Lys取代Arg;Glu,Gln,Lys,His或Asp取代Asn;Asn,Glu或Gln取代Asp;Ser或Ala取代Cys;Asn,Glu,Lys,His,Asp或Arg取代Gln;Asn,Gln,Lys或Asp取代Glu;Pro取代Gly;Asn,Lys,Gln,Arg或Tyr取代His;Leu,Met,Val或Phe取代Ile;Ile,Met,Val或Phe取代Leu;Asn,Glu,Gln,His或Arg取代Lys;Ile,Leu,Val或Phe取代Met;Trp,Tyr,Met,Ile或Leu取代Phe;Thr或Ala取代Ser;Ser或Ala取代Thr;Phe或Tyr取代Trp;His,Phe或Trp取代Tyr;和Met,Ile或Leu取代Val。
示例性的取代,缺失,插入,和/或添加一个或几个氨基酸残基也可以是非保守突变,只要该突变被氨基酸序列的不同位置中的一个或多个次级突变(secondary mutation)补偿,使得变体蛋白的活性或功能得到维持并与YajL蛋白的活性或功能相似,或YajL的三维结构相对于野生型或未修饰的蛋白没有显著变化。
为了评估蛋白或DNA同源性的程度,可以使用几种计算方法,如BLAST搜索、FASTA搜索和ClustalW方法。BLAST(基本局部对比搜索工具,www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)搜索是由blastp,blastn,blastx,megablast,tblastn,和tblastx程序采用的启发式搜索算法(heuristic search algorithm);这些程序使用Karlin S.和Altschul S.F.的统计学方法(Methods for assessing thestatistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1990,87:2264-2268;Applications andstatistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:5873-5877),将显著性归于它们的发现。计算机程序BLAST计算三个参数:得分,同一性和相似性。FASTA搜索方法由PearsonW.R.描述(“Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA”,Methods Enzymol.,1990,183:63-98)。ClustalW方法由Thompson J.D.等人描述(“CLUSTAL W:improving the sensitivity of progressive multiple sequencealignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weightmatrix choice”,Nucleic Acids Res.,1994,22:4673-4680)。
此外,yajL基因可以是变体核苷酸序列。短语“变体核苷酸序列”可以表示编码“变体蛋白”的核苷酸序列,其使用根据标准遗传密码表的任意同义氨基酸密码子(见例如Lewin B.,“Genes VIII”,2004,Pearson Education,Inc.,Upper Saddle River,NJ 07458)。因此,yajL基因可以是由于遗传密码的简并性所致的变体核苷酸序列。
短语“变体核苷酸序列”也可以表示但不限于在严格条件下与SEQ ID NO:1中所示的序列互补的核苷酸序列杂交的核苷酸序列,或可以在严格条件下从核苷酸序列制备的探针,只要其编码活性或功能性蛋白质。“严格条件”包括如下那些条件,在该条件下形成特异性杂交体,例如具有不低于60%,不低于70%,不低于80%,不低于90%,不低于95%,不低于96%,不低于97%,不低于98%,或不低于99%的同源性(当使用计算机程序BLAST时定义为参数“同一性”)的杂交体,而不形成非特异性杂交体,例如具有低于上文的同源性的杂交体。例如,严格条件可以通过以盐浓度为1xSSC(标准柠檬酸钠或标准氯化钠),0.1%SDS(十二烷基硫酸钠),或在另一个例子中,0.1xSSC,0.1%SDS在60℃或65℃洗涤一次或多次,或在另一个例子中,两次或三次例示。洗涤的持续时间依赖于用于印迹法的膜类型,且通常,应当是制造商所推荐的。例如,对于Amersham HybondTM-N+带正电荷的尼龙膜(GE Healthcare),在严格条件下推荐的洗涤持续时间是15分钟。该洗涤步骤可以进行2至3次。作为探针,也可以使用与SEQ ID NO:1中所示序列互补的序列的一部分。可以使用寡核苷酸作为基于SEQ ID NO:1中所示的序列制备的引物和含有核苷酸序列的DNA片段作为模板通过PCR产生此类探针。探针的长度推荐为>50bp;其可以根据杂交条件适当地选择,并通常为100bp至1kbp。例如,当具有约300bp长度的DNA片段作为探针使用时,杂交后的洗涤条件可以以2xSSC,0.1%SDS在50℃,60℃或65℃例示。
由于已经阐明了大肠杆菌物种的编码YajL蛋白的基因(见上文),可以如下获得编码YajL蛋白的yajL基因,和编码YajL蛋白的变体蛋白的变体核苷酸序列:利用基于yajL基因的核苷酸序列制备的引物从属于肠杆菌科的细菌通过PCR(聚合酶链式反应;参见White T.J.等,The polymerase chain reaction,Trends Genet.,1989,5:185-189)获得;或者通过体外处理含有野生型yajL基因的DNA进行的定点诱变法(例如使用羟胺),或用于处理微生物(例如含有野生型yajL基因的属于肠杆菌科的细菌)的方法,用紫外线(UV)照射或诱变剂进行,如N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于此类处理的亚硝酸;或者作为全长基因结构化学合成。以相似的方式可以获得编码肠杆菌科的其它微生物的YajL蛋白或其变体蛋白的基因。
短语“野生型蛋白”可以表示由肠杆菌科的野生型或亲本细菌菌株,例如由野生型大肠杆菌MG1655菌株天然产生的天然蛋白。野生型蛋白可以由天然存在于野生型细菌的基因组中的“野生型基因”或“未修饰的基因”编码。
可以通过修饰固有地具有产L-氨基酸的能力的细菌以过表达yajL基因来获得本文所述的细菌,例如通过将前述的DNA引入细菌中。或者,可以通过将产L-氨基酸的能力赋予已经经修饰以过表达yajL基因的细菌来获得本文所述的细菌。
除了已经提到的特性外,在不偏离本发明的范围的情况下,细菌可以具有其它特定的特性,如各种营养需求,药物抗性,药物敏感性和药物依赖性。2.方法
本发明的方法包括用于生产L-氨基酸的方法,如L-丙氨酸,L-精氨酸,L-天冬酰胺,L-天冬氨酸,L-瓜氨酸,L-半胱氨酸,L-谷氨酸,L-谷氨酰胺,甘氨酸,L-组氨酸,L-异亮氨酸,L-亮氨酸,L-赖氨酸,L-甲硫氨酸,L-鸟氨酸,L-苯丙氨酸,L-脯氨酸,L-丝氨酸,L-苏氨酸,L-色氨酸,L-酪氨酸和L-缬氨酸,或其混合物。用于生产L-氨基酸的方法可以包括下述步骤:在培养基中培养细菌以允许L-氨基酸产生,分泌,和/或在培养基中或在细菌细胞中积累,以及从所述培养基和/或所述细菌细胞收集L-氨基酸。L-氨基酸可以以其盐形式或水合形式,或其组合产生。例如,可以通过该方法产生L-氨基酸的钠、钾、铵等盐。L-氨基酸可以与例如另一种有机或无机化合物的其加合物形式产生。特别地,可以通过该方法产生L-氨基酸的单盐酸盐,如L-赖氨酸的单盐酸盐。
细菌的培养,以及L-氨基酸从培养基的收集和纯化等可以以与常规发酵方法相似的方式进行,其中使用微生物产生L-氨基酸。用于L-氨基酸的生产的培养基可以是合成的或天然的培养基,如含有碳源,氮源,硫源,无机离子,和需要的其它有机和无机组分的典型培养基。作为碳源,可以使用糖类,如葡萄糖,蔗糖,乳糖,半乳糖,果糖,阿拉伯糖,麦芽糖,木糖,海藻糖,核糖,和淀粉水解物;醇,如乙醇,甘油,甘露糖醇,和山梨糖醇;有机酸,如葡糖酸,富马酸,柠檬酸、苹果酸和琥珀酸;脂肪酸等。作为氮源,可以使用无机铵盐,如硫酸铵,氯化铵和磷酸铵;有机氮,如大豆水解产物;氨气;氨水等。硫源可以包括硫酸铵,硫酸镁,硫酸亚铁,硫酸锰等。维生素如维生素B1,需要的物质,例如有机营养物,如核酸,如腺嘌呤和RNA,或酵母提取物等可以以适当量(即便是痕量)存在。除了这些,如果必要的话,可以添加少量的磷酸钙,铁离子,锰离子等。
可以在需氧条件下进行培养,持续16至72小时,或32至68小时;培养期间的培养温度可以控制在30至45℃,或30至37℃内;且pH可以调节在5和8之间,或6.0和7.5之间。可以通过使用无机或有机酸性或碱性物质,以及氨气调节pH。
培养后,可以通过离心或膜过滤从液体培养基除去固体,如细胞和细胞碎片,然后可以通过常规技术(例如浓缩,离子交换层析,和结晶)的任意组合从发酵液回收目标L-氨基酸。