CN101405398B - 用于产生l-氨基酸的方法 - Google Patents

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Abstract

通过培养产生L-氨基酸的细菌来产生L-氨基酸，所述产生L-氨基酸的细菌属于肠杆菌科并且其经过修饰以增加乙酰-CoA合成酶活性。

Description

用于产生L-氨基酸的方法
技术领域
本发明涉及使用细菌产生L-氨基酸的方法，更具体地，涉及产生L-氨基酸如L-赖氨酸，L-苏氨酸和L-谷氨酸的方法。L-赖氨酸和L-苏氨酸可用于作为动物饲料，保健食品，氨基酸浸剂(amino acid infusion)等的添加剂。L-谷氨酸可用作食品调料(food seasoning)。
背景技术
L-氨基酸已经通过使用细菌的发酵方法进行了工业化生产，所述细菌属于短杆菌属(Brevibacterium)、棒杆菌属(Corynebacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)等等。产生L-赖氨酸的方法在EP 0643135 B，EP 0733712 B，EP1477565A，EP 0796912 A，EP 0837134 A，WO01/53459，EP 1170376 A，及WO2005/010175中有描述。在这些方法中，使用的细菌菌株有天然分离株或其人工突变株，也有经重组DNA技术修饰从而增强L-氨基酸生物合成酶活性的细菌菌株。
乙酰-CoA合成酶催化从乙酸、辅酶A和ATP产生乙酰-CoA、焦磷酸和AMP的反应，其由acs基因编码(J Bacteriol.1995May；177(10)：2878-86.)。然而，尚未报道增强乙酰-CoA合成酶的活性可以对L-氨基酸的产生有效。
发明内容
本发明的目的是提供能够有效产生L-氨基酸的细菌和使用该细菌有效产生L-氨基酸的方法。
本发明的发明人进行了广泛的研究以实现上述目标。结果是，他们发现，通过在产生L-氨基酸的细菌中扩增编码乙酰-CoA合成酶的acs基因，改进了L-氨基酸的产生，从而完成本发明。
即，本发明如下。
本发明的目的是提供产生L-氨基酸的方法，所述方法包括在培养基中培养细菌，和从所述培养基或细菌细胞中收集L-氨基酸，其中所述细菌是属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae family)的产生L-氨基酸的细菌，其经修饰以增强乙酰-CoA合成酶活性。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中通过增加编码乙酰-CoA合成酶的acs基因的拷贝数，或者通过修饰所述基因的表达调控序列，来增强乙酰-CoA合成酶活性。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述acs基因选自下组：
(a)包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA，和
(b)在严紧条件下与SEQ ID NO：3的核苷酸序列的互补核苷酸序列，或者与由所述核苷酸序列制备的探针杂交的DNA，其中所述DNA编码具有乙酰-CoA合成酶活性的蛋白。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，及其组合。
本发明的另一个目的是提供如上所述的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属，泛菌属(Pantoea)，或肠杆菌属(Enterobacter)。
优选实施方案描述
在下文中，将详述本发明。
<1>本发明的细菌
本发明的细菌属于肠杆菌科，具有产生L-氨基酸的能力，并经过了修饰从而使乙酰-CoA合成酶(ACS)的活性增强。在本文中，术语“产生L-氨基酸的能力”是指在培养基中培养本发明的细菌时，在该培养基中以可收集的水平产生和积累L-氨基酸的能力。本发明的细菌可能能够产生多种L-氨基酸。L-氨基酸产生能力对于细菌可能是天然的，或者是通过如下方法获得的：通过突变或重组DNA技术对细菌进行修饰以赋予L-氨基酸产生能力。
对L-氨基酸的种类没有特别限制，其实例包括碱性氨基酸如L-赖氨酸，L-鸟氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族L-氨基酸如L-异亮氨酸，L-丙氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，和L-甘氨酸；羟基单氨基羧酸(hydroxymonoaminocarboxylic acids)如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状L-氨基酸如L-脯氨酸；芳香L-氨基酸如L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，和L-色氨酸；含硫L-氨基酸如L-半胱氨酸，L-胱氨酸，和L-甲硫氨酸；以及酸性L-氨基酸如L-谷氨酸，L-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，和L-天冬酰胺。本发明的细菌可能能够产生两种或更多种的氨基酸。
<1-1>赋予产生L-氨基酸的能力。
在下文中，将叙述赋予产生L-氨基酸的能力的方法，以及能够对其赋予产生L-氨基酸能力的细菌的实例。但是，所述细菌并不限于此，只要其具有产生L-氨基酸的能力即可。
可将属于肠杆菌科的细菌(包括那些属于埃希氏菌属或泛菌属的细菌)用作亲本菌株，由其得到本发明的细菌。其它属于肠杆菌科的细菌实例包括γ-变形细菌(γ-Proteobacteria)如肠杆菌属、克雷伯杆菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙门氏菌属(Salmonella)和摩根氏菌属(Morganella)。
可以利用Neidhardt等报道的埃希氏菌属细菌((Backmann，B.J.1996.Derivations and Genotypes of some mutant derivatives of Escherichia coli K-12，第2460-2488页.表1.于F.D.Neidhardt(ed.)，Escherichia coli and SalmonellaCellular and Molecular Biology/Second Edition，American Society forMicrobiology Press，Washington，D.C.)，如大肠杆菌(Escherichia coli)。野生型大肠杆菌菌株的实例包括K-12株及其衍生株(derivatives)，大肠杆菌MG1655菌株(ATCC No.47076)，和W3110菌株(ATCC No.27325)。这些菌株可以从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection；ATCC)(地址：P.O.Box1549，Manassas，VA20108，1，United States ofAmerica)获得。
肠杆菌属细菌的实例包括成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)和产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，泛菌属细菌的实例包括Pantoea ananatis。近来，在某些情况下，根据对16S rRNA核苷酸序列的分析，将成团肠杆菌重新归类为成团泛菌(Pantoea agglomerans)，Pantoea ananatis，斯氏泛菌(Pantoea stewartii)，等等。因此，本发明的细菌可以属于肠杆菌属或泛菌属，只要归类在肠杆菌科中即可。当使用基因工程技术培育Pantoea ananatis时，可以使用Pantoea ananatisAJ13355菌株(FERM BP-6614)，AJ13356菌株(FERM BP-6615)，AJ13601菌株(FERM BP-7207)及其衍生菌株等。在分离时将这些菌株鉴定并保藏为成团肠杆菌，但是如上所述，根据对16S rRNA的核苷酸序列的分析将这些菌株重新分类为Pantoea ananatis。
可以将产生L-氨基酸的能力赋予如上所述的亲本菌株，如下。
为了赋予产生L-氨基酸的能力，可以使用在肠杆菌属细菌等的常规培育中所使用的方法，如通过获得营养缺陷型的突变菌株，类似物抗性菌株，或代谢调控突变菌株，或者通过构建L-氨基酸生物合成酶的表达增强的重组菌株(Amino Acid Fermentation，Japan Scientific Societies Press，第一版，出版日期：1986年5月30日，第77-100页)。在本发明中，为赋予菌株产生L-氨基酸的能力，可以单独地或以组合的形式赋予如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控等性质。此外，可以增强一种或多种L-氨基酸生物合成酶的表达。此外，可以将赋予如营养缺陷型、类似物抗性和代谢调控突变这些性质与增强L-氨基酸生物合成酶的表达组合。
可如下获得具有产生L-氨基酸能力的营养缺陷型突变菌株，L-氨基酸类似物抗性菌株，和代谢调控突变菌株。对亲本菌株或野生型菌株进行通常的突变处理，如用X射线或紫外线照射，或者使用诱变剂(包括N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和乙基甲磺酸(EMS))处理，然后选择表现出营养缺陷型、类似物抗性或代谢调控突变并且具有产生L-氨基酸能力的菌株。
基因重组技术包括增强编码涉及目标L-氨基酸生物合成的酶的基因的表达以及降低编码涉及目标L-氨基酸降解的酶的基因的表达。
在下文中，将例示被赋予产生L-氨基酸的能力的细菌，但是在本发明的方法中将使用到的细菌不限于这些实例。
产生L-苏氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-苏氨酸的细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌(E.coli)TDH-6/pVIC40(VKPMB-3996)(美国专利No.5,175,107、美国专利No.5,705,371)、大肠杆菌472T23/pYN7(ATCC98081)(美国专利No.5,631,157)、大肠杆菌NRRL-21593(美国专利No.5,939,307)、大肠杆菌FERM BP-3756(美国专利No.5,474,918)、大肠杆菌FERM BP-3519和FERM BP-3520(美国专利No.5,376,538)、大肠杆菌MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄语)，14，947-956(1978))、大肠杆菌VL643和VL2055(EP1149911A)，等等。
TDH-6菌株在thrC基因有缺陷，也是蔗糖同化型，并且ilvA基因有泄漏突变(leaky mutation)。该菌株的rhtA基因也有突变，该突变赋予对高浓度苏氨酸或高丝氨酸的抗性。B-3996菌株包含pVIC40，pVIC40是通过将含有突变的thrA基因的thrA*BC操纵子插入到由RSF1010获得的载体中而获得。这种突变的thrA基因编码的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I对苏氨酸的反馈抑制基本上是脱敏的。B-3996菌株在1987年11月19日被保藏于All-UnionScientific Center of Antibiotics(全联盟抗生素科学中心)(Nagatinskaya Street3-A，117105Moscow，Russian Federation)，登录号为RIA1867。该菌株也在1987年4月7日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(Russian NationalCollection of Industrial Microorganisms)(VKPM)(Russia，117545Moscow1，Dorozhny proezd.1)，登录号为B-3996。
还可以用大肠杆菌VKPM B-5318(EP0593792B)来获得本发明的产生L-苏氨酸的细菌。B-5318菌株关于异亮氨酸是原养型的，并且温度敏感的λ噬菌体C1阻遏物和PR启动子取代了pVIC40质粒中的苏氨酸操纵子的调控区域。VKPM B-5318菌株在1990年5月3日保藏于俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)，登录号为VKPM B-5318。
优选地，将本发明的细菌额外修饰以增强一种或多种下列基因的表达：
-突变thrA基因，其编码对苏氨酸的反馈抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I；
-thrB基因，其编码高丝氨酸激酶；
-thrC基因，其编码苏氨酸合酶(threonine synthase)；
-rhtA基因，其编码推定的跨膜蛋白；
-asd基因，其编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；以及
-aspC基因，其编码天冬氨酸氨基转移酶(天冬氨酸转氨酶)。
编码天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的大肠杆菌thrA基因的序列已经阐明(核苷酸位置337至2799，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrA基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrL和thrB基因之间。编码高丝氨酸激酶的大肠杆菌thrB基因的核苷酸序列已经阐明(核苷酸位置2801至3733，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrB基因位于大肠杆菌K-12染色体上的thrA和thrC基因之间。编码苏氨酸合酶的大肠杆菌thrC基因的核苷酸序列已经阐明(核苷酸位置3734至5020，GenBank登录号NC_000913.2，gi：49175990)。thrC基因位于大肠杆菌K-12染色体上thrB基因和yaaX开放阅读框之间。所有3个基因作为一个独立的苏氨酸操纵子一起发挥功能。为增强苏氨酸操纵子的表达，可以从操纵子中将影响转录的弱化子区域去除(WO2005/049808，WO2003/097839)。
编码具反馈抗性的天冬氨酸激酶高丝氨酸脱氢酶I的突变thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作为一个操纵子从熟知的pVIC40质粒中获得。该质粒存在于产生苏氨酸的大肠杆菌VKPM B-3996菌株中，在美国专利No.5,705,371中有详述。
rhtA基因在大肠杆菌染色体上的18min处，靠近glnHPQ操纵子，glnHPQ编码谷氨酰胺转运系统的成分。rhtA基因与ORF1(ybiF基因，核苷酸位置764至1651，GenBank登录号AAA218541，gi：440181)相同并且位于pexB与ompX基因之间。已将表达由ORF1编码的蛋白的序列命名为rhtA基因(rht：对高丝氨酸和苏氨酸的抗性)。同样地，rhtA23突变是相对于ATG起始密码子在-1位置用A-对-G取代(AB STRACTS of the17th International Congress ofBiochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and Molecular Biology(第17界国际生物化学与分子生物学大会暨美国生物化学与分子生物学协会年会摘要)，SanFrancisco，California，1997年8月24-29日，摘要号457，EP 1013765 A)。
大肠杆菌的asd基因的核苷酸序列已经阐明(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16131307)，并且可以根据该基因的核苷酸序列利用引物通过PCR(聚合酶链式反应；参见White，T.J.等，TrendsGenet.，5,185(1989))来获得。其它微生物的asd基因可以通过类似方式获得。
同样，大肠杆菌的aspC基因的核苷酸序列已经阐明(核苷酸位置983742至984932，GenBank登录号NC_000913.1，gi：16128895)，并且可以通过PCR获得。其它微生物的aspC基因可以通过类似方式获得。
产生L-赖氨酸的细菌
产生L-赖氨酸的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变体。L-赖氨酸类似物抑制属于埃希氏菌属细菌的生长，但是当L-赖氨酸共存于培养基中时这种抑制会被全部或部分脱敏。L-赖氨酸类似物的实例包括，但不限于，噁溶菌素，赖氨酸氧肟酸(lysine hydroxamate)，S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，γ-甲基赖氨酸，α-氯代己内酰胺等。将属于埃希氏菌属的细菌进行常规的人工诱变处理可以得到对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株。可用于产生L-赖氨酸的细菌菌株的具体实例包括大肠杆菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参见美国专利No.4,346,170)和大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶的反馈抑制是脱敏的。
可将WC196菌株用作产生L-赖氨酸的大肠杆菌细菌。通过赋予W3110菌株AEC抗性来培育这种细菌菌株，W3110菌株源自大肠杆菌K-12。将所得菌株命名为大肠杆菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(National Institute of Bioscience andHuman-Technology，Agency of Industrial Science and Technology)(现为独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心(National Institute ofAdvanced Industrial Science and Technology，International Patent Organi smDepositary，Tsukuba Central6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，取得登录号FERM P-14690。其后根据布达佩斯条约的规定于1995年9月29日转为国际保藏，并取得登录号FERM BP-5252(美国专利No.5,827,698)。
用于衍生本发明产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株实例还包括下述菌株，在所述菌株中将编码L-赖氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。涉及L-赖氨酸生物合成的酶的实例包括，但不限于，二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、二氨基庚二酸脱氢酶(ddh)(美国专利No.6,040,160)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)和天冬氨酸酶(aspA)(EP1253195A)。此外，亲本菌株中涉及能量效率(energy efficiency)的基因(cyo)(EP1170376A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利No.5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)、gdh基因(Gene23：199-209(1983))、arcA基因(EP 1382686 A)或它们的组合的表达增加。
用于获得本发明的产生L-赖氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括将催化下述反应的酶的活性减少或消除的菌株，所述反应通过从L-赖氨酸生物合成途径分支，生成除L-赖氨酸外的化合物。催化通过从L-赖氨酸生物合成途径分支，生成除L-赖氨酸外的化合物的反应的酶的实例包括高丝氨酸脱氢酶(WO95/23864)，赖氨酸脱羧酶(美国专利No.5,827,698)，和苹果酸酶(malicenzyme)(WO2005/010175)。
在大肠杆菌中，赖氨酸脱羧酶由cadA基因(Genbank登录号NP_418555，SEQ ID NO：5)和ldcC基因(Genbank登录号NP_414728，SEQ ID NO：7)编码(WO96/17930)，因此可以破坏这些基因以增强产生L-赖氨酸的能力。可以应用与cadA基因和ldcC基因同源的DNA分子，只要它们能够引起与宿主细菌染色体上的cadA基因和ldcC基因的同源重组。例如，与cadA基因同源的DNA分子在严紧条件下可以与SEQ ID NO：5的互补链杂交，与ldcC基因同源的DNA分子在严紧条件下可以与SEQ ID NO：7的互补链杂交。
产生L-半胱氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-半胱氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如用编码反馈抗性丝氨酸乙酰转移酶的不同cysE等位基因转化的大肠杆菌JM15菌株(美国专利No.6,218,168，俄罗斯专利申请2003121601)，过表达编码适于分泌有毒物质的蛋白的基因的大肠杆菌W3110(美国专利5,972,663)，半胱氨酸脱巯基酶(cysteine desulfohydrase)活性减少的大肠杆菌菌株(JP11155571A2)；由cysB基因(WO0127307A1)编码的半胱氨酸调节子的正向转录调控物活性增强的大肠杆菌W3110菌株，等等。
产生L-亮氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-亮氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如对亮氨酸有抗性的大肠杆菌菌株(例如，菌株57(VKPM B-7386，美国专利No.6,124,121))或对亮氨酸类似物(包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羟基亮氨酸、4-氮亮氨酸、5，5，5-三氟亮氨酸)有抗性的大肠杆菌菌株(JP62-34397B和JP8-70879A)；通过WO96/06926中描述的遗传工程方法获得的大肠杆菌菌株；大肠杆菌H-9068(JP8-70879A)，等等。
可以通过增强涉及L-亮氨酸生物合成的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因的实例包括leuABCD操纵子中的那些，所述操纵子优选地包括经过突变的leuA基因，从而使该基因编码对L-亮氨酸反馈抑制具有抗性的异丙基苹果酸合酶(美国专利6,403,342)。此外，可以通过增强编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。这类基因的实例包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP 1239041 A2)。
产生L-组氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-组氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌24菌株(VKPM B-5945，RU2003677)；大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，RU2119536)；大肠杆菌NRRL B-12116-B12121(美国专利No.4,388,405)；大肠杆菌H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(美国专利No.6,344,347)；大肠杆菌H-9341(FERMBP-6674)(EP1085087)；大肠杆菌AI80/pFM201(美国专利No.6,258,554)等等。
用于获得本发明的产生L-组氨酸细菌的亲本菌株的实例还包括如下菌株，所述菌株中编码L-组氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强。这些L-组氨酸生物合成酶的实例包括ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)、磷酸核糖基AMP环化水解酶(hisI)、磷酸核糖基-ATP焦磷酸水解酶(hisIE)、磷酸核糖基亚氨甲基-5-氨基咪唑氨甲酰核糖核苷酸异构酶(phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase)(hisA)、酰胺转移酶(hisH)、组氨醇磷酸氨基转移酶(hisC)、组氨醇磷酸酶(hisB)、组氨醇脱氢酶(hisD)等。
已知编码L-组氨酸生物合成酶的基因(hisG，hisBHAFI)被L-组氨酸所抑制，因此还可以通过向ATP磷酸核糖基转移酶(hisG)中引入诱导对反馈抑制有抗性的突变来有效地增强产生L-组氨酸的能力(俄罗斯专利Nos.2003677和2119536)。
具有产生L-组氨酸能力的菌株具体实例包括大肠杆菌FERM-P5038和5048，其已经用携带编码L-组氨酸生物合成酶的DNA的载体转化(JP56-005099A)，用rht(即用于氨基酸输出的基因)转化的大肠杆菌菌株(EP1016710A)，赋予了磺胺胍、DL-1，2，4-三唑-3-丙氨酸和链霉素抗性的大肠杆菌80菌株(VKPM B-7270，俄罗斯专利No.2119536)，等等。
产生L-谷氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-谷氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌VL334thrC+(EP 1172433)。大肠杆菌VL334(VKPM B-1641)是L-异亮氨酸和L-苏氨酸营养缺陷型，并且在thrC和ilvA基因中被突变(美国专利No.4,278,765)。利用生长于野生型大肠杆菌菌株K12(VKPM B-7)中的噬菌体P1，通过常规转导来转移thrC基因的野生型等位基因。结果，获得了L-异亮氨酸营养缺陷型的菌株VL334thrC+(VKPMB-8961)。
用于获得本发明的产生L-谷氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，编码L-谷氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的实例包括谷氨酸脱氢酶(gdhA)、谷氨酰胺合成酶(glnA)、谷氨酸合成酶(gltAB)、异柠檬酸脱氢酶(icdA)、乌头酸水合酶(acnA，acnB)、柠檬酸合酶(citrate synthase；gltA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、丙酮酸脱氢酶(aceEF，lpdA)、丙酮酸激酶(pykA，pykF)、磷酸烯醇丙酮酸合酶(ppsA)、烯醇化酶(eno)、磷酸甘油酸变位酶(pgmA)、磷酸甘油酸激酶(pgk)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapA)、丙糖磷酸异构酶(tpiA)、果糖二磷酸醛缩酶(fbp)、磷酸果糖激酶(pfkA，pfkB)和葡糖磷酸异构酶(pgi)。
经修饰以使柠檬酸合成酶(citrate synthetase)基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和/或谷氨酸脱氢酶基因的表达增强的菌株的实例包括在EP1078989A、EP955368A和EP952221A中公开的那些菌株。
用于获得本发明的产生L-谷氨酸细菌的亲本菌株的实例还包括将下述酶的活性减少或去除的菌株，所述酶催化除L-谷氨酸外的化合物的合成，并且从L-谷氨酸生物合成途径中分支。这类酶的实例包括异柠檬酸裂合酶，α-酮戊二酸脱氢酶，磷酸转乙酰酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合酶(acetohydorxy acidsynthase)，乙酰乳酸合酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，和谷氨酸脱羧酶。在美国专利Nos.5,378,616和5,573,945中描述了α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或降低的属于埃希氏菌属的细菌及其获得方法。
具体地，这些菌株包括下面的：
大肠杆菌W3110sucA::Kmr
大肠杆菌AJ12624(FERM BP-3853)
大肠杆菌AJ12628(FERM BP-3854)
大肠杆菌AJ12949(FERM BP-4881)
通过破坏大肠杆菌W3110的α-酮戊二酸脱氢酶基因(在下文称为“sucA基因”)来获得大肠杆菌W3110sucA::Kmr。该菌株的α-酮戊二酸脱氢酶完全缺失。
产生L-谷氨酸的细菌的其它实例包括属于埃希氏菌属并且具有对天冬氨酸抗代谢物的抗性的细菌。这些菌株也可能是α-酮戊二酸脱氢酶活性缺陷的，包括例如大肠杆菌AJ13199(FERM BP-5807)(美国专利No.5.908,768)，额外具有弱L-谷氨酸分解能力的FERM P-12379菌株(美国专利No.5,393,671)；AJ13138(FERM BP-5565)(美国专利No.6,110,714)，等等。
产生L-谷氨酸的细菌的实例还包括α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失或α-酮戊二酸脱氢酶活性降低的属于泛菌属的突变菌株，并且可以如上所述获得。这些菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美国专利No.6,331,419)。将Pantoeaananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在称作独立行政法人产业技术综合研究所特许微生物保藏中心，Central6，1-1，Higashi1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，Japan)，登录号为FERM P-16645。其后按照布达佩斯条约的规定，在1999年1月11日将其转为国际保藏，并得到登录号FERM BP-6615。作为破坏αKGDH-E1亚基基因(sucA)的结果，Pantoea ananatis AJ13356的α-酮戊二酸脱氢酶活性缺失。当将上述菌株分离时将其鉴定为成团肠杆菌，并且作为成团肠杆菌AJ13356保藏。但是，近来基于对16S rRNA的核苷酸测序等，将其重新归类为Pantoea ananatis。尽管AJ13356作为成团肠杆菌保藏在前述保藏单位，就本说明书而言，将它们描述为Pantoea ananatis。
产生L-苯丙氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-苯丙胺酸细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)；具有pheA34基因的大肠杆菌HW1089(ATCC55371)(美国专利No.5,354,672)；大肠杆菌MWEC101-b(KR8903681)；大肠杆菌NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(美国专利No.4,407,952)。同样地，可使用大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604(FERMBP-3579)的大肠杆菌K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]作为亲本菌株(EP488424B1)。此外，还可使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-苯丙氨酸的属于埃希氏菌属的细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
产生L-色氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-色氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如可以使用大肠杆菌JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)，其色氨酰-tRNA合成酶缺陷，该酶由突变的trpS基因编码(美国专利No.5,756,345)；大肠杆菌SV164(pGH5)，其具有编码对丝氨酸反馈抑制有抗性的磷酸甘油酸脱氢酶的serA等位基因和编码对色氨酸反馈抑制有抗性的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase)的trpE等位基因(美国专利6,180,373)；色氨酸酶缺陷的大肠杆菌AGX17(pGX44)(NRRLB-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美国专利No.4,371,614)；产生磷酸烯醇丙酮酸的能力增强的大肠杆菌AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美国专利No.6,319,696)等等。此外，还可以使用由yedA基因或yddG基因编码的蛋白活性增强的产生L-色氨酸的埃希氏菌属细菌(美国专利申请2003/0148473A1和2003/0157667A1)。
用于获得本发明的产生L-色氨酸细菌的亲本菌株的实例还包括其中选自邻氨基苯甲酸合酶(trpE)、磷酸甘油酸脱氢酶(serA)和色氨酸合酶(trpAB)中的一种或多种酶活性增强的菌株。邻氨基苯甲酸合酶和磷酸甘油酸脱氢酶两者受L-色氨酸和L-丝氨酸的反馈抑制，因此可以向这些酶中引入导致反馈抑制脱敏的突变。具有此类突变的菌株的具体实例包括具有脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的大肠杆菌SV164菌株和通过将质粒pGH5转入大肠杆菌SV164获得的菌株(WO94/08031)，所述质粒pGH5包含经突变以使其编码对反馈脱敏的磷酸甘油酸脱氢酶的serA基因。
用于获得本发明的产生L-色氨酸细菌的亲本菌株的实例还包括用色氨酸操纵子转化的菌株，所述色氨酸操纵子包含编码脱敏的邻氨基苯甲酸合酶的基因(JP57-71397A，JP62-244382A，美国专利No.4,371,614)。此外，可以通过增强色氨酸操纵子(trpBA)中编码色氨酸合酶的基因的表达来赋予产生L-色氨酸的能力。色氨酸合酶由α和β亚基组成，分别由trpA和trpB编码。另外，可以通过增强异柠檬酸裂合酶-苹果酸合酶操纵子的表达来改进产生L-色氨酸的能力(WO2005/103275)。
产生L-脯氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-脯氨酸细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如ilvA基因缺陷并且能够产生L-脯氨酸的大肠杆菌702ilvA(VKPM B-8012)(EP1172433)。
可以通过增强涉及L-脯氨酸生物合成的一个或多个基因的表达来改进本发明的细菌。用于产生L-脯氨酸细菌的优选基因的实例包括编码对L-脯氨酸反馈抑制脱敏的谷氨酸激酶的proB基因(德国专利3127361)。此外，可以通过增强一种或多种编码从细菌细胞分泌L-氨基酸的蛋白的基因的表达来改进本发明的细菌。这些基因包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041A2)。
具有产生L-脯氨酸活性的属于埃希氏菌属的细菌的实例包括下列大肠杆菌菌株：NRRL B-12403和NRRL B-12404(英国专利2075056)，VKPM B-8012(俄罗斯专利申请2000124295)，德国专利3127361中描述的质粒突变体，Bloom F.R.等描述的质粒突变体(The15thMiami winter symposium(第15界迈阿密冬季研讨会)，1983，第34页)等等。
产生L-精氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-精氨酸细菌的亲本菌株包括，但不限于，属于埃希氏菌属的菌株，如大肠杆菌237菌株(VKPM B-7925)(美国专利申请2002/058315A1)及其带有突变的N-乙酰谷氨酸合酶(N-acetylglutamatesynthase)的衍生菌株(俄罗斯专利申请No.2001112869)，大肠杆菌382菌株(VKPM B-7926)(EP1170358A1)，引入了编码N-乙酰谷氨酸合成酶(N-acetylglutamate synthetase)的argA基因的产生精氨酸的菌株(EP1170361A1)，等等。
用于获得本发明的产生L-精氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括编码L-精氨酸生物合成酶的一个或多个基因的表达增强的菌株。L-精氨酸生物合成酶的实例包括N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶(argC)、鸟氨酸乙酰转移酶(argJ)、N-乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鸟氨酸转氨酶(argD)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和氨甲酰基磷酸合成酶(carAB)。
产生L-缬氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株实例包括，但不限于，经修饰以过表达ilvGMEDA操纵子的菌株(美国专利No.5,998,178)。理想的是将衰减所需的ilvGMEDA操纵子的区域移除以使操纵子的表达不会被产生的L-缬氨酸所削弱。此外，理想的是将操纵子中的ilvA基因破坏从而降低苏氨酸脱氨酶的活性。用于获得本发明的产生L-缬氨酸的细菌的亲本菌株的实例还包括氨酰t-RNA合成酶的突变体(美国专利No.5,658,766)。例如，可以使用大肠杆菌VL1970，该菌株在编码异亮氨酸tRNA合成酶的ileS基因中具有突变。已将大肠杆菌VL1970在1988年6月24日保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)(Russia，113545Moscow，1Dorozhny Proezd.)，登录号为VKPM B-4411。
此外，还可以使用生长需要硫辛酸(lipoic acid)的突变体和/或缺乏H+-ATP酶的突变体(WO96/06926)。
产生L-异亮氨酸的细菌
用于获得本发明的产生L-异亮氨酸细菌的亲本菌株的实例包括，但不限于，对6-二甲基氨基嘌呤有抗性的突变体(JP5-304969A)，对异亮氨酸类似物如硫代异亮氨酸(thiaisoleucine)和异亮氨酸氧肟酸具有抗性的突变体，以及额外对DL-乙硫氨酸(DL-ethionine)和/或精氨酸氧肟酸具有抗性的突变体(JP5-130882A)。此外，还可以使用以编码涉及L-异亮氨酸生物合成的蛋白(如苏氨酸脱氨酶和乙酰羟酸合酶(acetohydroxate synthase))的基因转化的重组菌株(JP2-458A，FR0356739和美国专利5,998,178)。
<1-2>ACS活性的增强
可以通过对上述具有产生L-氨基酸的能力的细菌进行修饰，以增强ACS活性来获得本发明的细菌。然而，可以在对细菌进行修饰以增强ACS活性之后再赋予产生L-氨基酸的能力。如下所述，可以通过提高编码具有ACS活性的蛋白质的基因的表达来增强ACS活性，这可以通过修饰表达调控区例如启动子以增强内源基因的表达，或通过引入含有基因的质粒以增强该外源基因的表达来实现，等等。而且，这些方法可以进行组合。
在本发明中，术语“ACS活性”代表催化从乙酸、辅酶A(CoA)和ATP以产生乙酰-CoA、焦磷酸和AMP的反应的活性(EC6.2.1.1)。
Figure G2007800096680D00141
也有报道ACS催化从丙酸产生丙酰辅酶A的反应(Eur J Biochem2002；269(24)；6184-94)，还报道了ACS能够作为4-香豆酸CoA连接酶(4-coumarate CoA lygase)发挥作用(Genome Biol4(9)；R54)。
Figure G2007800096680D00151
Figure G2007800096680D00152
可以通过测量乙酰氧肟酸的量来确认ACS活性的增强，乙酰氧肟酸是由在体外通过上述反应生成的乙酰-CoA转化而来(Meth.Enzymol.1，585-591)。
短语“修饰以增强ACS的活性”包括与野生型菌株或未修饰菌株相比每细胞的ACS分子数增加的情形和每分子的ACS活性改进的情形。与野生型菌株或未修饰菌株相比，ACS活性改进不少于每细胞150％，优选地不少于每细胞200％，更优选地不少于每细胞300％。可以作为对照使用的属于肠杆菌科的野生型菌株的实例包括大肠杆菌MG1655菌株(ATCC No.47076)，W3110菌株(ATCC No.27325)，和Pantoea ananatis AJ13335菌株(FERM BP-6615)。
可以通过增加编码具有ACS活性的蛋白的基因(acs基因)的表达来增强ACS活性。与野生型或未经修饰菌株相比增加的表达可以通过与野生型或未经修饰菌株比较acs基因的mRNA水平来确认。确认基因表达的方法包括Northern杂交和RT-PCR(Molecular cloning(Cold spring Harbor LaboratoryPress，Cold spring Harbor(USA)，2001))。表达可以是任意水平的，只要与野生型或未经修饰菌株相比有所增加即可，例如，与野生型或未经修饰菌株相比表达优选地增加为不少于1.5倍，更优选地不少于2倍，进一步更优选地不少于3倍。同时，增强acs基因的表达也可以通过与野生型或未经修饰菌株相比相应蛋白水平的增加来确认，所述蛋白水平可以例如使用抗体通过Western印迹方法来检测(Molecular Cloning(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor(USA)，2001))。
acs基因的实例包括来自大肠杆菌的acs基因。在本发明中，大肠杆菌的acs基因的实例包括SEQ ID NO：3的acs基因(GenBank登录号No.NC_000913的核苷酸号4283436..4285394的互补链)。
其它来源的acs基因实例包括鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)的acs基因(GenBank登录号No.NC_004088的核苷酸号577565..579529的互补链)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)的acs基因(GenBank登录号No.AL627282的核苷酸号120832..122790的互补链)，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的acs基因(GenBank登录号No.NC_002505的核苷酸号305121..307121的互补链)以及鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimuriumi)的acs基因(GenBank登录号No.NC_003197的核苷酸号4513714..4515672的互补链)。
此外，根据与上面列出的基因的同源性，可以通过克隆从以下细菌获得acs基因的同源物：属于埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、耶尔森氏菌属(Yersinia)等的γ-变形细菌；棒状杆菌型细菌(coryneform bacterium)如谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，或乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)，假单胞菌属Pseudomonas)细菌如铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)；分枝杆菌属(Mycobacterium)细菌如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；等等。可以使用例如在SEQ ID NOS：1和2中显示的合成的寡核苷酸，通过PCR扩增所述同源物。
可以通过使用由Karlin和Altschul开发的BLAST算法(P ro.Natl.Acad.Sci.USA，90，5873(1993))或Pearson开发的FASTA算法(Methods Enzymol.，183，63(1990))确定氨基酸序列间和核苷酸序列间的同源性。根据BLAST算法，开发了称为BLASTN和BLASTX的程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。
短语“acs基因的同源物”包括源自其它细菌的基因以及天然或人工突变的基因，其与上述acs基因具有高度的结构相似性并且编码具有ACS的蛋白。“acs基因的同源物”包括编码蛋白质的基因，所述蛋白质与SEQ ID NO：4全序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，特别优选至少98％的同源性，并且所述蛋白质具有ACS活性。可以通过将基因在宿主细胞中表达并且检测ACS活性来确认ACS活性。
同时，acs基因不限于野生型基因，还可以是突变体或人工修饰的基因，其编码具有SEQ ID NO：4氨基酸序列的蛋白，但是所述蛋白在一个或多个位置可能包括一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入或添加，只要其ACS活性得以维持即可。在本发明中，尽管取决于在蛋白质中氨基酸残基在三维结构(ternary structure)中的位置和蛋白质中氨基酸残基的类型，术语“一个或几个”特指1到20，优选1至10，更优选1至5。上述取代优选为保守取代，保守取代的实例包括芳香族氨基酸之间的取代，如Phe、Trp和Tyr之间的取代；疏水氨基酸之间的取代，如Leu、Ile和Val之间的取代；极性氨基酸之间的取代，如Gln和Asn之间的取代；碱性氨基酸之间的取代，如Lys、Arg和His之间的取代；酸性氨基酸之间的取代，如Asp和Glu之间的取代；具有羟基的氨基酸之间的取代，如Ser和Thr之间的取代。保守取代的具体实例包括：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。同时，由于具有acs基因的细菌中的个体差异，类型的不同等，上述氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位可以是天然存在的突变(突变体或变体)。
同时，acs基因可以是在严紧条件下与SEQ ID NO：3的互补核苷酸序列杂交，或者与能够由该序列制备的探针杂交的DNA，只要该基因编码具有ACS活性的蛋白即可。在本发明中，术语“严紧条件”是指形成所谓特异性杂合体而不形成非特异性杂合体的条件。难以用数值来清楚地定义该条件，其实例包括下述条件，在该条件下具有高同源性的DNA，例如，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，或特别优选至少98％同源性的DNA互相杂交，而具有少于80％同源性的DNA不互相杂交；其具体实例包括在常规Southern杂交中的洗涤条件，即，在60℃，优选在68℃，在1x SSC、0.1％SDS，优选0.1x SSC、0.1％SDS的盐浓度，洗涤一次，优选两次或三次的条件。
可以通过例如利用基因重组技术增加细胞内基因的拷贝数来提高上述acs基因的表达。例如，将包含该基因的DNA片段连接到在宿主细菌内发挥功能的载体，优选多拷贝载体上，从而制备重组DNA，并且使用该重组DNA来转化宿主细菌。
当使用大肠杆菌的acs基因时，可以通过PCR(聚合酶链式反应；White，T.J.et al.，Trends Genet.5,185(1989))来获得acs基因，其使用基于SEQ ID NO：3的核苷酸序列的引物，例如，SEQ ID NOS：1和2的引物，并且使用大肠杆菌的染色体DNA作为模板。不同细菌的acs基因也可以从所选细菌的染色体DNA或基因组DNA文库中通过PCR获得，其使用基于所选细菌的acs基因或其它种类细菌的acs基因的已知序列，或基于ACS蛋白的氨基酸序列而制备的寡核苷酸作为引物。还可以使用基于序列制备的寡核苷酸作为探针，通过杂交来从不同细菌获得acs基因。染色体DNA可以从作为DNA供体的细菌中通过Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963)，Experiment Manual for Biotechnology，edited by The Society forBiotechnology，Japan，p97-98，Baifukan Co.，Ltd.，1992)等制备。
然后，通过将由PCR扩增得到的acs基因连接到能够在宿主细菌中发挥功能的载体DNA来制备重组DNA。能够在宿主细菌中发挥功能的载体实例包括能够在宿主细菌中自主复制的载体。
在大肠杆菌中自主复制的载体的实例包括pUC19、pUC18、pHSG299、pHSG399、pHSG398、pACYC184，(pHSG和pACYC可从Takara Bio Inc.获得)，RSF1010(Gene vol.75(2)，p271-288，1989)，pBR322、pMW219、pMW119(pMW可从Nippon Gene Co.，Ltd.获得)，pSTV28和pSTV29(Takara Bio Inc.)。也可以利用噬菌体DNA载体。
为将基因连接到上述载体上，用与包含acs基因的DNA片段末端的识别位点相对应的限制性酶来消化载体。通常利用连接酶如T4DNA连接酶来进行连接。消化和连接DNA的方法，染色体DNA的制备，质粒DNA的制备，转化，PCR，用作引物的寡核苷酸的设计是本领域技术人员所熟知的。这些方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“MolecularCloning ALaboratory Manual，Second Edition”，Cold Sprig Harbor Laboratory Press，(1989)等中描述。
通过常规的转化方法如电穿孔(Canadian Journal of Microbiology，43.197(1997))将由此制备的重组DNA导入细菌。也可以通过用氯化钙处理受体细胞来提高DNA的通透性，这在大肠杆菌K-12中已有报道(Mandel，M.and Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))；和将DNA导入增殖期的感受态细胞，其已报道用于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(Duncan，C.H.，Wilson，G.A and Young，F.E，Gene，l，153(1977))。
还可以通过向宿主细菌染色体DNA中导入多拷贝的acs基因来提高该基因的拷贝数。利用以多拷贝存在于染色体DNA上的靶序列，通过同源重组将多拷贝的基因导入宿主细菌的染色体DNA。这可能是重复DNA或存在于转座元件(transposing element)末端的反向重复序列。可选择地，如JP2-109985A中所公开的，通过将acs基因插入转座子中并将其转移以使多拷贝的所述基因整合入染色体DNA，可以把多拷贝的acs基因导入染色体DNA。可以利用部分所述基因作为探针，通过Southern杂交来确认该基因整合入染色体中。
此外，如WO00/18935，WO98/04715所述，可通过取代表达调控序列，例如以更强的启动子取代天然启动子，无论基因存在于染色体或质粒上，扩增能够增加该基因表达的调控元件，或者缺失或削弱使acs基因表达减少的调控元件，来增强acs基因的表达。已知的强启动子实例包括lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子，PL启动子，和tet启动子。
评估启动子强度的方法和强启动子的实例在Goldstein等(Prokaryoticpromoters in biotechnology.Biotechnol.Annu.Rev.，1995，1，105-128)等中描述。此外，已知核糖体结合位点(RBS)与翻译起始密码子之间的间隔序列，尤其是正好在起始密码子上游的几个核苷酸对于翻译效率有很大的影响。因此，可以修饰此序列。
此外，为增强由acsA基因编码的蛋白的活性，可以将增加ACS活性的突变引入该基因。这样的突变的实例包括增加acs基因转录水平的启动子序列中突变，以及增加ACS蛋白比活性的编码区中的突变。
<2>产生L-氨基酸的方法
本发明的产生L-氨基酸的方法包括在培养基中培养本发明的细菌，以在所述培养基或细菌细胞中产生和积累L-氨基酸，并且从所述培养基或所述细菌细胞中收集L-氨基酸。
可以使用在L-氨基酸的细菌发酵生产中通常使用的常规培养基。即，可以使用包含碳源、氮源、无机离子，如果需要的话还包含其它有机成分的常规培养基。在本发明中，碳源的实例包括糖类，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖及淀粉水解物；醇类如甘油和山梨糖醇；和有机酸如延胡索酸、柠檬酸及琥珀酸。氮源的实例包括无机铵盐如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵；有机氮如大豆水解物；氨气；和氨水。至于有机痕量营养物，营养缺陷的物质如维生素B1和L-高丝氨酸，酵母提取物等优选以适当的量包含在培养基中。除这些物质外，如果需要的话，还可以加入少量磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。本发明使用的培养基可以是天然培养基或合成培养基，只要其包含碳源、氮源、无机离子，如果需要的话，还包含其它有机痕量营养物。
培养优选在需氧条件下，在24℃至37℃的温度及pH5-9，进行l到7天。可以用无机或有机的酸性或碱性物质、氨气等来调节pH。可通过常规方法如离子交换树脂、沉淀及其它已知方法从发酵液中收集L-氨基酸。当L-氨基酸在细菌细胞中积累时，可以通过如下方法收集L-氨基酸，例如，通过超声处理等破碎细菌细胞以将L-氨基酸释放到上清级分中，然后通过离心去除细菌细胞，然后将所得上清级分通过离子交换树脂等。
在产生碱性L-氨基酸时，可在进行发酵的同时将培养过程中培养基的pH控制在6.5-9.0并在完成培养后将培养基的pH控制在7.2-9.0，以及在发酵过程中控制发酵罐的压力使其为正压。可选择地，可以将二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体加入培养基以使碳酸氢根离子和/或碳酸根离子在培养期内以至少2g/L的量存在于培养基中。这些离子作为反荷离子(counter ion)起到对抗碱性L-氨基酸的阳离子的作用，并可以收集目标碱性L-氨基酸(EP1182261，WO2006/038695)。
实施例
在下文中，将参考下述的非限定性实施例更详细地说明本发明。
实施例1
<1>构建用于扩增acs基因的质粒
为评估acs基因的扩增对产生L-氨基酸的影响，构建了用于扩增acs基因的质粒载体。大肠杆菌(大肠杆菌K-12菌株)的完整染色体核苷酸序列已经公开(Science，277，1453-1474(1997))。基于此文件中公开的acs基因的核苷酸序列，使用SEQ ID NO：2的寡核苷酸作为5’引物，其包含与GenBank登录号No.NC_000913的核苷酸4285765至4285784的互补序列附接的SalI位点；并且使用SEQ ID NO：l的寡核苷酸作为3’引物，其包含与No.NC_000913的4283415至4283435的序列附接的BamHI位点。使用大肠杆菌MG1655菌株的染色体DNA作为模板利用这些引物进行PCR。
将扩增的acs基因纯化并用SalI和BamHI消化，然后连接于经SalI和BamHI消化的载体pMW119(Takara Bio)，以获得用于扩增acs基因的质粒(pMWacs)。
实施例2：
构建具有破坏的赖氨酸脱羧酶编码基因(cadA和ldcC)的菌株
构建了不产生赖氨酸脱羧酶的菌株。赖氨酸脱羧酶由cadA基因(Genbank登录号No.NP_418555，SEQ ID NO：5)和ldcC基因(Genbank登录号No.NP414728，SEQ ID NO：7)编码(WO96/17930)。使用大肠杆菌WC196(FERMBP-5252)作为亲本菌株(WO96/17930)。
通过由Datsenko和Wanner开发的称为“Red-驱动整合(Red-drivenintegration)”的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)，并通过源自λ噬菌体的切除系统(J.Bacteriol.2002Sep；184(18)：5200-3.Interactions between integrase and excisionase in the phage lambdaexcisive nucleoprotein complex.Cho EH，GumportRI，Gardner JF.)来破坏cadA基因和ldcC基因。“Red-驱动整合”通过使用PCR产物能够在一步中构建基因破坏的菌株，所述PCR产物通过使用合成寡核苷酸作为引物获得，将所述合成寡核苷酸设计为5’端具有部分的靶向基因并且在3’端具有部分抗生素抗性基因。与源自λ噬菌体的切除系统的组合允许将已经并入基因被破坏的菌株中的抗生素抗性基因去除(WO2005/010175)。
(2-1)cadA基因的破坏
利用pMW118-attL-Cm-attR质粒(WO2005/010175)作为PCR的模板。pMW118-attL-Cm-attR是通过将attL和attR基因(其为λ噬菌体的附着位点)以及cat基因(其为抗生素抗性基因)插入pMW118(Takara Bio Inc.)而获得的。各基因以下列顺序排列：attL-cat-attR。
使用SEQ ID NOS：9和10中所示的合成寡核苷酸作为引物进行PCR，所述合成寡核苷酸在3’端具有与attL和attR对应的序列，并且在5’端具有与部分靶向的基因cadA对应的序列。
在琼脂糖胶中纯化扩增的PCR产物，并用电穿孔法将其导入大肠杆菌WC196菌株。该菌株携带有pKD46，pKD46具有温度敏感的复制性。pKD46(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，vol.97，No.12，p6640-6645)含有源自λ噬菌体的2154个核苷酸的DNA片段，其含有λRed同源重组系统的Red重组酶编码基因(γ，β，和exo基因)，该系统受到阿拉伯糖可诱导的ParaB启动子的控制(GenBank/EMBL登录号No.J02459，核苷酸号31088至33241)。pKD46对于将PCR产物整合入WC196菌株的染色体是必需的。
如下所述制备用于电穿孔的感受态细胞。即，将具有pKD46的大肠杆菌WC196菌株的细胞在含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中在30℃培养过夜，然后用含氨苄青霉素(20mg/L)和L-阿拉伯糖(1mM)的5mL SOB培养基(Molecular Cloning：Laboratory manual，2nd edition，Sambrook，J.et al.，ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989))稀释100倍。将稀释的细胞在30℃通气培养直至OD600达到约0.6，然后浓缩100倍并且以10％的甘油洗涤三次以使细胞可用于电穿孔。用70μL感受态细胞和约100ng PCR产物进行电穿孔。电穿孔结束后，向细胞中添加1mL SOC培养基(Molecular Cloning：Laboratorymanual，2nd edition，Sambrook，J.et al.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))，将细胞在37℃培养2.5小时，然后在含有Cm(氯霉素)(25mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养，从而选择Cm抗性的重组菌株。随后，为除去质粒pKD46，将细胞在含Cm的L-琼脂培养基上于42℃进行两次传代培养，并检验所得菌落的氨苄青霉素抗性，以产生消除了(cured)pKD46的氨苄青霉素敏感的菌株。
在已经通过氯霉素抗性基因鉴定的突变菌株中，通过PCR来确认cadA基因的缺失。将cadA-破坏的菌株命名为WC196ΔcadA::att-cat。
随后，利用辅助质粒pMW-intxis-ts(WO2005/010175)将导入cadA基因的att-cat基因去除。质粒pMW-intxis-ts携带编码λ噬菌体整合酶(Int)的基因，以及编码切除酶(Xis)的基因，并且具有温度敏感的复制性。
通过常规方法制备WC196ΔcadA::att-cat菌株的感受态细胞，然后将其用辅助质粒pMW-intxis-ts转化，然后在含有50mg/L氨苄青霉素的L-琼脂培养基上在30℃进行平板培养，从而选择氨苄青霉素抗性菌株。
随后，为除去质粒pMW-intxis-ts，将细胞在L-琼脂培养基上于42℃进行两次传代培养，检验所得菌落的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性，从而产生氯霉素和氨苄青霉素敏感的菌株，该菌株中的cadA基因被破坏，并且去除了att-cat和pMW-intxis-ts。将所述菌株命名为WC196ΔcadA。
(2-2)WC196ΔcadA菌株中ldcC基因的破坏
通过与上述相同的方式利用SEQ ID NOS：11和12的寡核苷酸作为引物，破坏WC196ΔcadA菌株中的ldcC基因。用这种方式，得到了名为WC196ΔcadAΔldcC的破坏了cadA和ldcC的菌株。
<3>在埃希氏菌属细菌的产生L-赖氨酸的菌株中扩增acs基因的效果
将用于赖氨酸产生的质粒导入WC196ΔcadAΔldcC菌株
用携带dapA基因、dapB基因、lysC基因和ddh基因的名为pCABD2(WO01/53459)的用于赖氨酸生产的质粒转化WC196ΔcadAΔldcC菌株，从而制备WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2菌株。
用实施例1中构建的用于扩增acs基因的质粒(pMWacs)和对照质粒(pMW119)(Takara Bio Inc)转化WC196ΔcadAΔldc/pCABD2菌株，并选择出链霉素和氨苄青霉素抗性菌株。确认了质粒的引入，并将引入pMWacs的菌株和引入pMW119的菌株分别命名为WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs菌株和WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119菌株。
将WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs和WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119菌株在含50mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素的L-培养基中于37℃培养，直至最终OD600达到约0.6，再将等体积的40％甘油溶液添加到培养物中，然后搅拌。接着，将得到的悬液以适当量分装并保存于-80℃，其用作甘油原种(glycerol stock)。
将菌株的甘油原种融化，以每个菌株100μL均匀地涂布在含50mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素的L-平板上，并于37℃培养24小时。将平板上每个菌株约八分之一的细胞接种到500mL-Sakaguchi烧瓶中的20mL发酵培养基中(用于埃希氏菌属细菌的L-赖氨酸生产培养基)，所述培养基含50mg/L氨苄青霉素和20mg/L链霉素，并用往复式摇床于37℃培养19小时。利用Biotech Analyzer AS210(Sakura Seiki Co，.Ltd.)来测定培养基中积累的L-赖氨酸的量。
[用于埃希氏菌属细菌的L-赖氨酸生产培养基]
葡萄糖                          40g/L
硫酸铵                          24g/L
磷酸二氢钾                      1.0g/L
七水合硫酸镁                    1.0g/L
七水合硫酸亚铁                  0.01g/L
七水合硫酸锰                    0.01g/L
酵母提取物                      2.0g/L
碳酸钙(法定级)(Official grade)  30g/L(单独灭菌)
利用氢氧化钾将培养基调节至pH7.0并且于115℃用蒸汽灭菌10分钟。
将葡萄糖和七水合硫酸镁单独灭菌。
将碳酸钙(法定级)通过于180℃加热两小时单独灭菌。
表1显示19小时后存在的L-赖氨酸的量。关于WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-acs菌株，与不含acs基因的WC196ΔcadAΔldc/pCABD2-119菌株相比，L-赖氨酸的量较高。该数据说明通过增强acs基因的表达，改进了产生L-赖氨酸的能力。
表1
Figure G2007800096680D00241
工业适用性
本发明的细菌使以下L-氨基酸的有效发酵产生成为可能：碱性L-氨基酸如L-赖氨酸、L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-组氨酸和L-瓜氨酸；脂肪族L-氨基酸如L-异亮氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-甘氨酸；羟基单氨基羧酸(hydroxy monoaminocarboxylic acids)如L-苏氨酸和L-丝氨酸；环状L-氨基酸如L-脯氨酸；芳香族L-氨基酸如L-苯丙氨酸、L-酪氨酸和L-色氨酸；含硫L-氨基酸如L-半胱氨酸、L-胱氨酸和L-甲硫氨酸；以及酸性L-氨基酸如L-谷氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和L-天冬酰胺。

Claims (6)

1.产生L-氨基酸的方法，其包括在培养基中培养细菌，并从培养基或所述细菌中收集L-氨基酸，其中所述细菌是产生L-氨基酸的属于肠杆菌科的细菌，其经过修饰以增强乙酰-CoA合成酶的活性，其中所述L-氨基酸选自下组：L-赖氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-异亮氨酸，L-缬氨酸，L-亮氨酸，L-苏氨酸，L-苯丙氨酸，L-酪氨酸，L-色氨酸，L-半胱氨酸，L-谷氨酸，和它们的组合，而且其中通过选自下组的方法增强所述乙酰-CoA合成酶的活性：
a)增加编码乙酰-CoA合成酶的acs基因的拷贝数，和
b)修饰所述基因的表达调控序列。
2.根据权利要求1的方法，其中修饰所述基因的表达调控序列是以更强的启动子取代所述基因的天然启动子。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述acs基因为由SEQ ID NO：3的核苷酸序列的DNA组成。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述acs基因编码由SEQ ID NO：4的氨基酸序列组成的蛋白。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述细菌属于埃希氏菌属，泛菌属，或肠杆菌属。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
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