CN104046663B - 使用肠杆菌科细菌生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

使用肠杆菌科细菌生产l-氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用肠杆菌科细菌生产L?氨基酸的方法，具体的描述了一种使用肠杆菌科(Enterobacteriaceae)细菌生产L?氨基酸的方法，其中所述细菌包含能够赋予针对由L?半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质。

Description

使用肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法
本申请是申请日为2011年01月17日，申请号为201110008628.2，发明名称为“使用肠杆菌科细菌生产L-氨基酸的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及微生物产业，特别涉及使用肠杆菌科的细菌生产L-氨基酸方法，所述细菌具有来源于属于泛菌属(Pantoea)的细菌的蛋白质，且所述蛋白质能够赋予对半胱氨酸的抗性。
背景技术
常规上，L-氨基酸是通过利用从天然来源获得的微生物菌株，或其突变体的发酵方法进行工业生产的。通常，对所述微生物进行修饰以提高L-氨基酸的产量。
已经报道了许多提高L-氨基酸产量的技术，包括用重组DNA转化微生物(美国专利号4,278,765)。其它提高产量的技术包括增加参与氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所述目标酶对由所得的L-氨基酸导致的反馈抑制脱敏(desensitize)(美国专利号4,346,170、5,661,012和6,040,160)。
公开了一种新的微生物菌株，其适于发酵生产L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰基-丝氨酸(其是从O-乙酰基-L-丝氨酸通过非酶法转化生产的)，和/或噻唑烷(thiazolidine)衍生物。该新菌株过表达至少一种编码介导抗生素或其它对所述微生物有毒的物质的细胞清除的蛋白质的基因(EP0885982)。
已经在基因库(genebank)中鉴定了一种来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的染色体片段，其能够在工业生产菌株中增加半胱氨酸的产量。亚克隆和遗传分析显示其原因是编码299个氨基酸的产物的开放阅读框，称为Orf299。在T7聚合酶/启动子系统中合成了该Orf299，其显示了膜内在蛋白质的特性。这些结果进一步表明ORF299编码负责排出半胱氨酸途径的不同代谢物的输出泵(exportpump)(DasslerT.等，Mol.Microbiol.;36(5):1101-12(2000)。
发现ORFyfiK基因当在一种工业大肠杆菌生产菌株中过表达时，能够增加半胱氨酸的生产。yfiK基因产物为膜内在蛋白质，具有约六个预测的跨膜螺旋，且其属于输出蛋白(exportprotein)的RhtB家族。从质粒过度产生YfiK导致O-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸强烈(drastic)并平行(parallel)地分泌到培养基中，但仅当所述生物具有对由半胱氨酸导致的反馈抑制不敏感的丝氨酸转乙酰酶时方如此。当将过量的O-乙酰基-L-丝氨酸添加至培养基中时，在携带yfiK的转化体以及在野生型菌株中，这种对于半胱氨酸分泌过程中存在反馈非敏感性丝氨酸转乙酰酶的需要均被消除。ΔyfiK突变体并不显示任何表型，且当用携带ydeD(之前已表征的另一种O-乙酰基-L-丝氨酸/半胱氨酸输出蛋白)的质粒转化时，能够输出O-乙酰基-L-丝氨酸和半胱氨酸。因为ydeD-yfiK双重突变体显示相同的表现模式(pattern)，看来YfiK和YdeD独立地起作用。细胞需要藉由输出蛋白的合成来调节O-乙酰基-L-丝氨酸内部储备池(internalpool)大小可能与该化合物(当外源供应时)可抑制生长的事实有关。ydeD或yfiK的过表达可减轻该抑制，并增加对O-乙酰基-L-丝氨酸的类似物重氮丝氨酸(azaserine)的抗性(FrankeI等,JBacteriol.;185(4):1161-6(2003))。
大肠杆菌细胞色素bd及周质(periplasmic)细胞色素的组装需要ATP-结合盒转运蛋白(cassettetransporter)CydDC，其底物未知。对来自野生型和cydD突变体菌株的周质的二维SDS-PAGE比较显示，后者有数种周质转运结合蛋白缺陷，尽管cydD周质中并未缺少任一种主要的蛋白质。相反，CydDC将氨基酸半胱氨酸从细胞质输出到周质，这可使用反转的膜囊来进一步示明：这些膜囊将放射性标记的半胱氨酸以依赖ATP、不依赖解耦合(uncoupled)的方式向内转运。报道了新的多效cydD表型，包括具有对苄青霉素和二硫苏糖醇敏感性的表型，和丧失活动力(motility)的表型。这两种表型均与二硫键形成的周质缺陷一致。在cydD和野生型菌株中外源半胱氨酸的存在能够反转(reverse)这些表型，并影响周质c-型细胞色素的水平，但并不恢复细胞色素d。与CydDC是半胱氨酸输出蛋白相一致，cydD突变体生长对高半胱氨酸浓度高度敏感，并产生更高的细胞质半胱氨酸水平，一种ORF299(其编码主要易化蛋白超家族(majorfacilitatorsuperfamily)的输出蛋白)有缺陷的突变体也是如此。cydDORF299双重突变体对于半胱氨酸极其敏感，并具有更高的细胞质半胱氨酸水平，而CydDC过表达赋予对高胞外半胱氨酸浓度的抗性。很可能CydDC负责半胱氨酸的输出，半胱氨酸的输出对于周质中的氧化还原的稳态是至关重要的(PittmanM.S.等，JBiolChem.;277(51):49841-9(2002))。
除了YdeD和YfiK(它们先前已作为大肠杆菌中的L-半胱氨酸输出蛋白被报道)之外，分析了大肠杆菌中33个推定的药物转运蛋白基因对L-半胱氨酸输出和过度产生的作用。acrD、acrEF、bcr、cusA、emrAB、emrKY、ybjYZ和yojIH的过表达反转了L-半胱氨酸对tnaA被破坏的大肠杆菌细胞的生长抑制。tnaA基因是主要的半胱氨酸脱巯基酶基因。发现这八个基因的过表达可减少在L-半胱氨酸的存在下培养之后的胞内L-半胱氨酸水平。氨基酸转运测定显示Bcr过表达，其赋予对双环霉素和四环素的抗性，尤其促进了由质子梯度产生的能量所驱动的L-半胱氨酸输出。当用携带bcr基因的质粒转化tnaA被破坏的、表达被改变的cysE基因的大肠杆菌菌株时，转化体与仅携带所述载体的细胞相比产生更多的L-半胱氨酸。报道基因测定表明所述bcr基因以显著的水平组成性表达。这些结果表明主要易化蛋白家族中的多种药物转运蛋白Bcr参与遗传工程改造的大肠杆菌细胞中L-半胱氨酸的输出和过度产生(YamadaS.等,ApplEnvironMicrobiol.;72(7):4735-42(2006))。
然而目前，并无使用具有如下蛋白质的细菌以供生产L-氨基酸的目的的报道：所述蛋白质来源于属于泛菌属的细菌、且能够赋予针对由细菌中的L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性。
发明内容
本发明公开的主题的方面可包括提高L-氨基酸生产菌株的生产能力，并提供使用这些菌株生产非芳族或芳族L-氨基酸的方法。
通过发现赋予细菌对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质活性可导致L-氨基酸(如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的产量提高而实现了上述方面。
本发明提供了肠杆菌科的细菌，其具有增加的生产氨基酸(如L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸)的能力。
本发明的一个方面是提供生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养肠杆菌科的细菌，并从所述培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌能够生产L-氨基酸，且经修饰而增加了能够赋予细菌对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质的活性，其中所述蛋白质选自下组：
(A)SEQIDNO:2的蛋白质或其变体，和
(B)SEQIDNO:4的蛋白质或其变体。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中在所述细菌中编码所述蛋白质的DNA表达增强。
本发明的另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌用编码所述蛋白质的DNA转化。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA选自c0011和d0663基因。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌经修饰以至少增加了蛋白质(B)或其变体的活性，并进一步经修饰以增加编码SEQIDNO:6的蛋白质或其变体的DNA的表达。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述DNA是c09478基因。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述细菌是Pantoeaananatis。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述芳族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述非芳族L-氨基酸选L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和O-乙酰基-L-丝氨酸。
本发明另一个方面是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸选自下组：L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸和O-乙酰基-L-丝氨酸。
本发明如下详细描述。
本发明还涉及如下方面：
1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的细菌，并从所述培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌能够生产L-氨基酸，且经过修饰而增加了能够赋予细菌针对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质的活性，其中所述蛋白质选自下组：
(A)SEQIDNO:2的蛋白质或其变体，和
(B)SEQIDNO:4的蛋白质或其变体。
2.依照项1的方法，其中在所述细菌中编码所述蛋白质的DNA的表达增强。
3.依照项1的方法，其中所述细菌用编码所述蛋白质的DNA转化。
4.依照项2或3的方法，其中所述DNA选自c0011和d0663基因。
5.依照项1-3中任一项所述的方法，其中所述细菌经修饰以至少增加了蛋白质(B)或其变体的活性，并经进一步修饰而增加了编码SEQIDNO:6的蛋白质或其变体的DNA的表达。
6.依照项5的方法，其中所述DNA是c09478基因。
7.依照项1-6中任一项所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属(Escherichia)。
8.依照项1-6中任一项所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属(Pantoea)。
9.依照项7的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
10.依照项8的方法，其中所述细菌是Pantoeaananatis。
11.依照项1-10中任一项所述的方法，其中所述L-氨基酸选自芳族L-氨基酸和非芳族L-氨基酸。
12.依照项11的方法，其中所述芳族L-氨基酸选自L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。
13.依照项12的方法，其中所述非芳族L-氨基酸选自L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸和L-半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和O-乙酰基-L-丝氨酸。
14.依照项11的方法，其中所述氨基酸选自L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸、L-谷氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸和O-乙酰基-L-丝氨酸。
附图简述
图1显示携带质粒pSTV-c0011PF和pSTV-PA36ccd的菌株在含有半胱氨酸的培养基中的生长曲线。
具体实施方式
1.细菌
所述细菌可为肠杆菌科的L-氨基酸生产菌，其中所述细菌具有来源于属于泛菌属的细菌的蛋白质，且所述蛋白质能够赋予对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性。
短语“L-氨基酸生产菌”可意指当在培养基中培养时，具有生产L-氨基酸并将L-氨基酸排入该培养基中的能力的细菌。
短语“L-氨基酸生产菌”还可意指能够生产L-氨基酸，并导致L-氨基酸在培养基中以大于野生型或亲本大肠杆菌菌株(如大肠杆菌K-12)的量积累的细菌，优选可意指所述微生物能够导致目标L-氨基酸在培养基中的积累量不少于0.5g/L，并在另一个实施方案中不少于1.0g/L。术语“L-氨基酸”可包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和O-乙酰基L-丝氨酸。
术语“芳族L-氨基酸”可包括L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸。术语“非芳族L-氨基酸”可包括L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸和半胱氨酸衍生物、L-甲硫氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和O-乙酰基L-丝氨酸。其它实施方案是L-苏氨酸、L-赖氨酸、L-半胱氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸和O-乙酰基L-丝氨酸。
一些由细菌生产的L-半胱氨酸可在培养基中通过形成二硫键而变为L-胱氨酸。培养基中存在的L-半胱氨酸和硫代硫酸反应可生成S-磺基半胱氨酸(SzczepkowskiT.W.,Nature，vol.182(1958))。当培养基中生产S-磺基半胱氨酸时，可通过用还原剂(如二硫苏糖醇)还原来将其转化为L-半胱氨酸。此外，在所述细菌细胞中生成的L-半胱氨酸可与同样存在于所述细胞中的酮、醛，或(例如)丙酮酸缩合，以通过中间产物半缩硫酮(hemithioketal)生产噻唑烷衍生物(参见日本专利号2992010)。所述噻唑烷衍生物和半缩硫酮可作为平衡的混合物存在。当在培养基中生产了L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物时，可通过下述方法生产L-半胱氨酸：从培养基收集所述噻唑烷衍生物以打破噻唑烷衍生物与L-半胱氨酸之间的反应平衡，从而使得L-半胱氨酸过量产生。因此，所述L-半胱氨酸生产能力并不仅限于在培养基或细胞中积累L-半胱氨酸的能力，还包括在培养基中积累L-胱氨酸或其衍生物如S-磺基胱氨酸、噻唑烷衍生物、半缩硫酮或其混合物的能力。
一些L-半胱氨酸衍生物，如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，可从作为重要起始材料的半胱氨酸来生物合成。所述L-半胱氨酸衍生物还可包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羰基半胱氨酸(carbocysteine)、磺基半胱氨酸(sulfocysteine)、乙酰基半胱氨酸(acetylcysteine)等。如上所述获得的L-半胱氨酸可用于产生这些L-半胱氨酸衍生物。
这些化合物的发酵生产可通过使用相应的生产微生物作为宿主菌株，结合过量产生半胱氨酸的能力来实现。因此，所述L-半胱氨酸生产能力包括上述化合物，如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸，这些化合物产生半胱氨酸作为重要的中间产物。
为了赋予生产由半胱氨酸生物合成的化合物(如γ-谷氨酰半胱氨酸、谷胱甘肽、胱硫醚、高半胱氨酸、甲硫氨酸和S-腺苷甲硫氨酸)的能力，可使用在培育棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌中常规使用的方法(参见“AminoAcidFermentation”，GakkaiShuppanCenter(Ltd.)，第一版，1986年5月30日出版，pp.77-100)。上述方法包括生产具有营养缺陷性突变体、类似物抗性菌株、或代谢调节突变体的特性的微生物，或构建重组菌株使得其过表达相应的生物合成酶。减少催化从主途径分支的反应和/或参与降解相应的化合物或其中间产物的酶的活性，也可有效地增加所述产物。在此，在每种生产细菌的培育中，可赋予上述特性中的一种或多种。相应的生物合成酶的表达可单独增强或以两种或更多种的组合增强。而且，赋予特性(如营养缺陷性突变、类似物抗性或代谢调节突变)可与增强生物合成酶的方法相组合。
短语“具有对由L-半胱氨酸导致的生长抑制抗性的细菌”可意指这样的细菌，其来源于作为亲本菌株的细菌菌株，且具有使其能够在含有L-半胱氨酸的培养基中生长的遗传特性。可使用固体培养基。
在含有L-半胱氨酸的培养基中培养时，对由L-半胱氨酸导致的生长抑制有抗性的细菌与亲本菌株相比，显示更有利(favorable)生长。例如，可在34℃在具有含50μM或更多(或在另一个实例中，200μM)L-半胱氨酸的M9基本培养基的板上培养20小时内形成菌落的细菌，可对L-半胱氨酸有抗性。
携带上述基因的菌株在含有50μM(或在另一个实例中，200μM)L-半胱氨酸的培养基中与对照菌株相比较可更快地生长，表明该基因或基因位点(genelocus)可赋予半胱氨酸抗性。
肠杆菌科包括属于埃希氏菌属、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、光杆菌属(Photorhab-dus)、普罗威登斯菌属(Providencia)、沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、志贺氏菌属(Shigella)、摩根氏菌属(Morganella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)等。具体而言，可使用那些根据NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347)使用的分类法归类为肠杆菌科的那些。
短语“属于埃希氏菌属的细菌”可意指所述细菌根据微生物学领域技术人员所知的分类法归类于埃希氏菌属。属于埃希氏菌属的细菌的实例包括但不仅限于大肠杆菌(E.coli)。
埃希氏菌属所属的细菌并无特别限制，但例如，可使用由Neidhardt，F.C.等(EscherichiacoliandSalmonellatyphimurium，AmericanSocietyforMicrobiology，WashingtonD.C.，1208，表1)描述的细菌。
短语“属于泛菌属的细菌”可意指所述细菌根据微生物学领域技术人员所知的分类法归类于泛菌属。最近，一些成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)的菌种基于对16SrRNA的核苷酸序列分析等被重新归类为成团泛菌(Pantoeaagglomerans)或Pantoeaananatis、斯氏泛菌(Pantoeastewartii)等(InternationalJournalofSystematicBacteriology,July1989,39(3).p.337-345)。而且，一些属于欧文氏菌属的细菌被重新归类为Pantoeaananatis或斯氏泛菌(InternationalJournalofSystematicBacteriology,Jan.1993，43(1),pp.162-173)。通常的泛菌属细菌的菌株包括但不仅限于，Pantoeaananatis、斯氏泛菌、成团泛菌和柠檬泛菌(Pantoeacitrea)。具体实例包括下述菌株：PantoeaananatisAJ13355(FERMBP-6614，欧洲专利公开号0952221)，PantoeaananatisAJ13356(FERMBP-6615，欧洲专利公开号0952221)，PantoeaananatisAJ13601(FERMBP-7207，欧洲专利公开号0952221)，PantoeaananatisSC17(FERMBP-11091，欧洲专利公开号0952221)。一种示例性的λ-Red抗性菌株是PantoeaananatisSC17(0)(VKPMB-9246，俄罗斯申请2006134574)。所述SC17菌株于2009年2月4日根据布达佩斯条约保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnology,InternationalPatentOrganismDepository)(地址：邮政编码305-8566日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，并指定保藏号FERMBP-11091。所述SC17(0)菌株于2005年9月21日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms(VKPM)，GNIIGenetika)(地址：Russia，117545Moscow，1Dorozhnyproezd.1)，保藏号为VKPMB-9246，然后于2006年10月13日根据布达佩斯条约转为国际保藏。
根据本发明公开的主题，修饰肠杆菌科细菌以增加具有氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白质或其变体的活性，或具有氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白质或其变体的活性，或这两个蛋白质的活性。
在本发明公开的主题的一个实施方案中，当所述细菌已经修饰而至少增加了具有SEQIDNO:4氨基酸序列的蛋白质或其变体时，进一步修饰所述细菌以增加编码SEQIDNO:6的蛋白质或其变体的DNA的表达。
具有氨基酸序列SEQIDNO:2的蛋白质或其变体的实例包括c0011基因。具有氨基酸序列SEQIDNO:4的蛋白质或其变体的实例包括c0603基因。具有氨基酸序列SEQIDNO:6的蛋白质或其变体的实例包括c09478基因。
来自菌株P.ananatisSC17的c0011基因的核苷酸序列和由所述c0011基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。
来自菌株P.ananatisSC17的d0663基因的核苷酸序列和由所述d0663基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:3和SEQIDNO:4。
来自菌株P.ananatisSC17的c09478基因的核苷酸序列和由所述c09478基因编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于SEQIDNO:5和SEQIDNO:6。
因为在肠杆菌科的属或株之间DNA序列可有一些差异，所述c0011、d0663和c09478基因并不限于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5中所示的基因，而还可包括与SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5同源的基因。
所述c0011基因可编码肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)的推定的跨膜蛋白(GenBank登录号ABR77369.1)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacterkoseri)的假定蛋白KCO_01469(GenBank登录号ABV12602.1)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)的通透酶(DMT)超家族(GenBank登录号ABO12139.2)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的推定的膜蛋白(GenBank登录号ABR86455.1)。
所述d0663基因可编码塔斯马尼亚欧文氏菌(Erwiniatasmaniensis)的赖氨酸输出蛋白(LYSE/YGGA)(GenBank登录号CAO95150.1)，黑腐果胶杆菌(Pectobacteriumatrosepticum)的推定的膜蛋白(GenBank登录号CAG76207.1)，紫色色杆菌(Chromobacteriumviolaceum)的可能的转运蛋白(GenBank登录号AAQ59575.1)，以及越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)的赖氨酸输出蛋白(LYSE/YGGA)(GenBank登录号ABO58107.1)。
因此，由所述c0011、d0663和c09478基因编码的蛋白质变体可相对于示于SEQIDNO:2、SEQIDNO:4和SEQIDNO:6中所示的完整氨基酸序列分别具有不少于80%，在另一个实例中不少于90%，在另一个实例中不少于95%，或在另一个实例中不少于98%，且在另一个实例中不少于99%的同源性，只要所述蛋白质赋予针对半胱氨酸的抗性。短语“蛋白质变体”可意指在其序列中具有改变的蛋白质，无论这些改变是氨基酸缺失、插入、添加或取代。变体蛋白质中改变的数目取决于在所述蛋白质三维结构中的位置或氨基酸残基的类型。其可为SEQIDNO:2，SEQIDNO:4和SEQIDNO:6中的1-30个，在另一个实例中为1-15个，在另一个实例中为1-5个。这些变体中的变化可发生于蛋白质中对该蛋白质三维结构并非至关重要的区域。这是因为一些氨基酸彼此之间具有高同源性，因此三维结构并不受该变化的影响。
两个氨基酸序列的同源性可使用公知的方法来确定，例如，计算机程序BLAST2.0，其计算三个参数：得分(score)、同一性(identity)和相似性(similarity)。在本说明书中，“同源性”可意指“同一性”。
一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、插入或添加可为保守突变，从而使得活性得以维持。代表性的保守突变可为保守取代。保守取代的实例包括用Ser或Thr取代Ala，用Gln、His或Lys取代Arg，用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn，用Asn、Glu或Gln取代Asp，用Ser或Ala取代Cys，用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln，用Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu，用Pro取代Gly，用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His，用Leu、Met、Val或Phe取代Ile，用Ile、Met、Val或Phe取代Leu，用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys，用Ile、Leu、Val或Phe取代Met，用Trp、Tyr，Met、Ile或Leu取代Phe，用Thr或Ala取代Ser，用Ser或Ala取代Thr，用Phe或Tyr取代Trp，用His、Phe或Trp取代Tyr，和用Met，Ile或Leu取代Val。
因此，所述c0011、d0663和c09478基因可以是在严格条件下与分别示于SEQIDNO:1、SEQIDNO:3和SEQIDNO:5的核苷酸序列或与可从这些核苷酸序列制备的探针杂交的变体，只要其编码功能性蛋白。“严格条件”包括这样的条件，在该条件下，形成特异性杂合体，例如具有不少于60%，在另一个实例中不少于70%，且在另一个实例中不少于80%，在另一个实例中不少于90%，在另一个实例中不少于95%，在另一个实例中不少于98%，在另一个实例中不少于99%的同源性的杂合体，而不形成非特异性杂合体，例如具有低于上述同源性的同源性的杂合体。例如，严格条件可以举例如下：在60℃，于1×SSC，0.1%SDS的盐浓度下，在另一个实例中于0.1×SSC，0.1%SDS的盐浓度下，洗涤一次或多次，且在另一个实例中洗涤两次或三次。洗涤时间取决于用于印迹的膜的类型，通常而言应依照生产商的推荐。例如，对于HybondTMN+尼龙膜(Amersham)，严格条件下的推荐洗涤时间是15分钟。洗涤可进行2-3次。探针的长度可取决于杂交条件合适地选取，且可为100bp-1kbp。
短语“细菌已经过修饰而增加了蛋白质活性”意指所述蛋白质在所述细胞中的活性与未经修饰的微生物(例如，亲本或野生型菌株)相比较高。所述蛋白质的活性可在细胞中通过增强编码所述蛋白质的基因的表达来提高。上述修饰的实例可包括增加每个细胞中表达基因的拷贝数，增加所述基因的表达水平等。表达基因的拷贝数的数量可通过，例如，限制酶切(restricting)染色体DNA，然后使用基于所述基因序列的探针进行的Southern印迹，荧光原位杂交(FISH)等来测定。基因表达的水平可通过多种已知方法，包括Northern印迹、定量RT-PCR等来测定。
更具体而言，对c0011、d0663或c09478基因表达的增强可通过分别增加所述c0011、d0663或c09478基因的拷贝数，修饰所述c0011、d0663或c09478基因的表达调节序列，扩增编码负责增加所述c0011、d0663或c09478基因的表达的调节因子的基因，或者通过使用转化或同源重组技术，破坏或减弱分别负责降低所述c0011、d0663或c09478基因的表达的调节因子的基因来实现。
例如，重组DNA可通过将包含所述c0011、d0663或c09478基因的基因片段连接于载体，优选多拷贝载体(其可在宿主微生物中复制)，并将所得的载体引入所述宿主微生物来制备。
所述c0011、d0663或c09478基因的拷贝数还可通过将所述基因的多重拷贝整合入微生物的染色体DNA来增加。为了将所述c0011、d0663或c09478基因的多重拷贝整合入微生物的染色体DNA，可通过靶向在染色体DNA上以多重拷贝存在的序列进行同源重组。可使用转座子末端的反向重复序列和重复DNA。或者，如JP2-109985A中公开的，还可将所述c0011、d0663或c09478基因整合入转座子，然后使其转移，从而使得所述基因的多重拷贝整合入所述染色体DNA。所述c0011、d0663或c09478基因在染色体中的整合可通过使用具有所述c0011、d0663或c09478基因的部分序列的探针进行Southern杂交来确认。
增强所述c0011、d0663或c09478基因的表达还可通过将染色体DNA或质粒上的表达调节序列(包括所述c0011、d0663或c09478基因的启动子)替换成更强的相应序列来加以实现，如WO00/18935中所述。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、PL启动子等为强启动子。而且，还可将几个核苷酸取代引入所述c0011、d0663或c09478基因的启动子区，从而使得所述启动子变强。评价启动子强度的方法和强启动子的实例公开于Goldstein等(Prokaryoticpromotersinbiotechnology.Biotechno1.Annu.Rev.,1995,1,105-128)。此外，已知在核糖体结合位点(RBS)和翻译起始密码子间隔序列(spacersequence)，特别是所述起始密码子紧邻上游的几个核苷酸，对翻译效率具有巨大的影响。因此可修饰该序列。所述c0011、d0663或c09478基因的表达调节序列可使用用于启动子鉴定的载体或遗传分析软件(如GENETYX)来鉴定。还可以通过延长mRNA的寿命来改进表达。此外，还可通过阻止所述酶蛋白的降解来增加酶活性。
为了增强由所述c0011、d0663或c09478基因编码的蛋白质的活性，可将增加L-氨基酸输出能力的突变引入所述c0011、d0663或c09478基因。增强由所述c0011、d0663或c09478基因编码的蛋白质(C0001、D0663或C09478蛋白质)的活性的突变的实例包括增加所述c0011、d0663或c09478基因转录的启动子序列突变，和增加所述C0001、D0663或C09478蛋白质比活性的c0011、d0663或c09478基因编码区突变。
制备质粒DNA、消化并连接DNA、转化、选择寡核苷酸作为引物等的方法可为本领域技术人员公知的通常方法。这样的方法描述于，例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,“MolecularCloning:ALaboratoryManual，SecondEdition”，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989)。
L-氨基酸-生产菌
可使用能够生产芳族或非芳族L-氨基酸的细菌。
所述细菌可通过将编码能够赋予针对半胱氨酸的抗性的蛋白质的基因引入固有地具有生产L-氨基酸能力的细菌来获得。或者，所述细菌可通过将生产L-氨基酸的能力赋予已经具有能够赋予针对半胱氨酸的抗性的蛋白质的细菌来获得。
L-苏氨酸生产菌
可用于得到L-苏氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌TDH-6/pVIC40(VKPMB-3996)(美国专利号5,175,107，美国专利号5,705,371)，大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利号5,631,157)，大肠杆菌NRRL-21593(美国专利号5,939,307)，大肠杆菌FERMBP-3756(美国专利号5,474,918)，大肠杆菌FERMBP-3519和FERMBP-3520(美国专利号5,376,538)，大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语),14,947-956(1978))，大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)等。
菌株TDH-6具有缺陷的thrC基因，为蔗糖同化型，且其ilvA基因具有泄漏突变(leakymutation)。该菌株还在rhtA基因中具有突变，其赋予针对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的抗性。菌株B-3996包含质粒pVIC40，其通过将包含突变型thrA基因的thrA*BC操纵子插入由RSF1010衍生的载体来获得。所述突变型thrA基因编码基本上对由苏氨酸导致的反馈抑制脱敏的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-UnionScientificCenterofAntibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Russia,117105Moscow,NagatinskayaStreet3-A)，保藏号为RIA1867。该菌株也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(RussianNationalCollectionofIndustrialMicroorganisms)(VKPM)(Russia,117545Moscow,1stDorozhnyproezd.,1)，保藏号为B-3996。
还可以使用大肠杆菌VKPMB-5318(EP0593792B)作为亲本菌株以得到本发明的L-苏氨酸生产菌。B-5318菌株对于异亮氨酸是原养型的，并且温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子替换了pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调节区。VKPMB-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM，Russia,117545Moscow,1stDorozhnyproezd.,1)，保藏号为VKPMB-5318。
可进一步修饰所述细菌以增强一种或多种下述基因的表达：
-突变型thrA基因，其编码对由苏氨酸导致的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；
-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；
-thrC基因，其编码苏氨酸合酶；
-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；
-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；和
-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)；
编码大肠杆菌的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的thrA基因已经阐明(核苷酸位置337-2799，GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL基因和thrB基因之间。编码大肠杆菌的高丝氨酸激酶的thrB基因已经阐明(核苷酸位置2801-3733，GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。所述thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA基因和thrC基因之间。编码大肠杆菌的苏氨酸合酶的thrC基因已经阐明(核苷酸编号3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2,gi:49175990)。所述thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所有三个基因作为单一的苏氨酸操纵子起作用。为增强所述苏氨酸操纵子的表达，可从操纵子中去除影响转录的弱化子区域(WO2005/049808，WO2003/097839)。
编码对由苏氨酸导致的反馈抑制有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作为一个操纵子从公知的质粒pVIC40中获得，所述质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌菌株VKPMB-3996中。pVIC40质粒在美国专利号5,705,371中详细描述。
所述rhtA基因存在于大肠杆菌染色体上的18min处，靠近编码谷氨酰胺转运系统的组分的glnHPQ操纵子。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸位置764-1651，GenBank登录号AAA218541,gi:440181)相同，且位于pexB与ompX基因之间。表达由ORF1编码的蛋白的单元称为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸有抗性)。此外，已经显示rhtA23突变是在相对于ATG起始密码子的-1位置用A取代G(ABSTRACTSofthe17thInternationalCongressofBiochemistryandMolecularBiologyinconjugationwithAnnualMeetingoftheAmericanSocietyforBiochemistryandMolecularBiology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学协会年会摘要),SanFrancisco,California,1997年8月24-29日,摘要号457，EP1013765A)。
大肠杆菌的asd基因已经阐明(核苷酸位置3572511-3571408，GenBank登录号NC_000913.1,gi:16131307)，并且可以利用基于所述基因的核苷酸序列制备的引物通过PCR来获得(参见White,T.J.等,TrendsGenet.,5,185(1989))。其它微生物的asd基因可以通过类似方式获得。
此外，大肠杆菌的aspC基因已经阐明(核苷酸位置983742-984932，GenBank登录号NC_000913.1,gi:16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以通过类似方式获得。
L-赖氨酸生产菌
属于埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物可抑制属于埃希氏菌属的细菌的生长，但是这种抑制在当L-赖氨酸存在于培养基中时会被全部或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例可以包括但不限于，氧代赖氨酸(oxalysine)，赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)，S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变体可以通过对属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理来得到。可用于生产L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERMBP-1543，NRRLB-12185；参见美国专利号4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，由L-赖氨酸导致的天冬氨酸激酶的反馈抑制是脱敏的。
WC196菌株可以用作大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌。该细菌菌株是通过对源自大肠杆菌K-12的W3110菌株赋予AEC抗性来培育的。所得的菌株命名为大肠杆菌AJ13069菌株，于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6,305-8566)，并获得登录号FERMP-14690。后于1995年9月29日根据布达佩斯条约的规定转为国际保藏，并获得登录号FERMBP-5252(美国专利号5,827,698)。
可用于得到L-赖氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括其中一个或多个编码L-赖氨酸生物合成酶的基因的表达被增强的菌株。这样的基因的实例包括但不仅限于，编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利号6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)、以及天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195A)的基因。此外，所述亲本菌株可具有下述基因的提高的表达：涉及能量效率的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利号5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)、或其组合。
可用于得到L-赖氨酸生产菌的亲本菌株的实例，还包括催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支而生成L-赖氨酸以外化合物的反应的酶的活性减少或消除的菌株。上述酶的实例，包括高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利号5,827,698)和苹果酸酶(WO2005/010175)。
L-半胱氨酸生产菌
可用于得到L-半胱氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌JM15，其用编码反馈抗性的丝氨酸乙酰转移酶的不同的cysE等位基因转化(美国专利号6,218,168；俄罗斯专利申请2003121601)；大肠杆菌W3110，其具有过表达的编码适于分泌对细胞有毒性的物质的蛋白质的基因(美国专利号5,972,663)；具有降低的半胱氨酸脱巯基酶活性的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因编码的半胱氨酸调节子的正转录调节物的活性增加的大肠杆菌W3110(WO0127307A1)等。
生产L-半胱氨酸衍生物的细菌
可用于得到半胱氨酸衍生物生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，如下所述的菌株。生产γ-谷氨酰半胱氨酸的能力可通过，例如，增强γ-谷氨酰半胱氨酸合酶的活性和/或减少谷胱甘肽合成酶的活性来实现。生产谷胱甘肽的能力可通过增强γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶和/或谷胱甘肽合成酶的活性来实现。使用突变的、不受谷胱甘肽反馈抑制的γ-谷氨酰半胱氨酸合酶也可赋予和/或改进生产谷胱甘肽的能力。Yin等总结了微生物生产谷胱甘肽的方法(YinLi,GongyuanWei,JianChen.ApplMicrobiolBiotechnol(2004)66:233-242)。生产甲硫氨酸的能力可通过赋予L-苏氨酸营养缺陷型或正亮氨酸抗性来实现(日本专利申请公开号2000-139471)。使甲硫氨酸阻遏物失活和/或增强甲硫氨酸生物合成途径(即高丝氨酸O-琥珀酰转移酶和胱硫醚γ-合酶)对于赋予或改进生产甲硫氨酸的能力也可为有效的(日本专利申请公开号2000-139471)。此外，使用不受甲硫氨酸反馈抑制的突变型高丝氨酸O-琥珀酰转移酶也可赋予和/或改进生产甲硫氨酸的能力。因为胱硫醚和高丝氨酸是甲硫氨酸生物合成的中间产物，上述生产甲硫氨酸的方法的一部分可用于它们的生产。日本专利公开号2003-010654(利用甲硫氨酸营养缺陷型)和日本专利公开号2005-16482(在生产培养基中补充半胱氨酸或高丝氨酸)中描述了改进胱硫醚生产的具体实例。因为胱硫醚是高半胱氨酸的前体，这些方法可用于生产高半胱氨酸。生产S-腺苷甲硫氨酸的能力可通过增强甲硫氨酸腺苷转移酶(欧洲专利号0647712，欧洲专利号1457569)和/或流出泵(effluxpump)MdfA(美国专利号7410789)来实现。
L-亮氨酸生产菌
可用于得到L-亮氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPMB-7386，美国专利号6,124,121))，或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩基丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-偶氮亮氨酸、5,5,5-三氟亮氨酸)有抗性的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A)、通过WO96/06926中描述的基因工程方法获得的大肠杆菌菌株、大肠杆菌H-9068(JP8-70879A)等。
可以通过增强涉及L-亮氨酸生物合成的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。其实例包括leuABCD操纵子中的基因，其优选以突变的leuA基因为代表，该基因编码不受L-亮氨酸反馈抑制的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强编码负责从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
L-组氨酸生产菌
可用于得到L-组氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPMB-5945，RU2003677)；大肠杆菌80菌株(VKPMB-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRLB-12116-B-12121(美国专利号4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERMBP-6675)和H-9343(FERMBP-6676)(美国专利号6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利号6,258,554)等。
可用于得到本发明的L-组氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括编码L-组氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。这样的基因的实例包括编码ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚胺甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazolecarboxamideribotideisomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等的基因。
已知由hisG和hisBHAFI编码的L-组氨酸生物合成酶被L-组氨酸所抑制，并因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶基因中引入赋予对反馈抑制的抗性的突变来有效地增强生产L-组氨酸的能力(俄罗斯专利号2003677和2119536)。
具有L-组氨酸生产能力的菌株的具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048，它们已被携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体所转化(JP56-005099A)，用氨基酸输出基因rht转化的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1,2,4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPMB-7270，俄罗斯专利号2119536)，等等。
L-谷氨酸生产菌
可用于得到L-谷氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC+(EP1172433)。大肠杆菌VL334(VKPMB-1641)是在thrC和ilvA基因中具有突变的L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型菌株(美国专利号4,278,765)。按照通用的转导方法使用在野生型大肠杆菌K12(VKPMB-7)细胞上生长的细菌噬菌体P1来转移所述thrC基因的野生型等位基因。结果，得到了能够生产L-谷氨酸的L-异亮氨酸营养缺陷型菌株VL334thrC+(VKPMB-8961)。
可用于得到L-谷氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株，或一种或多种编码L-谷氨酸生物合成酶的基因增强的菌株。参与L-谷氨酸生物合成的基因的实例包括编码下述酶的基因：谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、顺乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸羧化酶(pyc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA，pgmI)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)的基因。
经修饰使得柠檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。
经修饰而使得柠檬酸合成酶基因和/或磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因的表达减少，和/或具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。
可用于得到L-谷氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括这样的菌株，其中通过从L-谷氨酸生物合成途径分支而催化除L-谷氨酸之外的化合物的合成的酶活性减少或消除。这样的酶的实例包括异柠檬酸裂合酶(aceA)，α-酮戊二酸脱氢酶(sucA)，磷酸转乙酰酶(pta)、乙酸激酶(ack)、乙酰羟酸合酶(ilvG)，乙酰乳酸合酶(ilvI)，甲酸乙酰转移酶(pfl)，乳酸脱氢酶(ldh)，和谷氨酸脱羧酶(gadAB)。属于埃希氏菌属、具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或α-酮戊二酸脱氢酶活性减少的细菌，以及获得它们的方法描述于美国专利号5,378,616和5,573,945。具体而言，这些菌株包括下列：
大肠杆菌W3110sucA::KmR
大肠杆菌AJ12624(FERMBP-3853)
大肠杆菌AJ12628(FERMBP-3854)
大肠杆菌AJ12949(FERMBP-4881)
大肠杆菌W3110sucA::KmR是通过破坏大肠杆菌W1330的α-酮戊二酸脱氢酶基因(下文中称作“sucA”基因)获得的菌株。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺陷。
L-谷氨酸生产菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并具有针对天冬氨酸抗代谢物的抗性的那些。这些菌株也可具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷，并包括，例如，大肠杆菌AJ13199(FERMBP-5807)(美国专利号5,908,768)；，FFRMP-12379，其还具有低的L-谷氨酸分解能力(美国专利号5,393,671)；AJ13138(FERMBP-5565)(美国专利号6,110,714)等。
L-谷氨酸生产菌的实例包括属于泛菌属、具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷或具有减少的α-酮戊二酸脱氢酶活性的突变菌株，且可如上所述获得。这样的菌株包括PantoeaananatisAJ13356。(美国专利号6,331,419)。PantoeaananatisAJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(NationalInstituteofBioscienceandHuman-Technology,AgencyofIndustrialScienceandTechnology)(现在为独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心，地址为日本筑波市东1丁目1番地1中央第6，邮编305-8566)，登录号为FERMP-16645。依据布达佩斯条约的规定，该保藏物于1999年1月11日转为国际保藏，并获得登录号FERMBP-6615。PantoeaananatisAJ13356由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)的破坏而具有α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷。上述菌株在其被分离时鉴定为成团肠杆菌(Enterobacteragglomerans)，并作为成团肠杆菌AJ13356保藏。然而，最近基于16SrRNA的核苷酸测序等将其重新归类为Pantoeaananatis。尽管AJ13356在前述保藏机构作为成团肠杆菌保藏，就本说明书而言，将其描述为Pantoeaananatis。
L-苯丙氨酸生产菌
可用于得到L-苯丙氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10,tyrR)(VKPMB-8197)；携带突变型pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利号5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRLB-12141，NRRLB-12145，NRRLB-12146和NRRLB-12147(美国专利号4,407,952)等。此外，也可以使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERMBP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERMBP-12662)和命名为AJ12604(FERMBP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4,pACMAB]作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用属于埃希氏菌属、由yedA基因或yddG基因所编码的蛋白活性增强的L-苯丙氨酸生产菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
L-色氨酸生产菌
可用于得到L-色氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如可使用大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其具有由突变的trpS基因编码的色氨酰-tRNA合成酶缺陷(美国专利号5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码不受丝氨酸反馈抑制的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码不受色氨酸反馈抑制的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilatesynthase)的trpE等位基因(美国专利号6,180,373)；酶色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRLB-12264)(美国专利号4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸的生产能力增强的大肠杆菌AGX17/pGX50,pACKG4-pps(WO9708333,美国专利号6,319,696)等。还可以使用属于埃希氏菌属、由yedA基因或yddG基因编码的鉴定的蛋白的活性增强的L-色氨酸生产菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
可用于得到L-色氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括选自邻氨基苯甲酸合酶、磷酸甘油酸脱氢酶和色氨酸合酶中的一种或多种酶活性增强的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者均受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入使其对反馈抑制脱敏的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括携带脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164，和通过将质粒pGH5导入大肠杆菌SV164而获得的转化体菌株(WO94/08031)，所述质粒包含编码反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的突变serA基因。
可用于得到L-色氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括引入了包含编码脱敏型邻氨基苯甲酸合酶的基因的色氨酸操纵子的菌株(JP57-71397A,JP62-244382A，美国专利号4,371,614)。而且，L-色氨酸生产能力可通过增强编码色氨酸操纵子(trpBA)中色氨酸合酶的基因的表达来赋予。所述色氨酸合酶包括分别由trpA和trpB基因编码的α和β亚基。此外，L-色氨酸生产能力可通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进(WO2005/103275)。
L-脯氨酸生产菌
可用于得到L-脯氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷且能够生产L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPMB-8012)(EP1172433)。所述细菌可通过增强一种或多种涉及L-脯氨酸生物合成的基因的表达来改进。上述L-脯氨酸生产菌的基因的优选实例包括，编码已对L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利3127361)。此外，所述细菌可通过增强一种或多种编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白质的基因的表达来改进。上述基因可通过b2682基因和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)例示。
属于埃希氏菌属、具有L-脯氨酸生产能力的细菌的实例，包括下述大肠杆菌菌株：NRRLB-12403和NRRLB-12404(英国专利2075056)、VKPMB-8012(俄罗斯专利申请2000124295)、德国专利3127361中描述的质粒突变体、BloomF.R等(The15thMiamiwintersymposium,1983,p.34)描述的质粒突变体等。
L-精氨酸生产菌
可用于得到L-精氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌菌株237(VKPMB-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其携带突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请2001112869)，大肠杆菌菌株382(VKPMB-7926)(EP1170358A1)，其中引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamatesynthetase)的argA基因的精氨酸生产菌株(EP1170361A1)等。
可用于得到L-精氨酸生产菌的亲本菌株的实例还包括增强了一种或多种编码L-精氨酸生物合成酶的基因的表达的菌株。这样的基因的实例包括编码下述酶的基因：N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶(carAB)。
L-缬氨酸生产菌
可用于得到L-精氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括属于埃希氏菌属的菌株，如H-81(VKPMB-8066)，NRRLB-12287和NRRLB-12288(美国专利号4,391,907)，VKPMB-4411(美国专利号5,658,766)，VKPMB-7707(欧洲专利申请EP1016710A2)等。
可用于得到L-缬氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于经修饰而过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利号5,998,178)。理想的是将弱化作用所需的ilvGMEDA操纵子的区域除去，以使得操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。而且，可将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。
可用于得到L-缬氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括具有氨基-酰基t-RNA合成酶突变的突变体(美国专利号5,658,766)。例如，可使用在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变的大肠杆菌VL1970。大肠杆菌VL1970于1988年6月24日以登录号VKPMB-4411保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia,117545Moscow,1stDorozhnyProezd.,1)。
而且，还可以将生长需要硫辛酸(lipoicacid)的突变株和/或缺乏H+-ATPase的突变体用作亲本菌株(WO96/06926)。
L-异亮氨酸生产菌
可用于得到L-异亮氨酸生产菌的亲本菌株的实例包括但不仅限于，对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)、对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸等具有抗性的突变体、以及对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变体(JP5-130882A)。而且，亦可将用编码参与L-异亮氨酸生物合成的蛋白质(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶)的基因转化的重组菌株用作亲本菌株(JP2-458A，FR0356739，以及美国专利号5,998,178)。
L-酪氨酸生产菌
酪氨酸生产菌的实例包括具有脱敏型预苯酸脱水酶基因(tyrA)的埃希氏菌属菌株。该基因的表达产物对酪氨酸的抑制脱敏(欧洲专利申请公开号1616940)。
2.生产L-氨基酸的方法
描述了通过在培养基中培养本文所述的细菌以生产L-氨基酸并将L-氨基酸排入培养基，并且从所述培养基收集L-氨基酸而生产L-氨基酸的方法。
L-氨基酸的培养、收集及其从培养基的纯化等可以以与使用细菌生产氨基酸的常规发酵方法类似的方式进行。
用于培养的培养基可为合成或天然培养基，只要所述培养基包含碳源和氮源以及矿物质，且如果必要，包含合适量的细菌生长所需的营养物。作为碳源，可使用糖类(如葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜和淀粉水解物)，有机酸(如富马酸、柠檬酸和琥珀酸)，醇类(如乙醇和甘油)。作为氮源，可使用多种铵盐(如氨和硫酸铵)，其它含氮化合物(如胺)，天然氮源(如蛋白胨、大豆水解物和经消化的发酵微生物)。作为矿物质，可使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙等。作为维生素，可使用硫胺素、酵母提取物等。
所述培养可在有氧条件下进行，如通过在20-40℃，或在另一实例中30-38℃的温度进行通气振荡和/或搅拌进行。培养物的pH通常为5-9，或在另一个实例中为6.5-7.2。培养物的pH可用氨、碳酸钙、多种酸、多种碱和缓冲液调整。通常，1-5天培养导致目标L-氨基酸在液体培养基中积累。
在培养后，可通过离心或膜过滤从液体培养基移出固体(如细胞)，然后所述L-氨基酸可通过离子交换(Nagai,H.等,SeparationScienceandTechnology,39(16),3691-3710)、浓缩、膜分离方法(日本专利申请公开号9-164323和9-173792)、结晶方法(WO2008/078448,WO2008/078646)和/或其它方法来收集并纯化。
收集的L-氨基酸除了L-氨基酸之外，还可包含细菌细胞、培养基组分、水分和所述微生物的副产物代谢物。收集的L-氨基酸的纯度为，例如，50%或更高，85%或更高或甚至95%或更高(美国专利号5,431,933，日本专利公开号1-214636，美国专利号4,956,471，4,777,051，4,946,654，5,840,358，6,238,714，美国专利申请公开号2005/0025878)。
如上所述获得的L-半胱氨酸可用于生产半胱氨酸衍生物。所述半胱氨酸衍生物包括甲基半胱氨酸、乙基半胱氨酸、羰基半胱氨酸、磺基半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸等。
此外，当L-半胱氨酸的噻唑烷衍生物在培养基中积累时，可通过使噻唑烷衍生物和L-半胱氨酸之间反应平衡向L-半胱氨酸一侧改变来产生L-半胱氨酸。此外，当S-磺基半胱氨酸在培养基中积累时，可通过使用还原剂(如二硫苏糖醇)来将其转化为L-半胱氨酸。
实施例
下面参考下述非限定性实施例对本发明更加具体地加以说明。
实施例1基因c0011和基因位点d0663-c09478各自的过表达
1-1从P.ananatisSC17克隆c0011基因
使用引物P1(SEQIDNO:7)和P2(SEQIDNO:8)用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)通过PCR(94℃5分钟，然后进行30个循环，每个循环98℃5秒，55℃10秒，72℃4分钟)从P.ananatisSC17基因组DNA获得包含c0011ORF下游大约300nt和下游200nt的DNA片段。
利用在每个引物5’端设计的BamHI位点将获得的1.4kbDNA片段克隆入质粒pSTV29(TakaraBioInc.)以获得质粒pSTV-c0011PF，其中c0011基因与位于pSTV29上的lacZ启动子处于同一方向。
1-2从P.ananatisSC17克隆d0663-c09478基因位点
从P.ananatisSC17基因组DNA使用引物P3SEQIDNO:9)和P4(SEQIDNO:10)用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)通过PCR(94℃5分钟，然后进行30个循环，每循环98℃5秒，55℃10秒，72℃3分钟)获得包含d0663ORF下游大约200nt到c09478ORF下游大约200nt的DNA片段。利用在每个引物5’端设计的BamHI位点将获得的2.6kbDNA片段克隆入pSTV29以获得质粒pSTV-PA36ccd，其中c09478基因与位于pSTV29上的lacZ启动子处于同一方向。
1-3c0011和d0663-c09478对于半胱氨酸抗性的作用
为了测试c0011基因和包含两个基因d0663和c09478的基因位点对半胱氨酸抗性的作用，将pSTV-c0011PF和pSTV-PA36ccd，以及作为对照的相应载体pSTV29引入大肠杆菌菌株MG1655(ATCC47076，ATCC700926)，并使每个转化体在含有对野生型或对照菌株而言有毒的浓度的L-半胱氨酸的M9基本培养基(Sambrook等,Molecularcloning,第3版,2001ColdSpringHarborLaboratoryPress)中生长。将每个在装有3ml补充了0.4%葡萄糖的M9基本培养基(M9Glc培养基)的试管中在34℃培养的过夜培养物1:100稀释于总共3ml的含50μM半胱氨酸的新鲜M9Glc培养基中，并在试管中在34℃搅拌生长过夜。然后将细胞接种到试管中的含0和200μM半胱氨酸的新鲜M9Glc培养基中以得到初始OD660为0.007，使用TN-1506保温箱(AdvantecToyo,Tokyo,Japan)自动监视OD660nm。为了维持质粒，将25mg/L氯霉素补充到培养基中。所获得的生长曲线示于图1。从图1可见，携带质粒pSTV-c0011PF和pSTV-PA36ccd的菌株在200μM半胱氨酸的条件下的生长快于携带载体pSTV29的对照菌株，表明这些基因/基因位点可赋予针对半胱氨酸的抗性。这些作用也许可以归因于由c0011和d0663导致的半胱氨酸排出，从而缓解了胞内半胱氨酸的毒性作用，因为对它们二级结构的预测表明它们具有能跨膜转运小分子的转运蛋白的典型的多重跨膜螺旋。
实施例2c0011对半胱氨酸发酵生产的作用
2-1构建用于过表达c0011的质粒
使用两种具有不同启动子强度的表达质粒pMIV-Pnlp0和pNIV-Pnlp23进行c0011过表达。这些质粒包含强的nlp0启动子(或nlp23启动子)和rrnB终止子，以便可将目标基因克隆于这些结构之间而形成表达单元。启动子“Pnlp0”(SEQIDNO:11)来源于大肠杆菌K-12nlpD基因的启动子，“Pnlp23”(SEQIDNO:12)和“Pnlp8”(SEQIDNO:13)(参见下文详述)为具有不同启动子活性强度的变体(US2010209977)。构建这些表达质粒的总体方案在下文中作为构建质粒pMIV-Pnlp0-YeaS3加以描述(参见参考实施例1)，其中利用分别在所述ORF始端和末端设计的独特限制性位点SalI和XbaI将大肠杆菌K12的yeaS基因克隆到nlp0启动子和rrnB终止子之间。为了获得基于pMIV-Pnlp0的c0001的表达质粒，可应用具有SalI和XbaI的相同构建体，从而以c0011基因替换pMIV-Pnlp0-YeaS3上的yeaS基因，以得到pMIV-Pnlp0-c0011。此外，pMIV-Pnlp23-c0011可用相同的示意性方法使用SalI和XbaI获得，因为这两个质粒的基本结构几乎相同，只是它们在启动子区有少数核苷酸变化。
从P.ananatisSC17基因组DNA使用引物P5(SEQIDNO:14)和P6(SEQIDNO:15)用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)通过PCR(94℃5分钟，然后进行30个循环，每个循环98℃5秒，55℃5秒，72℃90秒)获得包含c0011ORF的DNA片段。利用在每个引物5’端设计的SalI和XbaI位点将所得的DNA片段分别克隆入pMIV-Pnlp0和pMIV-Pnlp23以获得质粒pMIV-Pnlp0-c0011和pMIV-Pnlp23-c0011。质粒pMIV-5JS(JP2008-99668,EP1942183)常规地用于相应的作为对照的空载体。
2-2构建半胱氨酸生产菌株
为了制备能够发酵生产半胱氨酸的大肠杆菌和P.ananatis菌株，构建了携带cysEX基因的质粒，该基因编码O-乙酰基L-丝氨酸硫化氢解酶(半胱氨酸生产的一种关键因子)的反馈抗性突变体(US20050112731A1)。为此目的，使用携带cysEX和ydeD基因的pACYC-DE1作为起始材料(US5972663A)。pACYC-DE1的构建在US2010209977中作为构建pACYC-DES(US2005124049,该质粒携带三个基因：cysEX、ydeD和serA5(US6180373))进行了描述，其中省略了将serA5克隆在质粒上的步骤，从而使得仅cysEX和ydeD位于所述质粒上。然后将pACYC-DE1用限制性酶MluI消化，并进行自连接(self-ligation)以缺失ydeD的ORF内的330bp区，得到pACYC-E1。这样，质粒pACYC-E1仅含有cysEX，它的引入可提供最简单的半胱氨酸生产菌株。将大肠杆菌MG1655和P.ananatisSC17菌株用pACYC-E1转化以分别获得菌株MG1655/pACYC-E1和SC17/pACYC-E1，将它们用作发酵生产半胱氨酸的基础生产菌株。
2-3c0011对大肠杆菌中半胱氨酸生产的作用
为了测试c0011过表达对半胱氨酸生产的作用，将pMIV-Pnlp0-c0011，pMIV-Pnlp23-c0011和pMIV-5JS(对照)引入半胱氨酸生产菌株MG1655/pACYC-E1。对所得的菌株进行生产测试(productiontest)，比较它们发酵生产半胱氨酸的能力。用于发酵实验的培养基组成如下所述：
发酵培养基的组成如下(终浓度)：
组分1：
组分2：
组分3：
细菌用胰蛋白胨0.6g/L
细菌用酵母提取物0.3g/L
NaCl0.6g/L
组分4：
CaCO320g/L
组分5：
L-组氨酸HClH2O135mg/L
组分6：
Na2S2O34g/L
组分7：
吡哆醇HCl2mg/L
组分8：
葡萄糖40g/L
每个组分分别制备为10x(组分1)、1000x(组分2)、100/6x(组分3)、100x(组分5)、350/4x(组分6)、1000x(组分7)和10x(组分8)的浓缩储液。灭菌条件为：在110℃高压灭菌30分钟(组分1、2、3、5和8)，在180℃干热灭菌超过5小时(组分4)和过滤灭菌(组分6和7)。
发酵如下面描述进行。将每个携带pMIV-Pnlp0-c0011，pMIV-Pnlp23-c0011和pMIV-5JS的生产菌株(MG1655/pACYC-E1)划线到LB平板上，并在34℃生长过夜。取一满环(loopful)的细胞(使用10微升蓝色环(NUNC)从充分生长的平板培养物上刮取7cm的细胞)，并接种至试管(内径23mm，所有试管长200mm)中2ml用于发酵的培养基中以起始培养。培养在32℃搅拌下进行，然后在所有糖耗尽(取决于试样，需要21到24小时)时终止。通过Gaitonde,M.K.等(BiochemJ.;104(2):627-33(1967))描述的方法常规地确定培养液中生产的半胱氨酸相关化合物的量。为了维持质粒，在培养过程中将25mg/L氯霉素和20mg/L四环素补充入培养基中。
所述半胱氨酸相关化合物的量和针对消耗的糖的得率，及其相应的标准偏差值(来自四个独立的试管发酵)示于表1。从表1可见，c0011的过表达对在大肠杆菌中半胱氨酸(包括半胱氨酸相关的化合物)生产的增加具有积极作用，其很可能是由于其半胱氨酸流出能力所致。
表1
2-4.c0011对P.ananatis中半胱氨酸生产的作用
为了测试c0011过表达在P.ananatis中对半胱氨酸生产的作用，将质粒pMIV-Pnlp0-c0011，pMIV-Pnlp23-c0011和pMIV-5JS(对照)引入半胱氨酸生产菌株SC17/pACYC-E1。如在用大肠杆菌的实验所述进行生产培养，但培养时间为18小时。半胱氨酸相关化合物的量和针对消耗的糖的得率，及其相应的来自每个菌株的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表2。从表2可见，c0011过表达对在P.ananatis中增加半胱氨酸的生产具有积极作用。
表2
实施例3c0011对氨基酸发酵生产的作用
3-1c0011对大肠杆菌中氨基酸生产的作用
为了测试c0011过表达对除半胱氨酸之外其它氨基酸生产的作用，将pMIV-Pnlp0-c0011和pMIV-5JS(对照)引入MG1655。对所得的菌株进行生产测试，比较氨基酸发酵生产能力。如在用大肠杆菌的半胱氨酸生产实验中所述进行生产培养，但培养时间为19-24.5小时。为了保持质粒，在培养的过程中将25mg/L氯霉素补充入培养基中。对在培养基中产生的L-氨基酸的定量分析使用氨基酸分析仪L-8900(HITACHI)进行。来自每个菌株数据的氨基酸的量及相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表3。从表3可见，c0011的过表达对在大肠杆菌中增加缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、谷氨酸、组氨酸和甘氨酸的生产具有积极作用。
表3
3-2c0011对P.ananatis中氨基酸生产的作用
为了测试c0011过表达对除了半胱氨酸之外其它氨基酸生产的作用，将pMIV-Pnlp0-c0011和pMIV-5JS(对照)引入SC17。对所得的菌株进行生产测试，比较氨基酸发酵生产的能力。如在用大肠杆菌的半胱氨酸生产实验中所述进行生产培养，只是起始葡萄糖浓度设为60g/L且培养时间为16小时。为了维持质粒，在培养过程中将25mg/L氯霉素补充入培养基中。对在培养基中生产的氨基酸的定量分析使用氨基酸分析仪L-8900(HITACHI)进行。来自每个菌株的数据的氨基酸的量及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表4。从表4可见，c0011的过表达对在P.ananatis中增加缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生产具有积极作用，这与大肠杆菌中所有这些氨基酸的生产的结果相似。
表4
实施例4.d0663和d0663-c09478位点对半胱氨酸发酵生产的作用
4-1构建用于过表达d0663和d0663-c09478位点的载体
从P.ananatisSC17的基因组DNA使用引物P3和P4用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)进行PCR(在94℃5分钟后，进行30个循环，每个循环98℃5秒，55℃10秒，72℃3分钟)获得包含d0663ORF下游大约200nt到c09478ORF下游大约200nt的DNA片段。从P.ananatisSC17的基因组DNA使用引物P3和P7(SEQIDNO:16)用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)通过PCR(94℃5分钟，然后进行30个循环，每个循环98℃5秒，55℃10秒，72℃3分钟)获得包含d0663ORF上游大约300nt和下游大约200nt的DNA片段。分别将所得的含有ORFd0663和c09478的2.6kbDNA片段，和含有d0663ORF的1.1kb片段使用在每个引物5’端设计的BamHI位点克隆入pACYC177(NIPPONGENECO.,LTD.,Tokyo,Japan)以得到质粒pACYC-PA36ccd和pACYC-d0663F，其中在pACYC-PA36ccd上的c09478和在pACYC-d0663F上的d0663分别与位于pACYC177上的Kmr基因处于相同方向。
除此之外，构建了基于pMIV-Pnlp8的d0663表达质粒(参见实施例2-1和实施例4-2)。包含P8(SEQIDNO:17)和P9(SEQIDNO:18)的DNA片段用PrimeSTARDNA聚合酶(TakaraBioInc.)扩增(94℃5分钟，然后进行30个循环，每个循环98℃5秒，55℃5秒，72℃90秒)。将所得的DNA片段利用在每个引物5’端设计的SalI和XbaI位点克隆入pMIV-Pnlp8以得到质粒pMIV-Pnlp8-d0663。在实验过程中得到了两个来自pMIV-Pnlp8-d0663的变体克隆，它们与原来构建的pMIV-Pnlp8-d0663相比，赋予大肠杆菌更高水平的半胱氨酸抗性(关于针对半胱氨酸的抗性，参见实施例1)。根据质粒的序列分析，突变并不位于d0663ORF本身，而是在d0663起始密码子的若干个核苷酸上游处，提升了翻译的改变提供了表达水平的升高的可能性。一个突变体的确切位置和碱基取代为C(-3)G(起始密码子上游第三个核苷酸用“G”取代“C”)，而另一个为C(-4)A；这些变体质粒分别命名为pMIV-Pnlp8-d0663(-3)和pMIV-Pnlp8-d0663(-4)，并用作d0663的高度活性的表达质粒。这些突变体也可用公知的定位诱变法使用pMIV-Pnlp8-d0663作为起始材料来构建。质粒pMIV-5JS(JP2008-99668)常规地用作相应的作为对照的空载体。
4-2构建半胱氨酸生产菌株
使用实施例2-2描述的MG1655/pACYC-E1作为能够发酵生产半胱氨酸的大肠杆菌菌株。
对于P.ananatis半胱氨酸生产菌株，制备了SC17/pMIV-CysE5和EYPSGint1M2。所述构建的总体方案步骤如下所述。
质粒pMIV-CysE5提供由cysE5编码的O-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶(半胱氨酸生产的一种必需因子)反馈抗性突变体等位基因(US20050112731A1)。从作为模板的pMW-PompC-cysE5(EP1650296A1)使用引物P10(SEQIDNO:19)和P11(SEQIDNO:20)通过PCR(进行27个循环，每个循环94℃30秒，57℃30秒，72℃1分钟；然后在72℃保持7分钟)获得包含cysE5等位基因的DNA片段。利用在每个引物5’端设计的SalI和XbaI位点将获得的包含cysE5的0.7kbDNA片段克隆入pMIV-PompC以产生pMIV-CysE5。质粒pMIV-PompC是通过将含有来自大肠杆菌K-12的ompC基因的启动子区的0.3kb片段使用SalI和PaeI克隆入pMIV-5JS(JP2008-99668)而构建的，其中该片段是从大肠杆菌MG1655的基因组DNA使用引物P12(SEQIDNO:21)和P13(SEQIDNO:22)通过PCR获得的，并在连接前用SalI和PaeI消化。将pMIV-CysE5引入P.ananatisSC17以提供半胱氨酸生产菌株SC17/pMIV-CysE5。
菌株EYPSGint1M2的构建描述于参考实施例1。
4-3d0663对大肠杆菌中半胱氨酸生产的作用
为了测试d0663过表达对半胱氨酸生产的作用，将质粒pMIV-Pnlp8-d0663(-3)，pMIV-Pnlp8-d0663(-4)和pMIV-5JS(对照)引入半胱氨酸生产菌株MG1655/pACYC-E1。对所得的菌株进行生产测试，比较半胱氨酸发酵生产的能力。如用c0011在大肠杆菌的实验中所述进行生产培养(参见实施例2-3)，只是培养时间为19小时。为了维持质粒，在培养过程中补充25mg/L氯霉素和20mg/L四环素。来自每个菌株的数据的半胱氨酸相关化合物的量和针对消耗的糖的得率，及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表5。从表5可见，d0663过表达对在大肠杆菌中增加半胱氨酸的生产具有积极作用。
表5
4-4d0663和d0663-c09478位点对P.ananatis中半胱氨酸生产的作用
为了确定d0663和d0663-c09478位点过表达对半胱氨酸生产的作用，将pACYC-d0663F、pACYC-PA36ccd(包含两个ORF，d0663和c09478)和pACYC177(对照)引入半胱氨酸生产菌株SC17/pMIV-CysE5。对所得的菌株进行生产测试，比较半胱氨酸发酵生产的能力。如用c0011在大肠杆菌的实验中所述进行生产培养(参见实施例2-3)，只是起始葡萄糖浓度设为60g/L而培养时间为16-20小时。为了维持质粒，在培养过程中将25mg/L氯霉素和20mg/L卡那霉素补充入培养基中。来自每个菌株的数据的半胱氨酸相关化合物的量和针对消耗的糖的得率，及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表6。从表6可见，d0663过表达对在P.ananatis中增加半胱氨酸的生产具有积极作用。发现添加c09478加速了d0663的作用，因为pACYC-PA36ccd与用pACYC-d0663F的生产相比使半胱氨酸生产加倍。
表6
使用EYPSGint1M2作为半胱氨酸生产菌株进行同样的实验。同样，引入质粒pACYC-d0663F、pACYC-PA36ccd(包含两个ORF，d0663和c09478)和pACYC177(对照)，并对所得的菌株进行用c0011在大肠杆菌的半胱氨酸生产实验(参见实施例2-3)中所述的生产测试。为了维持质粒，在培养过程中补充20mg/L卡那霉素。来自每个菌株的数据的半胱氨酸相关化合物的量和针对消耗的糖的得率，及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表7。如从表7可见，d0663过表达对在P.ananatis中增加半胱氨酸的生产具有积极作用，这通过添加c09478进一步促进。
表7
实施例5d0663对氨基酸发酵生产的作用
5-1d0663对P.ananatis中氨基酸生产的作用
为了确定d0663过表达对氨基酸生产的作用，将pMIV-Pnlp8-d0663(-3)，pMIV-Pnlp8-d0663(-4)和pMIV-5JS(对照)引入P.ananatisSC17。对所得的菌株进行生产测试，比较氨基酸发酵生产的能力。如用c0011在大肠杆菌的半胱氨酸生产实验中所述进行生产培养(参见实施例2-3)，只是起始葡萄糖浓度设为60g/L，培养时间为18小时。为了维持质粒，在培养过程中补充25mg/L氯霉素。使用氨基酸分析仪L-8900(HITACHI)进行对在培养基中生产的氨基酸的定量分析。来自每个菌株的数据的氨基酸的量及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表8。如从表8可见，d0663过表达对增加缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和苏氨酸的生产具有积极作用。
表8
实施例6推定的Cys输出蛋白对大肠杆菌的L-缬氨酸发酵生产的作用
6-1d0663(-4)对大肠杆菌中L-缬氨酸生产的作用
为了测试d0663(-4)过表达对缬氨酸生产的作用，将pMIV-Pnlp8-d0663(-4)和pMIV-5JS(对照)质粒引入缬氨酸生产菌株H-81。H-81菌株已于2001年1月30日以登录号VKPMB-8066保藏于俄罗斯国立微生物保藏中心(VKPM)(Russia113545,Moscow,1Dorozhnyproezd,1)，并在2002年2月1日根据布达佩斯条约转为国际保藏。对所得的菌株进行生产测试，比较L-缬氨酸发酵生产的能力。将来自储藏管的细胞(在-70℃储藏于25%甘油，0.9%NaCl中)铺于L-琼脂(酵母提取物-5g/L，蛋白胨-10g/l，NaCl-5g/l，琼脂-15g/l)上。对于质粒菌株，对L-琼脂补充合适的抗生素(Ap-100mg/l，Km-40mg/l)。将来自约0.5cm2平板表面的细胞接种入发酵培养基(2ml)，并在32℃培养72小时。所述发酵培养基的组成如下所述：将蔗糖-60g/l，(NH4)2SO4-15g/l，KH2PO4-1.5g/l，MgSO4-1g/l，硫胺素-0.1g/l，Mameno(豆浓)(TM)-0.4g/l，CaCO3-25g/l，pH7.0(KOH)，合适的抗生素(Km,50mg/l；Ap,100mg/l)添加入培养基。
对组织培养基中生产的缬氨酸的定量分析使用氨基酸分析仪L-8900(HITACHI)进行。来自每个菌株数据的缬氨酸的量及其相应的标准偏差值(四个独立试管的发酵)示于表9。从表9可见，d0663(-4)的过表达对增加大肠杆菌的L-缬氨酸生产具有积极作用。
表9
6-2c0011对大肠杆菌中L-缬氨酸生产的作用
为了测试c0011过表达对L-缬氨酸生产的作用，将pMIV-Pnlp23-c0011质粒引入缬氨酸生产菌株H-81。对所得的菌株与亲本H-81菌株进行生产测试，使用Marubishi发酵罐中的补料分批培养比较L-缬氨酸发酵生产的能力。
将细胞铺板于L-琼脂(酵母提取物-5g/L，蛋白胨-10g/l，NaCl-5g/l，琼脂-15g/l)上。对于质粒菌株，对L-琼脂补充合适的抗生素(Ap-100mg/l，Km-40mg/l)。将来自约0.5cm2平板表面的细胞接种入L-肉汤(胰蛋白胨-10g/l，酵母提取物-5g/l，NaCl-5g/l)培养基(60ml)，并在37℃以240rpm培养20小时。然后将40ml种子培养物转移至小型发酵釜中的360ml发酵培养基中，并在37℃培养20小时，起初以1200rpm搅拌，在18小时培养后，以900rpm搅拌。
发酵培养基的组成如下所述：葡萄糖-30g/l，MgSO47H2O-0.4g/l，Mameno(TM)-0.4g/l，(NH4)2SO4-5.0g/l，KH2PO4-3.0g/l，FeSO47H2O-0.02g/l，MnSO45H2O-0.02g/l，硫胺素-0.4mg/l，消泡剂-0.1mg/l，pH6.6(KOH)。自动添加混合补料(mixedfeed)(葡萄糖-140g，H2O-100ml，浓氨水-53ml)以维持6.6的恒定pH。
缬氨酸生产的数据列于表10。从表10可见，c0011的过表达对在大肠杆菌中增加缬氨酸生产有积极作用。
表10
实施例7d0663对大肠杆菌中O-乙酰基-L-丝氨酸生产的作用
为了测试d0663过表达对O-乙酰基-L-丝氨酸生产的作用，将pMIV-Pnlp8-d0663(-3)和pMIV-5JS(对照)质粒引入半胱氨酸生产菌株MG1655/pACYC-E1。因为菌株MG1655/pACYC-E1在质粒上携带反馈抗性CysE突变，该菌株适于生产O-乙酰基-L-丝氨酸。对所得的菌株进行生产测试，比较O-乙酰基-L-丝氨酸发酵生产的能力。如用c0011在大肠杆菌的实验中所述进行生产培养(参见实施例2)，只是培养时间为26小时。为了维持质粒，在培养过程中补充25mg/L氯霉素和12.5mg/L四环素。为了在碱性pH将产生的O-乙酰基-L-丝氨酸转化为N-乙酰丝氨酸(NAS)，将试样用200mMTris/HCl(pH9.0)稀释。将所得的NAS使用HPLC进行分析。HPLC分析条件如下所述：柱：InertsilODS-3(GLscience)，流速：1.0ml/min，柱温度：40℃，检测器：UV210mm，试样体积：10:l，缓冲液：0.1MK2HPO4-H3PO4(pH2.2)5mM1-辛烷磺酸钠。来自每个菌株三次重复数据的O-乙酰基-L-丝氨酸的量和针对消耗的糖的得率及其相应的标准偏差值示于表11。所得的数据显示，d0063过表达对在大肠杆菌中增加O-乙酰基-L-丝氨酸的生产具有积极作用。
表11
实施例8c0011对大肠杆菌中O-乙酰基-L-丝氨酸生产的作用
为了测试c0011过表达对O-乙酰基-L-丝氨酸生产的作用，将pMIV-Pnlp23-c0011和pMIV-5JS(对照)质粒引入半胱氨酸/O-乙酰基-L-丝氨酸生产菌株MG1655/pACYC-E1。所有生产培养和分析方法与使用d0663增强菌株的O-乙酰基-L-丝氨酸的生产(参见实施例7)中所描述的一样。来自每个菌株三次重复数据的产生的O-乙酰基-L-丝氨酸的量和针对消耗的糖的得率及其相应的标准偏差值示于表12。获得的数据显示，c0011过表达对在大肠杆菌中增加O-乙酰基-L-丝氨酸的生产具有积极作用。
表12
参考实施例1构建基因cysM表达增强的菌株
1.构建菌株P.ananatisEYPS1976(s)
使用PCR获得包含来自大肠杆菌的基因nlpD的启动子的DNA片段。以大肠杆菌MG1655(ATCC700926)菌株的染色体DNA作为模板，将引物P14(SEQIDNO:23)和P15(SEQIDNO:24)用于PCR。引物P14(SEQIDNO:23)在其5’端包含SalI限制酶的位点。引物P15(SEQIDNO:24)在其5’端包含PaeI限制酶的位点。PCR的条件如下：在95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，55℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为0.2kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化。然后，用内切核酸酶PaeI和SalI处理纯化的片段。然后将所得的DNA片段与预先用内切核酸酶PaeI和SalI处理的质粒pMIV-5JS连接(质粒pMIV-5JS的构建描述于EP1942183B1)。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。从所得的转化体分离质粒，并通过限制性分析进行分析。将所得包含来自大肠杆菌的基因nlpD的启动子的质粒命名为pMIV-Pnlp0。
使用PCR获得包含来自大肠杆菌的基因rrnB的终止子的DNA片段。以大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，将引物P16(SEQIDNO:25)和P17(SEQIDNO:26)用于PCR。引物P16(SEQIDNO:25)在其5’端包含XbaI限制酶的位点。引物P17(SEQIDNO:26)在其5’端包含BamHI限制酶的位点。PCR的条件如下：在95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，59℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为0.3kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化。然后，用内切核酸酶BamHI和XbaI处理纯化的片段。然后将所得的DNA片段与预先用内切核酸酶BamHI和XbaI处理的质粒pMIV-Pnlp0连接。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。从所得的转化体分离质粒，并通过限制性分析进行分析。将所得包含来自大肠杆菌的基因rrnB的终止子的质粒命名为pMIV-Pnlp0-ter。
使用PCR获得包含来自大肠杆菌的基因yeaS的DNA片段。以大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板，将引物P18(SEQIDNO:27)和P19(SEQIDNO:28)用于PCR。引物P18(SEQIDNO:27)在其5’端包含SalI限制酶的位点。引物P19(SEQIDNO:28)在其5’端包含XbaI限制酶的位点。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，55℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为0.7kb，将其通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后，用内切核酸酶SalI和XbaI处理纯化的片段。然后将所得的DNA片段与预先用内切核酸酶SalI和XbaI处理的质粒pMIV-Pnlp0-ter连接。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。将质粒从所得的转化体分离，并通过限制性分析进行分析。将所得包含来自大肠杆菌的基因yeaS的质粒命名为pMIV-Pnlp0-yeaS3。
然后进行启动子Pnlp-10区的随机化和Pnlp8启动子的选择。使用PCR扩增获得启动子Pnlp的3’端。以质粒pMIV-Pnlp0作为模板，将引物P14(SEQIDNO:23)和P20(SEQIDNO:29)用于PCR。引物P20具有随机核苷酸，在SEQIDNO:29中以字母“n”描述(代表A或G或C或T)，还在其5’端具有BglII限制性酶的位点。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。使用PCR扩增获得启动子Pnlp的5’端。以质粒pMIV-Pnlp0作为模板，将引物P15(SEQIDNO:24)和P21(SEQIDNO:30)用于PCR。引物P21具有随机核苷酸，在SEQIDNO:30中用字母“n”描述(代表A或G或C或T)，还在其5’端具有BglII限制性酶的位点。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。两个扩增的DNA片段均通过琼脂糖凝胶电泳纯化。然后将所得的DNA片段用内切核酸酶BglII处理，再以等摩尔比例连接所述片段。连接混合物在4℃温育过夜，并作为模板用于下一个PCR程序，将引物P14(SEQIDNO:23)和P15(SEQIDNO:24)用于PCR。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后12个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。
扩增的DNA片段大小约为0.2kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化。然后，用内切核酸酶PaeI和SalI处理纯化的片段。然后将所得的DNA片段与预先用内切核酸酶PaeI和SalI处理的质粒pMIV-Pnlp0-yeaS3连接。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。从所得的转化体分离质粒，并通过限制性分析进行分析。将所得包含启动子Pnlp8的质粒命名为pMIV-Pnlp8-yeaS7。
然后，将质粒pMIV-Pnlp8-yeaS7用内切核酸酶HindIII处理，然后进行纯化，并用DNA聚合酶I大片段(Klenow片段)处理。将所得的DNA纯化并用内切核酸酶NcoI处理。
然后将纯化后所得的DNA片段与预先用内切核酸酶SmaI和NcoI处理的质粒pMT-Pomp-cysE5以等摩尔比例连接(pMT-Pomp-cysE5来源于pMIV-Pomp-cysE5，通过将来自pACYC-184(tet-R)的XbaI-Eco88I/Klenow片段克隆入pMIV-Pomp-cysE5的PvuI位点获得，pMIV-Pomp-cysE5通过将来自pMW-Pomp-cysE5(WO2005007841)的PaeI+SacI片段亚克隆入pMIV-5JS的相同位点获得)。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。从所得的转化体分离质粒，并通过限制性分析进行分析。将所得包含cysE5的质粒命名为pMT-EY2。在所得转化体中测定丝氨酸转乙酰酶的酶活性以确证cysE5等位基因的完整性(intactness)。
下一步骤是将cysE5和yeaS基因整合入P.ananatis菌株SC17(美国专利6,596,517)的染色体。使用质粒pMH10(ZimenkovD.等，Biotechnology(俄语)，6,1-22(2004))通过电穿孔转化P.ananatis菌株SC17。将转化体铺于含卡那霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。将所得的菌株SC17/pMH10重新接种两次。之后，使用质粒pMT-EY2通过电穿孔转化P.ananatis菌株SC17/pMH10(该菌株在30℃生长)。通过在高温温育(42℃，20分钟)将转化体休克(shock)，并铺于含氯霉素(20mg/l)的LB琼脂板。将平板在39℃温育过夜，直至可见单独的菌落。将约50个克隆在39℃重新接种，将它们各自接种于1mlLA培养基中，并在39℃温育48h。在温育后，对所有50个变体测试质粒pMH10和pMT-EY2的消除(curing)。选择对氯霉素(20mg/l)有抗性，但对卡那霉素(20mg/l)和氨苄青霉素(50mg/l)敏感的变体。使用引物P1和P6通过PCR鉴定期望的整合体。所得的株系命名为EY01-EY50，并对所有菌株均测试其在试管发酵中生产半胱氨酸的能力。选择出最佳的生产菌株EY19用于下述实验。
为了消除P.ananatis菌株EY19针对氯霉素的抗性，菌株EY19用质粒pMT-Int-Xis2(WO2005/010175)使用电穿孔进行转化。将转化体铺于含四环素(10mg/l)的LB琼脂板。将平板在30℃温育过夜，直至可见单独的菌落。通过选择对氯霉素(20mg/l)敏感的变体来鉴定目标转化体。“消除的(cured)”菌株命名为EY19(s)。
下一步骤为在所述菌株EY19(s)中用Pnlp8启动子区来取代cysPTWA基因的启动子区。以质粒pMIV-Pnlp8-yeaS7作为模板，使用引物P14和P15进行PCR。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后20个循环的程序：94℃20秒，59℃20秒，72℃15秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为0.2kb，并通过凝胶电泳纯化。然后，用Klenow片段处理纯化的片段。然后将所述DNA片段以等摩尔比例与预先用内切核酸酶XbaI处理继以用Klenow片段处理的质粒pMW118-(λattL-Kmr-λattR)(EP2100957A1)连接。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含卡那霉素(20mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。从所得的转化体分离质粒，并通过限制性分析进行分析。将所得包含启动子Pnlp启动子的质粒命名为pMW-Km-Pnlp8。然后，以质粒pMW-Km-Pnlp8作为模板，使用引物P22(SEQIDNO:31)和P23(SEQIDNO:32)进行PCR。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后30个循环的程序：94℃20秒，54℃20秒，72℃90秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为1.6kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化，并用于通过电穿孔转化P.ananatis菌株SC17(0)。将转化体铺于含卡那霉素(20mg/l)的LB琼脂板。将平板在34℃温育过夜，直至可见单独的菌落。使用引物P24(SEQIDNO:33)和P25(SEQIDNO:34)通过PCR分析来鉴定目标转化体。所得的菌株命名为SC17-Pnlp8-PTWA。从菌株SC17-Pnlp8-PTWA分离染色体DNA。使用10μg该染色体DNA通过电穿孔转化P.ananatis菌株EY19(s)。将转化体铺于含卡那霉素(20mg/l)的LB琼脂板。将平板在34℃温育过夜，直至可见单独的菌落。使用引物P24和P25通过PCR分析来鉴定转化体。所得的菌株命名为EYP197。为了消除P.ananatis菌株EYP197针对卡那霉素的抗性，用质粒pMT-Int-Xis2通过电穿孔转化EYP197。将转化体铺于含四环素(10mg/l)的LB琼脂板。将平板在30℃温育过夜，直至可见单独的菌落。通过选择对卡那霉素(20mg/l)敏感的变体来鉴定目标转化体。“消除的(cured)”菌株命名为EY197(s)。
通过定点诱变引入突变N348A。为此目的，以菌株SC17的染色体DNA作为模板使用引物P26(SEQIDNO:35)和P27(SEQIDNO:36)通过PCR扩增获得基因serA(具有突变)的3’端，以菌株SC17的染色体DNA作为模板使用引物P28(SEQIDNO:37)和P29(SEQIDNO:38)通过PCR扩增获得serA基因的5’端。引物P27(SEQIDNO:36)和P29(SEQIDNO:38)均在其5’端包含SmaI限制酶的位点。第一PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后25个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃60秒；最后步骤：72℃5分钟。第二PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后20个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃20秒；最后步骤：72℃5分钟。两个扩增的DNA片段均通过琼脂糖凝胶电泳继以用内切核酸酶SmaI处理来纯化。然后将所得的DNA片段以等摩尔比例连接。将连接混合物在4℃温育过夜，并用作下一个PCR程序的模板(使用引物P26和P28)。引物P26(SEQIDNO:35)在其5’端包含SalI限制酶的位点。引物P28(SEQIDNO:37)在其5’端包含XbaI限制酶的位点。PCR的条件如下：95℃3分钟的变性步骤，首先两个循环的程序：95℃1分钟，50℃30秒，72℃40秒；最后15个循环的程序：94℃20秒，60℃20秒，72℃75秒；最后步骤：72℃5分钟。扩增的DNA片段大小约为1.3kb，通过琼脂糖凝胶电泳加以纯化。将所得的片段用内切核酸酶SalI和XbaI处理。在限制性酶切后，将DNA片段以等摩尔比例与预先用内切核酸酶SalI和XbaI处理的质粒pMIV-Pnlp8-ter连接。连接混合物在4℃温育过夜，然后用于通过电穿孔转化大肠杆菌菌株MG1655。将转化体铺于含氨苄青霉素(50mg/l)的LB琼脂板。将平板在37℃温育过夜，直至可见单独的菌落。将质粒从所述转化体分离并通过测序分析进行分析。将所得包含具有突变N348A的serA基因的质粒命名为pMIV-Pnlp8-serA348。
下一步骤是将serA348等位基因整合入P.ananatis菌株SC17的染色体。使用质粒DNApMIV-Pnlp8-serA348通过电穿孔转化P.ananatis菌株SC17/pMH10(该菌株在30℃培养)。将转化体通过在高温温育(42℃，20分钟)休克(shock)，并铺于含氯霉素(20mg/l)的LB琼脂板。将平板在39℃温育过夜，直至可见单独的菌落。将约50个克隆在39℃重新接种，并将它们各自接种于1mlLA培养基中，并在39℃温育48h。在温育后，对所有50个变体测试其质粒pMH10和pMIV-Pnlp8-serA348的消除，其通过选择对氯霉素(20mg/l)有抗性，但对卡那霉素(20mg/l)和氨苄青霉素(50mg/l)敏感的变体来进行。通过使用引物P14和P28通过PCR分析来鉴定目标整合体。在所有获得的变体中测定PGD的比活性，并选取活性最高的以供下述目的。将其命名为SC17int-serA348。
下一步骤是将serA348的一个整合的拷贝转移至菌株EYP197(s)中。
从菌株SC17int-serA348分离染色体DNA。使用10μg该染色体DNA通过电穿孔转化P.ananatisEYP197(s)。将转化体铺于含氯霉素(20mg/l)的LB琼脂板上。将平板在34℃温育过夜，直至可见单独的菌落。通过使用引物P14和P28的PCR分析来鉴定目标转化体。该菌株命名为EYPS1976。
为了消除P.ananatis菌株EYPS1976针对氯霉素的抗性，用质粒pMT-Int-Xis2通过电穿孔转化菌株EYPS1976。将转化体铺于含四环素(10mg/l)的LB琼脂板。将平板在30℃温育过夜，直至可见单独的菌落。通过选取对氯霉素(20mg/l)敏感的变体来鉴定目标转化体。该“消除的”菌株命名为EYPS1976(s)。
2.构建菌株EYPSGint1M2
菌株EYPSGint1M2通过将来自大肠杆菌的编码O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂合酶B的cysM基因整合入EYPS1976(s)的染色体来获得。在第一步，使用携带μ-转座酶的质粒pMH10(如上所述)将质粒pMIV-Pnlp1-cysM(参考实施例2)微μ整合进入菌株SC17的染色体，结果获得cysM的整合。将所得的构建物(int(Pnlp1-cysM))通过使用CmR选择标志物的染色体转化步骤从菌株SC17转移至菌株EYPS1976(s)。该菌株命名为EYPSGint1M2，并在消除了抗生素抗性标记后，将其用于进一步的实验。
参考实施例2构建质粒pMIV-Pnlp1-cysM
使用引物P30(SEQIDNO:39)和P31(SEQIDNO:40)并以菌株SC17的染色体DNA作为模板通过PCR扩增来自P.ananatis的基因nlpD启动子区。所得的DNA片段大小约为0.2kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化，并用PaeI和SalI内切核酸酶消化，然后与预先用相同内切核酸酶处理的质粒pMIV-5JS连接。
使用引物P32(SEQIDNO:41)和P33(SEQIDNO:42)并以菌株MG1655的染色体DNA作为模板通过PCR扩增大肠杆菌基因rrnB的终止子区。所得的DNA片段大小约为0.25kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化，并用XbaI和BamHI内切核酸酶消化，然后与预先用相同内切核酸酶处理的在前一步骤获得的质粒相连接。
使用引物P34(SEQIDNO:43)和P35(SEQIDNO:44)并以菌株MG1655的染色体DNA作为模板通过PCR扩增大肠杆菌基因cysM。所得的DNA片段大小为约1.1kb，通过琼脂糖凝胶电泳将其纯化，并用SalI和XbaI内切核酸酶消化，然后与预先用相同内切核酸酶处理的在前一步骤获得的质粒相连接。从而得到质粒pMIV-Pnlp1-cysM。
虽然本发明参照其优选实施方案进行详细描述，显然，对于本领域技术人员而言，可进行多种变化，使用等同手段，而不背离本发明的范围。上文提及的每一篇文献通过在本文中提述以其整体并入。

Claims (12)

1.一种生产L-氨基酸的方法，包括在培养基中培养埃希氏菌属(Escherichia)或泛菌属(Pantoea)的细菌，并从所述培养基收集所述L-氨基酸，其中所述细菌能够生产L-氨基酸，且经过修饰而增加了能够赋予细菌针对由L-半胱氨酸导致的生长抑制的抗性的蛋白质的活性，其中所述蛋白质是SEQIDNO:4的蛋白质，其中所述L-氨基酸选自下组：L-半胱氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸和O-乙酰基-L-丝氨酸。
2.依照权利要求1的方法，其中在所述细菌中编码所述蛋白质的DNA的表达增强。
3.依照权利要求1的方法，其中所述细菌用编码所述蛋白质的DNA转化。
4.依照权利要求2或3的方法，其中所述DNA是由SEQIDNO:3的核苷酸序列组成的d0663基因。
5.依照权利要求1所述的方法，其中所述细菌经进一步修饰而增加了编码SEQIDNO:6的蛋白质的DNA的表达。
6.依照权利要求5的方法，其中所述编码SEQIDNO:6的蛋白质的DNA是由SEQIDNO:5的核苷酸序列组成的c09478基因。
7.依照权利要求1的方法，其中所述细菌进一步经过修饰而增加了编码SEQIDNO:2的蛋白质的DNA的表达。
8.依照权利要求7的方法，其中所述编码SEQIDNO:2的蛋白质的DNA是由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成的c0011基因。
9.依照权利要求1所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属。
10.依照权利要求1所述的方法，其中所述细菌属于泛菌属。
11.依照权利要求9的方法，其中所述细菌是大肠杆菌(Escherichiacoli)。
12.依照权利要求10的方法，其中所述细菌是Pantoeaananatis。
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